液，第12孔加入 50yLPBS溶液作為陰性對(duì)照；在第1孔加入25yL被檢血清，充分混勻后移出25yL加至 第2孔，依次類推，倍比稀釋至第10孔，第10孔棄去25yL，設(shè)第11孔為病毒對(duì)照，第12孔 為紅細(xì)胞對(duì)照。在第1~11孔各加入25yL4單位抗原，輕叩反應(yīng)板，使反應(yīng)物混合均勻， 室溫下靜置30min。自右向左依次向各孔加入25yL1%的雞紅細(xì)胞懸液。將反應(yīng)板置于 微量振蕩器上振蕩lmin，室溫（20~25°C)靜置40min后觀察結(jié)果，紅細(xì)胞對(duì)照孔成明顯 的紐扣狀沉到孔底時(shí)即可判定結(jié)果。
[0073] 4 結(jié)果
[0074] 所有免疫組的HI抗體水平隨著時(shí)間逐漸升高，至免疫后28天，對(duì)照組未檢測(cè)到HI 抗體。重組多表位疫苗組的HI抗體滴度均超過7. 5,免疫組間不形成顯著差異（P> 0. 05)。 所有免疫組與PBS對(duì)照組形成極顯著差異（P< 0. 01)(見表3及圖9)。
[0075] 表3SPF雞免疫后不同時(shí)間段的HI抗體水平檢測(cè)
[0076]
[0077] 實(shí)施例八攻毒后排毒率檢測(cè)
[0078]IRNA提取于攻毒后第1天、3天、5天、7天、10天分別采集咽喉和泄殖腔棉拭 子，用RT-PCR方法檢測(cè)各組試驗(yàn)雞的排毒情況：將咽喉拭子和泄殖腔棉拭子分別放入盛有 ImL滅菌的0.OlmoL/LpH7.O~7. 4PBS(內(nèi)含青霉素2000IU/mL，鏈霉素2mg/mL)中，加蓋、 編號(hào)。按照Trizol試劑盒說明書提取各樣品病毒總RNA。
[0079] 2cDNA的合成體系RNA6yL加入隨機(jī)引物（10ymol/L)2yL、dNTP(10mmol/ Leach) 2yL、RNase抑制劑（RNasin) 0? 5yL(40U/yL)、AMV反轉(zhuǎn)錄酶 0? 5yL(5U/yL)及 5XRT緩沖液4ml，最后用DEPC水補(bǔ)至20yL。42°C反轉(zhuǎn)錄45分鐘，然后94°ClOmin。
[0080] 3PCR擴(kuò)增
[0081] 根據(jù)Genebank上已發(fā)表的基因VII型新城疫毒株的基因序列，用Primer5.O軟 件設(shè)計(jì)針對(duì)F特異性引物一對(duì)，上游引物Primerl:5'-TTGATGGCAGGCCTCTTGC-3'，下游引物 Primer2 :5' -GGAGGATGITGGCAGCAIT-3'，擴(kuò)增片段大小為 362bp。
[0082] 4PCR反應(yīng)體系內(nèi)含PI、P2 引物各IyL(10ymol/L)、dNTP2yL(10mmol/L)、 TaqDNA聚合酶IyL(5U/yL)、cDNA3yL、10XPCR緩沖液5yL，最后用雙蒸水補(bǔ)至50yL。 稍作離心后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR最佳反應(yīng)條件：95°C預(yù)變性5min，95°C變性30s，55°C退火 30s，72°C延伸 30s，循環(huán) 35cycles;最后 72°C延伸lOmin。
[0083] 5鑒別：進(jìn)行常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳，100v，30min凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果，在 362bp處可見明顯擴(kuò)增片段為陽(yáng)性結(jié)果，即排毒。
[0084] 6結(jié)果
[0085] 免疫后1天，只有對(duì)照組出現(xiàn)一只SPF雞排毒現(xiàn)象，未呈現(xiàn)明顯臨床癥狀。免疫后 三天，免疫組SPF雞開始排毒，除多表位疫苗140506組，其他三組均出現(xiàn)雞只排毒，活疫苗 組有2只免疫SPF雞出現(xiàn)咽喉排毒，1只泄殖腔排毒，多表位疫苗140505、140507組均出現(xiàn) 一只免疫SPF雞排毒。免疫后5天~7天，活苗組和多表位疫苗組各有一只SPF雞仍舊排 毒。免疫后10天，所有免疫組未發(fā)現(xiàn)排毒現(xiàn)象。整個(gè)攻毒期間，免疫組未表現(xiàn)為明顯的臨 床癥狀。對(duì)照組在免疫后3天全部雞只表現(xiàn)為明顯的臨床發(fā)病癥狀：腹瀉、呼吸困難、精神 不振、少食或不食。免疫后5天全部死亡（表4)。攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明所述的多表位 疫苗具有抵抗基因VII型新城疫病毒感染的效力。
[0086] 表4攻毒后各組棉拭子的病毒檢出結(jié)果
[0087]
[0088] 注：排毒率=排毒動(dòng)物數(shù)量/本實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物總量
[0089] 實(shí)施例九淋巴細(xì)胞增殖測(cè)定
[0090]1無(wú)菌免疫后7天、14天、21天、28天SPF雞外周抗凝血2mL，并與等體積的Hank's液輕輕混勻，將稀釋了的抗凝血緩慢加入含有4mL淋巴細(xì)胞分離液的離心管。常 溫下，2000rpm離心15min。用移液器小心轉(zhuǎn)移位于離心管中間的白色細(xì)胞層。用無(wú)菌 RPMI1640營(yíng)養(yǎng)液洗2遍，每分鐘1500rpm，離心，15min。臺(tái)盼藍(lán)染色，細(xì)胞統(tǒng)計(jì)，活細(xì)胞大 于90%后，用RPMI1640營(yíng)養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2. 5XIO6個(gè)/ml，加入到96孔板中，每孔 80yL，再加20yLPHA，每孔終體積為100yL。置于5% 0)2培養(yǎng)箱，39. 5°C培養(yǎng)44h后，每 孔加入20yL5.Omg/mLMTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，每孔加裂解液100yL，將細(xì)胞版置于微 量振蕩器上，振蕩5分鐘，使其完全溶解，在酶聯(lián)免疫儀上檢測(cè)570nm處的吸光值，作為T淋 巴細(xì)胞增殖的指標(biāo)。
[0091] 2 結(jié)果
[0092] 淋巴細(xì)胞增殖是反應(yīng)集體細(xì)胞免疫水平的一個(gè)重要指標(biāo)。細(xì)胞免疫可以通過致敏 淋巴細(xì)胞與相應(yīng)抗原作用而發(fā)揮病原體感染、抗腫瘤、協(xié)助B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體等作用。本 實(shí)驗(yàn)表明與陰性對(duì)照相比，多表位疫苗與活疫苗均具有增強(qiáng)淋巴增殖的作用，并且具有一 定的劑量效應(yīng)從表5可以看出，除免疫后7~14天，免疫組各時(shí)間點(diǎn)A57。值均顯著高于空 白對(duì)照組（P< 0. 05)，免疫組組間差異不明顯（P> 0. 05)。所有免疫組在首免后28天達(dá) 到高峰（表5及圖10)。結(jié)果表明本發(fā)明所述新城疫多表位疫苗能夠有效刺激細(xì)胞免疫，具 有增強(qiáng)淋巴細(xì)胞增殖的作用。
[0093] 表5雞外周血淋巴細(xì)胞增殖檢測(cè)
[0095] 注：同列數(shù)據(jù)后小寫字母不同者表示差異顯著（P<0? 05)
[0096] 實(shí)施例十雞外周血T細(xì)胞亞群動(dòng)態(tài)變化檢測(cè)
[0097] 1預(yù)處理取抗凝血0. 1ml，加8ml紅細(xì)胞裂解液，室溫作用10分鐘，1500r/min離 心10分鐘，棄上清液，加5mlPBS混懸，1500r/min離心10分鐘，重復(fù)2次。
[0098] 2熒光標(biāo)記FITC標(biāo)記大鼠抗小鼠單克隆抗y1 (0.Iyg)，4°C作用1小時(shí)，PBS緩 沖液洗1遍，將管底細(xì)胞用ImlPBS懸浮并測(cè)樣。
[0099] 3統(tǒng)計(jì)分析FACS檢測(cè)3000個(gè)細(xì)胞，所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)算其平均值。
[0100] 4 結(jié)果
[0101] 4. 1外周血⑶4+T淋巴細(xì)胞百分含量的變化重組多表位疫苗免疫組及活疫苗組 外周血CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)整體趨勢(shì)為隨免疫時(shí)間逐漸增加，到21天到達(dá)高峰，28天開始略 有下降。免疫后一周所有組間外周血⑶4+T淋巴細(xì)胞百分含量無(wú)顯著差異（P> 0. 05)，兩 周后所有免疫組外周血⑶4+T淋巴細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組細(xì)胞數(shù)異（P> 0. 05)，兩周后所 有免疫組外周血⑶4+T淋巴細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組細(xì)胞數(shù)（P< 0. 05)，多表位疫苗組與活 疫苗組外周血⑶4+T淋巴細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著差異（P> 0. 05)(表6及圖11)。
[0102] 表6疫苗免疫小鼠外周血⑶4+T淋巴細(xì)胞百分含量變化
[0103]
[0104] 4. 2外周血⑶8+T淋巴細(xì)胞百分含量的變化重組多表位疫苗免疫組及活疫苗組 外周血CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)整體趨勢(shì)為隨免疫時(shí)間逐漸增加，與CD4+T淋巴細(xì)胞百分含量變 化趨勢(shì)類似，到首免后21天到達(dá)高峰，28天開始略有下降。免疫后一周，140505多表位組 及對(duì)照組外周血⑶8+T淋巴細(xì)胞百分含量明顯低于其他免疫組，兩周后所有免疫組外周血 ⑶8+T淋巴細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組細(xì)胞數(shù)（P< 0. 05)，但多表位疫苗組與活疫苗組外周血 ⑶8+T淋巴細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著差異（P> 0. 05)(表7及圖12)。
[0105] 表7疫苗免疫小鼠外周血⑶8+T淋巴細(xì)胞百分含量變化
[0106]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基因VII型新城疫多表位疫苗融合蛋白，其氨基酸序列為SEQIDNo. 2。2. -種核酸分子，其編碼權(quán)利要求1項(xiàng)所述融合蛋白。3. -種載體，其含有權(quán)利要求2所述的核酸分子。4. 一種宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求3所述的載體。5. 權(quán)利要求2所述的核酸分子，其具體序列如下：〇6. -種用于預(yù)防基因VII型新城疫的疫苗，其包含權(quán)利要求1所述的融合蛋白以及藥 學(xué)上可接受的載體。7. 權(quán)利要求1所述的融合蛋白在制備重組基因VII型新城疫多表位疫苗中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種重組基因VII型新城疫多表位疫苗的制備與應(yīng)用。所述疫苗以基因VII型新城疫病毒主要囊膜糖蛋白：融合蛋白(F)、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白(HN)及核衣殼蛋白(NP)Th表位、CTL表位以及B細(xì)胞表位作為疫苗框架結(jié)構(gòu)，通過柔性linker連接，克隆入pRSETA載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)過發(fā)酵、純化、乳化等工藝，獲得具有理想免疫原性的新城疫多表位疫苗。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，重組基因VII型新城疫多表位疫苗不僅安全性良好，而且能夠激發(fā)有效的體液免疫與細(xì)胞免疫反應(yīng)。
【IPC分類】A61K39/17, A61P31/14, C12N1/21, C07K19/00, C12N15/62, C12N15/70
【公開號(hào)】CN105085686
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510470489
【發(fā)明人】齊春梅, 李殿明, 蒲勤, 張毓金, 田春輝, 劉甜甜, 任百亮, 張導(dǎo)春, 黨將將, 吳啟凡, 張曉丹
【申請(qǐng)人】青島紅橋明勤生物科技有限公司
【公開日】2015年11月25日
【申請(qǐng)日】2015年7月30日