S1基因和tm-1基因重組腺病毒的構(gòu)建方法及重組腺病毒和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種S1基因和TM?1基因重組腺病毒的構(gòu)建方法及重組腺病毒和應(yīng)用，從IBV H52株和MG S6株中分別擴(kuò)增出S1基因和TM?1基因，將獲得的目的基因克隆到穿梭載體pDC315?MCS?EGFP中，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC315?S1?TM?1?EGFP與腺病毒大骨架pBHGlox(delta)E1,3Cre共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，重組并包裝獲得含有S1基因和TM?1基因的重組腺病毒pBH?S1?TM?1?EGFP；本發(fā)明用于免疫雞以預(yù)防雞傳染性支氣管炎和慢性呼吸道病，將此重組腺病毒免疫雞后，雞的抗體水平得到顯著提高，且對(duì)雞產(chǎn)生有效的保護(hù)作用。
【專利說明】
S1基因和TM-1基因重組腺病毒的構(gòu)建方法及重組腺病毒和 應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于基因生物工程領(lǐng)域，設(shè)及構(gòu)建重組腺病毒的方法，具體說，是一種利用 IBV S1基因和MG TM-1基因重組腺病毒的構(gòu)建方法及重組腺病毒和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 雞傳染性支氣管炎(Avian infectious bronchitis, IB)是由雞傳染性支氣管炎 病毒(Avian infectious bronchitis virus,IBV)引起的雞的一種急性、高度接觸性、傳染 性呼吸道疾病，是世界禽類的主要呼吸道傳染性疾病之一。雞慢性呼吸道?。–hronic respiratoiy disease,C畑）是由雞毒支原體(Mycoplasma Gallisepti州m,MG)感染引起的 接觸性、慢性呼吸道傳染病。CRD主要引起產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋量下降，蛋的品質(zhì)降低，飼料轉(zhuǎn)化率降 低，常給養(yǎng)雞業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前市場(chǎng)上的疫苗W弱毒苗和滅活苗為主，雖然它們 在一定程度上可W預(yù)防和控制上述兩種疫病，但其各自都存在著一定的缺陷。基因工程苗 同時(shí)具備弱毒苗和滅活苗的優(yōu)勢(shì)，又能克服二者不足;此外，二聯(lián)苗還可W減少對(duì)動(dòng)物免疫 接種時(shí)的應(yīng)激并節(jié)約成本，達(dá)到一苗多防的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種S1基因和TM-1基因重組腺病毒的構(gòu)建方 法及重組腺病毒和應(yīng)用，將IBV的主要的免疫保護(hù)性基因（S1基因）和MG的膜外蛋白基因 (TM-1基因）與腺病毒載體系統(tǒng)高效穩(wěn)定表達(dá)外源基因的特性結(jié)合起來(lái)，構(gòu)建出能夠表達(dá)上 述基因的重組腺病毒，分別檢測(cè)免疫雞后機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的兩種抗體水平，通過免疫攻毒保護(hù) 試驗(yàn)檢測(cè)其免疫保護(hù)效果，評(píng)價(jià)研制的預(yù)防IB和CRD的二聯(lián)基因工程活載體疫苗。
[0004] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種S1基因和TM-1基因重組 腺病毒的構(gòu)建方法，包括W下步驟：
[0005] 1)從IBV冊(cè)2株和MG S6株中分別擴(kuò)增出S1基因序列GI:EU817497.1和TM-1基因序 列GI:S65869.1;
[0006] 所述的S1基因和TM-1基因的擴(kuò)增包括：WSl-F沈Q ID NO.巧日S1-R沈Q ID N0.2 為引物，WIBV的RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增獲得S1基因；WTM-1-F沈Q ID N0.3和TM-1-R SEQ ID NO. 4為引物，WMG的DNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得TM-1基因；
[0007] 2)分別將S1基因和TM-1基因亞克隆到腺病毒穿梭載體質(zhì)粒PDC315-MCS-EGFP上，獲 得重組穿梭質(zhì)粒PDC31日-S1-TM-1-EGFP;
[000引 3)將重組穿梭質(zhì)粒PDC315-S1-TM-1-EGFP與腺病毒大骨架質(zhì)粒地HGlox(delta化1， 3Cre共轉(zhuǎn)染肥K293細(xì)胞，重組并包裝獲得重組腺病毒地H-S1-TM-1-EGFP。
[0009] 所述的IBV S1基因和MG TM-1基因重組腺病毒的構(gòu)建方法制備的重組腺病毒。
[0010] 所述的IBV S1基因和MG TM-1基因重組腺病毒的構(gòu)建方法制備的重組腺病毒在預(yù) 防IB和CRD中的應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明的有益效果是:分別將IBV和MG的免疫保護(hù)性基因 SI基因和TM-1基因與腺 病毒載體系統(tǒng)高效穩(wěn)定表達(dá)外源基因的特性結(jié)合起來(lái)，構(gòu)建出能夠表達(dá)上述基因的重組腺 病毒地H-S1-TM-1-EGFP，籍此研制同時(shí)預(yù)防IB和CRD兩種傳染病的二聯(lián)基因工程活載體疫 苗。通過對(duì)免疫雞的兩種抗體水平檢測(cè)和免疫攻毒試驗(yàn)，評(píng)價(jià)了重組腺病毒的免疫效果。研 究結(jié)果表明，免疫重組腺病毒pBH-Sl-TM-1-EGFP的維雞，21日齡后兩種抗體均可達(dá)到有效 抗體水平(〇〇4〇5>0.49)，且可產(chǎn)生與市場(chǎng)弱毒疫苗的免疫保護(hù)作用相當(dāng)，甚至更優(yōu)。本發(fā)明 研制出一種預(yù)防IB和CRD的二聯(lián)基因工程活載體疫苗。
【附圖說明】
[001^ 圖1是S1基因 RT-PCR/PCR擴(kuò)增結(jié)果(M:DL2502 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1:S1基因 RT-PCR 產(chǎn)物；2: pMD-Sl質(zhì)粒PCR產(chǎn)物）。
[001引圖2是TM-1基因 PCR擴(kuò)增結(jié)果(M:DL2003 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；基因 PCR產(chǎn)物； 2: pMD-TM-1 質(zhì)粒PCR產(chǎn)物）。
[0014] 圖3是PDC315-S1-TM-1-EGFP質(zhì)粒雙酶切結(jié)果（M:DL2502 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1: pDC3i日-S1-TM-1-EGFP經(jīng)EcoR I和Nhe I的雙酶切產(chǎn)物；2:pDC3i日-S1-TM-1-EGFP經(jīng)Sal I和 Xmal I的雙酶切產(chǎn)物）。
[0015] 圖4是腺病毒在肥K293細(xì)胞中的重組與包裝(A:正常肥K293細(xì)胞圖；B:正常肥K293 細(xì)胞巧光顯微鏡下圖；C:轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后C陽(yáng)圖；D:轉(zhuǎn)染HEK293后C陽(yáng)巧光圖）。
[0016] 圖5是重組腺病毒感染肥K293細(xì)胞（X 100) (A:正常肥K293細(xì)胞圖；B:巧光顯微鏡 下正常肥K293細(xì)胞圖；C:重組腺病毒pBH-Sl-TM-1-EGFP感染肥K293細(xì)胞圖；D:重組腺病毒 地H-S1-TM-1-EGFP感染肥K293細(xì)胞巧光圖）。
[0017] 圖6是重組腺病毒pBH-Sl-TM-1-EGFP的S1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果(M:DL2502 DNA分子 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1:別基因 RT-PCR產(chǎn)物）。
[0018] 圖7是重組腺病毒pBH-Sl-TM-1-EGFP的TM-1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果(M:DL2003 DNA分 子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1: TM-1基因 RT-PCR產(chǎn)物）。
[0019] 圖8是Western Blot檢測(cè)在重組腺病毒感染肥K293細(xì)胞后S1蛋白和TM-1蛋白的表 達(dá)情況。
[0020] 圖9是化ISA檢測(cè)雞免疫IB疫苗后的抗體水平情況。從14日齡開始，免疫pBH-Sl- TM-1-EGFP和IBV弱毒疫苗的雞抗體水平分別與免疫pBH-EGFP的對(duì)照組雞抗體水平差異極 顯著；自28日齡開始，免疫pBH-Sl-TM-1-EGFP的雞抗體水平與IBV弱毒疫苗免疫的雞抗體水 平差異極顯著。
[0021] 圖10是化ISA檢測(cè)雞免疫M(jìn)G疫苗后的抗體水平情況。從14日齡開始，免疫pBH-Sl- TM-1-EGFP和MG弱毒疫苗的雞抗體水平分別與免疫地H-EGFP的對(duì)照組雞抗體水平顯著性差 異；自從21日齡開始，免疫pBH-Sl-TM-1-EGFP和MG弱毒疫苗的雞抗體水平分別與免疫pBH- EGFP的對(duì)照組雞抗體水平差異極顯著;免疫P冊(cè)-S1-TM-1-EGFP的雞抗體水平與MG弱毒疫苗 免疫的雞抗體水平始終無(wú)顯著性差異。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明：
[0023] 雞傳染性支氣管炎（IB)和雞慢性呼吸道病(CRD)是嚴(yán)重威脅養(yǎng)雞業(yè)的雞的重要的 呼吸道傳染病。目前市場(chǎng)上的疫苗W弱毒苗和滅活苗為主，雖然它們?cè)谝欢ǔ潭壬峡蒞預(yù) 防和控制上述疫病，但其各自都存在著一定的缺陷?；蚬こ堂缤瑫r(shí)具備弱毒苗和滅活苗 的優(yōu)勢(shì)，又能克服二者不足;此外，二聯(lián)苗還可W減少對(duì)動(dòng)物免疫接種時(shí)的應(yīng)激并節(jié)約成 本，達(dá)到一苗多防的目的。腺病毒載體相比其他載體具有明顯的優(yōu)勢(shì)，國(guó)內(nèi)外均有很多W腺 病毒為載體制備疫苗的報(bào)道，目前腺病毒載體系統(tǒng)已經(jīng)相當(dāng)成熟。對(duì)IBV和MG的研究也已相 當(dāng)清晰，有報(bào)道利用其它活載體研制IB或CRD的基因工程疫苗，且免疫攻毒試驗(yàn)證實(shí)對(duì)雞有 一定的保護(hù)作用，因此，本發(fā)明利用雞傳染性支氣管炎病毒的S1基因和雞毒支原體TM-1基 因構(gòu)建重組腺病毒pBH-Sl-TM-1-EGFP，籍此研制預(yù)防IB和CRD兩種傳染病的二聯(lián)基因工程 活載體疫苗。
[0024] 本發(fā)明S1基因和雞MG TM-1基因構(gòu)建重組腺病毒pBH-Sl-TM-1-EGFP的方法，包括 W下步驟：
[0025] 1)IBV S1和MG TM-1基因片段的擴(kuò)增與T-A克?。?br>[0026] 2)構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒 PDC315-TM-1-S1-GFP;
[0027] 3)在肥K293細(xì)胞中重組和包裝病毒地H-S1-TM-1-EGFP。
[0028] 具體包括步驟如下：
[0029] 1)從IBV冊(cè)2株和MG S6株中分別擴(kuò)增出S1基因序列GI:EU817497.1和TM-1基因序 列GI:S65869.1;
[0030] 所述的S1基因和TM-1基因的擴(kuò)增包括：WSl-F沈Q ID NO.巧日S1-R沈Q ID N0.2 為引物，WIBV的RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增獲得S1基因；WTM-1-F沈Q ID N0.3和TM-1-R SEQ ID NO. 4為引物，WMG的DNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得TM-1基因；
[0031] 2)分別將S1基因和TM-1基因亞克隆到腺病毒穿梭載體質(zhì)粒PDC31日-MCS-EGFP上，獲 得重組穿梭質(zhì)粒PDC31日-S1-TM-1-EGFP;
[0032] 3)將重組穿梭質(zhì)粒PDC31日-S1-TM-1-EGFP與腺病毒大骨架質(zhì)粒地HGlox(delta化1， 3Cre共轉(zhuǎn)染肥K293細(xì)胞，重組并包裝獲得重組腺病毒地H-S1-TM-1-EGFP。
[0033] 如所述的IBV S1基因和MG TM-1基因重組腺病毒的構(gòu)建方法制備的重組腺病毒。
[0034] 如所述的IBV S1基因和MG TM-1基因重組腺病毒的構(gòu)建方法制備的重組腺病毒在 預(yù)防IB和CRD中的應(yīng)用。
[0035] 也就是說:分別從IBV冊(cè)2株和MG S6株中擴(kuò)增出目的基因；將目的基因經(jīng)T-A克隆 至PMD19-T載體上;經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定后與穿梭載體PDC315-MCS-EGFP連接;利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 法將重組腺病毒穿梭質(zhì)粒PDC315-S1-TM-1-EGFP與腺病毒大骨架地HGlox(del化化1，3Cre共 轉(zhuǎn)染肥K293細(xì)胞，經(jīng)PCR、Western blot鑒定重組腺病毒;重組腺病毒純化后，經(jīng)TCID50方法 測(cè)定重組腺病毒的滴度;將重組腺病毒和市場(chǎng)弱毒疫苗分別免疫雞，ELISA檢測(cè)免疫雞抗 體，免疫攻毒檢測(cè)免疫雞的發(fā)病率和死亡率，評(píng)價(jià)研制二聯(lián)疫苗免疫雞的效果。
[0036] 下面結(jié)合具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明：
[0037] 1材料與方法
[003引 1.1 S1基因和TM-1基因的擴(kuò)增
[0039]接種IBV冊(cè)2株于9日齡雞胚，收集的雞胚尿囊液，利用化izol法提取病毒RNA。根 據(jù)GenBank中IBV冊(cè)2的S1基因序列化U817497.1)設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增目的基因片 段。收集接種到PPLO液體培養(yǎng)基中的MG S6株菌體，利用飽和酪-氯仿抽提法提取MG DM;根 據(jù)GenBank中MG TM-1基因序列（S65869.1)設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段。別基因引物和 TM-1基因引物見表1(劃線部分為酶切位點(diǎn)，斜體部分為Kozak序列，加粗部分為6X化s)，Sl 基因的PCR反應(yīng)體系見表2，TM-1基因的PCR反應(yīng)體系見表3。
[0040] 表1擴(kuò)增S1和TM-1基因片段的引物序列
[0041]
[0044] 注：反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C，預(yù)變性5min; {94°C，變性30s ; 62°C，退火40s ; 72°C，延伸 Imin}共32個(gè)循環(huán)，72°C延伸lOmin。
[0045] 表3 TM-1基因 PCR反應(yīng)體系
[0046]
[004引注：反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C，預(yù)變性5min; {94°C，變性30s ; 55 °C，退火35s ; 72°C，延伸 Imin}共30個(gè)循環(huán)，72°C延伸lOmin。
[0049] 1.2重組穿梭腺病毒載體的構(gòu)建
[0050] 將獲得的S1基因和TM-1基因先后與穿梭載體PDC315-MCS-EGFP用相應(yīng)的酶進(jìn)行雙 酶切(酶切反應(yīng)體系見表5、表6)，再將其用T4連接酶16 °C連接12h (反應(yīng)體系見表7)。經(jīng)菌液 PCR、酶切及測(cè)序鑒定，篩選出正確的重組穿梭質(zhì)粒PDC315-S1-TM-1-EGFP。
[0051 ] 表5酶切反應(yīng)體系
[0化2]
[0055]表7 T4連接酶連接體系
[0化6]
[0化引1.3腺病毒的重組與包裝
[0059] 取脂質(zhì)體12.0化，并將其與化g腺病毒穿梭質(zhì)粒PDC315-S1-TM-1-EGFP和化g腺病毒 大骨架質(zhì)粒地HGlox(delta化1，3化e混勻，共轉(zhuǎn)染肥K293細(xì)胞，使其在肥K293細(xì)胞中重組與 包裝14d左右，收集CPE細(xì)胞，反復(fù)凍融并收集病毒，凍存-80°C。
[0060] 將收集的重組腺病毒接種到正常的肥K293細(xì)胞，觀察細(xì)胞病變情況及巧光顯微鏡 觀察細(xì)胞巧光情況。通過提取病毒基因組試劑盒提取重組腺病毒的DNA，并進(jìn)行PCR檢測(cè)目 的基因；收集重組腺病毒感染4她后的皿K293細(xì)胞，然后通過western blot檢測(cè)S1蛋白和 TM-1蛋白的表達(dá)情況。
[0061 ] 1.4重組腺病毒滴度的測(cè)定
[0062] 利用腺病毒純化試劑盒，將重組腺病毒純化，再根據(jù)TCIDso法檢測(cè)重組腺病毒的滴 度。
[0063] 1.5 ELISA檢測(cè)免疫雞的抗體水平
[0064] 選取SPF雞120只，隨機(jī)分組6組，20只/組;分別設(shè)置地H-S1-TM-1-EGFP(a)組、P冊(cè)- Sl-TM-1-EGFP(b)組、IB弱毒疫苗組、MG弱毒疫苗組、pBH-EGFP(對(duì)照1)組和地H-EGFP(對(duì)照 2)組。7日齡進(jìn)行首免，2舊齡二免，點(diǎn)眼免疫接種106TCID5〇/mL，期間，每7天進(jìn)行一次翅下 靜脈采集血并分離血清。利用化ISA試劑盒檢測(cè)免疫雞不同時(shí)間的抗體水平。
[00化]1.6免疫保護(hù)試驗(yàn)
[0066] 分別對(duì)pBH-Sl-TM-1-EGFP(a)組、IB弱毒疫苗組、pBH-EGFP(對(duì)照1)組進(jìn)行接種強(qiáng) 毒IBV;分別對(duì)pBH-Sl-TM-1-EGFP(b)組、MG弱毒疫苗組、地H-EGFP(對(duì)照2)組進(jìn)行接種強(qiáng)毒 MG;統(tǒng)計(jì)雞的發(fā)病率與死亡率。
[0067] 2結(jié)果與分析
[006引 2.1 S1基因和TM-1基因的RT-PCR與PCR擴(kuò)增結(jié)果
[0069] 利用根據(jù)GenBank中S1基因序列設(shè)計(jì)的S1基因引物對(duì)提取IBV的RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò) 增，經(jīng)測(cè)序，獲得大小為1650bp左右的預(yù)期片段;T-A克隆獲得PMD-S1質(zhì)粒，同樣利用設(shè)計(jì)的 S1基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)測(cè)序，獲得大小為1650bp左右的預(yù)期目的片段(見圖1)。
[0070] 利用根據(jù)GenBank中TM-1基因序列設(shè)計(jì)的TM-1基因引物對(duì)提取MG的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，經(jīng)測(cè)序，獲得大小為804bp左右的預(yù)期片段;T-A克隆獲得PMD-TM-1質(zhì)粒，同樣利用設(shè)計(jì) 的TM-1基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)測(cè)序，獲得大小為804bp左右的預(yù)期目的片段(見圖2)。
[0071] 2.2擴(kuò)增的SI基因與TM-1基因測(cè)序結(jié)果分析
[0072] 將測(cè)序后的S1基因和TM-1基因的核巧酸序列分別與GenBank中S1基因核巧酸序列 化U817497.1)和TM-1基因核巧酸序列（S65869.1)進(jìn)行Blast對(duì)比分析，S1基因序列的同源 性達(dá)98%，TM-1基因序列的同源性達(dá)100%，且均無(wú)堿基缺失和插入。
[0073] 2.3腺病毒重組穿梭質(zhì)粒PDC315-S1-TM-1-EGFP雙酶切結(jié)果
[0074] 利用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶EcoR巧日Nhe I對(duì)腺病毒重組穿梭質(zhì)粒PDC315-S1-TM-1- EGFP進(jìn)行雙酶切鑒定，經(jīng)測(cè)序，獲得大小為1650bp左右的預(yù)期片段；同樣，利用設(shè)計(jì)的限制 性內(nèi)切酶Sal I和Xmal I對(duì)腺病毒重組穿梭質(zhì)粒PDC315-S1-TM-1-EGFP進(jìn)行雙酶切鑒定，經(jīng) 測(cè)序，獲得大小為804bp左右的預(yù)期片段(見圖3)。
[0075] 2.4腺病毒骨架和穿梭質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞結(jié)果
[0076] 利用脂質(zhì)體將腺病毒大骨架分別與重組穿梭質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染皿K293細(xì)胞，經(jīng)過14d左 右培養(yǎng)后，對(duì)皿K293細(xì)胞進(jìn)行觀察，細(xì)胞逐漸出現(xiàn)腫大、變圓，呈葡萄串狀，脫離細(xì)胞培養(yǎng)皿 等細(xì)胞病變，在巧光顯微鏡下經(jīng)過藍(lán)光激發(fā)，可看到細(xì)胞呈現(xiàn)綠色巧光，證明分別包裝出重 組腺病毒地H-S1-TM-1-EGFP(見圖4)。
[0077] 2.5包裝完成的重組腺病毒感染HEK293細(xì)胞結(jié)果
[0078] 將包裝完成的原代(Po代）重組腺病毒分別感染正常皿K293細(xì)胞，出現(xiàn)細(xì)胞腫大、 變圓，呈葡萄串狀，脫離細(xì)胞培養(yǎng)皿等細(xì)胞病變，在巧光顯微鏡下通過藍(lán)光激發(fā)，可看到細(xì) 胞呈現(xiàn)綠色巧光;未感染細(xì)胞狀態(tài)正常，且在巧光顯微鏡下觀察不到細(xì)胞及綠色巧光(見圖 5)。
[00巧]2.3重組病毒的目的基因檢測(cè)
[0080] 對(duì)包裝好的重組腺病毒提取DNA，分別利用設(shè)計(jì)的S1基因和TM-1基因引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并對(duì)目的基因序列進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果顯示：分別在1650bp左右和804bp左右處出現(xiàn) 與預(yù)期片段大小一致的目的條帶(見圖6、圖7)。
[0081 ] 2.6 Western blot檢測(cè)S1蛋白和TM-1蛋白表達(dá)的結(jié)果
[0082] Western Blot結(jié)果顯示：重組腺病毒pBH-Sl-TM-1-EGFP在約90邸a處出現(xiàn)特異性 條帶，與預(yù)期S1蛋白分子質(zhì)量大小相當(dāng)；pBH-Sl-TM-1-EGFP在約29KDa處出現(xiàn)特異性條帶， 與預(yù)期TM-1蛋白分子質(zhì)量大小相當(dāng)；pBH-Sl-TM-1-EGFP和pBH-EGFP在約43邸a處均出現(xiàn)特 異性條帶，與預(yù)期內(nèi)參β-actin蛋白分子質(zhì)量大小相當(dāng)（見圖8)。
[0083] 2.7重組病毒的滴度測(cè)定結(jié)果
[0084] 對(duì)純化濃縮后的重組腺病毒作倍比稀釋后感染肥K293細(xì)胞，感染7d后，根據(jù)KaBer 法進(jìn)行計(jì)算陽(yáng)性孔比率，現(xiàn)憶其滴度為1〇w'875TCID5〇/血。
[0085] 2.8 ELISA檢測(cè)結(jié)果
[0086] 根據(jù)化ISA試劑盒說明書，利用分離的血清檢測(cè)其抗體OD405。
[0087] 從14日齡開始，免疫pBH-Sl-TM-1-EGFP和IBV弱毒疫苗的雞抗體水平分別與免疫 pBH-EGFP的對(duì)照組雞抗體水平差異極顯著；自28日齡開始，免疫pBH-Sl-TM-1-EGFP的雞抗 體水平與IBV弱毒疫苗免疫的雞抗體水平差異極顯著。（見圖9)。
[0088] 從14日齡開始，免疫pBH-Sl-TM-1-EGFP和MG弱毒疫苗的雞抗體水平分別與免疫 pBH-EGFP的對(duì)照組雞抗體水平有顯著性差異；自從21日齡開始，免疫地H-S1-TM-1-EGFP和 MG弱毒疫苗的雞抗體水平分別與免疫地H-EGFP的對(duì)照組雞抗體水平差異極顯著;免疫pBH- Sl-TM-1-EGFP的雞抗體水平與MG弱毒疫苗免疫的雞抗體水平始終無(wú)顯著性差異(圖10)。
[0089] 從21日齡開始兩種抗體均可達(dá)到有效抗體水平(0D>0.49)(見圖9、圖10)。
[0090] 2.9免疫保護(hù)結(jié)果
[0091] 攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示：IBV強(qiáng)毒攻毒后，pBH-Sl-TM-1-EGFP免疫組保護(hù)率為90%，弱 毒IBV疫苗組保護(hù)率為85% (見表8);強(qiáng)毒MG攻毒后，pBH-Sl-TM-1-EGFP免疫組保護(hù)率為 80%，弱毒MG疫苗組保護(hù)率為85% (見表9)。
[0092] 表8強(qiáng)毒IBV攻毒雞的免疫保護(hù)結(jié)果
[0093]
[0096] 3 結(jié)論
[0097] 3.1從IBV冊(cè)2株和MG S6株中分別擴(kuò)增出S1基因和TM-1基因，并分別成功連接到 PMD19-T載體上，分別獲得pMD-別和pMD-TM-1克隆質(zhì)粒。
[009引 3.2成功獲得重組穿梭質(zhì)?？?〔315-51-了1-1斗6尸口。
[0099] 3.3成功獲得重組腺病毒98護(hù)51-了1-1斗6。？;且重組腺病毒能夠很好的表達(dá)51蛋 白和TM-1蛋白。
[0100] 3.4收獲的重組腺病毒98護(hù)51-了1-1斗6。?滴度為：10心8呵(：1050/1^，符合后續(xù)動(dòng) 物試驗(yàn)的所需的滴度要求。
[0101] 3.5構(gòu)建的重組腺病毒免疫雞的抗體水平及免疫效果與弱毒疫苗相當(dāng)，甚至更優(yōu)。
[0102] 本發(fā)明的創(chuàng)新之處在于，首次將IBV的主要的免疫保護(hù)性基因（S1基因）和MG的膜 外蛋白基因（TM-1基因）與腺病毒載體系統(tǒng)高效穩(wěn)定表達(dá)外源基因的特性結(jié)合起來(lái)，構(gòu)建出 能夠表達(dá)上述基因的重組腺病毒，分別檢測(cè)免疫雞后機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的兩種抗體水平，并通過 免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)檢測(cè)了其免疫保護(hù)效果，成功研制了預(yù)防IB和CRD的二聯(lián)基因工程活載 體疫苗。
[0103] W上所述的實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明的技術(shù)思想及特點(diǎn)，其目的在于使本領(lǐng)域內(nèi) 的技術(shù)人員能夠理解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)W實(shí)施，不能僅W本實(shí)施例來(lái)限定本發(fā)明的專利范 圍，即凡本發(fā)明所掲示的精神所作的同等變化或修飾，仍落在本發(fā)明的專利范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種S1基因和TM-1基因重組腺病毒的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 從IBV H52株和MG S6株中分別擴(kuò)增出S1基因序列GI:EU817497.1和TM-1基因序列 GI：S65869.1； 所述的S1基因和TM-1基因的擴(kuò)增包括：以S1-FSEQIDN0.1和S1-RSEQIDN0.2為引 物，以IBV的RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增獲得S1 基因；以TM-1-F SEQ ID N0.3和TM-1-R SEQ ID NO. 4為引物，以MG的DNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得TM-1基因； 2) 分別將S1基因和TM-1基因亞克隆到腺病毒穿梭載體質(zhì)粒pDC315-MCS-EGFP上，獲得重 組穿梭質(zhì)粒 pDC315-Sl-TM-1-EGFP; 3) 將重組穿梭質(zhì)粒pDC315-Sl-TM-1-EGFP與腺病毒大骨架質(zhì)粒pBHGlox El，3Cre共轉(zhuǎn)染 HEK293細(xì)胞，重組并包裝獲得重組腺病毒pBH-Sl-TM-1-EGFP。2. 如權(quán)利要求1所述的S1基因和TM-1基因重組腺病毒的構(gòu)建方法制備的重組腺病毒。3. 如權(quán)利要求1所述的S1基因和TM-1基因重組腺病毒的構(gòu)建方法制備的重組腺病毒在 預(yù)防雞傳染性支氣管炎和雞慢性呼吸道病中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K39/215GK106011087SQ201610622267
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年7月28日
【發(fā)明人】金天明, 張東超, 弓建芳, 高珂珂, 李小慧, 林靜, 孟佳麗, 尚翠玲, 李昕
【申請(qǐng)人】天津農(nóng)學(xué)院