專利名稱：一種獲取基因重組包涵體粗蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種獲取基因重組包涵體粗蛋白的 方法。
背景技術(shù)：
包涵體粗蛋白是大腸桿菌在高效表達(dá)外源基因時(shí)形成的由膜包裹的高密度、不溶 性蛋白質(zhì)顆粒。包涵體內(nèi)的蛋白是非折疊狀態(tài)的聚集體，不具有生物學(xué)活性，因此為了獲得 具有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)，應(yīng)用于生物工程、食品工程等，必須將包涵體溶解，進(jìn)行分離純 化，釋放出其中的蛋白質(zhì)，并進(jìn)行蛋白質(zhì)的復(fù)性。包涵體的形成為分離純化提供了非常便利 的條件，其純化步驟一般包括裂解細(xì)胞及回收包涵體、包涵體粗提取、溶解包涵體及變性蛋 白質(zhì)的純化。在裂解細(xì)胞時(shí)常由于細(xì)胞內(nèi)各種蛋白酶的釋放導(dǎo)致目的蛋白的降解，而降低 目的蛋白的獲取效率；包涵體的粗提取尚無規(guī)范的操作，粗純化效率也很低。而目的蛋白的 獲取更多依賴于最后的純化，由于前期的雜蛋白處理較粗糙，大量的雜蛋白與目的蛋白混 雜，使得目的蛋白的純化難度加大，甚至根本不能得到目標(biāo)蛋白的純品。本發(fā)明彌補(bǔ)了現(xiàn)有獲取基因重組包涵體粗蛋白存在的提純效率低的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有獲取基因重組包涵體粗蛋白存在的提純效率低的問題，而 提供了一種獲取基因重組包涵體粗蛋白的方法。本發(fā)明一種獲取基因重組包涵體粗蛋白的方法，包括以下步驟(1)獲取菌體沉淀將大腸桿菌表達(dá)外源基因后的培養(yǎng)液在4°C、6000_10000r/ min條件下離心15-30min，棄上清液，即獲取含有基因重組包涵體粗蛋白表達(dá)菌的菌體沉 淀；(2)超聲、裂解緩沖液洗滌將菌體沉淀以體積比為1 8-12重懸于裂解緩沖液 中，所述裂解緩沖液的組分為50mmol/L的Tris-Cl，IOOmmol/L的NaCl，lmmol/L的乙二胺 四乙酸，調(diào)裂解緩沖液的PH值為8. 0，然后在冰浴上超聲破菌，超聲波功率為200-300W， 每次持續(xù)時(shí)間為l_5s，兩次超聲間隔時(shí)間為l_5s，超聲循環(huán)100-300次，然后以轉(zhuǎn)速為 10000-12000r/min，離心 8-lOmin，獲取沉淀；上述步驟重復(fù)1次，獲取沉淀；(3)尿素洗滌將上述所得沉淀以體積比為1 8-12重懸于3-5mol/L的尿素液 中，混懸5-10min，10000-12000r/min條件下離心8-lOmin，獲取沉淀；上述步驟重復(fù)2次，獲取沉淀；(4)脫氧膽酸納洗滌上述獲取的沉淀以體積比為1 8-12重懸于3-5%的脫氧 膽酸納溶液中，混懸5-10min，7000-9000r/min條件下離心4_8min，獲取沉淀，即獲得包涵 體粗蛋白。本發(fā)明利用基因重組包涵體粗蛋白的抗剪切、屬于變性蛋白的特性，建立一種獲取基因重組包涵體粗蛋白的方法，使用該方法可大量減少其他非目的蛋白的混雜，包涵體 粗蛋白純度由25%左右升高到80%以上，為進(jìn)一步目的蛋白的純化奠定基礎(chǔ)；本發(fā)明方法 操作簡(jiǎn)便，成本低。


圖1為本發(fā)明一種獲取基因重組包涵體粗蛋白的方法的操作流程圖；圖2為Kringle5包涵體粗蛋白(纖溶酶原第五餅環(huán)區(qū)結(jié)構(gòu)域)經(jīng)粗純化后 SDS-PAGE檢測(cè)效果圖；圖3為gAd包涵體粗蛋白(脂聯(lián)素球狀結(jié)構(gòu)域)經(jīng)粗純化后SDS-PAGE檢測(cè)效果 圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1以pBV220-Kringle5質(zhì)粒載體(pBV220質(zhì)粒載體與纖溶酶原第五餅環(huán)區(qū)結(jié)構(gòu)域基 因體外基因重組獲得)在大腸桿菌JM109中表達(dá)后，獲取Kringle5包涵體粗蛋白的粗純化 步驟(1)獲取菌體沉淀大腸桿菌JM109在42°C表達(dá)Kringle5后的培養(yǎng)液在4°C、 10000r/min (也可以為6000r/min、8000r/min)條件下離心20min，棄上清獲取菌體沉淀；所得菌體沉淀SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖2的第1泳道所示，Kringle5蛋白占菌體 總蛋白的18.6% ；(2)超聲、裂解緩沖液洗滌將菌體沉淀以體積比為1 10(也可以是1 8、 1 12)重懸于裂解緩沖液，裂解緩沖液的組分為50mmol/L的Tris-Cl，100mmol/L的 NaCl，lmmol/L的乙二胺四乙酸，調(diào)裂解緩沖液的PH為8. 0，然后在冰浴上超聲破菌，功率為 250ff(也可以是200W、300W)，每次持續(xù)時(shí)間為3s (也可以是ls、5s)，兩次超聲間隔時(shí)間為 3s (也可以是ls、5s)，超聲循環(huán)200次(也可以是100次、300次)，然后以轉(zhuǎn)速為IOOOOr/ min (也可以是 11000r/min、12000r/min)，離心 IOmin (也可以是 8min、9min)，獲取沉淀；上述步驟重復(fù)一次，獲取沉淀；所得沉淀SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖2的第2泳道所示，Kringle5蛋白占菌體總蛋 白的24. 3% ；(3)尿素洗滌將上述所得沉淀以體積比為1 10(也可以是1 8、1 12)重 懸于4mol/L (也可以是3mol/L、5mol/L)的尿素液中，混懸8min (也可以是5min、IOmin)， 在 12000r/min (也可以是 10000r/min、11000r/min)條件下離心 8min (也可以是 9min、 IOmin)，獲取沉淀；上述步驟重復(fù)2次，獲取沉淀；所得沉淀SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖2的第3泳道所示，Kringle5蛋白占菌體總蛋 白的43. 2% ；(4)脫氧膽酸納洗滌上述獲取的沉淀以體積比為1 10(也可以是1 8、 1 12)重懸于3% (也可以是4%、5%)的脫氧膽酸納溶液中，混懸IOmin (也可以是5min、 8min)，8000r/min(也可以是 7000r/min、9000r/min)條件下離心 6min(也可以是 4min、8min)，獲取沉淀，即獲得包涵體粗蛋白；所得沉淀SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖2的第4泳道所示，Kringle5蛋白占菌體總蛋 白的81. 1%。實(shí) 施例2以pBV220_gAp質(zhì)粒載體(pBV220質(zhì)粒載體與脂聯(lián)素球狀結(jié)構(gòu)域基因體外基因重 組獲得)在大腸桿菌JM109中獲得表達(dá)后，制備脂聯(lián)素球狀結(jié)構(gòu)域(gAp)包涵體粗蛋白的 操作步驟(1)獲取菌體沉淀大腸桿菌JM109在42°C表達(dá)pBV220_gAp后的培養(yǎng)液在4°C、 80000r/min (也可以為6000r/min、10000r/min)條件下離心20min，棄上清獲取菌體沉淀；所得菌體沉淀SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖3的第1泳道所示，gAp蛋白占菌體總蛋白 的 15. 3% ；(2)超聲、裂解緩沖液洗滌將菌體沉淀以體積比為1 8(也可以是1 10、 1 12)重懸于裂解緩沖液，裂解緩沖液的組分為50mmol/L的TriS-Cl，100mmol/L的 NaCl，lmmol/L的乙二胺四乙酸，調(diào)裂解緩沖液的PH為8. 0，然后在冰浴上超聲破菌，功率為 200W(也可以是250W、300W)，每次持續(xù)時(shí)間為5s (也可以是ls、3s)，兩次超聲間隔時(shí)間為 Is (也可以是3s、5s)，超聲循環(huán)100次(也可以是200次、300次)；然后以轉(zhuǎn)速為IlOOOr/ min (也可以是 10000r/min、12000r/min)，離心 9min (也可以是 8min、IOmin)，獲取沉淀；上述步驟重復(fù)一次，獲取沉淀；所得沉淀SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖2的第2泳道所示，gAp蛋白占菌體總蛋白的 33. 5% ；(3)尿素洗滌將上述所得沉淀以體積比為1 8(也可以是1 10、1 12)重 懸于5mol/L (也可以是3mol/L、4mol/L)的尿素液中，混懸5min (也可以是8min、IOmin)， 在 11000r/min (也可以是 10000r/min、12000r/min)條件下離心 8min (也可以是 9min、 IOmin)，獲取沉淀；上述步驟重復(fù)2次，獲取沉淀；所得沉淀SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖2的第3泳道所示，gAp蛋白占菌體總蛋白的 46. 8% ；(4)脫氧膽酸納洗滌上述獲取的沉淀以體積比為1 12也可以是1 8、1 10) 重懸于4% (也可以是3%、5%)的脫氧膽酸納溶液中，混懸8min (也可以是5min、10min)， 9000r/min (也可以是 7000r/min、8000r/min)條件下離心 6min (也可以是 4min、8min)，獲
取沉淀，即獲得包涵體粗蛋白；所得沉淀SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖2的第4泳道所示，gAp蛋白占菌體總蛋白的 95. 2%。
權(quán)利要求
一種獲取基因重組包涵體粗蛋白的方法，其特征是包括以下步驟(1)獲取菌體沉淀將大腸桿菌表達(dá)外源基因后的培養(yǎng)液在4℃、6000-10000r/min條件下離心15-30min，棄上清液，即獲取含有基因重組包涵體粗蛋白表達(dá)菌的菌體沉淀；(2)超聲、裂解緩沖液洗滌將菌體沉淀以體積比為1∶8-12重懸于裂解緩沖液中，所述裂解緩沖液的組分為50mmol/L的Tris-Cl，100mmol/L的NaCl，1mmol/L的乙二胺四乙酸，調(diào)裂解緩沖液的PH值為8.0，然后在冰浴上超聲破菌，超聲波功率為200-300W，每次持續(xù)時(shí)間為1-5s，兩次超聲間隔時(shí)間為1-5s，超聲循環(huán)100-300次，然后以轉(zhuǎn)速為10000-12000r/min，離心8-10min，獲取沉淀；上述步驟重復(fù)1次，獲取沉淀；(3)尿素洗滌將上述所得沉淀以體積比為1∶8-12重懸于3-5mol/L的尿素液中，混懸5-10min，10000-12000r/min條件下離心8-10min，獲取沉淀；上述步驟重復(fù)2次，獲取沉淀；(4)脫氧膽酸納洗滌上述獲取的沉淀以體積比為1∶8-12重懸于3-5％的脫氧膽酸納溶液中，混懸5-10min，7000-9000r/min條件下離心4-8min，獲取沉淀，即獲得包涵體粗蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種獲取基因重組包涵體粗蛋白的方法，屬于生物化學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域，是為了解決現(xiàn)有包涵體純化法存在的提純效率低的問題。包括獲取含有基因重組包涵體粗蛋白表達(dá)菌的菌體沉淀；超聲、裂解緩沖液洗滌；尿素洗滌；脫氧膽酸納洗滌。本發(fā)明利用基因重組包涵體粗蛋白的抗剪切、屬于變性蛋白的特性，建立一種獲取基因重組包涵體粗蛋白的方法，使用該方法可大量減少其他非目的蛋白的混雜，包涵體粗蛋白純度由25％左右升高到80％以上，為進(jìn)一步目的蛋白的純化奠定基礎(chǔ)；本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)便，成本低。
文檔編號(hào)C07K1/14GK101880312SQ20101020220
公開日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2010年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月13日
發(fā)明者張?zhí)旃? 牛勃, 解軍, 趙榮瑞, 陳顯久 申請(qǐng)人:山西醫(yī)科大學(xué)