專利名稱：二氫嘧啶酮多聚體及其作為人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及雜環(huán)化合物及其在治療中的用途。

背景技術(shù)：
人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶為一種在中性粒細(xì)胞的嗜天青顆粒中發(fā)現(xiàn)的32kDa絲氨酸蛋白酶。它在多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的降解中起作用，所述細(xì)胞外基質(zhì)蛋白包括纖維連接蛋白、層粘連蛋白、蛋白聚糖、III型和IV型膠原蛋白以及彈性蛋白(Bieth，G.In Regulation of Matrixaccumulation，Mecham，R.P.編，Academic Press，NY，USA 1986，217-306)。HNE長(zhǎng)期被認(rèn)為通過(guò)經(jīng)由降解組織結(jié)構(gòu)蛋白而修復(fù)和處理受損組織而在保持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。它也與通過(guò)降解細(xì)菌體而防御細(xì)菌侵入有關(guān)。除了它對(duì)基質(zhì)組織的作用外，HNE還涉及IL-8基因表達(dá)的上調(diào)并且還促使IL-8從肺上皮細(xì)胞的釋放。在由暴露于煙草煙霧而誘發(fā)的慢性阻塞性肺疾患的動(dòng)物模型中，小分子抑制劑和HNE的蛋白抑制劑均抑制炎癥反應(yīng)和肺氣腫的形成(Wright，J.L.等Am.J.Respir.Crit.Care Med.2002，166，954-960；Churg，A.等Am.J.Respir.Crit.Care Med.2003，168，199-207)。因此，HNE在基質(zhì)破壞和增大下述慢性呼吸道疾病的炎癥反應(yīng)中都發(fā)揮作用，所述慢性呼吸道疾病以中性粒細(xì)胞的流入為特有特征。實(shí)際上，認(rèn)為HNE在若干種肺病中發(fā)揮作用，所述肺病包括慢性阻塞性肺疾患(COPD)、囊性纖維化(CF)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、肺氣腫、肺炎、重癥哮喘、結(jié)節(jié)病、支氣管擴(kuò)張和肺纖維化。它還與涉及組織改造(tissue remodelling)的若干種心血管疾病有關(guān)，例如急性心肌梗塞后的心力衰竭及缺血性組織損傷的發(fā)生。提高的HNE水平也與炎癥性腸病中炎癥的嚴(yán)重程度相關(guān)(SilbererH等，Clin Lab.2005；51(3-4)117-26)并且在潰瘍性結(jié)腸炎患者的受損粘膜的修復(fù)中發(fā)揮作用。
COPD是包括三種不同的病理狀態(tài)的概括術(shù)語(yǔ)，所述三種病理狀態(tài)均導(dǎo)致對(duì)氣流的限制慢性支氣管炎、肺氣腫和小氣道疾病。存在COPD的患者體內(nèi)通常不同程度地具有這三種病理狀態(tài)，并且這三種病理狀態(tài)均可歸因于中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥，這可從在COPD患者支氣管肺泡泄露(BAL)的流體中觀察到的中性粒細(xì)胞數(shù)目的增加中得到證實(shí)(Thompson，A.B.；Daughton，D.；等Am.Rev.Respir.Dis.1989，140，1527-1537)。COPD中的主要致病決定因素長(zhǎng)期被認(rèn)為是蛋白酶-抗蛋白酶平衡(也被稱為‘彈性蛋白酶抗彈性蛋白酶假說(shuō)’)，其中HNE和內(nèi)源性抗蛋白酶例如α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)、分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制因子(SLPI)及前彈力素(pre-elafin)的不平衡導(dǎo)致COPD的各種炎性疾病。具有蛋白酶抑制劑α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)的遺傳缺陷的個(gè)體會(huì)形成嚴(yán)重性隨時(shí)間而增加的肺氣腫(Laurrell，C.B.；Erikkson，SScand.J.Clin.Invest.1963 15，132-140)。因此HNE的過(guò)量是破壞性的，會(huì)導(dǎo)致伴有彈性喪失且肺中氣道的肺泡接觸破壞(氣腫)的肺部形態(tài)破壞，同時(shí)微血管通透性增加并且粘液分泌過(guò)多(慢性支氣管炎)。
多聚體配體由多個(gè)結(jié)合域組成，這些結(jié)合域通過(guò)一個(gè)合適的支架被拴系在一起。由此將各結(jié)合域連接在一起形成一個(gè)分子，增加了將多聚體與多個(gè)活性位點(diǎn)同時(shí)連接的概率從而導(dǎo)致高度親和的相互作用(Handl，H.L.等Expert Opin.Ther.Targets 2004，8，565-586；Han，Y.F.等，Bioorg.Med.Chem.Letts.1999，7，2569-2575)。同樣，多重結(jié)合相互作用與相對(duì)高的脫離率相結(jié)合會(huì)產(chǎn)生多聚體配體的低的總脫離率。因此，可預(yù)期由合適的連接體和配體組成的分子在作用的效能和/或持續(xù)性方面優(yōu)于單獨(dú)的單體配體。多聚體化合物未必為口服生物有效(按Lipinski的“規(guī)則5”所預(yù)測(cè))，在靶向肺部的吸入給藥途徑中多聚體化合物是有利的——因?yàn)樵诩词刮虢o藥后，大部分藥物可能進(jìn)入G1途徑。因此可預(yù)期所述化合物會(huì)展示出吸入給藥后的降低的全身接觸和因此比口服給藥治療改善的毒副反應(yīng)。
式(II)的單體在WO2004/024700、WO2004/024701、GB2392910、WO2005/082863和WO2005/082864中被描述為人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的抑制劑。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明第一方面為一種式(I)或式(IV)的化合物 (M)-(L)-(M) (I) [(M)-(L)]t-G(IV) 其中 每一個(gè)M獨(dú)立地為HNE的抑制劑；并且 每一個(gè)L獨(dú)立地為連接基團(tuán)； t為2-20；并且 G為芳基、雜芳基、烷基、環(huán)烷基、氮、樹狀分子(dendrimer)或式(V)-(VII)的任何一個(gè)的基團(tuán)
其中 Ar為芳基或雜芳基；并且 u為2-20； M為一個(gè)式(II)的基團(tuán)
其中 A為芳基或雜芳基； D為氧或硫； R1、R2和R3獨(dú)立地各自為氫、鹵素、硝基、氰基、烷基、羥基或烷氧基，其中烷基和烷氧基還可被選自鹵素、羥基和烷氧基的一至三個(gè)相同或不同的基團(tuán)取代； R4為氫、烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、烯氧基羰基、羥基羰基、氨基羰基、芳基羰基、雜芳基羰基、雜環(huán)烷基羰基、雜芳基、雜環(huán)烷基或氰基，其中烷基羰基、烷氧基羰基和氨基羰基還可被選自環(huán)烷基、羥基、烷氧基、烷氧基羰基、羥基羰基、氨基羰基、氰基、氨基、雜芳基、雜環(huán)烷基和三-(烷基)-甲硅烷基的一至三個(gè)相同或不同的基團(tuán)取代，并且其中雜芳基羰基、雜環(huán)烷基羰基、雜芳基和雜環(huán)烷基還可被烷基取代；或者 R4代表一個(gè)式(VIII)的基團(tuán)
其中，R4A、R4B、R4D、R4E、R4G、R4H、R4I和R4J獨(dú)立地為氫或烷基，或者R4H和R4I可用其所連接的氮原子連接成環(huán)； R4F為孤對(duì)電子，或R4F為烷基并且其連接的氮原子為季氮原子并且?guī)в幸粋€(gè)正電荷； R4C為孤對(duì)電子，或R4C為烷基并且其連接的氮原子為季氮原子并且?guī)в幸粋€(gè)正電荷；或者R4C、R4D或R4E的任何兩個(gè)可用其所連接的氮原子連接成環(huán)，該環(huán)任選包含選自氧或氮的另一個(gè)雜原子； v1為1-3； v2為1-6； R5為烷基，該烷基可被選自鹵素、羥基、烷氧基、烯氧基、烷硫基、氨基、羥基羰基、烷氧基羰基和-O-(烷基)-O-(烷基)基團(tuán)的一至三個(gè)相同或不同的基團(tuán)取代；或者R5為氨基； R6為鹵素、硝基、氰基、烷基、羥基或烷氧基；其中烷基和烷氧基還可被選自鹵素、羥基和烷氧基的一至三個(gè)相同或不同的基團(tuán)取代；并且 Y1、Y2、Y3、Y4和Y5相互獨(dú)立地各自為C或N，條件是包含它們的環(huán)含有不多于2個(gè)的N原子； L為式(III)的連接基團(tuán) -La-R7-Lb-W-Lb-R7-La-...(III) 其中 La為鍵或-C(O)-基； Lb為鍵或-C(O)-基； R7為鍵或亞烷基或亞環(huán)烷基； W為鍵或選自以下的二價(jià)基團(tuán) -(O-R8A)m1-O- -N(R9A)-(O-R8A)m1-R8A-N(R9A)- -N(R9A)-R8B-N(R9B)(R9C)-R8B-N(R9A)- -N(R9A)-R8B-N(R10B)C(＝NR10A)(NR10C)-R8B-N(R9A)- -N(R8A)-R8B-N(R9A)- -N(R9A)-R8B-N(R9A)-R8B-N(R9A)-R8B-N(R9A)-
其中 m1為1-4； R8A為亞烷基或亞環(huán)烷基； R8B為亞烷基或亞環(huán)烷基，或者為一個(gè)式A2的基團(tuán)； R9A為氫或烷基； R9B或R9C中的一個(gè)為孤對(duì)電子，另一個(gè)為氫或烷基，或者R9B和R9C兩者均為烷基，在此情形下，連于其上的氮為季氮并且?guī)б粋€(gè)正電荷；或者R9B和R9C用其所連接的氮連接成環(huán)； R10A為氫或烷基； R10B和R10C獨(dú)立地為氫或烷基，或者R10B和R10C被連接在一起形成環(huán)； m2為1-3； A1選自基團(tuán)-N(R9A)-R8-N(R9B)(R9C)-R8-N(R9A)-、-N(R9A)-R8-N(R10B)C(＝NR10A)(NR10C)-R8-N(R9A)-； A2選自以下基團(tuán)的一個(gè)；
其中Ar1、Ar2相互獨(dú)立地為芳基或雜芳基； 或者為其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或其N-氧化物。
當(dāng)有兩個(gè)基團(tuán)M時(shí)，可將本發(fā)明的化合物描述為二聚體。連接體L可再帶有一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)M。
應(yīng)該理解的是本發(fā)明的任何化合物可以前體藥物的形式使用。
本發(fā)明的化合物可用在治療或預(yù)防涉及HNE的疾病中，例如慢性阻塞性肺疾患(COPD)、慢性支氣管炎、肺纖維化、肺炎、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、肺氣腫、吸煙導(dǎo)致的肺氣腫、重癥哮喘、結(jié)節(jié)病、支氣管擴(kuò)張、囊性纖維化、炎癥性腸?。粷冃越Y(jié)腸炎和Crohn氏病。
本發(fā)明的另一方面為含有一種本發(fā)明的化合物和一種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。
本發(fā)明的另一方面為本發(fā)明的化合物用于生產(chǎn)治療或預(yù)防涉及HNE的疾病或病癥的藥物的用途。因此，本發(fā)明的化合物可用在治療方法中，用于治療患有上述定義的病癥或疾病的患者。

具體實(shí)施例方式 “烷基羰基”指-CO-烷基，其中烷基如本文所述。示例性的?；?COCH3和-COCH(CH3)2。
“?；被敝?NR-?；?，其中R和?；绫疚乃?。示例性的酰基氨基包括-NHCOCH3和-N(CH3)COCH3。
“烯氧基”指-O-烯基，其中烯基如下文所述。示例性基團(tuán)包括-O-烯丙基(-OCH2CH＝CH2)。
“烯氧基羰基”指-COO-烯基，其中烯基如下文所述。示例性基團(tuán)包括-C(O)O-烯丙基。
“烷氧基”和“烷基氧基”指-O-烷基，其中烷基如下文所述。示例性烷氧基包括甲氧基(-OCH3)和乙氧基(-OC2H5)。
“烷氧基羰基”指-COO-烷基，其中烷基如下文所述。示例性烷氧基羰基包括甲氧基羰基和乙氧基羰基。
“烷基”或“低級(jí)烷基”，作為一個(gè)基團(tuán)或基團(tuán)的一部分，指的是鏈中具有1-12、優(yōu)選1-6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈飽和烴基。示例性的烷基包括甲基、乙基、1-丙基和2-丙基。
作為一個(gè)基團(tuán)或基團(tuán)的一部分的“烯基”指的是鏈中具有1-12、優(yōu)選1-6個(gè)碳原子和一個(gè)碳-碳雙鍵的直鏈或支鏈烴基。示例性的烯基包括乙烯基、1-丙烯基和2-丙烯基。
“烷基氨基”指-NH-烷基基團(tuán)，其中烷基如上所定義。示例性的烷基氨基包括甲基氨基和乙基氨基。
“亞烷基”指-烷基-基團(tuán)，其中烷基如前所定義。示例性的亞烷基包括-CH2-、-(CH2)2-和-C(CH3)HCH2-。
“亞烯基”指-烯基-基團(tuán)，其中烯基如前所定義。示例性的亞烯基包括-CH＝CH-、-CH＝CHCH2-和-CH2CH＝CH-。
“烷硫基”指-S-烷基-基團(tuán)，其中烷基如上所定義。示例性的烷硫基包括甲硫基和乙硫基。
“氨基”指-NR1R2基，其中R1和R2相互獨(dú)立地為氫原子、烷基、芳基、芳基烷基、烯基、炔基、雜芳基或雜環(huán)烷基。(即氨基可以是伯、仲或叔氨基)。示例性的氨基包括-NH2、-NHCH3、-NHPh、-N(CH3)2等。
“氨基羰基”指-CO-NRR基，其中R如本文所述。示例性的氨基羰基包括-CONH2、-CONHCH3和-CONH-苯基。
“氨基烷基”指烷基-NH2基，其中烷基如前所述。示例性的氨基烷基包括-CH2NH2。
“銨”指季氮基-N+R1R2R3，其中R1、R2和R3為烷基、芳基、烯基、芳基烷基、雜芳基、雜環(huán)烷基，并且氮原子帶有一個(gè)表觀正電荷。
作為基團(tuán)或基團(tuán)的一部分的“芳基”表示具有6-14個(gè)碳原子、優(yōu)選6-10個(gè)碳原子的任選取代的單環(huán)或多環(huán)芳族碳環(huán)部分，例如苯基或萘基。該芳基可被一個(gè)或多個(gè)取代基取代。
“芳基烷基”指芳基-烷基-，其中芳基和烷基部分如前所述。示例性的芳基烷基包括苯甲基、苯乙基和萘甲基。
“芳基烷氧基”指芳基-烷氧基-基團(tuán)，其中芳基和烷氧基部分如前所述。優(yōu)選的芳基烷氧基含有C1-4烷基。示例性的芳基烷基包括芐氧基。
“芳基羰基”指連到羰基-(C＝O)上的芳環(huán)。示例性基團(tuán)包括苯甲酰基(-C(O)Ph)。
“芳氧基”指-O-芳基基團(tuán)，其中芳基如上所述。示例性的芳氧基包括苯氧基。
“環(huán)胺”指任選取代的3-8元單環(huán)環(huán)烷基環(huán)體系，其中一個(gè)環(huán)碳原子被氮取代，并且該環(huán)體系可任選含有另一個(gè)選自O(shè)、S或NR(其中R如本文所述)的雜原子。示例性的環(huán)胺包括吡咯烷、哌啶、嗎啉、哌嗪和N-甲基哌嗪。環(huán)胺基可被一個(gè)或多個(gè)取代基取代。
“環(huán)烷基”指任選取代的具有3-12個(gè)碳原子、優(yōu)選3-8個(gè)碳原子并且更優(yōu)選3-6個(gè)碳原子的飽和單環(huán)或雙環(huán)體系。示例性的單環(huán)環(huán)烷基包括環(huán)丙基、環(huán)戊基、環(huán)己基和環(huán)庚基。所述環(huán)烷基可被一個(gè)或多個(gè)取代基取代。
“亞環(huán)烷基”指作為二價(jià)基的任選取代的具有3-12個(gè)碳原子、優(yōu)選3-8個(gè)碳原子并且更優(yōu)選3-6個(gè)碳原子的飽和單環(huán)或雙環(huán)體系。示例性的亞環(huán)烷基包括環(huán)己烷-1，4-二基。
“環(huán)烷基烷基”指環(huán)烷基-烷基-基團(tuán)，其中環(huán)烷基和烷基部分如前所述。示例性的單環(huán)環(huán)烷基烷基包括環(huán)丙基甲基、環(huán)戊基甲基、環(huán)己基甲基和環(huán)庚基甲基。
“樹枝狀分子”指具有連接每一個(gè)官能位點(diǎn)的分支基團(tuán)的多官能核心基團(tuán)。每一個(gè)分支位點(diǎn)可連接另一個(gè)分支分子并且該過(guò)程可重復(fù)多次。
“鹵代”或“鹵素”指氟、氯、溴或碘。
“鹵代烷氧基”指-O-烷基，其中烷基被一個(gè)或多個(gè)鹵素原子取代。示例性的鹵代烷氧基包括三氟甲氧基和二氟甲氧基。
“鹵代烷基”指被一個(gè)或多個(gè)鹵素原子取代的烷基。示例性的鹵代烷基包括三氟甲基。
作為一個(gè)基團(tuán)或基團(tuán)的一部分的“雜芳基”表示任選取代的具有5-14個(gè)環(huán)原子、優(yōu)選5-10個(gè)環(huán)原子的芳族單環(huán)或多環(huán)有機(jī)部分，其中一個(gè)或多個(gè)環(huán)原子為除碳原子外的一種或多種元素，例如氮、氧或硫。所述基團(tuán)的實(shí)例包括苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、呋喃基、咪唑基、吲哚基、中氮茚基(indolizinyl)、異噁唑基、異喹啉基、異噻唑基、噁唑基、噁二唑基、吡嗪基、噠嗪基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、四唑基、1，3，4-噻二唑基、噻唑基、噻吩基和三唑基。雜芳基可被一個(gè)或多個(gè)取代基取代。雜芳基可通過(guò)任何可用的碳原子或氮原子連接至本發(fā)明化合物的其余部分。
“雜芳基羰基”指連至羰基——C(O)-上的雜芳基。示例性的基團(tuán)為吡啶-2-羰基、噻吩-2-羰基。
“雜芳氧基”指雜芳氧基-基團(tuán)，其中雜芳基如前所述。示例性的雜芳氧基包括吡啶氧基。
“雜環(huán)烷基”指(i)任選取代的具有4-8個(gè)環(huán)原子的環(huán)烷基，該環(huán)烷基含有一個(gè)或多個(gè)選自O(shè)、S或NR的雜原子；(ii)具有4-8個(gè)環(huán)原子的環(huán)烷基，該環(huán)烷基含有CONR和CONRCO(這類基團(tuán)的實(shí)例包括琥珀酰亞胺基和2-氧代吡咯烷基)。所述雜環(huán)烷基可被一個(gè)或多個(gè)取代基取代。所述雜環(huán)烷基可通過(guò)任何可用的碳或氮原子連至化合物的其余部分。
“雜環(huán)烷基烷基”指雜環(huán)烷基-烷基-基團(tuán)，其中雜環(huán)烷基和烷基部分如前所述。
“羥基羰基”指-COOH基團(tuán)。
“藥學(xué)上可接受的鹽”指生理學(xué)或毒理學(xué)上可耐受的鹽，并且當(dāng)合適的時(shí)候，還包括藥學(xué)上可接受的堿加成鹽(base addition salts)和藥學(xué)上可接受的酸加成鹽。例如(i)當(dāng)本發(fā)明的化合物含有一個(gè)或多個(gè)酸性基團(tuán)，例如羧基時(shí)，可形成的藥學(xué)上可接受的堿加成鹽包括鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽和銨鹽，或與有機(jī)胺例如二乙胺、N-甲基-葡糖胺、二乙醇胺或氨基酸類(例如賴氨酸)等形成的鹽；(ii)當(dāng)本發(fā)明的化合物含有一個(gè)堿性基團(tuán)，例如氨基時(shí)，可形成的藥學(xué)上可接受的酸加成鹽包括氫氯酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽等。“藥學(xué)上可接受的鹽”也指季銨鹽。在此情況下，可接受的鹽可以是氯化物、溴化物、碘化物、甲磺酸鹽、甲苯磺酸鹽、琥珀酸鹽等。
應(yīng)該理解本文提及本發(fā)明的化合物時(shí)也包括藥學(xué)上可接受的鹽。
“前體藥物”指在體內(nèi)可通過(guò)代謝(例如通過(guò)水解、還原或氧化)轉(zhuǎn)化成本發(fā)明化合物的化合物。例如含有一個(gè)羥基的本發(fā)明化合物的酯類藥物前體可在體內(nèi)通過(guò)水解轉(zhuǎn)化成母體分子。含有一個(gè)羥基的本發(fā)明化合物的合適的酯例如為乙酸酯、檸檬酸酯、乳酸酯、酒石酸酯、丙二酸酯、草酸酯、水楊酸酯、丙酸酯、琥珀酸酯、富馬酸酯、馬來(lái)酸酯、亞甲基-二-β-羥基萘甲酸酯、2，5-二羥基苯甲酸酯、羥乙基磺酸酯、二-對(duì)甲苯酰酒石酸酯、甲磺酸酯、乙磺酸酯、苯磺酸酯、對(duì)甲苯磺酸酯、萘二磺酸酯、環(huán)己基氨基磺酸酯和奎尼酸酯。作為另一個(gè)實(shí)例，含有一個(gè)羧基的本發(fā)明化合物的酯前體藥物可在體內(nèi)通過(guò)水解轉(zhuǎn)化成母體分子。酯前體藥物的實(shí)例為F.J.Leinweber，DrugMetab.Res.，1987，18，379所述的那些酯前體藥物。
應(yīng)該理解本文提及本發(fā)明的化合物時(shí)也包括前體藥物的形式。
“飽和的”涉及沒(méi)有任何碳-碳雙鍵或碳-碳叁鍵的化合物和/或基團(tuán)。
上述的環(huán)狀基團(tuán)，即芳基、雜芳基、環(huán)烷基和雜環(huán)烷基，可以被一個(gè)或多個(gè)取代基取代。合適的任選取代基包括?；?例如-COCH3)、烷氧基(例如-OCH3)、烷氧基羰基(例如-COOCH3)、烷基氨基(例如-NHCH3)、烷基亞磺?；?例如-SOCH3)、烷基磺?；?例如-SO2CH3)、烷硫基(例如-SCH3)、-NH2、氨基?；?例如-CON(CH3)2)、氨基烷基(例如-CH2NH2)、芳基烷基(例如-CH2Ph或-CH2-CH2-Ph)、氰基、二烷基氨基(例如-N(CH3)2)、鹵代、鹵代烷氧基(例如-OCF3或-OCHF2)、鹵代烷基(例如-CF3)、烷基(例如-CH3或-CH2CH3)、-OH、-CHO、-NO2、芳基(任選被烷氧基、鹵代烷氧基、鹵素、烷基或鹵代烷基取代)、雜芳基(任選被烷氧基、鹵代烷氧基、鹵素、烷基或鹵代烷基取代)、雜環(huán)烷基、氨基?；?例如-CONH2、-CONHCH3)、氨基磺?；?例如-SO2NH2、SO2NHCH3)、?；被?例如-NHCOCH3)、磺酰基氨基(例如-NHSO2CH3)、雜芳基烷基、環(huán)胺(例如嗎啉)、芳氧基、雜芳氧基、芳基烷氧基(例如苯甲氧基)和雜芳基烷氧基。
亞烷基或亞烯基可被任選取代。合適的任選取代基包括烷氧基(例如-OCH3)、烷基氨基(例如-NHCH3)、烷基亞磺?；?例如-SOCH3)、烷基磺?；?例如-SO2CH3)、烷硫基(例如-SCH3)、-NH2、氨基烷基(例如-CH2NH2)、芳基烷基(例如-CH2Ph或-CH2-CH2-Ph)、氰基、二烷基氨基(例如-N(CH3)2)、鹵代、鹵代烷氧基(例如-OCF3或-OCHF2)、鹵代烷基(例如-CF3)、烷基(例如-CH3或-CH2CH3)、-OH、-CHO和-NO2。
本發(fā)明化合物可以一種或多種幾何學(xué)、光學(xué)、對(duì)映體、非對(duì)映體和互變異構(gòu)的形式而存在，包括但不限于順式和反式、E式和Z式、R式、S式和內(nèi)消旋式、酮式和烯醇式。除非另有說(shuō)明，提及一種具體化合物時(shí)包括所有這類異構(gòu)形式，包括其外消旋混合物及其它混合物。在合適的情況下，所述異構(gòu)體可以通過(guò)實(shí)施或適用已知方法(例如色譜技術(shù)和重結(jié)晶技術(shù))從其混合物中分離出來(lái)。在合適的情況下，所述異構(gòu)體可通過(guò)實(shí)施或適用已知方法(例如不對(duì)稱合成)進(jìn)行制備。
G可以是式(V)-(VII)的任何一個(gè)的基團(tuán)或?yàn)闃渲罘肿?。?V)-(VII)的基團(tuán)的實(shí)例包括但不限于苯氧基苯基、聯(lián)苯基、聯(lián)吡啶基、乙二氨基、丙二氨基等。應(yīng)該理解為可能的連接點(diǎn)的數(shù)目由基團(tuán)體現(xiàn)的化合價(jià)決定，所以例如聯(lián)苯可以含有最高達(dá)10個(gè)可能的連接(每個(gè)苯環(huán)上5個(gè))，乙二氨基可以含有最高達(dá)4個(gè)可能的連接(每個(gè)末端胺上2個(gè))。適于用于本發(fā)明的樹枝狀分子的一個(gè)實(shí)例為
優(yōu)選某些化合物和取代基的結(jié)合。某些優(yōu)選情況在從屬權(quán)利要求中給出。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，每個(gè)M可以相同或不同并且為本文所定義的式(II)的基團(tuán)。在式(II)中，箭頭表示M到連接體L的連接點(diǎn)。優(yōu)選地，L為本文所定義的式(III)的一個(gè)基團(tuán)。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，化合物為式(I)的化合物。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，A為苯環(huán)。
在一實(shí)施方案中，R1為氰基，并且R2為氫原子。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，D為氧原子。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，基團(tuán)M具有下面所示的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)；
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，R6為鹵代烷基。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，Y1-Y5為碳原子。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，La為C(O)基。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，R7和Lb為鍵。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，W為基團(tuán)
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，W為基團(tuán)-N(R9A)-R8B-N(R9B)(R9C)-R8B-N(R9A)-。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，W為基團(tuán)-N(R9A)-R8B-N(R10B)C(＝NR10A)(NR10C)-R8B-N(R9A)-。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，W為基團(tuán)-N(R9A)-R8B-N(R9A)-R8B-N(R9A)--R8B-N(R9A)-。
在又一優(yōu)選實(shí)施方案中，R5為烷基。
在再一優(yōu)選實(shí)施方案中，R5為甲基。
在一實(shí)施方案中，R4為氫原子。
在另一實(shí)施方案中，R4為式(III)的基團(tuán)
優(yōu)選的本發(fā)明化合物包括實(shí)施例中的化合物，例如實(shí)施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、34、36、37和38中的化合物。
本發(fā)明化合物的治療效用適于已知至少部分通過(guò)人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的作用介導(dǎo)的任何疾病。例如，本發(fā)明化合物可能益于治療慢性阻塞性肺疾患(COPD)、囊性纖維化(CF)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、肺氣腫、肺炎和肺纖維化。
本發(fā)明也涉及含有本發(fā)明化合物作為活性成分的藥物制劑。其它化合物可與本發(fā)明化合物結(jié)合用于預(yù)防和治療肺的炎性疾病。因此本發(fā)明也涉及用于預(yù)防和治療肺的炎性疾病的藥物組合物，該藥物組合物含有治療有效量的本發(fā)明化合物和一種或多種其它治療劑。
適合與本發(fā)明化合物進(jìn)行結(jié)合治療的治療劑包括(1)皮質(zhì)類固醇，例如氟替卡松(fluticasone)、環(huán)索奈德(ciclesonide)或布地奈德(budesonide)；(2)β2-腎上腺素受體激動(dòng)劑，例如沙美特羅(salmeterol)、indacaterol或福莫特羅(formeterol)；(3)白細(xì)胞三烯調(diào)節(jié)劑，例如孟魯司特(montelukast)或普魯司特(pranlukast)；(4)毒蕈堿-3(M3)受體拮抗劑例如塞托溴胺(tiotropium bromide)；(5)在單個(gè)分子中同時(shí)具有M3受體拮抗劑和β2-腎上腺素受體激動(dòng)劑的支氣管擴(kuò)張劑；(6)磷酸二酯酶-IV(PDE-IV)抑制劑，例如羅氟司特(roflumilast)或西洛司特(cilomilast)；(7)鎮(zhèn)咳劑，例如可待因或右美沙芬(dextramorphan)；(8)非甾體類抗炎劑(NSAID)，例如布洛芬(ibuprofen)或酮洛芬(ketoprofen)；(9)激酶抑制劑，例如p38 MAP激酶抑制劑、IKK2抑制劑和(10)細(xì)胞因子和趨化因子的受體拮抗劑，例如IL-8、MCP-1、TNFα和IL-1β。
第一和第二活性成分的重量比可變化并取決于每種成分的有效劑量。通常，將使用每一種成分的有效劑量。
本發(fā)明化合物的預(yù)防性或治療性劑量的大小當(dāng)然會(huì)隨待治療病癥的嚴(yán)重程度情況和具體化合物及其給藥路徑而變化。它也隨各患者年齡、體重和反應(yīng)而變化。一般而言，日劑量范圍在每kg哺乳動(dòng)物體重約0.001mg-約100mg范圍內(nèi)，優(yōu)選每kg 0.01mg-約50mg，并且最優(yōu)選每kg0.1-10mg，其可為單個(gè)劑量或分開的劑量。另一方面，在某些情況下有必要使用所述范圍之外的劑量。
本發(fā)明的另一方面提供了含有一種本發(fā)明的化合物和一種藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。藥物組合物中的術(shù)語(yǔ)“組合物”，意欲包括含有一種或多種活性成分和組成載體的一種或多種惰性成分(藥學(xué)上可接受的賦形劑)的產(chǎn)品，以及由任何兩種或多種成分的結(jié)合、絡(luò)合或聚集、或由一種或多種成分的解離、或由一種或多種成分的其它類型的反應(yīng)或相互作用直接或間接產(chǎn)生的任何產(chǎn)品。因此，本發(fā)明的藥物組合物包括通過(guò)將一種本發(fā)明的化合物、其它一種或多種活性成分與藥學(xué)上可接受的賦形劑相混合而制得的任何組合物。
本發(fā)明的藥物組合物含有作為活性成分的一種本發(fā)明的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，并且還可含有一種藥學(xué)上可接受的載體和任選其它治療性成分。術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的鹽”指的是由藥學(xué)上可接受的無(wú)毒的堿或酸、包括無(wú)機(jī)堿或酸和有機(jī)堿或酸而制備的鹽。
可以使用將有效劑量的本發(fā)明化合物提供給哺乳動(dòng)物尤其是人類的任何適宜的給藥路徑。在治療性用途中，活性化合物可通過(guò)任何方便的、適宜的或有效的途徑給藥。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適宜的給藥路徑包括口服給藥、靜脈內(nèi)給藥、直腸給藥、腸胃外給藥、外用、眼部給藥、鼻腔給藥、口腔含化給藥和肺部給藥。優(yōu)選通過(guò)吸入送遞。
適宜通過(guò)吸入給藥的組合物是已知的，并且可包括已知的用于這類組合物的載體和/或稀釋劑。所述組合物可以含有0.01-99重量％的活性化合物。優(yōu)選地，單位劑量含有1μg-10mg量的活性化合物。
最適宜的劑量水平可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適宜方法確定。但是應(yīng)該理解的是，對(duì)任何具體患者的具體量取決于多種因素，包括所用具體化合物的活性、患者的年齡、體重、飲食、總體健康及性別、給藥時(shí)間、給藥路徑、排泄率、任何其它藥劑的使用及被治療的疾病的嚴(yán)重性。
對(duì)于吸入送遞，優(yōu)選微粒形式的活性化合物。它們可通過(guò)多種技術(shù)，包括噴霧干燥、冷凍干燥和微粉化作用進(jìn)行制備。
例如，本發(fā)明的組合物可制備成從噴霧器送遞的懸浮液或液體推進(jìn)劑(propellant)中的氣溶膠，以例如用于加壓的計(jì)量藥劑吸入器(doseinhaler)(PMDI)中。適于在PMDI中使用的推進(jìn)劑為技術(shù)人員所已知，包括CFC-12、HFA-134a、HFA-227、HCFC-22(CCI2F2)和HFA-152(CH4F2和異丁烷)。
在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物為干粉形式，以使用干粉吸入器(DPI)進(jìn)行送遞。DPI的許多類型為已知。
通過(guò)給藥送遞的微粒可用有助于送遞和釋放的賦形劑進(jìn)行配制。例如，在干粉制劑中，微?？捎幂o助從DPI流入肺部的大型載體粒子進(jìn)行配制。合適的載體粒子為已知，其中包括乳糖粒子；它們具有大于90μm的空氣動(dòng)力學(xué)質(zhì)量中值直徑(mass median aerodynamic diameter)。
在基于氣溶膠的制劑的情況下，優(yōu)選組合物為 本發(fā)明的化合物 24mg/罐 卵磷脂，NF液體濃液1.2mg/罐 三氯氟甲烷，NF4.025g/罐 二氯二氟甲烷，NF 12.15g/罐。
本發(fā)明的化合物可與其它用于治療/預(yù)防/抑制或改善疾病或病癥的藥物結(jié)合使用，本發(fā)明化合物對(duì)所述疾病或病癥有用。所述其它藥物可通過(guò)常規(guī)所用的量和路徑與本發(fā)明化合物同時(shí)或依次地進(jìn)行給藥。當(dāng)本發(fā)明化合物與一種或多種其它藥物同時(shí)使用時(shí)，優(yōu)選含有除本發(fā)明化合物外的所述其它藥物的藥物組合物。因此，本發(fā)明藥物組合物包括那些除本發(fā)明化合物外還含有一種或多種其它活性成分的藥物組合物。
本發(fā)明藥劑可以吸入形式進(jìn)行給藥。氣溶膠的生成可使用例如壓力驅(qū)動(dòng)的噴射霧化器(jet atomizers)或超聲霧化器來(lái)實(shí)施，優(yōu)選使用推進(jìn)劑驅(qū)動(dòng)的計(jì)量氣溶膠或者無(wú)推進(jìn)劑地給予來(lái)自例如吸入膠囊或其它“干粉”送遞系統(tǒng)的微粉化活性化合物。
所述活性化合物可根據(jù)所用吸入系統(tǒng)按所述方法給藥。除活性化合物外，給藥形式還另外含有賦形劑，例如推進(jìn)劑(例如在計(jì)量氣溶膠中的氟利昂)、表面活性物質(zhì)、乳化劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、調(diào)味劑、填料(例如粉末吸入劑中的乳糖)，或者如果合適，還含有其他活性化合物。
為吸入目的，許多體系可以產(chǎn)生最佳粒度的氣溶膠并使用適于患者的吸入技術(shù)進(jìn)行給藥。除使用適配器(間隔器、擴(kuò)張器)和梨形容器(例如Nebulator、Volumatic)及發(fā)射噴霧的自動(dòng)裝置(Autohaler)外，對(duì)于計(jì)量氣溶膠，特別是在粉末吸入劑的情況下，許多技術(shù)方案可用(例如Diskhaler、Rotaissk、Turbohaler或例如EP-A-0505321所述的吸入劑)。
本發(fā)明的化合物可根據(jù)以下方案和實(shí)施例的步驟，使用合適材料進(jìn)行制備，并且通過(guò)以下具體實(shí)施例作進(jìn)一步示例說(shuō)明。而且，通過(guò)利用所述步驟與本文的公開內(nèi)容，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可容易地制備本文所要求保護(hù)的本發(fā)明其它化合物。但是實(shí)施例中舉例的化合物不應(yīng)該理解為是本發(fā)明所考慮的唯一種類。實(shí)施例還說(shuō)明了制備本發(fā)明化合物的細(xì)節(jié)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地理解，對(duì)以下制備步驟的條件和方法的已知變化可用于制備這些化合物。
本發(fā)明的化合物可以其藥學(xué)上可接受的鹽例如上文所述的那些藥學(xué)上可接受的鹽的形式分離出來(lái)。對(duì)應(yīng)于所分離的鹽的游離酸形式可通過(guò)與一種合適的酸例如乙酸和氫氯酸中和并將游離酸萃取到有機(jī)溶劑中再進(jìn)行蒸發(fā)而生成。以該方式分離的游離酸形式可通過(guò)在有機(jī)溶劑中溶解、接著添加合適的堿、再蒸發(fā)、沉淀或結(jié)晶而進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成另一種藥學(xué)上可接受的鹽。
有必要保護(hù)用于制備本發(fā)明化合物的中間體中的反應(yīng)活性官能團(tuán)(例如羥基、氨基、硫基或羧基)，以免其不必要地參與到形成該化合物的反應(yīng)中?？梢允褂贸Ｒ?guī)保護(hù)基團(tuán)，例如T.W.Greene和P.G.M.Wuts在“Protective groups in organic chemistry”John Wiley andSons，1999中所述的那些保護(hù)基團(tuán)。
以下反應(yīng)方案說(shuō)明了如何制備本發(fā)明化合物、尤其是實(shí)施例的化合物。應(yīng)該理解為下面詳述的方法只為說(shuō)明本發(fā)明的目的，而不應(yīng)該理解為限制性的。利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的相似或類似的試劑和/或條件的方法也可用于獲得本發(fā)明化合物。
單體可用多種標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)方法連接在一起，例如與合適的雙官能連接分子在合適試劑和任選溶劑存在的情況下進(jìn)行反應(yīng)，方案1(路線A)。一個(gè)替代方法包括連接一個(gè)含有一個(gè)第二官能團(tuán)的間隔基團(tuán)，隨后連接一個(gè)二配位基連接分子，方案1(路線B)。二聚體的連接部分可在二聚后被改性。

方案1 對(duì)實(shí)施例化合物更具體而言，單體與合適的二胺或二醇的反應(yīng)可在堿和偶聯(lián)劑例如HATU并且任選有溶劑存在的情況下完成。單體與受保護(hù)的氨基醛(被保護(hù)為乙縮醛)在合適的堿與偶聯(lián)劑并且任選有溶劑存在的情況下進(jìn)行反應(yīng)，接著進(jìn)行脫保護(hù)，產(chǎn)生可與合適的二配位基物質(zhì)例如二胺進(jìn)行反應(yīng)的中間體，以生成本發(fā)明的化合物，方案2。


方案2 式(II)單體可根據(jù)WO2004024700、WO2004024701、GB2392910、WO200508263和WO2005082864中所述的方法制備為外消旋體。該單體可通過(guò)手性HPLC分離成其對(duì)映體?；蛘邌误w(作為羧酸)可通過(guò)與合適的手性堿例如降麻黃堿形成非對(duì)映體鹽而溶解(resolve)，接著進(jìn)行分級(jí)重結(jié)晶，方案3。
N-3可通過(guò)與合適的活化烷烴在合適的堿和任選有溶劑的存在下進(jìn)行烷基化而被功能化，所述合適的堿例如一種金屬氫化物。合適的離去基團(tuán)包括鹵素和磺酸鹽。類似地，單體的N-3可用?；u在相似條件下進(jìn)行?；?。該基團(tuán)(方案1-4中的R)可在隨后步驟中被進(jìn)一步改性。羧酸需要通過(guò)例如轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的烯丙酯而進(jìn)行預(yù)保護(hù)以防止不需要的副反應(yīng)。


方案3 在連接基中含有環(huán)狀胍部分的式(II)的化合物可根據(jù)方案4中概述的方法進(jìn)行制備。


方案4 季銨鹽形式的化合物可通過(guò)母體胺與合適活化烷烴的反應(yīng)而產(chǎn)生。合適的離去基團(tuán)包括鹵素和磺酸鹽。
以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了說(shuō)明。
一般實(shí)驗(yàn)的詳述 在產(chǎn)物用Isolute SPE Si II柱進(jìn)行純化時(shí)，“Isolute SPE Si柱”指的是含有非鍵合性活性二氧化硅的預(yù)填充的聚丙烯柱，所述二氧化硅為具有50μm平均尺寸和60標(biāo)稱孔隙率的不規(guī)則粒子。在使用IsoluteSCX-2柱時(shí)，“Isolute SCX-2柱”指的是含有非末端封閉的丙基磺酸功能化二氧化硅強(qiáng)陽(yáng)離子交換吸附劑的預(yù)填充的聚丙烯柱。所有溶劑和市售試劑均直接使用。HPLC純化后，將含產(chǎn)物的級(jí)分進(jìn)行合并并凍干從而得到白色或灰白色固體產(chǎn)物。在某些情況下，對(duì)于含有堿性中心的化合物，可獲得甲酸鹽形式的產(chǎn)物。
制備HPLC條件 HPLC體系1 C18反相柱(具有7μm粒子尺寸的100×22.5mm內(nèi)徑的Genesis柱)，用A水+0.1％甲酸；B乙腈+0.1％甲酸的梯度以5ml/min流速并且B按1％/min的梯度增加進(jìn)行洗脫。UV檢測(cè)波長(zhǎng)230nm。
HPLC體系2 苯基己基柱(具有5μm粒子尺寸的250×21.20mm的Luna柱)，用A水+0.1％TFA；B乙腈+0.1％TFA的梯度在5ml/min流速下進(jìn)行洗脫，UV檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。
HPLC體系3 直鏈淀粉三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)(具有5μm粒子尺寸的250×20mm的CHIRALPAK IA柱)用含乙醇(15％)的正庚烷+0.1％TFA的等度洗脫混合物在10ml/min流速下進(jìn)行洗脫，UV檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。
所用的液相色譜質(zhì)譜(LC/MS)體系 LC-MS方法1 具有C18反相柱(具有5μm粒子尺寸的100×3.0mm的HigginsClipeus)的Micromass Platform LCT，用A水+0.1％甲酸；B乙腈+0.1％甲酸進(jìn)行洗脫。梯度 檢測(cè)-MS、ELS、UV(100μl分流至具有在線UV檢測(cè)器的MS)。
MS電離方法-電噴霧(正離子)。
LC-MS方法2 具有C18反相柱(3μm粒子尺寸的30×4.6mm的Phenomenex Luna)的Micromass Platform LCT，用A水+0.1％甲酸；B乙腈+0.1％甲酸進(jìn)行洗脫。梯度 檢測(cè)-MS、ELS、UV(100μl分流至具有在線UV檢測(cè)器的MS)。
MS電離方法-電噴霧(正離子和負(fù)離子)。
LC-MS方法3: 具有C18反相柱(3μm粒子尺寸的30×4.6mm的Phenomenex Luna)的Waters Micromass ZQ，用A水+0.1％甲酸；B乙腈+0.1％甲酸進(jìn)行洗脫。梯度 檢測(cè)-MS、ELS、UV(100μl分流至具有在線UV檢測(cè)器的MS)。
MS電離方法-電噴霧(正離子和負(fù)離子)。
LC-MS方法4 具有C18反相柱(3μm粒子尺寸的30×4.6mm的Phenomenex Luna)的Waters Micromass ZMD，用A水+0.1％甲酸；B乙腈+0.1％甲酸進(jìn)行洗脫。梯度 檢測(cè)-MS、ELS、UV(100μl分流至具有在線UV檢測(cè)器的MS)。
MS電離方法-電噴霧(正離子和負(fù)離子)。
實(shí)驗(yàn)部分中所用的縮寫 DCM＝二氯甲烷 DCE＝1，1-二氯乙烷 DIPEA＝二-異丙基乙基胺 EDCI＝1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺氫氯化物 DMAP＝二甲基氨基吡啶 RT＝室溫 HATU＝O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯 TFA＝三氟乙酸 Rt＝保留時(shí)間 IMS＝工業(yè)用甲基化酒精 THF＝四氫呋喃 DMF＝N，N-二甲基甲酰胺 IPA＝異丙基醇 SPE＝固相萃取 SCX＝強(qiáng)陽(yáng)離子交換 中間體1
中間體1根據(jù)WO2004/024700進(jìn)行制備。
中間體2
將多磷酸(350g)懸浮于THF(1.9l)中并進(jìn)行機(jī)械攪拌，同時(shí)加入3-(三氟甲基)苯基脲(129g)、4-氰基苯甲醛(100g)和乙酰乙酸苯甲酯(121.3g)。將所得混合物在回流下加熱過(guò)夜。在減壓下蒸發(fā)掉大部分溶劑并且剩余物在水和EtOAc之間進(jìn)行分配。用水、K2CO3水溶液、水、鹽水洗滌有機(jī)相，干燥(Na2SO4)并蒸發(fā)。將剩余物與二乙基醚一起研磨從而得到黃色固體狀中間體2。
產(chǎn)量216.6g(70％) 1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ＝8.38(1H，d)、7.84(2H，m)、7.80-7.55(6H，m)、7.30(3H，m)、7.15(2H，m)、5.13(1H，d)、5.06(1H，d)、5.39(1H，d)、2.08(3H，s)。
中間體3
將中間體2(215g，0.54mol)懸浮于EtOAc(1.5l)中并添加IMS(500ml)。將該混合物浸入溫水浴(約40℃)中微熱直至均一，然后在氮?dú)夥障掠秘?fù)載在碳上的Pd(OH)2(20g，20％重量/重量，50％水分)進(jìn)行處理。密封并排空燒瓶然后將混合物在氫氣下攪拌，同時(shí)通過(guò)補(bǔ)充溫水浴而保溫。約4-6小時(shí)后，燒瓶被排空并將混合物通過(guò)“hyflo”進(jìn)行過(guò)濾。在真空下蒸發(fā)掉濾液并將剩余物與二乙醚一起研磨從而得到固體狀中間體3，該中間體直接用于下一步驟中。
中間體4
將中間體3(156.2g)懸浮于IPA(1500ml)中并用L-(-)-降麻黃堿進(jìn)行處理。該混合物變均一，然后開始沉淀固體。攪拌約6h后將固體過(guò)濾掉并用IPA洗滌并在過(guò)濾器上抽吸至盡可能干。將濾餅移出并溶解在最少量的熱IPA(約2.5l)中，然后在攪拌下冷卻過(guò)夜。過(guò)濾混合物并用IPA洗滌并干燥從而得到白色固體。將該白色固體在EtOAc和2M HCl之間進(jìn)行分配直至所有固體溶解。有機(jī)層用鹽水洗滌、干燥(Na2SO4)并蒸發(fā)從而得到無(wú)色泡沫狀中間體4(61.7g)。
產(chǎn)量61.7g(29％)。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ＝12.48(1H，br s)、8.32(1H，d)、7.88(2H，m)、7.79-7.54(6H，m)、5.36(1H，d)、4.03(2H，q)、2.05(3H，s)、1.18(3H，t)。
中間體4和5
用HPLC(體系3)將中間體3分離成其對(duì)映體。洗脫出的第一個(gè)對(duì)映體為中間體5。
中間體6
向中間體4(1.40g，3.49mmol)、1-氨基-2，3-二乙氧基丙烷(513mg，3.49mmol)和DIPEA(2.25g，17.45mmol)的DMF(50ml)溶液中加入HATU(1.592g，4.19mmol)。將該溶液在RT下靜置2h并蒸發(fā)掉DMF。剩余物在EtOAc(150ml)和飽和的NaHCO3水溶液(200ml)之間進(jìn)行分配。分離有機(jī)層并用EtOAc(2×150ml)進(jìn)一步萃取水相。合并的萃取液用水(200ml)、鹽水(100ml)洗滌、干燥(Na2SO4)并蒸發(fā)。將該粗產(chǎn)品在Isolute SPE Si II柱(20g)上用40-60％EtOAc的戊烷溶洗脫液然后用100％EtOAc洗脫以純化從而得到奶黃色固體。
產(chǎn)量1.59g(86％)。
LC-MS(方法3)Rt3.06min，m/z 553[MNa]+。
中間體7
用1M HCl(20ml)處理中間體6(1.59g，3.00mmol)的THF(20ml)溶液。將該溶液在RT下保持15min，然后真空蒸發(fā)THF。用水(100ml)稀釋混合物并用EtOAc(150ml)萃取產(chǎn)物。將有機(jī)層分離，用水(100ml)和鹽水(50ml)洗滌，干燥(Na2SO4)并蒸發(fā)。用Isolute SPE Si II柱(20g)色譜用60-100％EtOAc的戊烷溶液洗脫從而得到白色泡沫狀醛。
產(chǎn)量820mg(60％)。
LC-MS(方法2)Rt＝2.96min，m/z 457[MH]+。
中間體8
將中間體4(5.00g，12.47mmol)溶解在甲苯(250ml)中并加入乙二酰氯(1.30ml)。攪拌反應(yīng)混合物，同時(shí)加入催化量的DMF(25滴)。攪拌1h后，加入烯丙醇(1.81ml，31.18mmol)并將反應(yīng)混合物再攪拌2.5h。除去溶劑并將剩余物溶解在EtOAc(300ml)中。用飽和的NaHCO3水溶液(200ml)、水(200ml)和鹽水(100ml)洗滌溶液，干燥(Na2SO4)并蒸發(fā)從而得到淺黃色泡沫。
產(chǎn)量4.80g(87％)。
LC-MS(方法4)Rt 3.77min，m/z 442[MH]+。
中間體9
將中間體8(730mg，1.655mmol)溶解在DMF(15ml)中并將溶液在氬氣下冷卻至-10℃。加入氫化鈉(60％的礦物油分散體)(99mg，2.48mmol)并將反應(yīng)混合物攪拌10min，然后加入溴乙酸甲酯(279mg，1.821mmol)。攪拌1h后，通過(guò)添加飽和的NH4Cl水溶液(20ml)將反應(yīng)驟停。用EtOAc(2×150ml)萃取混合物并將合并的有機(jī)萃取液用鹽水(100ml)洗滌、干燥(Na2SO4)并蒸發(fā)。將粗產(chǎn)品在Isolute SPE Si II柱(10g)上用戊烷然后用30-35％的EtOAc的戊烷溶液洗脫從而進(jìn)行純化。得到白色泡沫狀產(chǎn)物。
產(chǎn)量612mg(72％)。
LC-MS(方法4)Rt 4.00min，m/z 514[MH]+。
中間體10
將中間體9(612mg，1.193mmol)和嗎啉(1ml，11.93mmol)溶解在THF(6ml)中并加入催化量的四(三苯基膦)化鈀(0)(10mg，0.008mmol)。將溶液在RT下在氮?dú)庀聰嚢?.5h并蒸發(fā)掉溶劑。將剩余物溶解在EtOAc(50ml)中并將溶液用1M HCl(50ml)、水(40ml)和鹽水(30ml)洗滌，干燥(Na2SO4)并蒸發(fā)從而得到淺黃色泡沫狀產(chǎn)物。
產(chǎn)量553mg(98％)。
LC-MS(方法4)Rt 3.35min，m/z 474[MH]+。
中間體11
根據(jù)Bartoli，S.；Jensen，K.B.；Kilburn，J.D.J.Org.Chem.(2003)68，9416-9422進(jìn)行制備。
中間體12
根據(jù)Bartoli，S.；Jensen，K.B.；Kilburn，J.D.J.Org.Chem.(2003)68，9416-9422進(jìn)行制備。
中間體13
將叔丁氧羰基-哌嗪(Boc-piperazine)(0.5g，2.69mmol)、1，2-二溴乙烷(253mg，1.34mmol)和NaHCO3(564mg，6.72mmol)的乙腈(20ml)溶液在90℃下加熱17h。冷卻至RT后，除去溶劑并將剩余物溶解在EtOAc(80ml)中。有機(jī)溶液用水(50ml)和鹽水(20ml)洗滌，干燥(Na2SO4)并蒸發(fā)從而得到白色固體狀中間體13。
產(chǎn)量426mg(80％)。
LC-MS(方法2)Rt 0.34/2.05min，m/z 399[MH+]。
中間體14
將哌嗪(144mg，1.68mmol)、3-(叔丁氧羰基-氨基)丙基溴(800mg，3.36mmol)和NaHCO3(722mg，8.4mmol)在乙腈(20ml)中在90℃下攪拌18h。除去溶劑并加入水(30ml)和EtOAc(60ml)，然后分離各層。對(duì)有機(jī)層進(jìn)行干燥(MgSO4)和蒸發(fā)。
產(chǎn)量588mg(88％)。
LC-MS(方法2)Rt 0.35/1.84min，401m/z[MH+]。
中間體15
將N-叔丁氧羰基哌嗪(2.0g，10.75mmol)、戊二醛(50％水溶液，1.08ml，5.37mmol)和三乙酰氧基硼氫化鈉(3.68g，17.2mmol)的DCE(30ml)溶液在RT下在氮?dú)庀聰嚢?h。對(duì)反應(yīng)混合物用飽和的NaHCO3水溶液進(jìn)行驟停，用EtOAc萃取，干燥(MgSO4)并蒸發(fā)從而得到無(wú)色油，該無(wú)色油靜置后即固化。
產(chǎn)量2.00g(42％)。
LC-MS(方法3)Rt 0.26/1.5min，441m/z[MH+]。
中間體16
將4，4-聯(lián)苯二羧酸(2.0g，8.3mmol)、N-叔丁氧羰基-哌嗪(3.38g，18.2mmol)、HATU(6.55g，18.2mmol)和DIPEA(9.4ml，55mmol)懸浮在DMF(30ml)中并在RT下攪拌30min。將混合物分成3份并且將每份混合物用微波在100℃下照射5min，然后將試樣重新合并，用二乙醚進(jìn)行稀釋并過(guò)濾。將固體用二乙醚洗滌并抽吸干從而得到灰白色粉末。
產(chǎn)量3.04g(63％)。
LC-MS(方法2)Rt 3.79min，579m/z[MH+]。
通過(guò)與合成中間體16所用的方法類似的方法用二酸和N-叔丁氧羰基-哌嗪制備以下化合物

1H-NMR(400MHz，MeOD)δ＝7.47(1H，d)；7.11(1H，d)；3.32-3.60(16h，br s)；1.41(18H，s)。
中間體22
將中間體15(1.0g，2.27mmol)溶解在DCM(4ml)中并加入TFA(4ml)。將混合物在RT下攪拌30min。除去溶劑并將剩余物溶于1∶1的DCM/MeOH中并上樣至SCX-2柱。用1∶1的DCM/MeOH洗滌然后用MeOH洗滌后，用2M的NH3的MeOH溶液將產(chǎn)物洗脫。除去溶劑。
產(chǎn)量676mg(100％(含溶劑))。
LC-MS(方法2)Rt 0.26min，241m/z[MH+]。
用類似于合成中間體22所用的方法制備以下化合物

實(shí)施例1
將中間體3(200mg，0.499mmol)、DMAP(65mg，0.533mmol)、EDC1(96mg，0.503mmol)和1，10-癸二醇(39mg，0.244mmol)溶解在DCM(2ml)中并將溶液攪拌17h。除去溶劑并將混合物通過(guò)HPLC純化(體系2)。
產(chǎn)量42mg(18％)。
LC-MS(方法1)Rt 15.45，m/z 941.13[MH]+。
實(shí)施例2
實(shí)施例2通過(guò)與實(shí)施例1所用的類似的方法由中間體3(100mg)和四甘醇進(jìn)行制備，并用HPLC進(jìn)行純化(體系2)。
產(chǎn)量62mg(56％)。
LC-MS(方法1)Rt 12.80min，m/z 961.17[MH+]。
實(shí)施例3
將中間體3(200mg，0.499mmol)、1，10-二氨基癸烷(39mg，0.227mmol)、DIPEA(87μl，0.500mmol)和HATU(190mg，0.500mmol)的乙腈(2ml)溶液在RT下攪拌17h。除去溶劑并將混合物通過(guò)HPLC純化(體系2)。
產(chǎn)量67mg(26％)。
LC-MS(方法1)Rt 12.64，m/z 939.30[MH]+。
實(shí)施例4
實(shí)施例4通過(guò)與實(shí)施例3的合成中所用的類似的方法由中間體3和4，9-二氧雜-1，12-十二烷二胺進(jìn)行制備。
產(chǎn)量58％。
LC-MS(方法1)Rt 11.30，m/z 971.20[MH]+。
實(shí)施例5
將中間體4(117g，0.292mmol)、3，3′-二氨基-N-甲基二丙基胺(21mg，0.146mmol)和DIPEA(254μl，1.46mmol)溶解在DMF(6ml)中。添加HATU(133mg，0.350mmol)并在RT下將溶液靜置2.5h。蒸發(fā)掉DMF并將剩余物溶解在EtOAc(100ml)中。用NaHCO3水溶液(60ml)、水(50ml)和鹽水(40ml)洗滌有機(jī)溶液。干燥(Na2SO4)后除去溶劑并將粗產(chǎn)品用HPLC(體系1)進(jìn)行純化。
產(chǎn)量38mg(14％)。
LC-MS(方法1)Rt 7.92min，m/z 912.23[MH+]。
用類似方法制備以下實(shí)施例


實(shí)施例15
實(shí)施例15的產(chǎn)物用類似于實(shí)施例5的合成中所用的方法由中間體10和3，3′-二氨基-N-甲基二丙基胺進(jìn)行制備。將粗產(chǎn)品溶解在MeOH中并上樣在用MeOH預(yù)處理過(guò)的SCX-2柱(10g)上。用MeOH沖洗該柱，然后用2M的NH3的MeOH溶液洗脫產(chǎn)品。得到淺黃色泡沫狀中間體15。
產(chǎn)量30％。
LC-MS(方法4)Rt 3.83min，m/z 1056[MH]+。
實(shí)施例16
實(shí)施例16的產(chǎn)物用與實(shí)施例5的合成中所用的類似的方法由中間體4和三乙撐四胺進(jìn)行制備。將粗產(chǎn)品在Isolute SPE Si II柱(10g)上用0-50％的MeOH的EtOAc溶液進(jìn)行洗脫并分離出白色固體而進(jìn)行純化。將少量試樣用HPLC(體系1)進(jìn)一步純化。
產(chǎn)率21％。
LC-MS(方法1)6.89min，m/z 913.05。
實(shí)施例17
將實(shí)施例15的產(chǎn)物(212mg，0.201mmol)用1M NaOH(25ml)和MeOH(15ml)進(jìn)行處理。將反應(yīng)混合物在RT下攪拌1.5h。將混合物用1M HCl(50ml)進(jìn)行酸化并用EtOAc(3×60ml)萃取。合并有機(jī)萃取液，用鹽水(50ml)洗滌，干燥(Na2SO4)。蒸發(fā)得到白色固體狀二酸。
產(chǎn)量115mg(56％)。
LC-MS(方法2)Rt 2.73min，m/z 1028[MH]+。
實(shí)施例18
實(shí)施例18的產(chǎn)物由實(shí)施例17的產(chǎn)物和4當(dāng)量的3，3′-二氨基-N-甲基二丙基胺用實(shí)施例5的合成中所用的條件進(jìn)行制備。用HPLC(體系1)進(jìn)行純化并得到實(shí)施例18的白色固體。
產(chǎn)率13％。
LC-MS(方法1)Rt 5.78min，m/z 1168.33[MH]+。
實(shí)施例19
將實(shí)施例15的產(chǎn)物(150mg，0.142mmol)溶解在DCM(20ml)中并加入碘甲烷(5ml)。將溶液在RT下靜置60h。蒸發(fā)掉揮發(fā)物。
產(chǎn)率定量的。
LC-MS(方法4)Rt 2.86min，m/z 1070[M]+。
實(shí)施例20
實(shí)施例20的產(chǎn)物用與實(shí)施例17的合成中所用的類似的方法由實(shí)施例19的產(chǎn)物進(jìn)行制備。通過(guò)與Et2O/DCM(5∶1)一起研磨進(jìn)行純化，得到淺黃色固體狀二酸。
產(chǎn)率80％。
LC-MS(方法4)Rt 2.74min，m/z 1042[M]+。
實(shí)施例21
實(shí)施例21的產(chǎn)物由實(shí)施例20的產(chǎn)物和4當(dāng)量的3，3′-二氨基-N-甲基二丙基胺用實(shí)施例5的合成中所用的條件進(jìn)行制備。用HPLC(體系1)進(jìn)行純化并得到實(shí)施例21的淺奶黃色固體。
產(chǎn)率4％。
LC-MS(方法1)Rt 5.96min，m/z 1182.07[M]+。
實(shí)施例22
將中間體7(82mg，0.180mmol)和1，7-二氨基庚烷(11mg，0.090mmol)溶解在DCE(4ml)中。向溶液中加入4分子篩和三乙酰氧基硼氫化鈉(43mg，0.203mmol)，并將反應(yīng)物在RT下攪拌1h。將混合物用DCE(20ml)稀釋并過(guò)濾。蒸發(fā)得到剩余物，該剩余物用HPLC(體系1)進(jìn)行純化得到白色固體。
產(chǎn)量10mg(5％)。
LC-MS(方法1)Rt 6.96min，m/z 1011.36[MH]+。
由類似方法用中間體7和所述二胺制備以下實(shí)施例

實(shí)施例31
將實(shí)施例16的產(chǎn)物(102mg，0.112mmol)溶解在DCM(10ml)中并加入1，1′-硫代羰基二吡啶酮(13mg，0.0559mmol)。將溶液加熱回流4h然后在RT下靜置3天。蒸發(fā)掉DCM并將剩余物在IsoluteSPE Si II柱(5g)上用0-10％的MeOH的EtOAc溶液洗脫從而進(jìn)行色譜分離。將含產(chǎn)物的級(jí)分合并，并通過(guò)Isolute SPE SCX-2柱進(jìn)行洗脫。蒸發(fā)得到白色固體。
產(chǎn)量66mg(78％)。
LC-MS(方法4)Rt 3.45min，m/z 955[MH]+。
實(shí)施例32
將實(shí)施例31的產(chǎn)物(66mg，0.0691mmol)和碘甲烷(2ml)溶解在IMS(6ml)中并將溶液在RT下靜置24h。蒸發(fā)掉揮發(fā)物并將剩余物溶解在2M的NH3的EtOH(5ml)溶液中。在50℃下將溶液加熱2h。之后將溶劑蒸發(fā)掉并將產(chǎn)物用HPLC(體系1)進(jìn)行純化。得到實(shí)施例32的白色固體。
產(chǎn)量12mg(19％)。
LC-MS(方法1)Rt 8.02min，m/z 938.05[MH]+。
實(shí)施例33
將中間體11(181mg，0.411mmol)溶解在20％TFA的DCM(20ml)溶液中并將溶液靜置3h，然后添加甲苯(50ml)，接著蒸發(fā)掉揮發(fā)物。將剩余物溶解在DMF(20ml)中并加入中間體4(329mg，0.903mmol)、DIPEA(1ml)和HATU(343mg，0.903mmol)。將溶液在RT下靜置1h然后蒸發(fā)溶劑。將剩余物溶解在EtOAc(100ml)中。將有機(jī)溶液用NaHCO3(60ml)水溶液、水(50ml)和鹽水(40ml)洗滌。干燥(Na2SO4)后，除去溶劑并將剩余膠質(zhì)與二乙醚一起研磨。通過(guò)色譜法在Isolute SPE Si II柱(10g)上用EtOAc然后用2-4％的MeOH的EtOAc溶液洗脫從而進(jìn)行進(jìn)一步純化，得到實(shí)施例33的白色固體。
產(chǎn)量190mg(46％)。
LC-MS(方法3)Rt 3.44min，m/z 1008[MH]+。
實(shí)施例34
用碳酸鉀(261mg，1.89mmol)的水(4ml)溶液對(duì)實(shí)施例33(190mg，0.189mmol)的MeOH(10ml)溶液進(jìn)行處理。攪拌30min后將溶液用水(70ml)稀釋并用EtOAc(100ml)萃取。將有機(jī)萃取液干燥(Na2SO4)和蒸發(fā)。用HPLC(體系1)進(jìn)行純化得到白色固體。
產(chǎn)量93mg(54％)。
LC-MS(方法1)Rt 8.07min，m/z 912.21[MH]+。
實(shí)施例35
實(shí)施例35的產(chǎn)物通過(guò)類似于實(shí)施例33的合成中所用的方法由中間體4和中間體12進(jìn)行制備。
產(chǎn)率70％。
LC-MS(方法4)Rt 3.61min，m/z 1036[M]+。
實(shí)施例36
實(shí)施例36的產(chǎn)物用類似于實(shí)施例34的制備中所用的方法由實(shí)施例35的產(chǎn)物進(jìn)行合成。用HPLC(體系1)進(jìn)行純化。
產(chǎn)率28％。
LC-MS(方法1)Rt 7.93min，m/z 940.15[MH]+。
實(shí)施例37
將實(shí)施例6的產(chǎn)物(131mg，0.144mmol)溶解在DCM(15ml)中并加入碘甲烷(4ml)。將反應(yīng)混合物靜置65h然后蒸發(fā)揮發(fā)物。用HPLC(體系1)純化混合物。
產(chǎn)量52mg(34％)。
LC-MS(方法1)Rt 7.88min，m/z 926.07[M]+。
實(shí)施例38
實(shí)施例38的產(chǎn)物用類似于實(shí)施例37的制備中所用的方法由實(shí)施例8的產(chǎn)物進(jìn)行合成。
產(chǎn)率31％。
LC-MS(方法1)Rt 7.98min，m/z 898.33[M]+。
彈性蛋白酶的抑制試驗(yàn) 對(duì)本發(fā)明各種化合物對(duì)HNE的抑制活性進(jìn)行試驗(yàn)。
熒光肽底物 在96孔板上以100μl的總試驗(yàn)體積進(jìn)行試驗(yàn)。酶(人類白細(xì)胞彈性蛋白酶，Sigma E8140)的終濃度為0.00036單位/孔。使用的肽底物(MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-ValAMC，Calbiochem #324745)的終濃度為100μM。試驗(yàn)緩沖液(0.05M Tris.HCl，pH 7.5，0.1MNaCl；0.1M CaCl2；0.0005％ brij-35)中DMSO的終濃度為1％。
酶促反應(yīng)通過(guò)添加酶而引發(fā)。酶促反應(yīng)在RT下進(jìn)行并在30分鐘后通過(guò)添加終濃度為50μg/孔的50μl大豆胰蛋白酶抑制劑(SigmaT-9003)而終止。熒光在使用380nm激發(fā)光和460nm發(fā)射光濾光片的FLEXstation(Molecular Devices)上讀取?；衔锏男苡?000nM-0.051nM范圍內(nèi)的一系列10個(gè)濃度進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果為兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，每個(gè)實(shí)驗(yàn)實(shí)施兩次。
試驗(yàn)的化合物顯示出具有的對(duì)HNE的IC50值在1-1000nM范圍內(nèi)。
使用熒光標(biāo)記的彈性蛋白 在96孔板上以100μl總試驗(yàn)體積進(jìn)行試驗(yàn)。酶(人類白細(xì)胞彈性蛋白酶，Sigma E8140)的終濃度為0.002單位/孔。使用的熒光標(biāo)記的、溶解的牛頸部韌帶彈性蛋白(Molecular Probes，E-12056)的終濃度為15μg/ml。試驗(yàn)緩沖液(0.1M tris-HCl，pH 8.0，含有0.2mM疊氮化鈉)中DMSO的終濃度為2.5％。
酶促反應(yīng)通過(guò)添加酶而引發(fā)。酶促反應(yīng)在RT下進(jìn)行并在120分鐘后讀數(shù)。熒光在使用485nm激發(fā)光和530nm發(fā)射光濾光片的FLEXstation(Molecular Devices)上讀取?；衔锏男苡?5000nM-1nM范圍內(nèi)的一系列10個(gè)濃度進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果為兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，每個(gè)實(shí)驗(yàn)實(shí)施兩次。
試驗(yàn)的化合物顯示出具有的對(duì)HNE的IC50值在1-1000nM范圍內(nèi)。
彈性蛋白酶選擇性試驗(yàn) 彈性蛋白酶抑制作用的選擇性通過(guò)對(duì)化合物對(duì)一組6個(gè)蛋白酶進(jìn)行試驗(yàn)來(lái)測(cè)定纖維蛋白溶酶、凝血酶、組織蛋白酶G、蛋白酶3、胰蛋白酶、糜蛋白酶(所有這些蛋白酶均源于Sigma，目錄號(hào)分別為P1867、T1063、C4428、P0615、T6424、C8949)。在96孔板上以100μl總試驗(yàn)體積進(jìn)行試驗(yàn)。將一種常規(guī)的通用底物用于所有蛋白酶終濃度為20μg/ml(組織蛋白酶G和糜蛋白酶)、10μg/ml(纖維蛋白溶酶和凝血酶)或5μg/ml(蛋白酶3和胰蛋白酶)的熒光標(biāo)記的酪蛋白(Molecular Probes，E-6639)。底物的終濃度接近于對(duì)該底物確定的各Km值。試驗(yàn)緩沖液(0.05M tris.HCl，pH 7.5，0.1M NaCl；0.1M CaCl2；0.0005％brij-35)中DMSO的終濃度為5％。酶促反應(yīng)通過(guò)添加酶而引發(fā)。酶促反應(yīng)在RT下進(jìn)行60min。熒光在使用589nm激發(fā)光和617nm發(fā)射光濾光片的FLEXstation(Molecular Devices)上讀取?；衔锏男苡?00μM-0.2μM范圍內(nèi)的一系列8個(gè)濃度進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果為兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，每個(gè)實(shí)驗(yàn)實(shí)施兩次。
試驗(yàn)的化合物顯示的對(duì)蛋白酶的選擇性范圍為1至＞300倍。
膜結(jié)合彈性蛋白酶 收集健康志愿者的血液。通過(guò)ficol密度離心法分離PMN并將紅血細(xì)胞溶解的低滲細(xì)胞用低聚甲醛/戊二醛固定并通過(guò)離心作用洗滌?；衔锉惶砑拥胶蠬BSS的溶液中(make up in HBSScontaining)并在37℃下與細(xì)胞培養(yǎng)5min。將熒光AAPV底物(Calbiochem #324745)加入到每個(gè)孔中形成100μl終體積并在37℃下用Spectramax Gemini Ex 380nm Em 460讀取平板30min。
發(fā)現(xiàn)在該試驗(yàn)中所檢查的本發(fā)明化合物展示出的IC50值小于100nM、優(yōu)選小于20nM。
細(xì)胞內(nèi)彈性蛋白酶(與溶解的細(xì)胞彈性蛋白酶對(duì)照) PMN按以上所述進(jìn)行分離。將PMN添加到96孔聚丙烯板中，并將DMSO或化合物添加到每個(gè)孔中從而達(dá)到150μl體積。將板在37℃下培育30min。細(xì)胞通過(guò)離心作用洗滌并用含有0.04％三硝基甲苯的HBSS溶液進(jìn)行溶解。將細(xì)胞碎片壓成丸并將上層清液轉(zhuǎn)移到具有化合物或DMSO的新板上。將熒光AAPV底物加入到所有孔中并在37℃下用Spectramax Gemini Ex380nm Em 460讀取平板30min。
中性粒細(xì)胞釋放的彈性蛋白酶活性試驗(yàn)(人、小鼠、豚鼠) 由豚鼠釋放的中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的產(chǎn)生 用LPS氣溶膠對(duì)豚鼠進(jìn)行處理。將動(dòng)物放置4小時(shí)，使之安樂(lè)死并灌洗肺以回收PMN。將支氣管肺泡灌洗液(BAL)在400g下旋轉(zhuǎn)10分鐘并將細(xì)胞在HBSS中再次懸浮。加入10μM細(xì)胞松馳素B至細(xì)胞懸浮液中并在37℃下培育5分鐘，其后再加入1μM fMLP再培育5分鐘。400g下將細(xì)胞離心分離10分鐘。將‘富含彈性蛋白酶的上層清液’轉(zhuǎn)移到新管中。
由小鼠中性粒細(xì)胞釋放的彈性蛋白酶的產(chǎn)生 將小鼠麻醉并用LPS i.n.進(jìn)行處理。將動(dòng)物放置4小時(shí)，使之安樂(lè)死并灌洗肺以回收PMN。將支氣管肺泡灌洗液(BAL)在400g下離心分離10分鐘并將細(xì)胞在1ml HBSS中再次懸浮。加入10μM細(xì)胞松馳素B至細(xì)胞懸浮液中并在37℃下培育5分鐘，其后再加入1μM fMLP再培育5分鐘。400g下將細(xì)胞離心分離10分鐘。將‘富含彈性蛋白酶的上層清液’轉(zhuǎn)移到新管中。
由人的中性粒細(xì)胞釋放的彈性蛋白酶的產(chǎn)生 將人的PMN按以上所述進(jìn)行分離。加入10μM細(xì)胞松馳素B至細(xì)胞懸浮液中并在37℃下培育5分鐘，其后再加入1μM fMLP再培育5分鐘。400g下將細(xì)胞離心分離10分鐘。將‘富含彈性蛋白酶的上層清液’轉(zhuǎn)移到新管中。
向一個(gè)底部干凈的96孔板中加入化合物并用‘富含彈性蛋白酶’的上層清液在37℃下培育5分鐘。將熒光AAPV底物加入到所有孔中并在37℃下用Spectramax Gemini Ex 380nm Em 460讀取平板30min。為進(jìn)行對(duì)比，也進(jìn)行人彈性蛋白酶的活性匹配對(duì)照。
HNE導(dǎo)致的大鼠肺出血 將人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(HNE)滴注入大鼠肺部導(dǎo)致急性肺損傷。該損傷程度通過(guò)測(cè)量肺出血進(jìn)行評(píng)估。
雄性Sprague Dawley大鼠(175-220g)由Harlan UK Ltd.處獲得，收到大鼠時(shí)全部進(jìn)行隔離飼養(yǎng)并證明不含所指明的微生物。稱重動(dòng)物并隨機(jī)指定處理小組(每組7-12個(gè)動(dòng)物)。
所用載體為1％的DMSO/鹽水。在加入0.9％的鹽水前將抑制劑溶解在1％的DMSO中。
每一個(gè)研究中的動(dòng)物用于確定通過(guò)各種路徑局部送遞至肺的彈性蛋白酶抑制劑的效力。用吸入麻醉劑異氟烷(4％)對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，此時(shí)在給藥人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(HNE)前30min-6h給予此劑量，或用hypnorm∶hypnovel∶水(1.5∶1∶2，以2.7ml/kg)進(jìn)行末端麻醉，此時(shí)在HNE給藥前30min內(nèi)給予前劑量并且用Penn Century微型噴霧器經(jīng)口腔進(jìn)行氣管內(nèi)(i.t.)給藥或通過(guò)將液體滴至鼻孔內(nèi)進(jìn)行鼻內(nèi)(i.n.)給藥。動(dòng)物接受的載體或化合物的劑量體積為0.5ml/kg。
在施用藥物之后恢復(fù)的動(dòng)物用hypnorm∶hypnovel∶水(1.5∶1∶2，以2.7ml/kg)進(jìn)行末端麻醉。一旦充分麻醉，將HNE(600單位/ml)或無(wú)菌鹽水以100μl的體積用Penn Century微型噴霧器經(jīng)口腔進(jìn)行氣管滴注給藥。將動(dòng)物在溫度可控盒內(nèi)保持溫暖并按所需給出至頂(top up)麻醉劑量以確保持續(xù)麻醉直至結(jié)束。
HNE攻擊后一個(gè)小時(shí)將動(dòng)物殺死(0.5ml-1ml戊巴比妥鈉)。暴露出氣管并在兩氣管環(huán)之間切一小切口以使插管(10號(hào)，外徑2-10mm，Portex Ltd.)朝肺部向氣管中插入約2cm。用棉花繃帶固定該插管位置。然后用4ml等分的新鮮肝素化(10單位/ml)磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)的將肺灌洗(BAL)三次。將所得BALF保持在冰上直至將其進(jìn)行離心分離。
將BALF在冷卻至4℃到10℃的離心機(jī)中在1000r.p.m.下離心分離10分鐘。棄掉上層清液并將細(xì)胞團(tuán)在1ml 0.1％CETAB/PBS中進(jìn)行再懸浮以溶解細(xì)胞。冰凍細(xì)胞溶解產(chǎn)物直至可對(duì)血液含量進(jìn)行分光光度分析。通過(guò)制備全大鼠血液的0.1％CETAB/PBS溶液來(lái)制備標(biāo)準(zhǔn)樣品。
一旦解凍，將100μl的每種溶解細(xì)胞懸浮液放置在96孔平底板的各孔中。對(duì)所有樣品試驗(yàn)兩次并將100μl 0.1％的CETAB/PBS放置在板上作為空白試驗(yàn)。用spectramax 250(Molecular devices)在415nm下測(cè)量每個(gè)孔內(nèi)含物的OD。
標(biāo)準(zhǔn)曲線通過(guò)測(cè)量不同濃度的血液的0.1％CETAB/PBS溶液(30、10、7、3、1、0.3、0.1μl/ml)的OD(415nm下)進(jìn)行繪制。
每個(gè)試驗(yàn)試樣中的血液含量通過(guò)同標(biāo)準(zhǔn)曲線比較進(jìn)行計(jì)算。然后按如下分析數(shù)據(jù) 1)計(jì)算兩次試驗(yàn)的平均OD， 2)從所有其它試樣值中減去空白試驗(yàn)值， 3)評(píng)估數(shù)據(jù)從而對(duì)分布的正常性進(jìn)行評(píng)價(jià)。
本發(fā)明化合物展示出具有所希望的HNE抑制活性。
權(quán)利要求
1.式(I)的化合物
M-L-M(I)
或者其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或其N-氧化物，
其中L為連接體并且每個(gè)M相互獨(dú)立地為式(II)的基團(tuán)
其中
A為芳基或雜芳基；
D為氧或硫；
R1、R2和R3獨(dú)立地各自為氫、鹵素、硝基、氰基、烷基、羥基或烷氧基，其中烷基和烷氧基還可被選自鹵素、羥基和烷氧基的一至三個(gè)相同或不同的基團(tuán)取代；
R4為氫、烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、烯氧基羰基、羥基羰基、氨基羰基、芳基羰基、雜芳基羰基、雜環(huán)烷基羰基、雜芳基、雜環(huán)烷基或氰基，其中烷基羰基、烷氧基羰基和氨基羰基還可被選自環(huán)烷基、羥基、烷氧基、烷氧基羰基、羥基羰基、氨基羰基、氰基、氨基、雜芳基、雜環(huán)烷基和三-(烷基)-甲硅烷基的一至三個(gè)相同或不同的基團(tuán)取代，并且其中雜芳基羰基、雜環(huán)烷基羰基、雜芳基和雜環(huán)烷基還可被烷基取代；或者
R4代表一個(gè)式(VIII)的基團(tuán)
其中
其中，R4A、R4B、R4D、R4E、R4G、R4H、R4I和R4J獨(dú)立地為氫或烷基，或者R4H和R4I可用其所連接的氮原子連接成環(huán)；
R4F為孤對(duì)電子，或R4F為烷基并且連于其上的氮原子為季氮原子并且?guī)в幸粋€(gè)正電荷；
R4C為孤對(duì)電子，或R4C為烷基并且連于其上的氮原子為季氮原子并且?guī)в幸粋€(gè)正電荷；或者R4C、R4D或R4E的任何兩個(gè)可用其所連接的氮原子連接成環(huán)，該環(huán)還任選包含選自氧或氮的另一個(gè)雜原子；
v1為1-3；
v2為1-6；
R5為烷基，該烷基可被選自鹵素、羥基、烷氧基、烯氧基、烷硫基、氨基、羥基羰基、烷氧基羰基和-O-(烷基)-O-(烷基)基團(tuán)的一至三個(gè)相同或不同的基團(tuán)取代；或者R5為氨基；
R6為鹵素、硝基、氰基、烷基、羥基或烷氧基，其中烷基和烷氧基還可被選自鹵素、羥基和烷氧基的一至三個(gè)相同或不同的基團(tuán)取代；并且
Y1、Y2、Y3、Y4和Y5相互獨(dú)立地各自為C或N，條件為包含它們的環(huán)含有不多于2個(gè)的N原子。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中A為苯基。
3.權(quán)利要求1的化合物，其中基團(tuán)M具有如下所示的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)。
4.上述任何一項(xiàng)權(quán)利要求的化合物，其中R1為氫。
5.上述任何一項(xiàng)權(quán)利要求的化合物，其中R2為-CN。
6.上述任何一項(xiàng)權(quán)利要求的化合物，其中R3為氫。
7.上述任何一項(xiàng)權(quán)利要求的化合物，其中R4為氫。
8.權(quán)利要求1-6中任何一項(xiàng)的化合物，其中R4為權(quán)利要求1定義的式(VIII)的一個(gè)基團(tuán)。
9.上述任何一項(xiàng)權(quán)利要求的化合物，其中R5為甲基。
10.上述任何一項(xiàng)權(quán)利要求的化合物，其中R6為三氟甲基。
11.上述任何一項(xiàng)權(quán)利要求的化合物，其中Y1、Y2、Y3、Y4和Y5均不為N。
12.上述任何一項(xiàng)權(quán)利要求的化合物，其中D為氧。
13.上述任何一項(xiàng)權(quán)利要求的化合物，其為式(IV)的一種化合物。
(M-L)t-G(IV)
其中t為2-20；并且
G為芳基、雜芳基、烷基、環(huán)烷基、氮、樹狀分子或式(V)-(VII)的任何一個(gè)基團(tuán)
其中
Ar為芳基或雜芳基；并且
u為2-20；
14.權(quán)利要求12的化合物，其中G為苯氧基苯基、聯(lián)苯基、聯(lián)吡啶基、乙二氨基、丙二氨基或樹狀分子。
15.上述任何一項(xiàng)權(quán)利要求的化合物，其中L為式(III)的基團(tuán)
-La-R7-Lb-W-Lb-R7-La-...(III)
其中
La為鍵或-C(O)-基；
Lb為鍵或-C(O)-基；
R7為鍵或亞烷基或亞環(huán)烷基；
W為鍵或選自以下的二價(jià)基團(tuán)
-(O-R8A)m1-O-
-N(R9A)-(O-R8A)m1-R8A-N(R9A)-
-N(R9A)-R8B-N(R9B)(R9C)-R8B-N(R9A)-
-N(R9A)-R8B-N(R10B)C(＝NR10A)(NR10C)-R8B-N(R9A)-
-N(R9A)-R8B-N(R9A)-
-N(R9A)-R8B-N(R9A)-R8B-N(R9A)-R8B-N(R9A)-
其中
m1為1-4；
R8A為亞烷基或亞環(huán)烷基；
R8B為亞烷基或亞環(huán)烷基，或者為一個(gè)式A2的基團(tuán)；
R9A為氫或烷基；
R9B或R9C中的一個(gè)為孤對(duì)電子，另一個(gè)為氫或烷基，或者R9B和R9C兩者均為烷基，在此情形下，連于其上的氮為季氮并且?guī)б粋€(gè)正電荷；或者R9B和R9C與連于其上的氮一起形成環(huán)；
R10A為氫或烷基；
R10B和R10C獨(dú)立地為氫或烷基，或者R10B和R10C被連接在一起形成環(huán)；
m2為1-3；
A1為-N(R9A)-R8-N(R9B)(R9C)-R8-N(R9A)-或-N(R9A)-R8-N(R10B)C(＝NR10A)(NR10C)-R8-N(R9A)-；并且
A2為以下基團(tuán)的一個(gè)
其中Ar1和Ar2相互獨(dú)立地為芳基或雜芳基。
16.權(quán)利要求14的化合物，其中每個(gè)La獨(dú)立地為-C(O)-或共價(jià)鍵。
17.權(quán)利要求16的化合物，其中La為基團(tuán)C(O)。
18.權(quán)利要求15-17中任何一項(xiàng)的化合物，其中R7和Lb包括一個(gè)鍵。
19.權(quán)利要求15-18中任何一項(xiàng)的化合物，其中W為
-N(R9A)-R8B-N(R9B)(R9C)-R8B-N(R9A)-。
20.權(quán)利要求15-18中任何一項(xiàng)的化合物，其中W為
-N(R9A)-R8B-N(R10B)C(＝NR10A)(NR10C)-R8B-N(R9A)-。
21.權(quán)利要求15-18中任何一項(xiàng)的化合物，其中W為
22.權(quán)利要求15-18中任何一項(xiàng)的化合物，其中W為
-N(R9A)-R8B-N(R9A)-R8B-N(R9A)-R8B-N(R9A)-。
23.權(quán)利要求15-18中任何一項(xiàng)的化合物，其中W為
24.權(quán)利要求15-18中任何一項(xiàng)的化合物，其中W為-N(R9B)(R9C)-。
25.上述任何一項(xiàng)權(quán)利要求的化合物，其中A為芳基或雜芳基；D為氧或硫；
R1、R2和R3獨(dú)立地各自為氫、鹵素、硝基、氰基、烷基、羥基或烷氧基，其中烷基和烷氧基還可被選自鹵素、羥基和烷氧基的一至三個(gè)相同或不同的基團(tuán)取代；
R4為氫、烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、烯氧基羰基、羥基羰基、氨基羰基、芳基羰基、雜芳基羰基、雜環(huán)烷基羰基、雜芳基、雜環(huán)烷基或氰基，其中烷基羰基、烷氧基羰基和氨基羰基還可被選自環(huán)烷基、羥基、烷氧基、烷氧基羰基、羥基羰基、氨基羰基、氰基、氨基、雜芳基、雜環(huán)烷基和三-(烷基)-甲硅烷基的一至三個(gè)相同或不同的基團(tuán)取代，并且其中雜芳基羰基、雜環(huán)烷基羰基、雜芳基和雜環(huán)烷基還可被烷基取代；或者
R4代表一個(gè)式(VIII)的基團(tuán)
其中，R4A、R4B、R4D、R4E、R4G、R4H、R4I和R4J獨(dú)立地為氫或烷基，或者R4H和R4I可用其所連接的氮原子連接成環(huán)；
R4F為孤對(duì)電子，或R4F為烷基并且連于其上的氮原子為季氮原子并且?guī)в幸粋€(gè)正電荷；
R4C為孤對(duì)電子，或R4C為烷基并且連于其上的氮原子為季氮原子并且?guī)в幸粋€(gè)正電荷；或者R4C、R4D或R4E的任何兩個(gè)可用其所連接的氮原子連接成環(huán)，該環(huán)還任選包含選自氧或氮的另一個(gè)雜原子；
v1為1-3；
v2為1-6；
R5為烷基，該烷基可被選自鹵素、羥基、烷氧基、烯氧基、烷硫基、氨基、羥基羰基、烷氧基羰基和-O-(烷基)-O-(烷基)基團(tuán)的一至三個(gè)相同或不同的基團(tuán)取代；或者R5為氨基；
R6為鹵素、硝基、氰基、烷基、羥基或烷氧基，其中烷基和烷氧基還可被選自鹵素、羥基和烷氧基的一至三個(gè)相同或不同的基團(tuán)取代，并且
Y1、Y2、Y3、Y4和Y5相互獨(dú)立地各自為C或N，條件為包含它們的環(huán)含有不多于2個(gè)的N原子；
26.權(quán)利要求1的化合物，如實(shí)施例1-38的任何一個(gè)中所定義。
27.權(quán)利要求1的化合物，如實(shí)施例1-17的任何一個(gè)中所定義。
28.權(quán)利要求1的化合物，如實(shí)施例7、8、16、18、21、32、34、36、37、38的任何一個(gè)中所定義。
29.上述任何一項(xiàng)權(quán)利要求的化合物，用于治療。
30.一種藥物組合物，含有一種權(quán)利要求1-28的任何一項(xiàng)的化合物和一種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
31.權(quán)利要求1-28的任何一項(xiàng)的化合物的用途，所述用途為生產(chǎn)用于治療選自哮喘、炎癥性腸病、慢性阻塞性肺疾患(COPD)、慢性支氣管炎、肺纖維化、肺炎、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、肺氣腫、吸煙導(dǎo)致的肺氣腫、結(jié)節(jié)病、支氣管擴(kuò)張或囊性纖維化(CF)的病癥的藥物。
32.權(quán)利要求31的用途，其中所述病癥為COPD。
33.權(quán)利要求31的用途，其中所述病癥為CF。
34.權(quán)利要求31的用途，其中所述病癥為潰瘍性結(jié)腸炎或Crohn氏疾病。
35.權(quán)利要求31-34的任何一項(xiàng)的用途，其中所述病癥為呼吸性疾病并且藥物經(jīng)由吸入路徑給藥。
全文摘要
式M-L-M(I)的一種化合物，其中L為連接體，并且每一個(gè)M獨(dú)立地為一個(gè)式(II)的基團(tuán)，該化合物對(duì)治療例如呼吸道疾病有效。
文檔編號(hào)A61K31/513GK101243055SQ200680030331
公開日2008年8月13日 申請(qǐng)日期2006年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月24日
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