60mL，20%的醋酸鋼溶液。有機相用乙酸乙 醋萃取Ξ次后用無水硫酸鋼干燥。隨后減壓除去溶劑，將所得粗產(chǎn)物用200-300目細硅膠 柱分離，洗脫劑為石油酸/乙酸乙醋2:1，最后得到無色固體約2. 86g，產(chǎn)率為82%。
[0040] iHNMR化MSO-de, 400MHz) :δ10. 09 (S, 1H)，8. 70 (S, 1H)，8. 28 (d, 1H,J= 8.OHz)，8. 06 (dd,IH,J= 8. 7, 1. 7Hz)，7. 52 (m, 3H)，7. 32 (ddd,IH,J= 7. 5, 7. 4, 1.OHz)， 3. 98(s,IH)。
[0041] 實施例2中間體2的合成：
[0042]
陽0創(chuàng)將2. 09g1，2, 2-S甲基苯并[e]嗎I噪（lOmmol)，1. 83g1，3-丙橫酸內(nèi)醋 (15mmol，1. 5當量）和10血甲苯加入到50血的圓底燒瓶中攬拌，加熱回流1她后將反應液 冷卻至室溫。過濾得到粉紅色的固體，并用lOmL丙酬洗涂Ξ次。得到的產(chǎn)物進一步用甲醇 和乙酸重結(jié)晶，得到2. 48g固體（產(chǎn)率：75% )。
[0044]電NMR(CD3孤，400MHz) :δ8. ：34 化 1H,J= 8. 4Hz)，8. 26 (dd, 1H,J= 8.細Z,J= 4. 4Hz)，8. 18 ~8. 14 (m, 2H)，7. 82 (t, 1H,J= 8.OHz)，7. 73 (d, 1H,J= 8.OHz)，4. 88 (t, 2H,J =8.OHz)，3. 37 (s, 3H)，3. 07 (t,甜，J= 6. 4Hz)，2. 49-2. 42 (m, 2H)，1. 86 (s, 6H)。 W45] 實施例3似-3-(3, 3-二甲基-2-(2-巧-甲基巧挫-3-醒）乙締基）-苯并[g]嗎I噪-1-正-1-醒）丙烷-1-橫酸鹽（化合物3)的合成：
[0046]
[0047] 將 70mg中間體 1 (0. 33mmol)，122mg中間體 2 (0. 3mmol, 1. 1當量）W及 41. 8mg醋 酸錠化66mmol，2.0當量）溶解在10血無水乙醇中，室溫攬拌2地，過濾得到藍色的固體。 用5mL乙醇洗Ξ次，產(chǎn)物在無水乙醇中重結(jié)晶得到60mg目標產(chǎn)物（產(chǎn)率：34% )。
[0048] 咱NMR值MSO-de, 400MHz) :δ9. 34 (S, 1H)，8. 78 化J= 15. 9Hz, 1H)，8. 43 (dd,J= 8. 5, 3.OHz, 2H)，8. 38 (d,J= 7. 6Hz,IH)，8. 28 (d,J= 8. 9Hz,IH)，8. 19 (t,J= 8. 7Hz, 2H)， 8. 03 (d,J= 16.IHz,IH)，7. 80 (dd,J= 7. 9, 5. 3Hz, 2H)，7. 73 ~7. 67 (m, 2H)，7. 58 (t,J= 7. 7Hz,IH)，7. 36 (t,J= 7. 2Hz,IH)，5. 05 ~4. 95 (t,J= 7. 6Hz,IH)，3. 98 (s, 3H)，，2. 82 ~ 2. 74 (t,J= 6.OHz,IH)，2. 29 (s, 2H)，2. 09 (s, 6H)。
[0049] 口C醒R(DMS〇-de，lOOMHz) :δ182. 15,155. 40,144. 39,141. 91，139. 00, 138. 03， 134. 20,133. 31，133. 89,131. 34,130. 44,128. 70,128. 14,127. 32,127. 18,126. 46,123. 61， 123. 36,，122. 80, 121. 51，120. 93,113. 39,110. 50,109. 10,53. 68,47. 70,45. 63,29. 88， 26. 36, 25. 12d
[0050] MS(ESI)m/z:523. 2053[M+H]+。
[0051] 實施例4化合物3的選擇、干擾實驗： 陽05引在含10μΜ探針分子的抑7. 4的緩沖溶液中加入100μΜ的亞硫酸根和亞硫酸氨 根會導致探針在463皿和625皿處的巧光強度比迅速增強（圖2)。而加入ImM其他陰離 子，W及包括HzS在內(nèi)的活性硫等對化合物3在463nm和625nm處的巧光強度比幾乎沒有 任何變化（黑色條框）。同時，化合物3對S化的檢測也表現(xiàn)出了非常好的抗干擾能力。向 化合物3(1〇μΜ)中先加入ImM的各種陰離子或活性硫物質(zhì)（半脫氨酸，高半脫氨酸W及谷 脫甘膚），攬拌均勻后再加入100μΜ的亞硫酸氨根，反應2分鐘。探針在463nm和625nm處 的巧光強度比（白色條框）基本沒有受到任何影響。說明化合物3適用于復雜條件下，尤 其是在生物體內(nèi)對S化的檢測。
[0053] 實施例5化合物3在化La細胞中與Mito-TrackerDe巧Red的共定位實驗：
[0054] 首先，在含10%胎牛血清的DMEM做培養(yǎng)基中，通5%C〇2,將化La細胞于37°C下 培育24小時。然后將培養(yǎng)基去除后，加入含有4μΜ化合物3的生理鹽水并加入1μΜ市售 細胞線粒體染料Mito-TrackerDe巧Red,共培養(yǎng)30分鐘，取出培養(yǎng)皿，用生理鹽水洗3次 后，將培養(yǎng)皿放在巧光共聚焦顯微鏡上成像得到圖3。 陽化引圖3中a圖中激發(fā)光為488nm，收集540~680皿波段；b圖中激發(fā)光為638nm，收 集700~780nm波段。從疊加圖C可W看出，化合物3的染色區(qū)域和市售線粒體染料基本 一致，皮爾遜相關系數(shù)為0. 94,說明化合物3有很好的線粒體祀向性。
[0056] 實施例6化合物3在化la細胞中檢測線粒體S〇2,
[0057] 在含10%胎牛血清的DMEM做培養(yǎng)基中，通5%C〇2,將化La細胞于37°C下培育 24小時。首先，將培養(yǎng)基去除后，在第Ξ組細胞中加入含有ImMNEM的生理鹽水，解化15分 鐘后用生理鹽水洗3次；然后分別在Ξ組細胞中加入4μΜ化合物3,解化30分鐘后用生理 鹽水洗3次；生理鹽水去除后，在第二、Ξ組細胞中再加入含有60μΜ的SOzdonor的生理鹽 水，繼續(xù)解化15分鐘；最后，取出培養(yǎng)皿，用生理鹽水洗3次后，將培養(yǎng)皿放在巧光共聚焦顯 微鏡上成像得到圖4。
[0058] 圖4中藍色巧光通道激發(fā)光為405皿，收集425~520皿波段；綠色巧光通道激發(fā) 光為488nm，收集540~680nm波段。從體外校正曲線圖m和Ξ組細胞中的學生t-檢驗統(tǒng) 計分析圖η可W看出，化合物3能很好的定量檢測線粒體內(nèi)S化。
[0059] 實施例7化合物3的細胞毒性實驗
[0060] 將處于對數(shù)生長期的化La細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔接種3000個細胞，用 含10%胎牛血清的DMEM(H)培養(yǎng)基在37°C，5%C〇2條件下培養(yǎng)過夜。待細胞完全貼壁，加 入不同濃度梯度的化合物3,每個濃度設3個復孔，同時設空白對照組。加藥后繼續(xù)培養(yǎng)24 小時，MTT法檢測細胞的抑制率。
[0061] 如圖5所示，在濃度范圍0.5~8μΜ范圍內(nèi)，化合物3的細胞毒性非常小。
[0062] 本發(fā)明提供的取代的巧挫-嗎I噪橫酸鹽衍生物具有毒副性小、原料簡單易得、整 條合成路線可操作性強、反應條件溫和、總體成本較低等優(yōu)勢，和現(xiàn)有的定量檢測線粒體內(nèi) S〇2染料相比，無疑更有市場競爭力。
【主權項】
1. 取代的咔唑-吲哚磺酸鹽衍生物，其結(jié)構(gòu)式如式I所示：其中，1^與R 2環(huán)合形成6~18元芳基。2. 根據(jù)權利要求1所述的取代的咔唑-吲哚磺酸鹽衍生物，其特征在于： 札與R 2環(huán)合形成6~12元芳基； 優(yōu)選的，1^與R 2環(huán)合形成6或1〇元芳基； 進一步優(yōu)選的，所述的取代的咔唑-吲哚磺酸鹽衍生物為最優(yōu)的，所述的取代的咔唑-吲哚磺酸鹽衍生物為3. 權利要求1或2所述取代的咔唑-吲哚磺酸鹽衍生物的制備方法，包括以下步驟： a、 將N-甲基咔唑溶于N，N-二甲基甲酰胺，然后加入三氯氧磷，升溫至125°C，在氮氣保 護，反應lh，制備得到中間體1; b、 原料1與環(huán)丙磺酸內(nèi)酯在甲苯中回流制備得到中間體2 ; c、 將中間體1與中間體2在乙醇中回流反應，加入乙酸銨催化，制備得到取代咔唑-吲 哚磺酸鹽衍生物。4. 根據(jù)權利要求3所述取代的咔唑-B引噪磺酸鹽衍生物的制備方法，其特征在于：步 驟a所述的N，N-二甲基甲酰胺為無水的N，N-二甲基甲酰胺。5. 根據(jù)權利要求3所述的取代的咔唑-吲哚磺酸鹽衍生物的制備方法，其特征在于： 步驟a所述三氯氧磷與N-甲基咔唑的摩爾比為1:1. 4~1. 8,N，N-二甲基甲酰胺的與N-甲 基咔唑的摩爾比為2~4:1。6. 根據(jù)權利要求3所述的取代的咔唑-吲哚磺酸鹽衍生物的制備方法，其特征在于： 步驟b所述原料1與環(huán)丙磺酸內(nèi)酯的摩爾比為1:1. 3~1. 6。7. 根據(jù)權利要求3所述的取代的咔唑-吲哚磺酸鹽衍生物的制備方法，其特征在于： 步驟c所述乙酸銨的用量為中間體1的2倍當量。8. 根據(jù)權利要求3所述的取代的咔唑-吲哚磺酸鹽衍生物的制備方法，其特征在于： 步驟c所述中間體1與2的摩爾比為1:1. 1~1. 2。9. 權利要求1或2所述的取代的咔唑-吲哚磺酸鹽衍生物在定量檢測線粒體內(nèi)SO2濃 度中的用途。
【專利摘要】本發(fā)明屬于有機化學領域，具體涉及取代的咔唑-吲哚磺酸鹽衍生物及其制備方法和用途。本發(fā)明提供了一種咔唑-吲哚磺酸鹽衍生物，其結(jié)構(gòu)式如式Ⅰ所示。本發(fā)明還提供了上述咔唑-吲哚磺酸鹽衍生物的制備方法，以及該衍生物在定量檢測線粒體內(nèi)SO2濃度中的用途。本發(fā)明提供的咔唑-吲哚磺酸鹽衍生物具有水溶性好、靈敏度高、毒副性小、原料簡單易得、整條合成路線可操作性強、反應條件溫和、總體成本較低等優(yōu)勢，為定量檢測線粒體內(nèi)SO2提供了新的選擇。
【IPC分類】C09K11/06, G01N21/64, C07D403/06
【公開號】CN105348268
【申請?zhí)枴緾N201510618052
【發(fā)明人】余孝其, 李坤, 劉雨
【申請人】四川大學
【公開日】2016年2月24日
【申請日】2015年9月24日