專(zhuān)利名稱(chēng)：Exserohilum monoceras的新菌株及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及Exserohilum monoceras的一種新菌株、一種含有該菌株的雜草控制劑以及使用該雜草控制劑的雜草控制方法。
為使糧食產(chǎn)量穩(wěn)定，需要在農(nóng)田中使用農(nóng)藥。但是，由于長(zhǎng)期將大量的含有非天然產(chǎn)生的物質(zhì)的合成農(nóng)藥施加到土地上，這些物質(zhì)會(huì)產(chǎn)生有害作用。最嚴(yán)重的問(wèn)題是其直接影響人及家畜，并且破壞生態(tài)系統(tǒng)。近年來(lái)，由于極大改進(jìn)用于雜草、有害昆蟲(chóng)和病菌的農(nóng)藥的特異性，已減少其對(duì)人及家畜的有害作用。但是，聯(lián)系到使用農(nóng)藥時(shí)高的農(nóng)藥濃度，仍然應(yīng)對(duì)這些有害作用給予足夠的關(guān)注。而且，對(duì)用于雜草、有害昆蟲(chóng)及病菌的農(nóng)藥的濃度的選擇不必高，高的濃度往往會(huì)導(dǎo)致對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的破壞。
為解決這一問(wèn)題，需要研制出一些除草劑來(lái)保護(hù)環(huán)境。這些除草劑不會(huì)對(duì)靶種類(lèi)之外的其他種類(lèi)有不利影響。上述除草劑的一個(gè)例子就是使用雜草病原體的除草劑。某些雜草病原體在雜草中是普遍存在的，并且已知可將這些病原體用于除草劑中，該除草劑幾乎不損傷人、家畜以及包括魚(yú)類(lèi)、昆蟲(chóng)等在內(nèi)的小型生物，對(duì)植物的藥害小。此外，將病原體用于靶雜草的該除草劑的特異性是如此強(qiáng)，以致其選擇性相當(dāng)高，幾乎不破壞生態(tài)系統(tǒng)。目前，從市場(chǎng)上可購(gòu)得的使用雜草病原體的除草劑的例子是將棕櫚疫霉(Phytophthora palmivora)用于Stranglervine的除草劑Devine、將盤(pán)長(zhǎng)孢狀毛盤(pán)孢(Colletotrichum gloeosporioides)的變種aeschynomene 用于 Northernjointvetch的除草劑Collego以及將盤(pán)長(zhǎng)孢狀毛盤(pán)孢的變種malvae用于圓葉錦葵的除草劑BioMal。
將雜草病原體用來(lái)控制稻田中最嚴(yán)重的雜草稗(Echinochloa spp.)的除草劑的例子是Cochliobolus lunatus(AnamorphCurvularia lunata)[“雜草研究”(Weed Research)，27，43-47，(1987)和日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)No.284,963/93]、Ustilago trichophora[WO93/05656]以及Drechslera monoceras(Exserohilummonoceras的異名)[日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)系列219,883/91，226,905/92，360,678/92，370,090/92，277,042/94，329,513/94以及247,822/94]。
但是這些常規(guī)的除草劑是有缺限的例如，Cochliobolus lunatus充分顯示其作用需要有18小時(shí)以上的浸潤(rùn)期；Ustilago trichophora在噴施后到充分顯示其作用需4至5周；并且Drechslera monoceras產(chǎn)生少量的孢子。因此，使用這些真菌的除草劑還未進(jìn)入到實(shí)際應(yīng)用中。
本發(fā)明的目的在于提供既具有足夠的除草作用又有高的產(chǎn)生孢子的性能的微生物。
發(fā)明人篩選了對(duì)稗有致病性的菌株，得到一種具有強(qiáng)的除草作用的菌株，并且發(fā)現(xiàn)一類(lèi)既具有強(qiáng)的除草作用又具有高的產(chǎn)生孢子的性能的菌株。此外，發(fā)明人檢測(cè)了這些菌株的酯酶酶譜類(lèi)型，發(fā)現(xiàn)該類(lèi)菌株表現(xiàn)有相似的酯酶酶譜類(lèi)型，該酶譜類(lèi)型與已知菌株的所有酯酶酶譜類(lèi)型都不相似。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人完成了以下發(fā)明本發(fā)明是Exserohilum monoceras的一種菌株，其表現(xiàn)有

圖1所示的酯酶酶譜類(lèi)型。
另外，本發(fā)明是一種雜草控制劑，其含有作為活性成份的所述菌株。
此外，本發(fā)明是一種控制雜草的方法，其包括使用所述的雜草控制劑。
在下文中，對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述。
本發(fā)明的菌株是由染病的稗分離的，并且該真菌的特征如下其為需氣生物，在馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基平板上形成深灰或黑色菌落?？梢杂^察到白色或灰色的氣生菌絲體。該真菌具有大量的深色分生孢子，每一孢子具有2-8隔，為紡綞形，中部最寬，向端部變窄。在基部末端突出有一個(gè)門(mén)。分生孢子的大小為約40～150×10～25μm。
由以上(觀察)結(jié)果，尤其是其菌落的形成和形狀以及其分生孢子的形態(tài)學(xué)，通過(guò)參考A.Sivanesan“Bipolaris屬、彎孢屬(Curvularia)、Drechslera屬、Exserohilum屬的草棲種類(lèi)及其變種”(Graminicolous Species ofBipolaris、Curvularia、Drechslera、Exserohilum and Their Telemorphs)(“真菌學(xué)論文”(Mycological Papers)，No.158，P.261，Nov.1987)第201-237頁(yè)，發(fā)明人將所述菌株鑒定為Exserohilum monoceras。
對(duì)該真菌屬的命名“Exserohilum”是按照A，Sivanesan的分類(lèi)方法。Luttrell(“真菌學(xué)評(píng)論”(Revue de Mycologie)，41，271-279，(1977))和Alcom(“真菌分類(lèi)學(xué)”(Mycotaxon)，8,411-414，(1978)也支持這一分類(lèi)方法。在另一方面，Ellis(Dematioceous Hyphomycetes，CMI，Kew，608(1971))曾將Exserohilum屬和Bipolaris屬歸為Drechslera屬，并且只用Drechslera屬。不過(guò)，近年來(lái)，除Ellis外，沒(méi)有任何研究者不贊同有Exserohilum和Bipolaris種，因而，認(rèn)為采用Exserohilum種是合適的。由于已知Exserohilum種的變形狀態(tài)為Setosphaeria種，也可以將歸為Setosphaeria種的微生物包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的菌株具體為JTB-012、JTB-013、JTB-799、JTB-803以及JTB-808。已將JTB-012保藏為FERM BP-5271，JTB-013為FERM BP-5272，JTB-799為FERM BP-5273，JTB-803為FERMBP-5274，JTB-808為FERM BP-5275，所有菌株均于1995年10月27日保藏于工業(yè)科學(xué)和技術(shù)署，國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所(NationalInstitute of Bioscience and Human-Technology，Agency of Industrial Scienceand Technology(1-3，Higashi l-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-Ken，Japan)。
如圖2中所示，這些菌株表現(xiàn)出一種酯酶酶譜類(lèi)型，該酶譜類(lèi)型與Exserohilum monoceras的已知菌株IFO9800、IMI125854、IMI125855、ATCC2464l和ATCC58346的酶譜類(lèi)型不同。
可以以和用于Exserohilum monoceras的已知菌株的方式相同的方式而勿需特殊的方法，來(lái)培養(yǎng)本發(fā)明的菌株。就適當(dāng)?shù)睾锌赏奶荚春偷春蜔o(wú)機(jī)物以及必需的生長(zhǎng)促進(jìn)劑而論，培養(yǎng)基可以是任何合成的或天然的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的例子為燕麥蔗糖瓊脂培養(yǎng)基、燕麥瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基、V-8汁液瓊脂培養(yǎng)基、Czapek-Dox瓊脂培養(yǎng)基等。在培養(yǎng)中，將培養(yǎng)基保持在15-30℃的溫度下，優(yōu)選在20-25℃下，并且將培養(yǎng)基保持在pH3-9，優(yōu)選在pH5-8。于上述條件下培養(yǎng)7-14天后，在培養(yǎng)基平板上形成足夠數(shù)量的孢子。
本發(fā)明的雜草控制劑是通過(guò)將表面活性劑等加入到作為活性成份的所述孢子中來(lái)制備的?？梢杂谀茱@示除草作用的范圍內(nèi)隨意地決定孢子密度，在這個(gè)范圍內(nèi)可以適當(dāng)使用102-106孢子/ml的密度，優(yōu)選103-105孢子/ml的密度。
對(duì)于將本發(fā)明的雜草控制劑用于實(shí)際田間，優(yōu)選用109-1010孢子/1000m2的密度。
用本發(fā)明的雜草控制劑處理的雜草包括稗，但不限于此。
實(shí)施例[實(shí)施例1]稗(Echinochloa crus-galli)的控制實(shí)驗(yàn)從日本各地收集Echinochloa spp.的染病植株。切除其侵噬斑，并于25℃潮濕條件下培養(yǎng)，由此形成分生孢子。用針將分生孢子刮下，并接種到馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，以分離單個(gè)孢子。將所有菌株接種至燕麥蔗糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，并于25℃下培養(yǎng)14天以形成分生孢子。然后，以每5ml有103、104和105個(gè)孢子的密度將分生孢子懸浮于0.02％的吐溫20(Tween 20)的水溶液中。
于一個(gè)100cm2的盆中分別將稗培養(yǎng)至1.5葉時(shí)期，注水至大約5cm深。向每個(gè)盆中一滴滴地加入5ml的每一所述孢子懸液，并使之于溫室中保持3周，檢測(cè)其除草效率。如下測(cè)定其對(duì)稗的除草效率除草效率＝[1-(存活的個(gè)體數(shù)目/20)]×100表1.菌株及其對(duì)稗的除草效率菌株除草效率103104105JTB-0123895100JTB-013357095JTB-79947100 100JTB-80335100 100JTB-80832100 100IMI-125855 0 2 25未處理0[實(shí)施例2]分生孢子的繁殖力實(shí)驗(yàn)將每一菌株接種到燕麥蔗糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，并于25℃下靜止培養(yǎng)14天。然后通過(guò)將分生孢子懸浮于0.1％的Tween 20中來(lái)回收培養(yǎng)基平板上的分生孢子。產(chǎn)生的分生孢子的量見(jiàn)表2。
表2.菌株及其分生孢子產(chǎn)量菌株 分生孢子產(chǎn)量/cm3JTB-012 4.4×105JTB-013 4.5×105JTB-799 7.5×105
JTB-803 8.6×105JTB-808 6.6×105IFO-9800 ＜2.4×103IMI-125854 ＜2.4×103IMI-125855 4.0×104ATCC-24641 ＜2.4×103ATCC-58346 ＜2.4×103JTB-012、JTB-013、JTB-799、JTB-803和JTB-808這類(lèi)菌株至少以4.4×105分生孢子/cm3的產(chǎn)量產(chǎn)生分生孢子。在另一方面，IMI-125855，即在已知菌株中產(chǎn)生分生孢子的能力最大的菌株，以4.4×104分生孢子/cm2的產(chǎn)量產(chǎn)生分生孢子。由其他所有已知菌株產(chǎn)生的分生孢子的量低于檢測(cè)限度，這表明由這類(lèi)菌株的每一菌株產(chǎn)生的分生孢子的量比每一已知菌株的要高10倍。[實(shí)施例3]酯酶酶譜分析將JTB-012、JTB-013、JTB-799、JTB-803、JTB-808、IFO-9800、IMI-125854、IMI-125855、ATCC-24641以及ATCC-58346這10個(gè)菌株用作樣品。通過(guò)于日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)No.329,513/94中描述的方法，從每一菌株制備粗酶溶液。
于25℃下、黑暗中、在馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基中將每一菌株靜止培養(yǎng)7-10天以形成真菌叢。用蒸留水將該真菌叢洗滌幾次，于-80℃下冰凍，并凍干。
把該真菌叢于50mM Tris-HCl緩中液(pH7.4)中勻漿，通過(guò)濾紙過(guò)濾，并于10,000r.p.m.離心濾液。把上清液用作樣品。通過(guò)Lowry方法定量檢測(cè)樣品蛋白質(zhì)的濃度。于一個(gè)大的平板凝膠電泳槽中，用丙烯酰胺凝膠(濃縮膠，4.5％；分離膠，10％)將每一樣品(大約50μg蛋白)于30mA下電泳2個(gè)小時(shí)。
電泳后，進(jìn)行酯酶活性染色。將40mg乙酸萘酯溶于50％丙酮的水溶液中，向其中加入200mg固紫B鹽和200ml 50mM Tris-HCl緩沖液，并將所得的溶液用作染色液。將膠浸沒(méi)于染色液中，并輕微振蕩30分鐘，進(jìn)行染色。然后，用蒸餾水洗滌凝膠，檢測(cè)每條帶中的遷移率。
結(jié)果如圖1和2中所示，JTB-012、JTB-013、JTB-799、JTB-803和JTB-808顯示出有相似的酯酶酶譜類(lèi)型，因此，顯然JTB-012、JTB-013、JTB-799、JTB-803和JTB-808菌株屬于同一類(lèi)中。由于這類(lèi)菌株的酯酶酶譜類(lèi)型和日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)No.329,513/94中所述的已知的IFO-9800、IMI-125854、IMI-125855、ATCC-24641、ATCC-58346以及Drechsrela monoceras var.。microsporus菌株的不同，同樣顯然的是這類(lèi)菌株是與所知菌株不同的一類(lèi)新菌株。[制劑的例子]例1(于水中形成的乳劑)把Exserohilum monoceras的2×109個(gè)分生孢子以及4g Tween 80加入20L無(wú)菌水中，將其混合制成液體制劑。例2(可濕性粉劑)把分生孢子(JTB-803)懸浮于9％麥芽糖、1％粘土和90％水組成的混合物中，制成每ml中含有107個(gè)分生孢子的懸液。把懸液風(fēng)干，將干燥的產(chǎn)物研磨，制成可濕性粉劑。例3(可濕性粉劑)把分生孢子(JTB-012)懸浮于9％乳糖、1％沸石和90％水組成的混合物中，制成每ml含107個(gè)分生孢子的懸液。把懸液風(fēng)干，研磨干燥的產(chǎn)物，制成可濕性粉劑。例4(可濕性粉劑)把分生孢子(JTB-808)懸浮于15％硅藻土、77％高嶺土以及8％聚乙烯烷基苯基醚組成的混合物中，制成每ml中含107個(gè)分生孢子的懸液。把懸液風(fēng)干，研磨干燥的產(chǎn)物，制成可濕性性粉劑。例5(可濕性粉劑)把分生孢子(JTB-799)懸浮于33％硅藻土、0.33％羧甲基纖維素和66.67％水組成的混合物中，制成每ml含107個(gè)分生孢子的懸液。把懸液干燥，研磨干燥的產(chǎn)物，制成可濕性粉劑。例6(粉劑)把分生孢子(JTB-012)與一種混合物混合，該混合物含有14％羥丙基-β-環(huán)糊精，12％白碳黑和74％粘土，制成每g中含107個(gè)分生孢子的混合物，把混合物干燥，均勻研磨，制成粉劑。例7(顆粒劑)
把分生孢子(JTB-808)和一種混合物揉捏，該混合物含15％β-環(huán)糊精、2％淀粉、18％皂土、36％碳酸鉀和29％水，制成每g中含107個(gè)分生孢子的混合物，然后將其于成粒機(jī)中粒化，干燥，制成顆粒劑。例8(可乳化的濃縮物)把分生孢子(JTB-799)均勻懸乳于一種混合物中，該混合物中含18％聚氧乙烯壬基苯基醚磷酸銨、6％聚氧乙烯壬基苯基醚、29％磷酸三乙酯和47％的磷酸三丁酯，制成每ml含107個(gè)孢子的乳劑。例9(油劑)把分生孢子(JTB-803)懸浮于一種混合物中，該混合物含有95％錠子油、4％蓖麻油和1％硅氧烷油，制成每ml中含107個(gè)孢子的油劑。例10(干的流動(dòng)劑)把分生孢子(JTB-013)懸浮于一種組合物中，該組合物含12％烷基苯磺酸鈉和88％聚乙烯乙二醇醚，制成每ml中含107個(gè)分生孢子的干的流動(dòng)劑。例11(微囊劑)將分生孢子(JTB-803)懸浮于一種混合物中，該混合物含0.7％8藻酸鈉、5％高嶺土、15％甘油和79.3％水，制成每ml含107個(gè)分生孢子的懸液。把懸液滴加到0.2M乙酸鈣上，以產(chǎn)生微囊化產(chǎn)物。把產(chǎn)物切碎、過(guò)篩并風(fēng)干，制成微囊劑。例12(微囊劑)把分生孢子(JTB-013)懸浮于一種混合物中，該混合物含0.7％藻酸鈉、5％高嶺土、15％甘油和79.3％水，制成每ml含107個(gè)分生孢子的懸液。把懸液一滴滴地加到0.2M氯化鈣上，產(chǎn)生微囊化產(chǎn)物。把產(chǎn)物切碎、過(guò)篩并風(fēng)干，制成微囊劑。
本發(fā)明提供了Exserohilum monoceras的一個(gè)新菌株。與Exserohilummonoceras的常規(guī)菌株相比，該菌株有很好的除草效果和孢子繁殖力，其具有作為菌菌除草劑的成份合適性能。
附圖的簡(jiǎn)要描述圖1是本發(fā)明的新菌株的酯酶酶譜2是本發(fā)明的新菌株和常規(guī)菌株的酯酶酶譜圖。
權(quán)利要求
1.Exserohilum monoceras的一種菌株，該菌株表現(xiàn)有圖1中所示的酯酶酶譜。
2.如權(quán)利要求1的菌株，該菌株為Exserohilum monoceras JTB-012、Exserohilum monoceras JTB-013、Exserohilum monoceras JTB-799、Exserohilum monoceras JTB-803或Exserohilum monoceras JTB-808。
3.一種用于控制雜草的制劑，該制劑包含有作為活性成份的權(quán)利要求1或2的菌株。
4.如權(quán)利要求3的制劑，其中該雜草是稗(Echinochloa spp)。
5.一種用于控制雜草的方法，該方法包括使用權(quán)利要求3的制劑。
6.一種如權(quán)利要求5的方法，其中該雜草為稗(Echinochloa spp)。
全文摘要
使用Exserohilum monoceras的一個(gè)菌株的一種除草劑和一種除草方法,該菌株表現(xiàn)有和常規(guī)微生物的酯酶酶譜類(lèi)型不同的酯酶酶譜類(lèi)型,并且有強(qiáng)的形成孢子的能力。
文檔編號(hào)C12R1/645GK1177375SQ9619233
公開(kāi)日1998年3月25日 申請(qǐng)日期1996年11月19日 優(yōu)先權(quán)日1995年11月20日
發(fā)明者本浩史, 高林美千代, 稗田忠治, 鄉(xiāng)原雅敏 申請(qǐng)人:日本煙草產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社