本發(fā)明涉及一種雞溶菌酶和雞β-防御素7融合基因及其制備方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

目前，由于抗生素濫用，導(dǎo)致耐藥菌株猛增和食品安全危機等公共安全問題層出不窮，尋找高效、無殘留、綠色環(huán)保的抗生素替代品已成研究熱點。

溶菌酶主要存在于動植物的組織液和某些微生物體內(nèi)，如鼻粘液、眼淚、唾液、卵蛋白、枯草桿菌培養(yǎng)物和某些蔬菜中。該酶能水解細菌的細胞壁中N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰胞壁酸之間的β-1，4-糖苷鍵，故又稱胞壁質(zhì)酶，即N-乙酰胞壁質(zhì)糖苷聚糖水解酶。其中對雞蛋清溶菌酶的研究最清楚，它是由129個氨基酸殘基構(gòu)成的一種堿性蛋白，分子量約為14KD，對熱穩(wěn)定，對堿不穩(wěn)定，對革蘭氏陽性細菌有較強的殺菌作用。可藥用，具抗菌、清除局部壞死組織、止血、消腫、消炎等作用。在食品工業(yè)上可用作防腐劑，還可添加在牙膏中作為防治齲齒的藥用牙膏。在發(fā)酵工業(yè)上是一種重要的溶菌劑，用于分解細胞壁，制備無菌體提取液。

防御素是動物體內(nèi)廣泛存在的一類富含半胱氨酸的抗菌肽,對細菌、真菌、病毒等多種病原微生物均具有抑制作用。防御素抗菌機理獨特,不易產(chǎn)生耐受性,是機體抵御外界病原微生物侵襲的重要武器。由于動物防御素具有抗菌譜廣、不易產(chǎn)生耐藥、安全性高等特點,現(xiàn)已成為抗菌藥物研究的熱點。研究表明,禽類防御素(Av BD)均屬于β-防御素,具備廣譜抗菌活性,有開發(fā)成抗菌藥物的潛力。目前關(guān)于禽類防御素的研究較少,僅在雞、鴨、鵝等常見家禽和少數(shù)幾種野禽中發(fā)現(xiàn)了數(shù)十種防御素或防御素基因。

以往對溶菌酶、抗菌肽的研究多是針對單一物質(zhì)。而馮瑄構(gòu)建了抗菌肽B-人溶菌酶融合蛋白的表達載體；歐陽萍對人溶菌酶-抗菌肽進行了融合表達，并用于小鼠乳房炎的治療試驗，取得了較好的抗菌療效，但將雞溶菌酶-抗菌肽融合表達的研究，還未見報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在為尋找新的抗生素替代品，提供一種雞溶菌酶和雞β-防御素7融合基因及其制備方法。

本發(fā)明為達到以上目的，是通過這樣的技術(shù)方案來實現(xiàn)的：提供一種雞溶菌酶和雞β-防御素的融合基因，其核苷酸序列是SEQIDNO：1。

該融合基因的核苷酸序列中包含序列SEQIDNO：3、SEQIDNO：4和SEQIDNO：7?；虻?′端為SEQIDNO：3序列，來自于雞溶菌酶基因，全長393bp。基因的3′端為SEQIDNO：4序列，來自于雞β-防御素，全長132bp。SEQIDNO：3和SEQIDNO：4之間為連接肽編碼序列SEQIDNO：7。

本發(fā)明還提供了上述融合基因的制備方法，包括以下步驟：

(1)設(shè)計擴增雞溶菌酶和雞β-防御素基因片段的PCR引物；

(2)在雞溶菌酶基因下游引物和雞β-防御素基因上游引物中加上一段連接肽序列，然后通過PCR反應(yīng)擴增雞溶菌酶和雞β-防御素基因；

(3)根據(jù)基因重疊延伸技術(shù)，以步驟(2)所得的兩個PCR反應(yīng)產(chǎn)物的混合物為模版，以雞溶菌酶基因上游引物和雞β-防御素7基因下游引物為引物，分三步進行基因重疊延伸，獲得融合基因。

本發(fā)明構(gòu)建融合基因表達載體時所用的表達載體為pET32a。

本發(fā)明構(gòu)建的融合基因工程菌將融合基因表達載體轉(zhuǎn)入宿主制備而得。

本發(fā)明構(gòu)建的融合基因工程菌為大腸桿菌。

本發(fā)明的融合基因表達載體的構(gòu)建方法：步驟(2)通過設(shè)計恰當(dāng)?shù)囊铮ㄟ^PCR延伸反應(yīng)，使雞溶菌酶基因的下游含有完整的連接子序列，而雞β-防御素基因的上游含有部分的連接子序列。步驟(3)根據(jù)基因重疊延伸技術(shù)，以步驟(2)所得的兩個PCR產(chǎn)物的混合物為模版，不加引物進行互為引物擴增，此時已獲得融合基因。回收擴增產(chǎn)物作為進一步PCR反應(yīng)的模板，以雞溶菌酶基因的上游引物和雞β-防御素基因的下游引物為引物進行擴增反應(yīng)，獲得更大量的融合基因產(chǎn)物。然后依次進行了目的片段割膠回收，并插入克隆載體或表達載體、質(zhì)粒提取等步驟。

本發(fā)明還提供了上述融合基因表達載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

(1)以PCR擴增融合基因，得到融合基因擴增片段SEQIDNO：1；

(2)采用雙酶切法，雙酶切載體與擴增后的片段，并用T4連接酶將雙酶切后的產(chǎn)物連接到質(zhì)粒；

(3)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得陽性克隆子，提取質(zhì)粒，測序驗證后，得到所述融合基因的表達載體。

本發(fā)明同時提供了上述融合基因編碼的融合蛋白，其氨基酸序列是SEQIDNO：2。

該融合蛋白的氨基酸序列SEQIDNO：2同時具有SEQIDNO：5和SEQIDNO：6中的氨基酸序列。

該融合蛋白同時具有雞溶菌酶和雞β-防御素的功能，同時該融合蛋白對金黃色葡萄球菌有明顯的抑菌活性，其最小抑菌濃度低于4mg/ml。

本發(fā)明的設(shè)計原理：為了防止雞溶菌酶或雞β-防御素在宿主菌中表達成有活性的蛋白形式，而造成的宿主菌的自殺效應(yīng)，設(shè)計連接肽將雞溶菌酶和雞β-防御素連接起來導(dǎo)入宿主細胞，將其融合表達，由于通過這種方式表達的產(chǎn)物蛋白沒有活性，并且融合蛋白的分子量較大，在宿主細胞中大量表達會形成包涵體，有利于之后的蛋白分離純化。

雞溶菌酶和雞β-防御素7，都是存在于動物體內(nèi)的高效抗菌(抑菌)多肽，對多種微生物發(fā)揮抑殺作用，本身無殘留，也不產(chǎn)生賴藥性，作為抗菌藥物、食品添加劑、防腐劑，發(fā)揮作用后還能增加食品的蛋白質(zhì)含量。

具體實施方式

實施例1、PCR引物設(shè)計

在保留雞溶菌酶基因和雞β-防御素基因的功能區(qū)域基礎(chǔ)上，設(shè)計PCR引物；本發(fā)明是由連接肽過渡連接的融合蛋白，因此在兩基因的連接區(qū)引入連接肽編碼序列(Linker)。

1、雞溶菌酶基因引物：

提取雞輸卵管總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以其為模板，根據(jù)Genbank公布的雞溶菌酶基因的序列，運用引物設(shè)計軟件(primer5.0)，設(shè)計上下游引物，P1和P2，用于擴增刪除終止密碼子的雞溶菌酶基因。在上游引物中引入BamH I酶切位點序列，下游引物中加入linker序列。

上游引物序列如下，引物名稱為P1：

5′-CGGGATCCGATGAAAGTCTT-3′(劃線部分為BamH I酶切位點)；

下游引物序列如下，引物名稱為P2：

5′-linker-CAGCCGGCAGCCTCTG-3′

(linker為5′-tccacctgaaccacctccacctgaaccacctccacc-3′)；

2、雞β-防御素7基因引物：

提取雞脊椎總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以其為模板，根據(jù)Genbank公布的雞β-防御素7基因的序列，運用引物設(shè)計軟件(primer5.0)，設(shè)計上下游引物，P3和P4，用于擴增刪除終止密碼子的雞β-防御素7基因。在下游引物中引入Hind III酶切位點序列，上游引物中加入linker序列。

上游引物序列如下，引物名稱為P3：

5′-linker-AGGCCTATTGATACTTGTAGGCTT-3′

(linker為5′-ggtggaggtggttcaggtggaggtggttcaggtgga-3′)；

下游引物序列如下，引物名稱為P4：

5′-AGAAGCTTAGTTATCAGCTCCTCC-3′(劃線部分為Hind III酶切位點)

3、雞溶菌酶和雞β-防御素7融合基因的基因引物：

以所述雞溶菌酶基因和雞β-防御素7基因的PCR擴增產(chǎn)物作為模板，以引物P1和P4為引物，進行PCR擴增，得到雞溶菌酶和雞β-防御素7融合基因。

實施例2、PCR擴增

1、擴增雞溶菌酶基因片段：

此為PCR1，其反應(yīng)體系為：含Lyz gene質(zhì)粒0.5μl，上游引物(P1)0.5μl，下游引物(P2)0.5μl，2×HiFi-PCR Master12.5μl，加ddH2O至總體積25μl；擴增條件為：95℃變性5min后進入循環(huán)，95℃變性30s，57℃復(fù)性30s，72℃延伸30s，30個循環(huán)后在72℃延伸10min。

2、擴增雞β-防御素7基因片段：

此為PCR2，其反應(yīng)體系為：含β-Gal7gene質(zhì)粒0.5μl，上游引物(P1)0.5μl，下游引物(P2)0.5μl，2×HiFi-PCR Master12.5μl，加ddH2O至總體積25μl；擴增條件為：95℃變性5min后進入循環(huán)，95℃變性30s，52℃復(fù)性30s，72℃延伸30s，30個循環(huán)后在72℃延伸10min。

3、雞溶菌酶基因和雞β-防御素基因的PCR擴增結(jié)果

圖1是雞溶菌酶基因Lyz的PCR擴增結(jié)果圖，圖2是雞β-防御素7基因β-Gal7的PCR擴增結(jié)果圖，從圖中可以看出雞溶菌酶基因和雞β-防御素基因的PCR產(chǎn)物長分別是393bp和132bp，和目的基因的大小一致。

實施例3、融合基因Lyz-β-Gal7的構(gòu)建(重疊延伸PCR法)

首先，分別進行PCR1反應(yīng)擴增雞溶菌酶基因Lyz gene和PCR2反應(yīng)擴增雞抗菌肽基因β-Gal7gene，各取PCR產(chǎn)物25ul分別進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳，并用干凈的手術(shù)刀切下在100bp至250bp之間、在250bp至500bp之間的目的片段凝膠，并用DNA膠回收試劑盒純化回收凝膠中的DNA片段，取5～10ul回收溶液用分光光度計測OD，計算其中的基因分子濃度，分別取適當(dāng)體積的Lyz gene回收液和β-Gal7gene回收液使兩基因等量混合，進行PCR3反應(yīng)構(gòu)建和擴增Lyz-β-Gal7gene，此處PCR3反應(yīng)的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如表1所示。最后對PCR3反應(yīng)產(chǎn)物進行1.2％瓊脂糖凝膠電泳和目的片段Lyz-β-Gal7gene膠回收純化。

圖3為融合基因Lyz-β-Gal7的PCR擴增結(jié)果圖，從圖中可以看出雞溶菌酶和雞β-防御素融合基因Lyz-β-Gal7的PCR產(chǎn)物為573bp，和目的基因的大小一致。

表1 PCR3構(gòu)建和擴增Lyz-β-Gal7融合基因的體系和操作

實施例4、融合基因Lyz-β-Gal7的T載體克隆與擴增

Taq DNA聚合酶參與PCR反應(yīng)延伸DNA鏈時在新生DNA鏈的3′端添加突出的A堿基，該PCR產(chǎn)物與T Vector 3′端突出的T堿基進行AT配對，再受到連接酶的催化，使目的基因與T載體形成環(huán)形質(zhì)粒，可導(dǎo)入E.coli DH5α擴增。

含目的片段Lyz-β-Gal7gene的純化PCR3產(chǎn)物10μl，T Vector2.0μl(約20ng)，10×連接酶緩沖液1μl，T4DNA連接酶(濃度U/μl)2μl，50％PEG 4000 2μl，10×Ligation Buffer 2μl，ddH2O 2μl，總體積20μl。16℃連接12h，連接產(chǎn)物可導(dǎo)入E.coli DH5α擴增T-Lyz-β-Gal7或于-20℃冰箱保存。

圖4為融合基因Lyz-β-Gal7與T Vector連后的質(zhì)粒圖譜。

實施例5、T載體連接與酶切

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、感受態(tài)的制備、陽性克隆篩選、質(zhì)粒DNA的提取均按文獻所記載的現(xiàn)有技術(shù)進行。融合基因片段與和T載體連接并導(dǎo)入宿主菌DH5α后，篩選陽性重組質(zhì)粒T-Lyz-β-Gal7；然后，提取質(zhì)粒T-Lyz-β-Gal7，BamH I，Hind III雙酶切，重組質(zhì)粒Lyz-β-Gal7–T雙酶切，酶切體系如下：10×MBuffer3.0μl，BamH I限制性內(nèi)切酶(10U/μl)1.0μl，Hind III限制性內(nèi)切酶(10U/μl)1.0μl，T–Lyz-β-Gal7重組克隆載體20.0μl，加ddH2O至總體積30μl，反應(yīng)液混勻，37℃酶切過夜。電泳，割膠回收目的基因Lyz-β-Gal7。

圖5為經(jīng)氨芐青霉素抗性及α-互補篩選得到的陽性重組質(zhì)粒的PCR擴增結(jié)果圖。

實施例6、雞溶菌酶-雞β-防御素7融合基因表達載體的構(gòu)建：

提取的Lyz-β-Gal7目的片段與BamH I，Hind III雙酶切、純化的質(zhì)粒pET32a連接，構(gòu)建表達載體，導(dǎo)入BL21(DE3)，篩選陽性克隆。

目的基因和表達載體pET32a片段連接，連接反應(yīng)體系如下：酶切載體DNA2.0μl，目的基因10.0μl，T4DNA連接酶2.0μl，50％PEG 40002.0μl，10×Ligation Buffer2.0μl，加ddH2O至總體積20μl，于37℃連接過夜。連接產(chǎn)物大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆吧。

實施例7、融合表達產(chǎn)物純化及活性檢測

7.1融合表達產(chǎn)物純化

取重組工程菌株pET32a/Lyz-β-Gal7/E.coli BL21單菌落或少量菌液接種于2支裝有3ml含100ug/ml Amp的LB液體培養(yǎng)基的10ml試管中，37℃振蕩培養(yǎng)13～15h活化。按1％取5ml活化菌液接種于500ml含100ug/ml Amp的LB液體培養(yǎng)基(可分裝于多個錐形瓶)，37℃180r/min培養(yǎng)3h，加終濃度為0.7mmol/L的IPTG誘導(dǎo)4h。

采用超聲波破碎儀破碎菌懸液，條件設(shè)置為：工作時間5s，間隙時間6s，80個循環(huán),冰浴中超聲波破碎菌液20mL左右。對破碎上清液中的目的蛋白用鎳柱進行分離純化，純化步驟如下：

(1)用50ml滅菌離心管收集菌液，用冰冷10ml PBS清洗菌液1次，離心。

(2)重懸于20ml 1×Bind Buffer，冰浴超聲破碎，同實例7，至菌液不在粘稠，分裝至10ml離心管。

(3)4℃12000r/min20min，收集上清，沉淀用5ml 1×Bind Buffer重懸，離心取上清。

(4)1ml Ni-NTA預(yù)裝柱，先用10ml滅菌dH2O洗柱，控制流速0.5ml/min。

(5)10ml 1×Bind Buffer進行平衡，流速:0.5ml/min，檢測流出液至A280nm＝0為洗干凈。

(6)將準(zhǔn)備好的樣品上樣(pET28a-lyz-β-Gal7/BL21表達菌的破碎上清)，上清加入柱內(nèi)(結(jié)合時間1h-1.5h)流速控制在0.1-0.5ml/min左右，用一支10ml離心管收集上樣后的流出液。

(7)10ml 1×Wash Buffer洗柱子，分管收集洗脫液10-15管，流速在0.5ml/min左右，至A280nm＝0為止。

(8)5ml 1×Elution Buffer洗柱子(收集洗脫液5管)。

(9)收集洗脫峰，放入透析袋于4℃，對0.01M pH7.4PBS透析24h，期間更換6次透析液(每次更換一半，最后一次全部更換)，透析結(jié)束，用PEG8000濃縮，12000rpm 4℃離心10min，收集上清，用于后續(xù)試驗或-80℃保存。用10ml 1×Refresh Buffer洗柱子，直至A280nm＝0為止，再用10ml1×Bind Buffer進行平衡，可接著作下一次純化。

純化后的目的蛋白含量測定：收集用鎳柱分離純化的Lyz-β-Gal7融合蛋白溶液，取100ul該蛋白液用鎳柱洗脫液進行適當(dāng)稀釋，以鎳柱洗脫液作參比，測OD₂₆₀和OD₂₈₀，粗略計算蛋白濃度C＝1.45*OD₂₈₀—0.74*OD₂₆₀(mg/ml)。

圖6為鎳柱分離純化前后超聲破碎上清液的SDS-PAGE圖，圖中可見融合蛋白Lyz-β-Gal7條帶。圖7為超聲破碎上清液用鎳柱進行分離純化后的SDS-PAGE圖，圖中可見雜條帶基本消失。

7.2融合表達產(chǎn)物活性檢測

蛋白活性檢測(Lyz-β-Gal7融合蛋白對金黃色葡萄球菌的抑制)：參考混菌瓊脂平板打孔法，將固體培養(yǎng)基冷至50℃時，加入終密度為5×10⁶個/ml細菌(乘以混合體積得出要加的菌體數(shù)量，菌體數(shù)量除以菌體密度得出體積，而菌體密度由比濁法測定)，混勻后倒平板，厚度約0.5～1cm，凝固后用打孔器打兩個孔，右邊孔加入100ul 7mg/ml Lyz-β-Gal7融合蛋白(透明圈直徑達到3.9cm)；左邊孔加入等體積的透析液PBS作對照。圖8為Lyz-β-Gal7融合蛋白對金黃色葡萄球菌作用結(jié)果圖。

探究Lyz-β-Gal7融合蛋白對金黃色葡萄球菌的最小抑制濃度：重復(fù)上述步驟，用打孔器打4個孔，孔1、孔2、孔3、孔4，取出圓孔內(nèi)的瓊脂塊，分別加入100ul濃度分別為1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml的融合蛋白液。把加樣完后的平板正向平放于裝有少量水的盒子內(nèi)，37℃培養(yǎng)18～24h。圖9為不同濃度Lyz-β-Gal7融合蛋白對金黃色葡萄球菌作用結(jié)果圖。

結(jié)果表明，本發(fā)明的融合蛋白對金黃色葡萄球菌有明顯的抑菌活性，最小抑菌濃度低于4mg/ml，純化后的蛋白電泳得到單一的、大小與理論分子量一致的目的條帶。

最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護范圍。