專利名稱：新的基因重組體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組人免疫缺陷病毒載體及其生產(chǎn)方法。更具體地講，本發(fā)明涉及新的重組人免疫缺陷病毒載體，該載體可用于由CD4陽性細(xì)胞引起的疾病的基因治療，還涉及生產(chǎn)這種載體的方法。
獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)是由人免疫缺陷病毒(HIV)感染所引起的疾病，其中細(xì)胞免疫性被明顯損害，并因此誘發(fā)各種機(jī)遇性感染、淋巴瘤、神經(jīng)疾病等?，F(xiàn)階段用于治療HIV的藥物為被稱為核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的藥物，如疊氮胸苷(AZT)、2′，3′-雙脫氧肌苷(ddI)、2′，3′-雙脫氧胞苷(ddC)等，這些藥物被單獨(dú)使用或組合使用。不過，這類藥物不能清除已被感染的細(xì)胞。而且，還會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重問題，包括有效的骨髓抑制、諸如消化性疾病的嚴(yán)重副作用、出現(xiàn)耐藥性病毒等。因此，迫切需要開發(fā)出新型藥物，它具有較高的效力、幾乎沒有副作用或耐藥性。
“基因治療”是指一種全新的疾病治療方法，通過被導(dǎo)入體內(nèi)的外源基因的表達(dá)可以起到藥物的作用。預(yù)計(jì)，基因療法能有效治療所有的因基因異常所致的先天性或獲得性疾病。具體地講，預(yù)計(jì)該基因療法能很好地應(yīng)用于治療癌癥和AIDS之類的致命性疾病，迄今還沒有建立治療這類疾病的方法。在美國，已開始嘗試用基因療法治療遺傳性疾病〔腺苷脫氨酶(ADA)缺陷、低密度脂蛋白(LDL)受體缺陷、囊性肺纖維化等〕和癌癥(腦瘤、惡性黑素瘤等)。近年來，已就基因療法在治療病毒感染性疾病(以AIDS為代表)方面進(jìn)行了大量的基礎(chǔ)研究。
可用于用藥物基因?qū)IDS進(jìn)行基因治療的有前途的候選方法包括這樣一種方法，其中用諸如TAR或RRE誘餌之類的RNA誘餌抑制似乎能促進(jìn)HIV復(fù)制的Tat或Rev[Sullenger B.A.，等，Cell，63，601(1990)]；HIV的mRNA或DNA與反義寡核苷酸雜交的方法[Chatteriee S.等，Science，258，1485(1992)]；用核酶裂解HIV的RNA的方法[Stevelo K.M.
等，Virology，190，176(1992)]；以及通過反顯性突變抑制HIV復(fù)制必需的蛋白的功能的方法[Hope T.J.等，J.Virol.，66，1849(1992)]。盡管HIV的復(fù)制機(jī)理被熟練地應(yīng)用于此類治療系統(tǒng)，但要求使藥物基因的表達(dá)超過HIV的復(fù)制。因此，尚需要進(jìn)一步的研究，以開發(fā)出有助于基因更有效地表達(dá)的啟動(dòng)子。
近來，已對能夠把非毒性藥物前體轉(zhuǎn)化成毒性藥物的酶基因的導(dǎo)入進(jìn)行了研究。當(dāng)在細(xì)胞中通過磷酸化修飾成三磷酸時(shí)，將9-(1，3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤〔即一種鳥苷類似物；9-(1，3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤，以下簡稱為GCV〕摻入DNA中類似的常見核堿基處。隨后馬上終止該DNA在細(xì)胞中的延伸，由此導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在形成三磷酸的磷酸化作用中需要兩種類型的酶。首先，用胸苷激酶催化GCV的單磷酸化，這種酶源于一種病毒，僅見于病毒感染細(xì)胞。也就是說，在未受病毒感染的細(xì)胞中絕對不會(huì)發(fā)生這種磷酸化作用。通過源于細(xì)胞的磷酸化酶向GCV單磷酸上再增加兩個(gè)磷酸基團(tuán)，從而形成GCV三磷酸。已知GCV是一種依賴于上述作用機(jī)理的抗病毒劑。近來，所述系統(tǒng)已被用于基因治療領(lǐng)域。即，已開始嘗試通過將源于病毒的編碼胸苷激酶的基因?qū)氚┘?xì)胞并用GCV誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的方法治療癌癥，即從體內(nèi)消除癌細(xì)胞[Shu-Hsia Chen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91，3054(1994)]。
另外，還嘗試了將該治療系統(tǒng)用于AIDS的基因治療。Venkatesh等通過將胸苷激酶基因連接在HIV LTR下游并將所述基因插入一種腺病毒的基因組結(jié)構(gòu)構(gòu)建了一種重組腺病毒載體[Venkatesh L.K.等，Proc.Natl.Acad，Sic.USA，87,8746(1990)]。
另一方面，在提高治療效果方面，藥物基因轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞的效率是一個(gè)重要因素，類似于上述藥物基因的開發(fā)。已嘗試過各種方法來提高轉(zhuǎn)移基因的效率。盡管在八十年代初期嘗試過用諸如顯微注射的物理方法，但轉(zhuǎn)移效率很差，而且不能以穩(wěn)定狀態(tài)轉(zhuǎn)移基因。另外，當(dāng)時(shí)用于大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)有限，不可能將這種嘗試投入實(shí)際應(yīng)用。隨后，研制了能有效將外源基因轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞的重組病毒(病毒載體)，從而第一次使得基因療法可應(yīng)用于臨床目的。
下面將披露幾種類型的病毒載體。目前用于基因治療的病毒載體最常見的是源于Moloney鼠白血病病毒(MoMLV)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。就是說，利用該病毒的增殖方式轉(zhuǎn)移基因。逆轉(zhuǎn)錄病毒是一種有包膜的RNA病毒，它通過包膜蛋白與宿主細(xì)胞上的受體的結(jié)合而侵入細(xì)胞。侵入細(xì)胞后，單鏈的病毒RNA由逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)化成雙鏈DNA，并以隨機(jī)方式穩(wěn)定地整合到被感染細(xì)胞的基因組DNA上。不過，只有細(xì)胞分裂和增殖時(shí)才能實(shí)現(xiàn)這種整合[Miller D.G.等，Molecular and Cellular Biology，10(8)，4239(1990)]。這樣整合的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因被稱為原病毒。RNA由這類原病毒轉(zhuǎn)錄而合成病毒蛋白。再由蛋白和病毒RNA形成新的病毒顆粒。在逆轉(zhuǎn)錄病毒中，上述逆轉(zhuǎn)錄病毒基因與外源基因重組[Miller A.D.，Current Topics in Microbiology and Immunology，158，1(1992)].由于MoMLV載體能夠被多種宿主所接受，因此它能將基因轉(zhuǎn)入各種細(xì)胞。就其安全性而言，迄今已進(jìn)行過大量研究，至今尚未出現(xiàn)嚴(yán)重問題[Kenneth C.，Br.H.Hematol.，80，421(1992)]。
另外，腺病毒載體可以作為適用于基因轉(zhuǎn)移的病毒載體的另一個(gè)例子。近來，腺病毒載體已引起人們的極大興趣，因?yàn)樗軌驅(qū)⒒蜣D(zhuǎn)移到未處于分裂狀態(tài)的細(xì)胞，并能很容易地濃縮至約1010的水平。最新研究表明，利用這類腺病毒載體能夠在體內(nèi)以較高比例將基因轉(zhuǎn)入呼吸道上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、肌細(xì)胞等。另一方面，這種腺病毒載體的一個(gè)基本特征是，外源基因不會(huì)整合到靶細(xì)胞的基因組DNA中。因此，在用該載體處理靶細(xì)胞之后，基因轉(zhuǎn)移作用僅能維持幾周時(shí)間，最長維持幾個(gè)月時(shí)間。因此，必需反復(fù)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移，這會(huì)帶來一些問題，例如增加患者的生理及心理負(fù)擔(dān)，并因?yàn)榭瓜俨《镜目贵w的出現(xiàn)等等原因而降低基因轉(zhuǎn)移的效率。
相反，腺伴隨病毒(AAV)的特點(diǎn)是外源基因能整合到靶細(xì)胞的基因組DNA上，而且，該載體既無致病性又無細(xì)胞毒性[Kotin R.M.，Hum，Gene Ther.，5，793-901(1994)；Nienhuis A.W.等，Viruses and BoneMarrow，Dekker Inc.，353-414(1993)]。而且，其ITR(反向末端重復(fù))為包裝病毒顆粒和基因向基因組DNA上的整合所必需，但對基因表達(dá)無促進(jìn)作用。因此，通過采用合適的內(nèi)部啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子可以隨意啟動(dòng)/終止基因表達(dá)。就AAV載體而言，它可應(yīng)用于多種宿主，因此，該載體可應(yīng)用于各種靶細(xì)胞/疾病。由于以上特征，預(yù)計(jì)AAV可作為一種新的病毒載體，即用于取代MoMLV載體。已發(fā)現(xiàn)野生型AAV能整合到第19條染色體的特定位點(diǎn)[Samulski R.J.等，EMBO J.，10，3941-3980(1991)]。這種AAV載體引起了公眾的注意，因?yàn)樽鳛檩d體它能夠?qū)蛘衔稽c(diǎn)進(jìn)行定位。
上述MoMLV載體、腺病毒載體和AAV載體的共同特征是無宿主專一性。這一特征意味著，可以用這些病毒載體對很多細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)治療。就是說，用這種病毒載體可以治愈多種疾病。
如上所述，上述病毒載體無宿主專一性，但另一方面，這一特征使得給活的有機(jī)體服用這種載體變得很困難。當(dāng)這種載體被應(yīng)用于實(shí)際治療時(shí)，需要各種服用方法。一種已知的治療血細(xì)胞的方法包括將待治療的細(xì)胞自體內(nèi)取出，在完成基因轉(zhuǎn)移以后再將該細(xì)胞放回體內(nèi)(即來自體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)移)。對于寄宿在器官或組織里的細(xì)胞來說，在待治療的器官或組織中局部使用病毒載體。就前一種情形而言，要求有特殊的設(shè)備，這限制了這種治療的實(shí)施。另一方面，后一種情形存在的問題是，在某些場合必需施行手術(shù)，以便進(jìn)行局部服用。當(dāng)通過誘導(dǎo)細(xì)胞死亡而治療疾病時(shí)，從安全角度考慮，尤其需要僅將基因轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞。上述病毒載體不能滿足這一要求。
在AIDS的基因治療中，CD4-陽性T淋巴細(xì)胞是靶細(xì)胞。近年來，已開發(fā)出多種用于AIDS的基因治療的藥物基因。因此，迫切需要開發(fā)一種能夠?qū)⑸鲜龌蛴行У?、專一性地轉(zhuǎn)移到CDT-陽性T淋巴細(xì)胞的系統(tǒng)。在嘗試通過將能夠誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的基因?qū)攵委烝IDS時(shí)，從安全角度考慮，特別需要將所述基因僅轉(zhuǎn)移到CD4陽性T淋巴細(xì)胞中。然而，到目前為止業(yè)已應(yīng)用于臨床的病毒載體(即MoMLV載體、腺病毒載體、AAV載體等)不具有上述組織專一性，因此，不能滿足上述要求。
本發(fā)明是在上述條件下完成的，其目的在于提供一種系統(tǒng)，該系統(tǒng)能將可直接或間接破壞細(xì)胞的基因有效而且專一性地轉(zhuǎn)入CD4-陽性T淋巴細(xì)胞。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明人進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用人免疫缺陷病毒載體能將細(xì)胞毒性基因高效而專一性地轉(zhuǎn)入CD4-陽性細(xì)胞，而所轉(zhuǎn)入的基因僅能在HIV感染的細(xì)胞中表達(dá)，由此實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明提供了一種帶有編碼一種細(xì)胞毒素的DNA序列的重組人免疫缺陷病毒載體。


圖1是表示重組質(zhì)粒HXTKN結(jié)構(gòu)的模擬示意圖。
圖2是表示輔助質(zhì)粒CGPE(-)結(jié)構(gòu)的模擬示意圖。
圖3是表示載體質(zhì)粒HXN結(jié)構(gòu)的模擬示意圖。
圖4是表示通過用重組病毒進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移所獲得的G418-抗性集落的示意圖(表示一種生物的形態(tài)學(xué)的照片)。
圖5是表示用XhoI消化的處理基因組DNA之后的Southern印跡的結(jié)果的示意圖(電泳圖)。
圖6是表示在用ScaI消化基因組DNA之后得到的Southern印跡結(jié)果的示意圖(電泳圖)。
圖7是表示編碼Tat的質(zhì)粒BTA/LA的結(jié)構(gòu)的模擬示意圖。
圖8是表示Northern印跡結(jié)果的示意圖(電泳圖)，表示依賴于Tat的RNA表達(dá)。
被用于本發(fā)明的病毒載體是人免疫缺陷病毒載體。業(yè)已知道，人免疫缺陷病毒(HIV)能特異性地感染人CD4陽性T淋巴細(xì)胞。這是因?yàn)樵诟腥緯r(shí)HIV的包膜蛋白gp120能專門結(jié)合位于CD4陽性T淋巴細(xì)胞表面的CD4蛋白。HIV的這種特異性感染系統(tǒng)被應(yīng)用于本發(fā)明的病毒載體上(Shimada T.等，J.Clin.Invest.，88 1043(1991)]。
本發(fā)明的重組人免疫缺陷病毒載體是通過將編碼細(xì)胞毒素的DNA序列整合到HIV載體中而制成的?！凹?xì)胞毒素”一詞是指在細(xì)胞中起著細(xì)胞毒性基因作用的物質(zhì)。其例子包括能將非毒性藥物前體轉(zhuǎn)化成具有細(xì)胞毒性的物質(zhì)的酶基因(例如，胸苷激酶能催化GCV的單磷酸化，從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡)以及各種能直接損害細(xì)胞的毒素基因(例如，白喉毒素、破傷風(fēng)毒素、霍亂毒素)。優(yōu)選將胸苷激酶，尤其是源于人單純皰疹病毒的胸苷激酶用作細(xì)胞毒素的酶基因。作為一種毒素，優(yōu)選使用白喉毒素。
可以用分子生物學(xué)領(lǐng)域中眾所周知的基因重組技術(shù)將本發(fā)明的細(xì)胞毒素整合到HIV載體上。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，可以將本發(fā)明的重組人免疫缺陷病毒載體構(gòu)建成在編碼細(xì)胞毒素的DNA序列上游無內(nèi)部啟動(dòng)子，因而該基因只能由HIV LTR啟動(dòng)。因此，所述基因只能在有源于HIV的Tat蛋白的條件下進(jìn)行表達(dá)。即使該基因被轉(zhuǎn)入了未被HIV感染的CD4陽性T淋巴細(xì)胞，該基因也不會(huì)表達(dá)，因此不會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。在該實(shí)施方案中，HIV感染的細(xì)胞會(huì)選擇性地受到損害，因此，預(yù)計(jì)可以建立起高度專一性的處理。
在本發(fā)明中，可以用以下方法制備用于特異性基因轉(zhuǎn)移的優(yōu)選病毒載體。
本發(fā)明的病毒載體可以通過用圖2所示的輔助質(zhì)粒(即從5′→3′末端依次含有巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、HIV的編碼gag、pol和env、但缺乏任何包裝信號的基因，源于皰疹病毒的胸苷激酶啟動(dòng)子、新霉素抗性基因的質(zhì)粒，其被插入含有氨芐青霉素抗性基因和SV40的復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒載體上)和圖1所示的載體質(zhì)粒(即具有長末端重復(fù)(LTRs)的質(zhì)粒，在兩末端重復(fù)之間沿5′→3′末端方向依次插入損傷細(xì)胞用的基因、源于皰疹病毒的胸苷激酶啟動(dòng)子和新霉素抗性基因，并插入含有一個(gè)氨芐青霉素抗性基因和SV40的復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒載體)對COS細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染而獲得。
由此獲得的本發(fā)明HIV載體不僅能將基因?qū)Ｒ恍缘剞D(zhuǎn)入人CD4陽性T淋巴細(xì)胞，而且能選擇性地僅損害HIV感染的細(xì)胞。由于本發(fā)明的細(xì)胞毒性基因是由HIV LTR啟動(dòng)的，因此該基因只能在有源于HIV的Tat蛋白的條件下表達(dá)。因此，即使該基因被轉(zhuǎn)入未受HIV感染的CD4陽性T淋巴細(xì)胞，也不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。通過采用使用了該HIV載體的基因轉(zhuǎn)移方法，可將外源基因穩(wěn)定導(dǎo)入基因組DNA。在經(jīng)過細(xì)胞分裂以后，子代細(xì)胞中繼承了由此整合的基因。即，該方法能有效應(yīng)用于預(yù)防感染。就是說，本發(fā)明的HIV載體是一種用于基因治療的載體，似乎具有極寬的應(yīng)用范圍，它能克服常規(guī)MoMLV、腺病毒和AAV載體所具有的各種不便。
實(shí)施例下面的實(shí)施例是用于對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)地說明的，而不是要對本發(fā)明進(jìn)行限定。
例1質(zhì)粒的構(gòu)建所有質(zhì)粒都是通過本領(lǐng)域常見的遺傳工程方法構(gòu)建的。重組質(zhì)粒HXTKN是這樣構(gòu)建的如圖1所示，將一個(gè)沿5′→3′末端方向依次含有HIV LTR、源于人單純皰疹病毒的胸苷激酶基因(tk)、源于人單純皰疹病毒的胸苷激酶基因的啟動(dòng)子(TK)、新霉素抗性基因(neo)和HIVLTR的質(zhì)粒插入具有SV40復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒載體[Shimada T.等，J.Clin.Invest.，88，1043(1991)]。
例2制備重組病毒將在上述例1中獲得的10μg HXTKN與10μg輔助質(zhì)粒CGPE(-)混合，其中，一個(gè)基因結(jié)構(gòu)被插入含有氨芐青霉素抗性基因和SV40復(fù)制起點(diǎn)的表達(dá)載體中，所述基因結(jié)構(gòu)包括位于含有HIV基因序列中的gag、pol和env基因的基因組上游的巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子而缺乏任何包裝信號，如圖2所示。然后將無菌的純化水和氯化鈣水溶液加入所述混合物中，將總體積調(diào)至0.5ml。在搖動(dòng)條件下將所得到的混合物滴入0.5mlHBSP緩沖液中，并在室溫下放置30分鐘，從而形成質(zhì)粒/磷酸鈣共沉淀物。將該共沉淀物加入COS細(xì)胞的培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基已在培養(yǎng)皿(9cm)中培養(yǎng)至約70％的鋪滿度。在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)，然后用新的培養(yǎng)基取代上述培養(yǎng)基，再繼續(xù)培養(yǎng)2天。由此獲得的培養(yǎng)上清液被稱為病毒溶液。用僅由10μg CGPE(-)轉(zhuǎn)染的組制備負(fù)對照病毒溶液。另一方面，用由10μg載體質(zhì)粒HXN(圖3)[Shimada等，J.Clon.Invest.，88，1043(1991)]和10μg CGPE(-)共轉(zhuǎn)染的組制備正對照病毒溶液。
例3用重組病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞并克隆藥物抗性株以每個(gè)培養(yǎng)皿(60mm)2×105的密度接種CD4陽性Hela細(xì)胞并培養(yǎng)過夜。將在例2中獲得的3ml每種病毒溶液與30μg Polybrene一起加入其中(轉(zhuǎn)導(dǎo))。在CO2培養(yǎng)箱中放置2天后，用一種胰蛋白酶/EDTA混合物從上述培養(yǎng)皿中剝離細(xì)胞，并再次接種到另一個(gè)培養(yǎng)皿(90mm)中。在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時(shí)，然后加入G-418，使每ml的培養(yǎng)基的濃度為750μg。再培養(yǎng)10天，然后將G-418即一種新霉素類似物加入該培養(yǎng)基中，使其終濃度為1000μg/ml。再培養(yǎng)10天，然后得到獲得了G-418抗性的集落。用結(jié)晶紫對這些集溶進(jìn)行染色。結(jié)果如圖4所示。在負(fù)對照組中，未形成重組病毒載體，因此所有細(xì)胞均被消除。相反，在用CGPE(-)和HXN共轉(zhuǎn)染的組和用CGPE(-)和HXTKN共轉(zhuǎn)染的組中，出現(xiàn)一些抗藥性集落。這兩組在集溶數(shù)量方面幾乎相當(dāng)。上述結(jié)果表明，tk基因插入重組HIV載體的基因組DNA后不會(huì)導(dǎo)致重組HIV載體的滴度下降，而轉(zhuǎn)入所述細(xì)胞的tk基因不表現(xiàn)出細(xì)胞毒性。用一種胰蛋白酶/EDTA混合物從培養(yǎng)皿中剝離一些集落，并將每個(gè)集落接種到另一個(gè)培養(yǎng)皿中作進(jìn)一步分析。
例4從轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD4陽性Hela細(xì)胞中提取基因組DNA，并通過Southern印跡證實(shí)基因轉(zhuǎn)移通過用胰蛋白酶-EDTA混合物處理從培養(yǎng)皿(90mm)中剝離達(dá)到鋪滿的細(xì)胞，并向其中加入表面活性劑進(jìn)行裂解。以200μg/ml的濃度加入蛋白酶K，然后在37℃下培養(yǎng)3小時(shí)。用苯酚/氯仿提取進(jìn)行脫蛋白，將殘余物對Tris/EDTA緩沖液透析過夜。然后加入NaCl(終濃度0.2M)、RNase A(終濃度100μg/ml)和蛋白酶K(終濃度100μg/ml)，并在37℃下培養(yǎng)3小時(shí)。用苯酚/氯仿提取以后，該培養(yǎng)物再次對Tris/EDTA緩沖液進(jìn)行透析。2天后結(jié)束透析并獲得基因組DNA。
以常規(guī)方法進(jìn)行Southern印跡。用限制酶XhoI或ScaI消化10μg基因組DNA。作為負(fù)對照組，用相同方法處理未經(jīng)重組病毒處理過的CD4陽性HeLa細(xì)胞。用由32p標(biāo)記過的neo基因(600bp)作為探針。結(jié)果如圖5和6所示?？寺∈侵斧@得了G-418抗性的單株，而集團(tuán)表示50個(gè)克隆的混合物。在用XhoI消化的組中，在3.6kb處觀察到放射活性，這表明，所述重組基因已由本發(fā)明的重組病毒載體插入基因組DNA中，但未產(chǎn)生任何重排。
例5證實(shí)依賴于Tat的RNA表達(dá)通過磷酸鈣法用10μg編碼Tat的質(zhì)粒BTAT/LH(如圖7所示)轉(zhuǎn)染在例3中獲得的細(xì)胞株(克隆)。作為負(fù)對照組，以相同方法轉(zhuǎn)染未用重組病毒處理過的CD4H細(xì)胞。在CO2培養(yǎng)箱中放置2天，然后從培養(yǎng)皿中剝離細(xì)胞，并用含有異硫氰酸胍的細(xì)胞裂解液進(jìn)行處理。然后通過CsCl梯度離心除去其中的蛋白和DNA，以便僅分離出RNA。電泳后用常規(guī)方法進(jìn)行Northern吸印。用由32P標(biāo)記的tk基因(600bp)作為探針。如圖8所示，在負(fù)對照組及未用BTAT/LH轉(zhuǎn)染的克隆中未見tk基因表達(dá)。相反，證實(shí)了在用BTAT/LH轉(zhuǎn)染的克隆中依賴于Tat的RNA表達(dá)。
權(quán)利要求
1.一種重組人免疫缺陷病毒載體，它含有編碼一種細(xì)胞毒素的DNA序列。
2.如權(quán)利要求1的重組人免疫缺陷病毒載體，其中所述細(xì)胞毒素是胸苷激酶。
3.如權(quán)利要求1的重組人免疫缺陷病毒載體，其中，在所述編碼細(xì)胞毒素的DNA序列上游無內(nèi)部啟動(dòng)子，該基因僅由HIV LTR啟動(dòng)。
4.如權(quán)利要求1的重組人免疫缺陷病毒載體，其中，有一個(gè)用于啟動(dòng)所述編碼細(xì)胞毒素的DNA序列的內(nèi)部啟動(dòng)子。
全文摘要
一種重組人免疫缺陷病毒載體,它含有編碼一種細(xì)胞毒素的DNA序列。
文檔編號C12N15/86GK1178555SQ96192613
公開日1998年4月8日 申請日期1996年3月15日 優(yōu)先權(quán)日1996年3月15日
發(fā)明者島田隆, 秋山勝彥, 鈴木要介 申請人:久光制藥株式會(huì)社