一種豆芽中非法添加藥物的高效檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種豆芽中非法添加藥物的高效檢測(cè)方法，包括如下步驟：（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液配制；（2）待測(cè)樣處理；（3）在線固相萃取；（4）高效液相色譜?靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜測(cè)定。本發(fā)明采用高效、重復(fù)性好的在線固相萃取方法結(jié)合高效液相色譜串聯(lián)靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜測(cè)定豆芽中的非法添加藥物，可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中非法添加藥物的定性和定量測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果靈敏可靠；且采用本方法，對(duì)樣品的前處理過程快速簡(jiǎn)便，提高工作效率；本方法中，根據(jù)豆芽中非法添加藥物的特性，選擇適當(dāng)?shù)妮腿∪軇?、清洗劑和洗脫劑以及適當(dāng)?shù)馁|(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)，提高檢測(cè)精度和可靠度；本方法的自動(dòng)化程度高，有效避免人為操作帶來(lái)的誤差。
【專利說(shuō)明】
一種豆芽中非法添加藥物的高效檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及豆芽中非法添加藥物的檢測(cè)方法，具體涉及一種 豆芽中非法添加藥物的在線固相萃取-高效液相色譜串聯(lián)靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜測(cè)定方 法。
【背景技術(shù)】
[0002 ]豆芽中的非法添加藥物包括:4-氯苯氧乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸、赤霉素、萘乙酸、 吲哚丁酸、6-芐基腺嘌呤、多菌靈和吲哚乙酸等。以上這些藥物中，除了多菌靈屬于農(nóng)藥外， 其他藥物均屬于植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。這是一類用于調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的藥物，可促進(jìn)植物生 長(zhǎng)、提高農(nóng)作物的質(zhì)量和產(chǎn)量。
[0003] 4-氯苯氧乙酸是一種有機(jī)酸，又名防落素，防止落花、落果;其以4-氯苯氧乙酸鈉 的形式用于豆芽生產(chǎn)中，主要是抑制豆芽生根和催熟生長(zhǎng)。2,4_二氯苯氧乙酸主要用于誘 導(dǎo)細(xì)胞增殖，引起脫分化和未組織化的細(xì)胞生長(zhǎng)，對(duì)豆芽生長(zhǎng)具有很好的促進(jìn)和調(diào)節(jié)作用。 赤霉素是廣泛存在的一類植物激素，可刺激葉和芽的生長(zhǎng)，在植物幼苗生長(zhǎng)過程中提高發(fā) 芽率，用于豆芽生產(chǎn)可提高產(chǎn)量。吲哚乙酸和吲哚丁酸可促進(jìn)插條生根，誘導(dǎo)細(xì)胞分裂和分 化，促進(jìn)插條不定根的形成。萘乙酸是一種植物激素生長(zhǎng)素，可促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大，誘導(dǎo) 形成不定根。多菌靈為一種廣譜性殺菌劑，能夠殺死豆芽中的霉菌、細(xì)菌。6-芐基腺嘌呤是 細(xì)胞分裂素的一種，促進(jìn)細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)組織分化，用于豆芽生產(chǎn)中可促進(jìn)芽的生長(zhǎng)，抑制 根的生長(zhǎng)，縮短生長(zhǎng)周期。
[0004] 近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑雖然低毒，但會(huì)在農(nóng)作物中殘留，通過食物鏈進(jìn) 入人體。人體長(zhǎng)時(shí)間吸收后會(huì)對(duì)其造成一定程度的傷害:輕則造成腹瀉等疾病;重則造成人 體免疫力下降，骨骼疏松，甚至致畸、致癌、致突變等后果。
[0005] 目前測(cè)定豆芽中的非法添加藥物的前處理多是有機(jī)溶劑提取，使用大量的有機(jī)溶 劑，操作繁瑣同時(shí)對(duì)操作人員造成傷害;或是采用固相萃取，手動(dòng)操作，耗費(fèi)大量人力。儀器 方法多采用液相色譜法或高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜法，考慮到非法添加的藥物品 種較多，并且有可能是未知藥物，因此采用高分辨質(zhì)譜進(jìn)行精確質(zhì)量數(shù)篩查，不僅能檢測(cè)已 知可能添加的藥物，也可以篩查出未知的添加物，對(duì)于豆芽品質(zhì)監(jiān)控有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 發(fā)明目的:本發(fā)明目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種操作簡(jiǎn)便、精準(zhǔn)度高的 豆芽中非法添加藥物的在線固相萃取-高效液相色譜串聯(lián)靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜測(cè)定方 法，該方法可同時(shí)實(shí)現(xiàn)樣品的定性和定量檢測(cè)且靈敏高、結(jié)果可靠。
[0007] 技術(shù)方案:本發(fā)明所述的豆芽中非法添加藥物的高效檢測(cè)方法，包括如下步驟：
[0008] (1)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：將非法添加藥物標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇配制成濃度為150~300mg/L的 標(biāo)準(zhǔn)溶液，2~6 °C保存;再用甲醇逐級(jí)稀釋成濃度為0.8~1.2mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液；
[0009] (2)待測(cè)樣處理:豆芽樣品預(yù)先切碎，攪勻，稱取0.5~2g于50mL離心管，加入冰醋 酸-乙腈溶液，禍旋，置于超聲儀中超聲15~30min; 5000~lOOOOrpm離心2~5min，取上清 液，氮?dú)獯蹈?，然后用甲醇與水的混合溶液溶解并定容至l.OmL，過濾于進(jìn)樣小瓶；
[0010] (3)在線固相萃取:采用HLB萃取柱，用甲醇和水分別活化，流速為4~6mL/min;然 后上樣，上樣量為0.3~0.8ml，上樣溶劑為水，體積0.3~1. OmL;清洗溶劑為水;洗脫溶劑為 甲醇；
[0011] (4)高效液相色譜-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜測(cè)定：采用加熱的電噴霧離子源 (HESI-n );毛細(xì)管溫度為300~400°C，鞘氣流速40~60L/min，輔助氣流速4~8L/min，吹掃 氣流速2~6L/min;噴霧電壓為3KV，透鏡電壓為50V;采用正負(fù)離子切換模式同時(shí)采集數(shù)據(jù)； 進(jìn)樣前將色譜柱平衡15~30min，在柱溫為25~35°C下重復(fù)進(jìn)同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，當(dāng)峰面 積變化在±10%以內(nèi)，保留時(shí)間在±5%以內(nèi)，開始正式進(jìn)樣;進(jìn)樣系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為5~ 150ng/mL，以標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積為縱坐標(biāo)，溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，用標(biāo)準(zhǔn)工 作曲線對(duì)樣品進(jìn)行定量，樣品溶液中藥物的響應(yīng)值在儀器測(cè)定的線性范圍內(nèi)。
[0012]本發(fā)明中，所述的非法添加藥物包括4-氯苯氧乙酸、2,4_二氯苯氧乙酸、赤霉素、 萘乙酸、吲哚丁酸、6-芐基腺嘌呤、多菌靈和吲哚乙酸。
[0013] 優(yōu)選地，步驟⑶中活化劑為lmL甲醇和lmL7K。
[0014] 優(yōu)選地，步驟（3)中清洗溶劑為lmL的水，流速為5mL/min;洗脫溶劑為0.5mL的甲 醇，流速為〇. 15mL/min。
[0015] 優(yōu)選地，步驟⑷中采用的色譜柱為Agilent Polaris C-18,長(zhǎng)度為100mm，內(nèi)徑為 2 ? 1mm，填料粒徑為5ym。
[0016]優(yōu)選地，步驟(4)中采用梯度洗脫程序，流動(dòng)相為醋酸銨與甲醇的混合液。
[0017]優(yōu)選地，所述的梯度洗脫程序具體如下：時(shí)刻Omin:采用95wt %的醋酸銨和5wt % 的甲醇混合液做流動(dòng)相，流速為〇. 3mL/min;時(shí)刻2min:采用95wt %的醋酸銨和5wt %的甲醇 混合液做流動(dòng)相，流速為0.3mL/min;時(shí)刻4min:采用5wt %的醋酸銨和95wt %的甲醇混合液 做流動(dòng)相，流速為0.3mL/min;時(shí)刻9min:采用5wt %的醋酸銨和95wt %的甲醇混合液做流動(dòng) 相，流速為〇. 3mL/min;時(shí)刻10min:采用95wt %的醋酸銨和5wt %的甲醇混合液做流動(dòng)相，流 速為0.3mL/min;時(shí)刻12min:采用95wt %的醋酸銨和5wt %的甲醇混合液做流動(dòng)相，流速為 0?3mL/min〇
[0018]優(yōu)選地，步驟(4)中所述的鞘氣、輔助氣和吹掃氣均為N2。
[0019]優(yōu)選地，步驟(4)中采集數(shù)據(jù)的掃描范圍為100-600m/z，一級(jí)全掃描的分辨率R = 70000〇
[0020] 有益效果：（1)本發(fā)明采用高效、重復(fù)性好的在線固相萃取方法結(jié)合高效液相色譜 串聯(lián)靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜測(cè)定豆芽中的非法添加藥物，可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中非法添加藥物 的定性和定量測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果靈敏可靠;且采用本方法，對(duì)樣品的前處理過程快速簡(jiǎn)便，提 高工作效率；（2)本方法中，根據(jù)豆芽中非法添加藥物的特性，選擇適當(dāng)?shù)妮腿∪軇?、清洗?和洗脫劑以及適當(dāng)?shù)馁|(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)，提高檢測(cè)精度和可靠度；（3)本方法的自動(dòng)化程度高， 有效避免人為操作帶來(lái)的誤差。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1為豆芽中各類非法添加物標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖；（其中：1.4-氯苯氧乙酸、2.2,4_二 氯苯氧乙酸、3.赤霉素、4.萘乙酸、5.吲哚丁酸、6.6-芐基腺嘌呤、7.多菌靈、8.吲哚乙酸）。
[0022] 圖2為采用本方法檢測(cè)含有非法添加藥物的陰性豆芽樣品得到的色譜圖，（其中： 1.4-氯苯氧乙酸、2.2，4_二氯苯氧乙酸、3.赤霉素、4.萘乙酸、5. B引噪丁酸、6.6-芐基腺嘌 呤、7.多菌靈、8.吲哚乙酸）。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面通過附圖對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于 所述實(shí)施例。
[0024] 本發(fā)明所述的實(shí)例使用的質(zhì)譜儀為Thermo Fisher公司的Q-Exactive型高效液相 色譜-靜電場(chǎng)軌道講高分辨質(zhì)譜儀，數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)為美國(guó)Thermo Fisher公司的Xcalibur數(shù) 據(jù)處理系統(tǒng);試劑均為常規(guī)市售。
[0025] 實(shí)施例:一種豆芽中非法添加藥物的檢測(cè)方法，包括如下步驟：
[0026] (1)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:將非法添加藥物標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇配制成濃度為200mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶 液，4°C保存;再用甲醇逐級(jí)稀釋成濃度為lmg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液；
[0027] (2)待測(cè)樣處理:豆芽樣品預(yù)先切碎，攪勻，稱取lg于50mL離心管，加入0.1 %冰醋 酸-乙腈溶液，禍旋，置于超聲儀中超聲20min; 8000rpm離心3min，取上清液，氮?dú)獯蹈?，然?用甲醇與水的混合溶液溶解并定容至lmL，其中甲醇與水的體積比為3:7;過濾于進(jìn)樣小瓶；
[0028] (3)在線固相萃?。翰捎肏LB萃取柱，用lmL的甲醇和lmL水分別活化，流速為4~ 6mL/min;然后上樣，上樣量為0.5ml，上樣溶劑為0.5ml的水，流速為0.5mL/min;清洗溶劑為 lmL的水，流速為5mL/min;洗脫溶劑為0.5mL的甲醇，流速為0.15mL/min;
[0029] (4)高效液相色譜-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜測(cè)定：采用加熱的電噴霧離子源 (HESI-n );毛細(xì)管溫度為350°C，鞘氣(N2)流速50L/min，輔助氣（N2)流速6L/min，吹掃氣 (N 2)流速3L/min;噴霧電壓為3KV，透鏡電壓為50V;采用正離子模式采集數(shù)據(jù)，一級(jí)全掃描 的分辨率R = 70000,掃描范圍：100-600m/z;采用的色譜柱為AgilentPolaris C-18,長(zhǎng)度為 100mm，內(nèi)徑為2.1mm，填料粒徑為5ym;進(jìn)樣前將色譜柱平衡15min，在柱溫為30°C下重復(fù)進(jìn) 同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，當(dāng)峰面積變化在±10%以內(nèi)，保留時(shí)間在±5%以內(nèi)，開始正式進(jìn)樣； 進(jìn)樣系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為5，10，20，50，100，150ng/mL，本過程中采用梯度洗脫程序，流動(dòng)相 為醋酸銨與甲醇的混合液；梯度洗脫程序具體如下：時(shí)刻Omin :采用95wt %的醋酸銨和 5wt %的甲醇混合液做流動(dòng)相，流速為0.3mL/min;時(shí)刻2min:采用95wt %的醋酸銨和5wt % 的甲醇混合液做流動(dòng)相，流速為〇. 3mL/min;時(shí)刻4min:采用5wt%的醋酸銨和95wt%的甲醇 混合液做流動(dòng)相，流速為0.3mL/min;時(shí)刻9min:采用5wt %的醋酸銨和95wt %的甲醇混合液 做流動(dòng)相，流速為0.3mL/min;時(shí)刻lOmin:采用95wt %的醋酸銨和5wt %的甲醇混合液做流 動(dòng)相，流速為0.3mL/min;時(shí)刻12min:采用95wt %的醋酸銨和5wt %的甲醇混合液做流動(dòng)相， 流速為0.3mL/min以標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積為縱坐標(biāo)，溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，用 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對(duì)樣品進(jìn)行定量，樣品溶液中藥物的響應(yīng)值在儀器測(cè)定的線性范圍內(nèi)。
[0030] 其中，高效液相色譜梯度洗脫程序見表1;豆芽中非法添加藥物的中英文名稱及質(zhì) 譜精確質(zhì)量數(shù)見表2;
[0031]表1高效液相色譜梯度洗脫程序
[0033]表2非法添加藥物的中英文名稱及質(zhì)譜精確質(zhì)量數(shù)
[0035] 參考上表2數(shù)據(jù)和圖1曲線，樣品中是否存在某種藥物，需滿足如下條件:該樣品出 現(xiàn)的色譜峰的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間相差不超過± 2.5 % ;樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的精確質(zhì)量 數(shù)的偏差小于5*1(T6,則確定為樣品中含有該藥物，圖2為采用本方法檢測(cè)含有非法添加藥 物的陰性豆芽樣品得到的色譜圖，由兩圖對(duì)比可知，對(duì)于含有各類非法添加藥物的豆芽樣 品，采用本方法的檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品的出峰位置基本一致，證明，采用本發(fā)明方法對(duì)豆芽中 非法添加藥物檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。
[0036] 采用本發(fā)明方法對(duì)典型含有非法添加藥物的豆芽陰性樣品加標(biāo)回收率范圍見表 3；
[0037] 表3典型豆芽陰性樣品加標(biāo)回收率范圍
[0039]由表3數(shù)據(jù)可證明，采用本發(fā)明方法，對(duì)典型豆芽陰性樣品的加標(biāo)回收率可控制在 一個(gè)較適宜且穩(wěn)定的范圍內(nèi)，證明本方法用于豆芽中非法添加藥物的可靠度高，適于推廣 使用。
[0040]如上所述，盡管參照特定的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)表示和表述了本發(fā)明，但其不得解釋 為對(duì)本發(fā)明自身的限制。在不脫離所附權(quán)利要求定義的本發(fā)明的精神和范圍前提下，可對(duì) 其在形式上和細(xì)節(jié)上作出各種變化。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種豆芽中非法添加藥物的高效檢測(cè)方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：將非法添加藥物標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇配制成濃度為150~300mg//L的標(biāo)準(zhǔn) 溶液，2~6°C保存;再用甲醇逐級(jí)稀釋成濃度為0.8~1.2mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液； (2) 待測(cè)樣處理:豆芽樣品預(yù)先切碎，攪勻，稱取0.5~2g于50mL離心管，加入冰醋酸-乙 腈溶液，禍旋，置于超聲儀中超聲15~30min; 5000~1000 Orpm離心2~5min，取上清液，氮?dú)?吹干，然后用甲醇與水的混合溶液溶解并定容至I.OmU過濾于進(jìn)樣小瓶； (3) 在線固相萃取:采用HLB萃取柱，用甲醇和水分別活化，流速為4~6mL/min;然后進(jìn) 樣，上樣量為〇. 3~0.8ml，上樣溶劑為水，體積0.3~1.0 mL，流速為0.4~0.6mL/min;清洗溶 劑為水;洗脫溶劑為甲醇； (4) 高效液相色譜-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜測(cè)定：采用加熱的電噴霧離子源(HESI-Π );毛細(xì)管溫度為300~400 °C，鞘氣流速40~60L/min，輔助氣流速4~8L/min，吹掃氣流速 2~6L/min;噴霧電壓為3KV，透鏡電壓為50V;采用正負(fù)離子切換模式同時(shí)采集數(shù)據(jù);進(jìn)樣前 將色譜柱平衡15~30min，在柱溫為25~35°C下重復(fù)進(jìn)同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，當(dāng)峰面積變化 在±10%以內(nèi)，保留時(shí)間在±5%以內(nèi)，開始正式進(jìn)樣;進(jìn)樣系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為5~150ng/ mL，以標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積為縱坐標(biāo)，溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線 對(duì)樣品進(jìn)行定量，樣品溶液中藥物的響應(yīng)值在儀器測(cè)定的線性范圍內(nèi)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豆芽中非法添加藥物的高效檢測(cè)方法，其特征在于:所述的非 法添加藥物包括4-氯苯氧乙酸、2,4_二氯苯氧乙酸、赤霉素、萘乙酸、吲哚丁酸、6-芐基腺嘌 呤、多菌靈和吲哚乙酸。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豆芽中非法添加藥物的高效檢測(cè)方法，其特征在于:步驟(3) 中活化劑為ImL的甲醇和ImL水，流速為4~6mL/min。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豆芽中非法添加藥物的高效檢測(cè)方法，其特征在于:步驟(3) 中清洗溶劑為〇 . 5-1.5mL的水，流速為4-6mL/min;洗脫溶劑為0.3-0.7mL的甲醇，流速為 0·1-0·3mL/min〇5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豆芽中非法添加藥物的高效檢測(cè)方法，其特征在于:步驟(4) 中采用的色譜柱為Agilent Polaris C-18,長(zhǎng)度為100mm，內(nèi)徑為2.1mm，填料粒徑為5μηι。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豆芽中非法添加藥物的高效檢測(cè)方法，其特征在于:步驟(4) 中采用梯度洗脫程序，流動(dòng)相為醋酸銨與甲醇的混合液。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的豆芽中非法添加藥物的高效檢測(cè)方法，其特征在于:所述的梯 度洗脫程序具體如下：時(shí)刻Omin:采用95wt %的醋酸銨和5wt %的甲醇混合液做流動(dòng)相，流 速為0.3mL/min;時(shí)刻2min:采用95wt%的醋酸銨和5wt%的甲醇混合液做流動(dòng)相，流速為 0.3mL/min;時(shí)刻4min:采用5wt %的醋酸銨和95wt %的甲醇混合液做流動(dòng)相，流速為0.3mL/ min;時(shí)刻9min:采用5wt %的醋酸銨和95wt %的甲醇混合液做流動(dòng)相，流速為0.3mL/min;時(shí) 刻IOmin:采用95wt %的醋酸銨和5wt %的甲醇混合液做流動(dòng)相，流速為0.3mL/min;時(shí)刻 12min:采用95wt%的醋酸銨和5wt%的甲醇混合液做流動(dòng)相，流速為0.3mL/min。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豆芽中非法添加藥物的高效檢測(cè)方法，其特征在于:步驟(4) 中所述的鞘氣、輔助氣和吹掃氣均為N2。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豆芽中非法添加藥物的高效檢測(cè)方法，其特征在于:步驟(4) 中采集數(shù)據(jù)的掃描范圍為100-600m/z，一級(jí)全掃描的分辨率R=70000。
【文檔編號(hào)】G01N30/06GK105929091SQ201610510191
【公開日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年6月30日
【發(fā)明人】柳菡, 張睿, 趙增運(yùn), 沈偉健, 丁濤, 吳斌, 沈崇鈺
【申請(qǐng)人】江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心