專利名稱：：通過轉(zhuǎn)座的dna整合的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種新的DNA結(jié)構(gòu)，可用于構(gòu)建具有在其基因組上整合了一個(gè)以上感興趣的DNA序列的拷貝的細(xì)菌細(xì)胞，該細(xì)胞可能無任何選擇標(biāo)記，還涉及構(gòu)建所述細(xì)胞的方法。原核細(xì)胞轉(zhuǎn)座因子是可以插入原核基因組的單位點(diǎn)或多位點(diǎn)的分立DNA序列。通常，這些因子組成編碼轉(zhuǎn)座酶蛋白的基因和轉(zhuǎn)座框，該轉(zhuǎn)座框包括一個(gè)抗性基因，其側(cè)翼為可由轉(zhuǎn)座酶蛋白識(shí)別的序列。轉(zhuǎn)座框進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組(可以隨機(jī)發(fā)生或發(fā)生于熱點(diǎn)位點(diǎn))的轉(zhuǎn)座作用是通過轉(zhuǎn)座酶蛋白與轉(zhuǎn)座框的側(cè)翼序列之間的識(shí)別和相互作用而實(shí)現(xiàn)的。存在不同類型的轉(zhuǎn)座因子。一種類型包括i)插入序列(IS)，其為編碼轉(zhuǎn)座酶蛋白或其它介導(dǎo)轉(zhuǎn)座作用的決定子的小型(小于2kb)DNA片段，和ii)復(fù)合轉(zhuǎn)座子，即其側(cè)翼為兩個(gè)拷貝插入序列的DNA片段。所有IS序列的末端部分都包括反向重復(fù)序列。轉(zhuǎn)座酶蛋白的作用是識(shí)別這些末端序列并與這些序列相互作用，以實(shí)現(xiàn)在基因組里的轉(zhuǎn)座作用。第二種類型的轉(zhuǎn)座子是轉(zhuǎn)座子的Tn3家族。這些轉(zhuǎn)座子編碼與兩步轉(zhuǎn)座過程有關(guān)的兩種產(chǎn)物一種為轉(zhuǎn)座酶，一種為解離酶。屬于第二種類型的轉(zhuǎn)座子具有約35-40bp的反向末端重復(fù)序列。第三種類型包括噬菌體Mu及相關(guān)噬菌體。噬菌體Mu比其它轉(zhuǎn)座子大，其基因組為36kb。Mu編碼參與轉(zhuǎn)座過程的兩種基因產(chǎn)物，一種為70kDa的轉(zhuǎn)座酶，一種為約33kDa的輔助蛋白。Mu區(qū)別于其它轉(zhuǎn)座子的一個(gè)異常特征是，其末端不是反向重復(fù)序列。不過，業(yè)已證實(shí)Mu轉(zhuǎn)座酶在體外結(jié)合試驗(yàn)中能與兩端結(jié)合。轉(zhuǎn)座子已被廣泛應(yīng)用于在革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌里的誘變和克隆Youngman，P.J.Perkins，J.B.，Losick，R.(1983)GenetictranspositionandinsertionalmutagenesisinBacillussubtiliswithStreptococcusfaecalistransposonTn917，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80，2305-2309；Youngman，P.，Perkins，J.B.，Losick，R.(1984)，ConstructionofacloningsitenearoneendofTn917intowhichforeignDNAmaybeinsertedwithoutaffectingtranspositioninBacillussubtilisorexpressionofthetransposon-borneermgene，Plasmid12，1-9；Youngman，P.(1985)PlasmidvectorsforrecoveringandexpolitingTn917transpositionsinBacillussubtilisandOthergrampositives，P.79-103，見K.Hardy(著)Plasmidsapracticalapproach，IRLPress，Oxford；Kleckner，N.，Roth，J.，Botstein，D.(1977)GeneticengineeringinVivousingtranslocatabledrug-resistanceelements.Newmethodsinbacterialgenetics，J.Mol.Biol.，116，125-159；Wati，M.R.，Priest，F(xiàn).G.，Mitchell，W.J.(1990)MutagenesisusingTn917inBacilluslicheniformis.FEMSmicrobiol.Lett.，71，211-214；Petit，M.-A.，Bruand，C.，Janniere，L.，Ehrlich，S.D.(1990)Tn10-derivedtransposonsactiveinBacillussubtilis.J.Bacteriol.，172，6736-6740.后一件參考文獻(xiàn)披露了pHV1248和pHV1249，它們是復(fù)制對熱敏感的質(zhì)粒，其帶有源于Tn10的轉(zhuǎn)座酶基因，該基因被修飾成可在枯草芽孢桿菌中表達(dá)，并有足夠的源于Tn10的IS10因子的序列位于氯霉素抗性基因兩側(cè)(小型-Tn10)，以便小型-Tn10能夠轉(zhuǎn)座到枯草芽孢桿菌的染色體中。Maguin等(Maguin，E.，Duwat，P.，Hege，T.，Ehrlich，D，Grruss，A.(1992)Newthermosensitiveplasmidforgram-positivebacteria，J.Bacteriol.174，5633-5638)披露了該系統(tǒng)的另一種形式。EP485701披露了將轉(zhuǎn)座子用于將單拷貝DNA序列導(dǎo)入原核細(xì)胞基因組，轉(zhuǎn)座酶蛋白是順式編碼的。Slugenova等((1993)，Euhancedα-amylaseProductionbychromosomalintegrationofpTVA1inindustrialstraininB.subtilis，BiotechnologyLetters，15，483-488)披露了質(zhì)粒pTVA1的多次整合，該質(zhì)粒含有一個(gè)修飾的轉(zhuǎn)座子Tn917和一個(gè)位于該轉(zhuǎn)座子之外的感興趣的α-淀粉酶基因。在所得到的菌株中存在抗生素抗性標(biāo)記基因。EP0332488披露了一種用于構(gòu)建多拷貝細(xì)菌菌株的轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，即該菌株含有多拷貝的感興趣的基因，還包括隨感興趣的基因一起導(dǎo)入的多拷貝選擇標(biāo)記基因。以噬菌體Mu轉(zhuǎn)座子為例對將該系統(tǒng)用于修飾革蘭氏陰性細(xì)菌進(jìn)行說明。W095/01095披露了將小型轉(zhuǎn)座子用作一種載體，用于將外源基因穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化到真核(如動(dòng)物)染色體中。Simon，R.，Priefer，U.，Pühler，A.((1983)，AbroadhostrangemobilizationsystemforinvivogeneticengineringTransposonmutagenesisingram-negativebacteria，Bio/Technology，l，784-791)披露了將大腸桿菌特異性載體用于通過接合作用將轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)入其它革蘭氏陰性菌株。業(yè)已通過整合含有感興趣的基因和一個(gè)抗生素選擇標(biāo)記的遺傳結(jié)構(gòu)，并在有大劑量抗生素的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞以擴(kuò)增所述結(jié)構(gòu)而生產(chǎn)出幾種上述多拷貝菌株。因此，所得到的細(xì)胞通常含有若干抗生素抗性基因。這些基因的存在是不需要的，特別是環(huán)保和產(chǎn)品許可角度來看尤為如此。業(yè)已將非抗生素選擇標(biāo)記用于構(gòu)建多拷貝菌株。Herrero，M.，deLorenzo，V.，Timmis，K.N，((1990)，Transposonvectorscontainingnon-antibioticresistanceselectionmarkersforcloningandstablechromosomalinsertionofforeigngenesingram-negativebacteria，J.Bacteriol.，172，6557-6567)披露了這樣的系統(tǒng)，其中，將除草劑或重金屬抗性用作選擇標(biāo)記。在DE4231764中披露了使用抗生素抗性標(biāo)記的另一種方案，其中，將Thy-(三甲氧芐二氨嘧啶抗性)和Thy+(thy原養(yǎng)型)的交替選擇用于把產(chǎn)物基因?qū)胙堪麠U菌，從而避免使用選擇標(biāo)記。源于細(xì)菌染色體的DNA片段的特異缺失通常是通過同源重組的方法進(jìn)行的(Hamilton，C.H.，Aldea，M.，Washburn，B.K.，Babitzke，P.(1989)，NewmethodofgeneratingdeletionsandgenereplacementinEsderichiacoli.J.Bacteriol.，171，4617-4622；Maguin，E.，Duwat，P.，Hege，T.，Ehrlich，D，Gruss，A.(1992).Newthermosensitiveplasmidforgram-positivebacteria.J.Bacteriol.174，5633-5638)。不過，同源重組不大適于從具有多個(gè)串聯(lián)拷貝的這種基因的菌株中缺失抗性標(biāo)記基因，所述基因各自與感興趣的基因的一個(gè)拷貝連接，因?yàn)橥粗亟M同樣會(huì)使感興趣的基因的過多的拷貝缺失。業(yè)已披露了(Hasan，N.，Koob，M.，Szybalski，w.(1994)，Escherichiacoligenometargeting，I.，Cre-lox-mediatedinvitrogenerationoforiplasmidsandtheirinvivochromosomalintegrationandretrieval.Gene，150，51-56)將位點(diǎn)專一性重組系統(tǒng)用于整合和挽回源于細(xì)菌染色體的序列的構(gòu)思，該構(gòu)思采用源于λ噬菌體或P1的因子，并披露了實(shí)現(xiàn)這一目的的一些具體方法。Abremski，K.，Hoess，R.，Sternberg，N.進(jìn)一步披露了該cre-lox系統(tǒng)((1983)，StudiesonthepropertiesofP1site-specificrecombinationEvidencefortopologicallyunlinkedproductsfollowingrecombination，cell，321301-1311)。另一種系統(tǒng)基于廣宿主范圍質(zhì)粒RP4的重組系統(tǒng)(Eberl，L.，Kristensen，C.S.，Givskov，M.，Grohmann，E.，Gerlitz，M.，Schwab，H.(1994)，AnalysisofthemultimerresolutionsystemencodedbytheparCBAoperonofbroad-host-rangeplasmidRP4，Mol.Microbiol.，12，131-141))。Stark，W.M.，Boocock，M.R.，Sherratt，D.J.(1992)，Catalysisbysite-specificrecombinases，TrendsinGenetics，8，432-439)的文章對解離酶的作用機(jī)理進(jìn)行了綜述。Camilli等((1994)，Useofgeneticrecombinationasareporterofgeneexpression，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91，2634-2638)披露了將res位點(diǎn)和源于霍亂弧菌(Vibriocholera)的γδ轉(zhuǎn)座子的解離酶體為染色體基因的基因表達(dá)的穩(wěn)定的可遺傳的標(biāo)記。該解離系統(tǒng)不是用于切除標(biāo)記基因的。Chang，L.-K.等((1994)，ConstructionofTn917asl，atransposonusefulformutagenesisandcloningofBacillussubtilisgenes，Gene，150，129-134)披露了含有erm-res-tnpA(轉(zhuǎn)座酶)-tnpR(解離酶)samtIR-res-ovicolE1-ABR1-ABR2-IR(pD917；Tn917acl)的質(zhì)粒(pE194)。其中的2個(gè)res位點(diǎn)使轉(zhuǎn)座子能正確發(fā)揮功能，不會(huì)切除間插DNA。有報(bào)道說寬宿主范圍的革蘭氏陽性質(zhì)粒pAMβ1(Clewell，D.B.，Yagi，Y.，Dunny，G.M.，Schultz，S.K.(1974)Characterizationofthreeplasmiddeoxyribonucleicacidmoleculesinastrainofstreptococcusfaecalisidentificationofaplasmiddeterminingerythromycinresistance.J.Bacteriol.117，283-289)含有一個(gè)解離系統(tǒng)，該系統(tǒng)通過位點(diǎn)專一性重組過程將質(zhì)粒多體解離成單體，該過程需要一種特殊的由質(zhì)粒編碼的酶(解離酶)和一個(gè)位于該質(zhì)粒上的位點(diǎn)res(Swinfield，T.-J，Janniere，L.，Ehrlich，S.D.，Minton，N.P.(1991).CharacterizationofaregionoftheEnterococcusfaecalisplasmidpAMβ1whichenhancesthesegregationalstabilityofpAMβ1-devivedcloningvectorsinBacillussubtilis.Plasmid26，209-221；Janniere，L.，Gruss，A.，Ehrlich，S.D.(1993)Plasmids，pp.625-644，inSonenshein，A.L.，Hoch，J.A.，Losick，R.(著)Bacillussubtilisandothergram-positivebacteriaBiochemistry，physiologyandmoleculargenetics.Americonsocietyformicrobiology，WashingtonD.C.)。曾經(jīng)提出用一種位點(diǎn)專一性重組系統(tǒng)從細(xì)菌細(xì)胞的基因組中除去一個(gè)單一的選擇標(biāo)記基因。例如Dale等(1991)Genetransferwithsubsequentremovaloftheselectiongenefromthehostgenome，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，10558-10562)披露了將所述cre/lox系統(tǒng)用于從轉(zhuǎn)基因植物中除去標(biāo)記基因的用途，并指出該系統(tǒng)的使用可以避免在隨后幾輪將基因轉(zhuǎn)入同一宿主的過程中對不同選擇標(biāo)記的需要。Kristensen，C.S.等((1995)，J.Bacteriol.，177，52-58)披露了將質(zhì)粒RP4的多體解離系統(tǒng)用于從革蘭氏陰性細(xì)菌上精確切除染色體片段(如與異源DNA一起導(dǎo)入的標(biāo)記基因)的用途。它指出，該系統(tǒng)被設(shè)計(jì)成有利于異源DNA片段插入染色體的發(fā)生，最終避免使用任何選擇標(biāo)記。WO95/02058披露了一種新的源于蘇云金芽胞桿菌(B.thuringiensis)的轉(zhuǎn)座子(tn5401)，其含有轉(zhuǎn)座酶、解離酶和res位點(diǎn)。該轉(zhuǎn)座子被用于含有蘇云金芽胞桿菌DNA(如起點(diǎn)和毒素基因)的質(zhì)粒中，其側(cè)翼為res位點(diǎn)、非蘇云金芽胞桿菌DNA(如大腸桿菌起點(diǎn)、選擇標(biāo)記基因)。將該質(zhì)粒導(dǎo)入蘇云金芽胞桿菌中。然后，導(dǎo)入表達(dá)解離酶的質(zhì)粒(如含有完整轉(zhuǎn)座子-但僅作為解離酶供體的熱敏感性質(zhì)粒)，從而將非蘇云金芽胞桿菌DNA從所述第一質(zhì)粒上切除?；谝陨纤玫奈墨I(xiàn)，可對現(xiàn)有技術(shù)的狀態(tài)作如下總結(jié)通過轉(zhuǎn)座作用插入感興趣的多基因的方法是已知的，如在EP332488中所述。然而，所有含有感興趣的多轉(zhuǎn)座序列的菌株都含有選擇標(biāo)記。通過位點(diǎn)專一性重組從染色體或質(zhì)粒上除去標(biāo)記基因的方法是已知的(參見Kristensen等，(1995)，Eberl等(1994)，W095/02058)。已知可以除去通過轉(zhuǎn)座子導(dǎo)入的標(biāo)記基因。不存在異源選擇標(biāo)記基因的多拷貝菌株是已知的(DE4231764)，這些菌株是通過取決于Thy標(biāo)記基因的使用的繁瑣的方法構(gòu)建的。本發(fā)明的目的是構(gòu)建細(xì)菌細(xì)胞，該細(xì)胞具有穩(wěn)定的、固定的和確定拷貝數(shù)的一個(gè)或幾個(gè)感興趣的基因，在最終的菌株中沒有選擇標(biāo)記基因。本發(fā)明基于以下驚人發(fā)現(xiàn)DNA結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)座作用可用于構(gòu)建多拷貝革蘭氏陽性細(xì)菌菌株，該DNA結(jié)構(gòu)除了實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)座所需的轉(zhuǎn)座酶靶序列和轉(zhuǎn)座酶基因之外，還含有用于位點(diǎn)專一性重組酶的靶序列。第一方面，本發(fā)明涉及一種可用于整合到宿主細(xì)胞基因組上的DNA結(jié)構(gòu)，該DNA結(jié)構(gòu)含有結(jié)構(gòu)IR(1)-P-R-M2-R-IR(2)或IR(1)-R-M2-R-P-IR(2)，其中IR(1)和IR(2)表示轉(zhuǎn)座酶靶序列，P為含有感興趣的DNA序列的DNA片段，R為用于位點(diǎn)專一性重組酶的靶序列，和M2為一個(gè)選擇標(biāo)記基因，該結(jié)構(gòu)與一個(gè)編碼一種轉(zhuǎn)座酶蛋白的基因(T)相關(guān)，該轉(zhuǎn)座酶蛋白能夠識(shí)別并與轉(zhuǎn)座酶靶序列IR(1)和IR(2)相互作用，該基因(T)位于由IR(1)和IR(2)序列所限定的結(jié)構(gòu)外面。在本文中，“相關(guān)”一詞是指T存在于本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)上，但并不一定與由IR(1)和IR(2)所限定的結(jié)構(gòu)(即位于IR(1)和IR(2)之間并包括IR(1)和IR(2)的結(jié)構(gòu))直接接觸。因此，在該結(jié)構(gòu)和T之間可能存在接頭或其它序列。T的確切位置并不重要，只要該基因位于由IR(1)和IR(2)限定的結(jié)構(gòu)外即可。因此，T可以位于由IR(1)和IR(2)限定的結(jié)構(gòu)的任一側(cè)。在本文中，“選擇標(biāo)記基因”是指編碼一種基因產(chǎn)物的DNA序列，它能使表達(dá)該產(chǎn)物的宿主細(xì)胞具有一種選擇特征，如抗一種抗生素的抗性。DNA序列M2還可包括一個(gè)或幾個(gè)表達(dá)編碼該選擇標(biāo)記的DNA序列所需或參與其表達(dá)的調(diào)節(jié)因子，如啟動(dòng)子、終止子等。所述調(diào)節(jié)因子可以是與所述DNA序列異源或同源的?！稗D(zhuǎn)座酶基因”是指編碼一種轉(zhuǎn)座酶蛋白即一種為進(jìn)行轉(zhuǎn)座作用所必需的蛋白的DNA序列。該基因還可包括一個(gè)或幾個(gè)表達(dá)編碼該轉(zhuǎn)座酶蛋白的DNA序列所需或參與其表達(dá)的調(diào)節(jié)因子，如啟動(dòng)子、終止子等。所述調(diào)節(jié)因子可以是與所述DNA序列異源或同源的。“轉(zhuǎn)座酶靶序列”是指被由轉(zhuǎn)座酶基因T編碼的轉(zhuǎn)座酶蛋白識(shí)別的DNA序列。轉(zhuǎn)座酶靶序列IR(1)和IR(2)應(yīng)當(dāng)含有源于轉(zhuǎn)座子末端序列的足夠的DNA，以保留這些序列的功能，以便當(dāng)表達(dá)由T編碼的轉(zhuǎn)座酶時(shí)，包括并位于這些序列內(nèi)的結(jié)構(gòu)可進(jìn)行轉(zhuǎn)座。足以轉(zhuǎn)座的最小序列的組成和長度的變化取決于該系統(tǒng)是由哪一種轉(zhuǎn)座子形成的。例如，對于Tn10衍生的轉(zhuǎn)座酶靶序列來說，23或42bp就足以進(jìn)行轉(zhuǎn)座作用(Kleckner，N.(1988)TransposonTnlo.pp227-268，見Berg，D.E.，和Howe，M.M.(著)MobileDNA.Americansocietyformicrobiology，Washington，D.C.)。在本文中，“用于位點(diǎn)專一性重組酶的靶序列”是指一種由位點(diǎn)專一性重組酶識(shí)別的DNA序列(下面作進(jìn)一步討論)。靶序列可能是，但并非必須是相同的。因此，這些序列之間可能存在差異，只要重組酶能夠識(shí)別并與該序列相互作用即可?！案信d趣的DNA序列”這一表達(dá)形式被用于表示一段編碼想要的RNA或蛋白產(chǎn)物的序列(與宿主細(xì)胞異源或?yàn)樗拗骷?xì)胞所固有)或由該序列本身提供宿主細(xì)胞需要的特性，如突變表型。如果需要，該DNA序列還可以包括一個(gè)或幾外表達(dá)編碼想要的RNA或蛋白產(chǎn)物的DNA序列所需的或參與其表達(dá)的調(diào)節(jié)因子，如啟動(dòng)子、終止子等。所述調(diào)節(jié)因子可以與所述DNA序列異源或同源。業(yè)已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的新型DNA結(jié)構(gòu)特別適于構(gòu)建在其基因組中含有一個(gè)以上，優(yōu)選為多個(gè)隨機(jī)定位的整合DNA序列拷貝的菌株，該細(xì)胞的優(yōu)選形式為不含編碼不需要的選擇標(biāo)記的基因，例如，從環(huán)保角度看，該標(biāo)記基因的存在是不需要的。應(yīng)當(dāng)指出，本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)與EP485701所提供的DNA結(jié)構(gòu)的差別在于本發(fā)明DNA結(jié)構(gòu)上的選擇標(biāo)記基因位于其旁側(cè)為轉(zhuǎn)座酶靶序列的結(jié)構(gòu)之外。這種定位對于構(gòu)建本發(fā)明的無標(biāo)記細(xì)胞來說是重要的。采用上述用于缺失標(biāo)記基因的重組系統(tǒng)的、用于通過轉(zhuǎn)座作用構(gòu)建修飾細(xì)胞的另一種方法，是通過同源重組實(shí)現(xiàn)標(biāo)記基因的缺失的。因此，第二方面，本發(fā)明涉及一種提供的DNA結(jié)構(gòu)，其含有結(jié)構(gòu)IR(1)-P-R′-M2-R″-IR(2)或IR(1)-R′-M2-R″-P-IR(2)，其中IR(1)和IR(2)表示轉(zhuǎn)座酶靶序列，P為一個(gè)含有感興趣的DNA序列的DNA片段，R′和R″分別為以平行重復(fù)方式提供的位于選擇標(biāo)記基因M2兩側(cè)的DNA序列，和M2為選擇標(biāo)記基因，該結(jié)構(gòu)與編碼一種轉(zhuǎn)座酶蛋白的基因(T)相關(guān)，該轉(zhuǎn)座酶蛋白能識(shí)別并與轉(zhuǎn)座酶靶序列IR(1)和IR(2)相互作用，該基因(T)位于由IR(1)和IR(2)序列所限定的結(jié)構(gòu)外面，即位于結(jié)構(gòu)IR(1)-p-R′-M2-R″-IR(2)或IR(1)-R′-M2-R″-P-IR(2)外面?！耙云叫兄貜?fù)方式提供”這一表達(dá)形式是指在M2兩側(cè)的DNA序列R′和R″的同源性足夠高，以便在這兩種序列之間可以進(jìn)行同源重組。理想的是，序列R′和R″各自包括一個(gè)大致相同的片段，其長度至少為20個(gè)核苷酸，至少50個(gè)核甘酸較好，如50-100個(gè)核苷酸，至少500(如500-1000)個(gè)核苷酸更好，至少1000個(gè)核苷酸最好，如1000-3000個(gè)核苷酸。用于位點(diǎn)專一性重組酶的靶序列的存在(第一方面)或平行重復(fù)序列的存在(第二方面)，使得標(biāo)記基因M2可以從宿主細(xì)胞中特異缺失，該細(xì)胞的基因組上通過轉(zhuǎn)座而獲得了所述標(biāo)記基因。更具體地講，根據(jù)本發(fā)明第一和第二方面的DNA結(jié)構(gòu)，其標(biāo)記基因M2分別位于用于位點(diǎn)專一性重組酶的靶序列之間或位于平行重復(fù)序列之間，這種DNA結(jié)構(gòu)特別適用于構(gòu)建無標(biāo)記的多拷貝菌株(即在其基因組中含有多個(gè)拷貝的整合的感興趣的DNA序列的細(xì)菌細(xì)胞)。簡言之，各DNA結(jié)構(gòu)擬用于兩步整合過程，其中，在第一步通過轉(zhuǎn)座作用和選擇M2+細(xì)胞實(shí)現(xiàn)片段IR(1)-P-R-M2-R-IR(2)或IR(1)-R-M2-R-P-IR(2)(第一方面)或者IR(1)-p-R′-M2-R″-IR(2)或IR(1)-R′-M2-R″-P-IR(2)(第二方面)的基因組整合，而在第二步通過以反式形式提供的位點(diǎn)專一性重組酶及其與標(biāo)記基因M2兩側(cè)的靶序列R相互作用(第一方面)或通過平行重復(fù)序列R′和R″之間的重組(第二方面)而將選擇標(biāo)記基因M2除去。在本文中，“無標(biāo)記”一詞是指具有整合的多拷貝感興趣的DNA序列的細(xì)胞不表達(dá)選擇標(biāo)記，如抗生素抗性，這種抗性在細(xì)胞中的存在是不需要的，將該標(biāo)記基因用于構(gòu)建細(xì)胞是必需的或有利的。下面將對本發(fā)明的各方面作更詳細(xì)地說明。本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)除了上述本發(fā)明第一方面和第二方面的DNA結(jié)構(gòu)之外，在第三方面，本發(fā)明涉及一種DNA結(jié)構(gòu)，其包括結(jié)構(gòu)IR(1)-R-M2-T-R-P-IR(2)，IR(1)-P-R-M2-T-R-IR(2)，IR(1)-R-T-M2-R-P-IR(2)或IR(1)-P-R-T-M2-R-IR(2)，其中IR(1)和IR(2)表示轉(zhuǎn)座酶靶序列，P為一段感興趣的DNA序列，R為用于位點(diǎn)專一性重組酶的靶序列，M2為選擇標(biāo)記基因，和T為轉(zhuǎn)座酶基因T。與本發(fā)明第一方面的DNA結(jié)構(gòu)相比，本發(fā)明第三方面的DNA結(jié)構(gòu)的DNA結(jié)構(gòu)包括位于由IR(1)和IR(2)限定的結(jié)構(gòu)里面而不是位于該結(jié)構(gòu)外面的轉(zhuǎn)座酶基因T。類似地，第四方面，本發(fā)明涉及一種DNA結(jié)構(gòu)，其包括結(jié)構(gòu)IR(1)-R′-M2-T-R″-P-IR(2)、IR(1)-P-R′-M2-T-R″-IR(2)，IR(1)-R′-T-M2-R″-P-IR(2)或IR(1)-P-R′-T-M2-R″-IR(2)，其中IR(1)和IR(2)表示轉(zhuǎn)座酶靶序列，P為感興趣的DNA序列，R′和R″為平行重復(fù)序列，M2為選擇標(biāo)記基因，和T為轉(zhuǎn)座酶基因。本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)最好是這樣的，它能夠在革蘭氏陽性細(xì)菌，特別是芽胞桿菌菌株的細(xì)胞中轉(zhuǎn)座。選擇標(biāo)記為了有利于選擇其基因組上業(yè)已整合了本發(fā)明DNA結(jié)構(gòu)的細(xì)胞，該DNA結(jié)構(gòu)位于反向重復(fù)序列IR(1)和IR(2)(如與本發(fā)明第一方面有關(guān)的結(jié)構(gòu)IR(1)-P-R-M2-R-IR(2)或IR(1)-R-M2-R-P-IR(2))中并包括這些結(jié)構(gòu)，所述DNA結(jié)構(gòu)最好在由IR(1)和IR(2)所限定的結(jié)構(gòu)(含IR(1)和IR(2))外面含有另一種選擇標(biāo)記基因M1。在這種情況下，所述DNA結(jié)構(gòu)包括位于由IR(1)和2R(2)限定的并包括IR(1)和IR(2)的結(jié)構(gòu)外面的第一個(gè)選擇標(biāo)記基因M1，和位于該結(jié)構(gòu)里面的第二個(gè)標(biāo)記M2。因此，當(dāng)M1不同于M2時(shí)，在本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)被轉(zhuǎn)座到受體細(xì)胞的基因組中時(shí)可以進(jìn)行兩步選擇，第一步選擇導(dǎo)入了所述DNA結(jié)構(gòu)的細(xì)胞(M1+、M2+細(xì)胞)，第二步選擇由IR(1)和IR(2)限定的包括標(biāo)記基因M2的結(jié)構(gòu)業(yè)已整合到其基因組上而所述DNA結(jié)構(gòu)(帶有M1)的其余部分已丟失的細(xì)胞(M1-，M2+)。然后，通過解離酶蛋白的作用將標(biāo)記基因M2從所得到的細(xì)胞中消除。選擇標(biāo)記基因可以是編碼能賦予表達(dá)該基因的細(xì)胞抗生素抗性的基因或非抗生素標(biāo)記基因，如能減輕其它類型的生長抑制的基因，即使得帶有該基因的細(xì)胞在其它生長抑制條件下生長的標(biāo)記基因。這些基因的例子包括能賦予營養(yǎng)缺陷型菌株原養(yǎng)型的基因，例如被導(dǎo)dal-菌株的dal基因(參見B.Diderichsen，見BacillusMolecularGeneticsandBiotechnologyApplications，A.T.Ganesan和J.A.Hoch，著，AcademicPress，1986，pp.35-46)或被導(dǎo)入thy-細(xì)胞的thy基因(參見Gryczan和Dubnau(1982)，Gene，20，459-469)或能使獲得了該基因的細(xì)胞在特定條件下生長的基因，如amdS基因，該基因的表達(dá)使得獲得了該基因的細(xì)胞能夠在以乙酰胺為唯一氮源或碳源的培養(yǎng)基上生長(如在EP635574中所述)，或能賦予表達(dá)該基因的細(xì)胞對重金屬(如亞砷酸鹽、砷酸鹽、銻、鎘或有機(jī)汞化合物)的抗性的基因。能在這種條件下存活的細(xì)胞或?yàn)楹腥旧w外形式存在的導(dǎo)入DNA結(jié)構(gòu)的細(xì)胞或?yàn)樯鲜鼋Y(jié)構(gòu)已整合至其中的細(xì)胞。另外，選擇標(biāo)記基因可以是能賦予表達(dá)該基因的細(xì)胞免疫性的選擇標(biāo)記基因。感興趣的DNA序列存在于本發(fā)明DNA結(jié)構(gòu)上的感興趣的DNA序列可以是具有或編碼任何功能的DNA序列。例如，該DNA序列可以包括一段編碼一種結(jié)構(gòu)或調(diào)節(jié)蛋白的序列，或可以包括一段諸如啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)序列。另外，所插入的序列可以是不知其具有任何生物學(xué)功能的序列，可將其用于干擾細(xì)胞功能，如通過將其插入一個(gè)關(guān)鍵基因內(nèi)而中斷該基因的功能。所述感興趣的DNA序列可以是一個(gè)基因，因此，它與其表達(dá)所需的調(diào)節(jié)因子相關(guān)，包括啟動(dòng)子，終止子或核糖體結(jié)合位點(diǎn)。通過以上說明可以理解，本發(fā)明特別適用于構(gòu)建含有多拷貝的感興趣的DNA序列的細(xì)菌細(xì)胞。這種多拷貝菌株特別有利于感興趣的多肽的工業(yè)生產(chǎn)，因此，在最佳實(shí)施方案中，所述感興趣的DNA序列編碼一種感興趣的多肽。所述多肽可以是一種轉(zhuǎn)位多肽，即這樣一種多肽在表達(dá)時(shí)帶有一個(gè)信號(hào)序列，使其可以通過細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)。具體地講，轉(zhuǎn)位的多肽可以是一種分泌多肽或是與相關(guān)的細(xì)菌細(xì)胞的分泌機(jī)制有關(guān)的多肽。所述分泌或不分泌的多肽可以是一種酶，例如選自淀粉分解酶、脂肪分解酶、蛋白分解酶、纖維素分解酶，氧化還原酶或植物細(xì)胞壁降解酶的酶。這些酶的例子包括AMG、淀粉酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、酯酶、纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶、過氧化物酶、漆酶、酚氧化酶、過氧化氫酶、葡糖氧化酶、植酸酶、裂合酶、果膠酶、葡糖苷酸、甘露糖苷酶、異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)化酶、轉(zhuǎn)移酶、核糖核酸酶、半乳糖苷酶和殼多糖酶。另外，所分泌的多肽可以是激素、生長因子或受體等。由分泌途徑所轉(zhuǎn)運(yùn)的多肽的優(yōu)選例子為PrsA(WO94/19471)，業(yè)已發(fā)現(xiàn)當(dāng)其在芽胞桿菌屬細(xì)胞中過量表達(dá)時(shí)會(huì)導(dǎo)致感興趣的分泌多肽從該細(xì)胞中大量分泌。轉(zhuǎn)座酶和轉(zhuǎn)座酶識(shí)別序列可以理解，轉(zhuǎn)座酶基因和轉(zhuǎn)座酶靶序列必需經(jīng)過選擇，以便能夠共同起作用。在本發(fā)明中，任何轉(zhuǎn)座酶識(shí)別序列都可以與相關(guān)的轉(zhuǎn)座酶一起使用。轉(zhuǎn)座酶基因和轉(zhuǎn)座酶靶序列通常是源于同一種類型的轉(zhuǎn)座子(參見上述本發(fā)明的
背景技術(shù)：
部分)，優(yōu)選源于同一轉(zhuǎn)座子。轉(zhuǎn)座酶識(shí)別序列可以是反向重復(fù)序列，例如源于Tn1、Tn2、Tn3、Tn5、Tn9、Tn10和Tn903。另外，所述轉(zhuǎn)座酶識(shí)別序列無反向重復(fù)。這種序列的例子為源于噬菌體Mu及相關(guān)的轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座酶識(shí)別序列。當(dāng)轉(zhuǎn)座酶識(shí)別序列源于噬菌體Mu時(shí)，除轉(zhuǎn)座酶之外，它還必須能夠產(chǎn)生一種輔助蛋白(參見上述本發(fā)明的
背景技術(shù)：
部分)。轉(zhuǎn)座酶基因和轉(zhuǎn)座酶靶序列可源于天然存在的轉(zhuǎn)座子，或者用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從有關(guān)原料中分離或根據(jù)已知序列合成。應(yīng)當(dāng)理解，可以采用天然存在的序列的功能類似物或衍生物，只要其能夠介導(dǎo)轉(zhuǎn)座作用。所述功能類似物或衍生物可以通過合成方法制備，并可以與其野生型序列有一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的差別。解離酶及解離酶靶序列應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明第二方面的重要特征是用位點(diǎn)專一性重組系統(tǒng)缺失標(biāo)記基因M2，一旦發(fā)生了進(jìn)入宿主基因組的轉(zhuǎn)座作用的話。有幾種已知的位點(diǎn)專一性重組系統(tǒng)(參見上述本發(fā)明的
背景技術(shù)：
部分)，所有這類系統(tǒng)均可用于本發(fā)明中。對于本發(fā)明來說，優(yōu)選采用僅由兩個(gè)因子組成的系統(tǒng)一種位點(diǎn)專一性重組酶和一個(gè)用于該酶的靶序列。這種系統(tǒng)的例子為具有作為靶序列的pAMβres序列的pAMβ1解離酶(Janniere，L.，Gruss，A.，Ehrlich，S.D.(1993)，Plasmids，pp.625-644，見Sonenshein，A.L.，Hoch，J.A.，Losick，R.(著)Bacillussubtilisandothergram-positivebacteriaBiochemisty，Physiologyandmoleculargenetics，Americansocietyformicrobiology，WashingtonD.C.)和具有作為靶序列的P1lox位點(diǎn)的噬菌體P1Cre酶(Hasan，N.，koob，M.，SzybalskiW.(1994).Escherichiacoligenometargeting，I.Cre-lox-mediatedinvitrogenerationoforiplasmidsandtheirinvivochromosomalintegrationandretrieval，Gene，150，51-56)。可以理解，編碼重組酶的DNA序列和該酶的靶序列可以源于天然存在的系統(tǒng)(如上文所述)，或用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從有關(guān)原料中分離或根據(jù)已知序列合成。應(yīng)當(dāng)理解，可以采用天然序列的功能類似物或衍生物，只要其能夠以需要的方式起作用。所述功能類似物或衍生物可以通過合成制備，并可以與野生型序列有一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的差別。對于某些用途來說，可以用天然存在的質(zhì)粒將編碼重組酶的基因(以反式形式提供)導(dǎo)入細(xì)胞，如含有所述基因的pAMβ1。編碼重組酶的DNA序列優(yōu)選以反式形式提供。不過，該DNA序列存在于帶有本發(fā)明DNA結(jié)構(gòu)的載體中可能比較有利。在這種場合，所述DNA序列優(yōu)選位于整合在宿主細(xì)胞基因組上的載體部分，最好位于這樣的DNA部分該部分在整合之后由于重組酶的作用而被從基因組上切除。另外，該DNA序列應(yīng)當(dāng)置于一個(gè)可誘導(dǎo)或可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子的控制之下，如溫度誘導(dǎo)的啟動(dòng)子、或木糖誘導(dǎo)啟動(dòng)子或SPAC啟動(dòng)子，以便控制該DNA序列的表達(dá)僅在發(fā)生轉(zhuǎn)座作用以后進(jìn)行。如果編碼重組酶的DNA序列是以順式形式提供并被置于可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子的控制之下時(shí)，僅用一個(gè)轉(zhuǎn)化步驟即可完成本發(fā)明的方法。另外，編碼位點(diǎn)專一性重組酶的基因可以用本領(lǐng)域眾所周知的方法進(jìn)行工程操作，以使其能在宿主菌株中正確表達(dá)?？蓪⑵滢D(zhuǎn)移到溫度敏感的或其它條件復(fù)制子上，以便一旦發(fā)生了位點(diǎn)專一性重組行為后該基因易于從宿主細(xì)胞中丟失。與反選擇標(biāo)記結(jié)合的同源重組盡管當(dāng)采用根據(jù)本發(fā)明第二方面的DNA結(jié)構(gòu)時(shí)，選擇標(biāo)記基因可以通過DNA序列R′和R″之間的同源重組而缺失，但這種同源重組發(fā)生的頻率極低，因此，實(shí)際上其篩選可能很困難。為了避免這一實(shí)際問題，選擇標(biāo)記基因M2最好是這樣一種基因，其在所選擇的宿主細(xì)胞中可以進(jìn)行反選擇。換句話說，最好采用這樣一個(gè)標(biāo)記基因可對其存在和缺乏進(jìn)行選擇。例如，該標(biāo)記基因可以是能賦予營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞以原養(yǎng)型的基因，例如，用于thy--細(xì)胞的thy基因(Gryczan，T.J.，和Dubnau，D.(1982)，DirectselectionofrecombinantplasmidsinBacillussubtilis，Gene，20，459-469)，或者是使表達(dá)該基因的細(xì)胞能在一種特殊底物上生長的基因，如amdS該基因的表達(dá)使細(xì)胞能在以乙酰胺為唯一氮源或碳源的培養(yǎng)基上生長(EP635574)。當(dāng)采用thy基因時(shí)，將本發(fā)明第二方面的DNA結(jié)構(gòu)上的選擇標(biāo)記M2導(dǎo)入thy-細(xì)胞，以便可以選擇已接受了該結(jié)構(gòu)(第一步)的細(xì)胞，而在第二步讓所得到的細(xì)胞在不能耐受thy基因存在的培養(yǎng)基上生長，以便可以選擇已通過同源重組而丟失了thy基因的細(xì)胞(將thy基因用作反選擇標(biāo)記的原理由Gryczan和Dubnau作了詳細(xì)披露，同上)。類似地，可將amdS基因用于一種兩步方法，其中，在第一步通過在以乙酰胺為唯一碳源或氮源的培養(yǎng)基上生長選擇含amdS的細(xì)胞，而在第二步通過讓細(xì)胞在含有氟乙酰胺和尿素作為氮源的培養(yǎng)基上生長(參見EP635574)進(jìn)行反選擇，以便選擇不含amdS基因的細(xì)胞。構(gòu)建本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)可以根據(jù)天然存在的或以其它形式存在的轉(zhuǎn)座子輸送載體方便地構(gòu)建本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)。在文獻(xiàn)中所披露的轉(zhuǎn)座子輸送載體含有一個(gè)轉(zhuǎn)座酶基因，如果需要對其進(jìn)行修飾，以便能在希望的宿主生物中表達(dá)，還含有一個(gè)轉(zhuǎn)座框，主要含有一個(gè)抗性基因，其側(cè)翼為源于原始轉(zhuǎn)座子末端(如反向重復(fù)序列)的足夠的DNA，使得該抗性基因可以轉(zhuǎn)座到宿主基因組中。在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)可以通過修飾所述轉(zhuǎn)座子輸送載體而制備，以便在通過轉(zhuǎn)座而整合到宿主基因組的結(jié)構(gòu)上含有一個(gè)感興的DNA序列，由該序列取代或補(bǔ)充抗生素抗性基因。還可以用任何其它選擇標(biāo)記基因取代抗生素抗性基因?？梢杂帽绢I(lǐng)域已知方法對轉(zhuǎn)座子輸送載體進(jìn)行修飾。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)是通過用本領(lǐng)域已知方法連接待包括于該DNA結(jié)構(gòu)上的各獨(dú)立因子而制成的。當(dāng)要把該選擇標(biāo)記基因從整合了該DNA結(jié)構(gòu)的細(xì)胞中消除時(shí)，該標(biāo)記基因的側(cè)翼應(yīng)當(dāng)有解離酶靶序列或平行重復(fù)同源DNA序列?？梢杂帽绢I(lǐng)域已知方法將該序列插入按上述方法制備的DNA結(jié)構(gòu)中。重要的是，感興趣的基因位于由這些靶序列為側(cè)翼的結(jié)構(gòu)之外。本發(fā)明的載體復(fù)制起點(diǎn)為了用于本發(fā)明，通常理想的是，本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)與一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)連接，即存在于載體上。在本文中，“載體”是指能夠作為一種自主復(fù)制的染色體外因子起作用的DNA分子。例如，該載體可以是一種質(zhì)粒或噬菌體。復(fù)制起點(diǎn)不應(yīng)當(dāng)位于轉(zhuǎn)座酶識(shí)別序列IR(1)和IR(2)之間，因?yàn)檫@種位置將導(dǎo)致該復(fù)制起點(diǎn)整合到宿主細(xì)胞基因組上。從穩(wěn)定角度考慮，復(fù)制起點(diǎn)的基因組整合是不需要的。除上述情況外，復(fù)制起點(diǎn)的位置并不重要。因此，本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)中，復(fù)制起點(diǎn)可位于“T”和“M1”(如果有的話)的任一側(cè)。如果需要提高分離具有一種整合的DNA結(jié)構(gòu)的細(xì)胞的效率，該DNA結(jié)構(gòu)可以存在于一種含有一個(gè)條件復(fù)制起點(diǎn)的載體上。換句話說，可以采用在某些條件下(允許的)能夠復(fù)制而在其它條件下(不允許的)不能夠復(fù)制的載體。例如，該載體可以是其復(fù)制對溫度敏感的載體。因此，在本發(fā)明方法的一種實(shí)施方案中，含有待整合的DNA結(jié)構(gòu)的載體是在高溫下不能復(fù)制的載體，但宿主細(xì)胞仍能生長。首先在載體能夠復(fù)制的溫度下培養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞，然后，在本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)可能已整合到細(xì)菌基因組上后，在不允許載體復(fù)制的溫度下培養(yǎng)，以使被導(dǎo)入細(xì)胞的載體從該細(xì)胞中丟失。在不允許溫度下的培養(yǎng)是在選擇條件下進(jìn)行的，以確保僅有含有整合的DNA結(jié)構(gòu)的細(xì)胞能夠存活。提高所述載體整合以及隨后從該細(xì)胞中丟失的效率，可以用一種質(zhì)粒清除劑，如新生霉素在于上述選擇條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞之后處理用該載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(Gado，I.等，1987，Zbl.Bakt.Hyg.A.265，136-145)。另一種類型的條件復(fù)制起點(diǎn)可以是一種有限宿主范圍的質(zhì)粒，即僅能在有限數(shù)目的微生物菌種中復(fù)制的質(zhì)粒。對于本發(fā)明來說，應(yīng)當(dāng)選擇這樣的復(fù)制起點(diǎn)其源于一種有限宿主范圍的質(zhì)粒，不能在待將該DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)座到其中的受體細(xì)胞中復(fù)制。當(dāng)本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)是通過修飾轉(zhuǎn)座子輸送載體而構(gòu)建的時(shí)，可以使用正常存在于該載體上的復(fù)制起點(diǎn)?；蛘咄ㄟ^將該DNA結(jié)構(gòu)插入適于導(dǎo)入希望的宿主細(xì)胞的載體上而方便地提供該復(fù)制起點(diǎn)。可以用在文獻(xiàn)(Petit等，1990，同上)中披露的方法將轉(zhuǎn)座框整合到宿主細(xì)胞基因組中，以便利用轉(zhuǎn)座子輸送載體進(jìn)行誘變。順式作用接合因子可能希望通過接合作用將帶有本發(fā)明DNA結(jié)構(gòu)的本發(fā)明的載體導(dǎo)入相關(guān)受體細(xì)胞中(在下面的題為“構(gòu)建單拷貝或多拷貝的、選擇性地?zé)o標(biāo)記的菌株”部分將對此作進(jìn)一步說明)。為此，所述DNA結(jié)構(gòu)或載體含有一個(gè)所謂順式作用DNA序列，該序列為發(fā)生接合作用所必需。因此，當(dāng)帶有本發(fā)明DNA結(jié)構(gòu)的載體將通過接合作用而導(dǎo)入受體細(xì)胞時(shí)，該DNA結(jié)構(gòu)或載體還包括一個(gè)為轉(zhuǎn)移一種含有所述DNA結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒所必需的順式作用DNA序列。所述順式作用DNA序列通常可以是任何能介導(dǎo)轉(zhuǎn)移的DNA序列或DNA位點(diǎn)，一個(gè)優(yōu)選例子為四環(huán)素抗性質(zhì)粒pBC16或金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)卡那霉素抗性質(zhì)粒pUB110的oriT(如Sellinger等所述，JournalofBacteriology，June1990，pp.3290-3297)或?yàn)閛riT的功能類似物或部分。對于所有類型的含有本發(fā)明DNA結(jié)構(gòu)的載體來說(獲得了如本發(fā)明的第一、第二、第三和第四方面的任何結(jié)構(gòu))，所述順式作用序列可以位于載體上，但位于由IR(1)和IR(2)限定的并包括IR(1)和IR(2)的結(jié)構(gòu)的外面，以便該序列將隨轉(zhuǎn)座子輸送載體一起被切除。因此，所述順式作用DNA序列可位于所述結(jié)構(gòu)和DNA序列T和DNA序列M1(如果有的話)的任一側(cè)。在本發(fā)明第一、二、三和四方面的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述順式作用序列位于所述結(jié)構(gòu)部分上，該結(jié)構(gòu)位于解離酶靶序列R和平行重復(fù)序列R′和R″里，并分別包括這些序列。因此，該順式作用序列可隨選擇標(biāo)記基因M2和選擇性地隨T一起(本發(fā)明第二和四方面)從其中整合了該DNA結(jié)構(gòu)的細(xì)胞的基因組上切除。構(gòu)建單拷貝或多拷貝的、選擇性地?zé)o標(biāo)記的菌株正如將要了解到的，多拷貝無標(biāo)記生產(chǎn)菌株的構(gòu)建可以用上述能逐步將一個(gè)或幾個(gè)感興趣的DNA序列的拷貝整合到細(xì)菌細(xì)胞的基因組中的DNA結(jié)構(gòu)而實(shí)現(xiàn)，該方法包括重復(fù)的轉(zhuǎn)座步驟，和隨后的位點(diǎn)專一性標(biāo)記缺失。因此，另一方面，本發(fā)明涉及通過分別利用本發(fā)明第一、二、三和四方面的DNA結(jié)構(gòu)構(gòu)建本發(fā)明細(xì)菌細(xì)胞的方法，如上文所作的進(jìn)一步說明。因此，再一方面，本發(fā)明涉及構(gòu)建一種細(xì)菌細(xì)胞的方法，在該細(xì)胞的基因組DNA上整合了一個(gè)拷貝以上的感興趣的DNA序列，而且它不含編碼一種不需要的選擇標(biāo)記的DNA序列，該方法包括a)將含有根據(jù)本發(fā)明第一方面的DNA結(jié)構(gòu)的第一載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，所述DNA結(jié)構(gòu)包括與轉(zhuǎn)座酶基因T相關(guān)的結(jié)構(gòu)IR(1)-P-R-M2-R-IR(2)或IR(1)-R-M2-R-P-IR(2)，并選擇性地與一個(gè)選擇標(biāo)記基因M1相關(guān)，其中，R表示一種用于位點(diǎn)專一性重組酶的靶序列，b)選擇M2+及選擇性地M1-細(xì)胞，在該細(xì)胞的基因組中含有結(jié)構(gòu)IR(1)-P-R-M2-R-IR(2)或IR(1)-R-M2-R-P-IR(2)，c)將含有編碼一種位點(diǎn)專一性重組酶的DNA序列的第二載體導(dǎo)入在步驟b)中所選擇的細(xì)胞，以便將結(jié)構(gòu)R-M2或M2-R從該細(xì)胞的基因組中切除，以使所獲得的細(xì)胞具有整合結(jié)構(gòu)IR(1)-R-P-IR(2)或IR(1)-P-R-IR(2)，d)清除在步驟c)中所得細(xì)胞里的第二質(zhì)粒，以及選擇性地e)重復(fù)步驟a-d)一次或幾次，以產(chǎn)生含有一個(gè)或幾個(gè)額外拷貝的結(jié)構(gòu)IR(1)-R-P-IR(2)或IR(1)-P-R-IR(2)的細(xì)菌細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明涉及一種構(gòu)建一種細(xì)菌細(xì)胞的方法，在該細(xì)胞的基因組DNA上具有整合了一個(gè)以上拷貝的感興趣的DNA序列，而且它不含編碼一種不需要的選擇標(biāo)記的DNA序列，該方法包括a)將含有根據(jù)本發(fā)明第三方面的DNA結(jié)構(gòu)的第一載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，所述DNA結(jié)構(gòu)包括結(jié)構(gòu)IR(1)-R-M2-T-R-P-IR(2)、IR(1)-P-R-M2-T-R-IR(2)、IR(1)-R-T-M2-R-P-IR(2)或IR(1)-P-R-T-M2-R-IR(2)，該結(jié)構(gòu)選擇性地與一個(gè)選擇標(biāo)記基因M1相關(guān)，b)選擇M1-(如果載體上有M1的話)及M2+細(xì)胞，在該細(xì)胞的基因組上含有在a)中所確定的結(jié)構(gòu)之一，c)選擇具有增多拷貝數(shù)標(biāo)記基因M2的細(xì)胞，d)將含有編碼一種位點(diǎn)專一性重組酶的DNA序列的第二載體導(dǎo)入在步驟b)中選擇的細(xì)胞，以便將結(jié)構(gòu)R-M2-T、R-T-M2、M2-T-R或T-R-M2從該細(xì)胞的基因組中切除，以使所得的細(xì)胞具有整合的結(jié)構(gòu)IR(1)-R-P-IR(2)或IR(1)-P-R-IR(2)，e)清除在步驟d)中獲得的細(xì)胞里的第二質(zhì)粒，以及選擇性地f)重復(fù)步驟a-e一次或幾次，以產(chǎn)生含有一個(gè)或幾個(gè)額外拷貝的結(jié)構(gòu)IR(1)-R-P-IR(2)或IR(1)-P-R-IR(2)的細(xì)菌細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明涉及一種構(gòu)建一種細(xì)菌細(xì)胞的方法，在該細(xì)胞的基因組DNA上整合了一個(gè)以上拷貝的感興趣的DNA序列，而且，它不含編碼一種不需要的選擇標(biāo)記的DNA序列，該方法包括a)將含有根據(jù)本發(fā)明第二方面的DNA結(jié)構(gòu)的第一載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，所述DNA結(jié)構(gòu)包括與轉(zhuǎn)座酶基因T相關(guān)并選擇性地與選擇標(biāo)記基因M1相關(guān)的結(jié)構(gòu)IR(1)-P-R′-M2-R″-IR(2)或IR(1)-R′-M2-R″-P-IR(2)，其中，R′和R″表示平行重復(fù)序列，b)選擇M1-(如果載體上有M1的話)和M2+細(xì)胞，在該細(xì)胞的基因組上包括結(jié)構(gòu)IR(1)-P-R′-M2-R″-IR(2)或IR(1)-R′-M2-R″-P-IR(2)，c)讓DNA序列R′和R″之間進(jìn)行同源重組，以便切除選擇標(biāo)記基因M2，使所獲得的細(xì)胞具有整合的結(jié)構(gòu)IR(1)-R′/R″-P-IR(2)或IR(1)-P-R′/R″-IR(2)(其中R′/R″表示共同的重組序列)，以及選擇性地d)重復(fù)步驟a-c一次或幾次，以產(chǎn)生含有一個(gè)或幾個(gè)額外拷貝的DNA結(jié)構(gòu)IR(1)-R′/R″-P-IR(2)或IR(1)-P-R′/R″-IR(2)的細(xì)菌細(xì)胞。再一方面，本發(fā)明涉及一種構(gòu)建一種細(xì)菌細(xì)胞的方法，在該細(xì)胞的基因組DNA上整合了一個(gè)以上拷貝的感興趣的DNA序列，而且，它不含編碼一種不需要的選擇標(biāo)記的DNA序列，該方法包括a)將含有根據(jù)本發(fā)明第四方面的DNA結(jié)構(gòu)的第一載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，所述DNA結(jié)構(gòu)包括選擇性地與選擇標(biāo)記基因M1相關(guān)的結(jié)構(gòu)IR(1)-R′-M2-T-R″-P-IR(2)、IR(1)-P-R′-M2-T-R″-IR(2)、IR(1)-R′-T-M2-R″-P-IR(2)或IR(1)-P-R′-T-M2-R″-IR(2)，其中，R′和R″表示平行重復(fù)序列，b)選擇M1-(如果載體上有M1的話)及M2+細(xì)胞，在該細(xì)胞的基因組上含有在a)中所確定的有關(guān)結(jié)構(gòu)，c)選擇具有增多拷貝數(shù)的選擇標(biāo)記基因M2的細(xì)胞，d)讓DNA序列R′和R″之間進(jìn)行同源重組，以便切除選擇標(biāo)記基因M2和轉(zhuǎn)座酶基因T，使所得到的細(xì)胞具有整合的結(jié)構(gòu)IR(1)-R′/R″-P-IR(2)或IR(1)-P-R′/R″-IR(2)(其中R′/R″表示共同的重組序列)，以及選擇性地e)重復(fù)步驟a-d一次或幾次，以產(chǎn)生含有一個(gè)或幾個(gè)額外拷貝的DNA結(jié)構(gòu)IR(1)-R′/R″-P-IR(2)或IR(1)-P-R′/R″-IR(2)的細(xì)菌細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)指出，分別按照本發(fā)明第一和第三方面的DNA結(jié)構(gòu)的整合，會(huì)使得同一宿主細(xì)胞獲得結(jié)構(gòu)IR(1)-R-P-IR(2)或IR(1)-P-R-IR(2)，而分別按照本發(fā)明第二和四方面的DNA結(jié)構(gòu)的整合，會(huì)使得同一宿主細(xì)胞獲得結(jié)構(gòu)IR(1)-R′/R″-P-IR(2)或IR(1)-P-R′/R″-IR(2)。在上述任何方法的步驟a)中，可以用任何適合于相關(guān)細(xì)菌細(xì)胞的方法將所述載體導(dǎo)入所述細(xì)菌細(xì)胞中。有多種將DNA導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域廣為人知。其中包括感受態(tài)細(xì)胞(通過化學(xué)處理或“天然”感受性)的使用、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、接合、電擊、轉(zhuǎn)導(dǎo)、或沖擊轉(zhuǎn)化。盡管可以用眾所周知的自身可傳遞質(zhì)粒(如質(zhì)粒pLS20)作為克隆載體進(jìn)行接合，業(yè)已發(fā)現(xiàn)以下具體接合方法通常適于將DNA導(dǎo)入諸如芽胞桿菌的細(xì)胞，當(dāng)采用諸如原生質(zhì)體融合之類的常規(guī)方法時(shí)，該細(xì)胞不能或僅能困難地接納DNA。更具體地講，接合是通過這樣一種方法實(shí)現(xiàn)的，其中，將一群具有i)一個(gè)質(zhì)粒，其含有一個(gè)本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)和至少一個(gè)為通過接合作用在有反式作用移動(dòng)因子存在的條件下轉(zhuǎn)移所述質(zhì)粒所需的順式作用DNA序列，和ii)至少一個(gè)編碼所述反式作用移動(dòng)因子的DNA序列的細(xì)菌供體細(xì)胞和一群受體細(xì)胞混合，混合是在使所述質(zhì)粒能通過接合作用從供體細(xì)胞群轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞群的條件下進(jìn)行的。例如，供體細(xì)胞群可以是一群大腸桿菌細(xì)胞或芽胞桿菌細(xì)胞，其例子在下面將提及。受體細(xì)胞優(yōu)選為芽胞桿菌細(xì)胞，如在下面將要提及的。特別有價(jià)值的受體細(xì)胞為地衣型芽胞桿菌(B.licheniformis)、解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)和遲緩芽胞桿菌(B.lentus)以及枯草芽胞桿菌的非感受態(tài)細(xì)胞。順式作用DNA序列及其在本發(fā)明DNA結(jié)構(gòu)或載體上的優(yōu)選位置披露于上述題為“順式作用接合因子”部分?！胺词阶饔靡苿?dòng)因子”是指一種能介導(dǎo)含有如上文所定義的順式作用DNA序列的DNA序列的接合轉(zhuǎn)移作用的蛋白。反式作用移動(dòng)因子可以是由接合質(zhì)粒，如芽胞桿菌質(zhì)粒pLS20編碼的一種蛋白(KoehlerandThorne，JournalofBacteriology，Nov.1987，pp.5771-5278)或其一部分或衍生物，或是由諸如質(zhì)粒pBC16或pUB110的orf-β的DNA序列編碼的一種蛋白(Sellinger等，JournalofBacteriology，June，1990，pp.3290-3297)或其功能性類似物或部分?？梢岳斫?，由于移動(dòng)因子是以反式形式作用的，它可以由存在于供體細(xì)胞基因組上或存在于該供體細(xì)胞里的第二質(zhì)粒上的DNA編碼。細(xì)胞的混合通常是通過混合供體細(xì)胞和受體細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)的，將混合細(xì)胞在30-37℃下放置至少4小時(shí)，選擇具有接收的DNA結(jié)構(gòu)的受體細(xì)胞。進(jìn)一步的詳情參見Selinger等，1990。在步驟b)中所采用的培養(yǎng)條件特別取決于選擇標(biāo)記的種類。例如，當(dāng)由M2編碼的選擇標(biāo)記是抗生素抗性時(shí)，b)的培養(yǎng)是在有合適劑量的相關(guān)抗生素的條件下進(jìn)行，以便選擇具有接收的M2并能表達(dá)M2的細(xì)胞。被導(dǎo)入受體宿主細(xì)胞的DNA結(jié)構(gòu)上抗生素抗性標(biāo)記M1和M2的存在可以極大地方便選擇和篩選。標(biāo)記M1位于該DNA結(jié)構(gòu)的“載體部分”，即該結(jié)構(gòu)的在由IR(1)和IR(2)限定的結(jié)構(gòu)以外的部分，而標(biāo)記基因M2位于所述結(jié)構(gòu)里面。不過，應(yīng)當(dāng)指出的是，當(dāng)該DNA結(jié)構(gòu)僅含有一個(gè)選擇標(biāo)記，即M1或M2時(shí)，也可以實(shí)現(xiàn)成功的轉(zhuǎn)座。采用合適的生長方法，如在有關(guān)pHV1248的文獻(xiàn)中所披露的方法(Petit，M.-A.，Bruand，C.，Janniere，L.，Ehrlich，S.D.(1990)，Tn10-derivedtransposonsactiveinBacillussubtilis，J.Bacteriol，172，6736-6740)，在含有適當(dāng)抗生素的培養(yǎng)皿上選擇含有M2的菌株，并通過復(fù)制鋪板篩選M1的缺乏。該菌株不再具有轉(zhuǎn)座子輸送載體，并且有整合至其基因組上的轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)。通過轉(zhuǎn)座作用的DNA結(jié)構(gòu)的整合可以發(fā)生在宿主細(xì)胞基因組的隨機(jī)位置上。因此，當(dāng)生產(chǎn)出多拷貝細(xì)胞時(shí)，整合的拷貝將位于該細(xì)胞的隨機(jī)、分離的位置上，這有助于提高該細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性?？梢杂帽绢I(lǐng)域已知方法測定P的存在，例如，如果合適的話，通過Southern分析，PCR擴(kuò)增或P的表型表達(dá)進(jìn)行。當(dāng)待導(dǎo)入細(xì)胞的DNA結(jié)構(gòu)具有選擇標(biāo)記基因M1時(shí)，M1表型的喪失被用于指示在一旦發(fā)生了轉(zhuǎn)座作用后被導(dǎo)入的DNA的載體部分的喪失。當(dāng)采用根據(jù)本發(fā)明第一或第三方面的DNA結(jié)構(gòu)時(shí)(即含有位點(diǎn)專一性重組酶的靶序列的DNA結(jié)構(gòu))，后一個(gè)步驟是將表達(dá)與M2側(cè)翼的靶序列有關(guān)的位點(diǎn)專一性重組酶的第二載體導(dǎo)入已接收了第一載體的菌株。重組酶的活性是對基因組中位于M2以及選擇性地T側(cè)翼的兩個(gè)靶順列進(jìn)行重組，從而將標(biāo)記基因以及選擇性地將T缺失，這一過程可以通過諸如復(fù)制鋪板的篩選方便地檢測到。一旦獲得無M2菌株，將其中的表達(dá)重組酶的質(zhì)粒清除，例如，如果該載體是一個(gè)溫度敏感型復(fù)制子的話，通過在非允許溫度下繁殖而實(shí)現(xiàn)所述清除。另外，讓所述載體在宿主中駐留一定時(shí)間，然后將該細(xì)胞中的質(zhì)粒清除，并篩選喪失了M2的無質(zhì)粒細(xì)胞。這一方法可以得到一種含有感興趣的基因的一個(gè)轉(zhuǎn)座拷貝的菌株，但是無標(biāo)記基因。在新的一輪轉(zhuǎn)座和標(biāo)記缺失中將該菌株用作宿主菌株，其中，可以采用與第一輪完全相同的修飾轉(zhuǎn)座子輸送載體和重組酶編碼載體，即i)將修飾的轉(zhuǎn)座子輸送載體導(dǎo)入宿主菌株，ii)按上述方法獲得含有轉(zhuǎn)座的感興趣的DNA序列的拷貝+標(biāo)記基因M2并且無轉(zhuǎn)座子輸送載體的菌株，iii)將表達(dá)有關(guān)位點(diǎn)專一性重組酶的載體導(dǎo)入所述菌株(在根據(jù)第三方面的DNA結(jié)構(gòu)的條件下)，和iv)按上述方法分離其標(biāo)記基因M2以及選擇性地T因?yàn)橹亟M酶(由根據(jù)本發(fā)明第一或第三方面的DNA結(jié)構(gòu)構(gòu)建時(shí))的活性或同源重組(由根據(jù)本發(fā)明第二或四方面的DNA結(jié)構(gòu)構(gòu)建時(shí))而缺失的菌株，并獲得該菌株的無質(zhì)粒形式?，F(xiàn)在所得到的是含有兩個(gè)轉(zhuǎn)座的感興趣的基因的拷貝但無標(biāo)記基因的菌株。該菌株在新一輪的轉(zhuǎn)座和標(biāo)記缺失中被用作宿主菌株，而且這一過程基本上可以重復(fù)無數(shù)次。如果編碼重組酶的DNA序列以順式形式置于可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子(如上所述)的控制之下，在每一輪次中僅需要進(jìn)行一個(gè)轉(zhuǎn)化步驟。在實(shí)踐中，當(dāng)轉(zhuǎn)座作用已完成時(shí)，所述可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子啟動(dòng)，重組酶得以表達(dá)。由位點(diǎn)專一性重組酶進(jìn)行的標(biāo)記缺失在染色體上留下一個(gè)拷貝的相關(guān)靶序列。隨后的轉(zhuǎn)座作用將該靶序列的新拷貝引入。由于轉(zhuǎn)座作用可以在該基因組的多數(shù)位點(diǎn)上進(jìn)行，接近隨機(jī)整合，新的靶序列將以較大可能性位于距第一個(gè)靶序列較遠(yuǎn)處。位點(diǎn)專一性重組酶在相隔很遠(yuǎn)的序列上的作用效果似乎較差。另外，由所述重組過程所導(dǎo)致的大量基因組DNA的缺失將會(huì)致死，因此，用上述方法不能分離到發(fā)生過這種過程的菌株。用由根據(jù)本發(fā)明第二或四方面的DNA結(jié)構(gòu)生產(chǎn)的菌株進(jìn)行一個(gè)類似的過程。在這種情況下，標(biāo)記基因M2的切除，以及有關(guān)T的切除是通過序列R′和R″之間的同源重組實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明的細(xì)胞另一方面，本發(fā)明涉及一種細(xì)菌細(xì)胞，在其基因組上整合了一個(gè)以上拷貝的包括結(jié)構(gòu)IR(1)-P-IR(2)的DNA結(jié)構(gòu)，其中，IR(1)和IR(2)表示轉(zhuǎn)座酶靶序列，而P為一個(gè)感興趣的DNA序列，其中，結(jié)構(gòu)IR(1)-P-IR(2)不編碼一種不需要的選擇標(biāo)記。該結(jié)構(gòu)還包括一個(gè)重組靶序列R或位于IR(1)和IR(2)之間的共同的同源重組序列R′/R″。在本文中，“基因組”一詞是指細(xì)胞的組成DNA，包括染色體和穩(wěn)定遺傳的染色體外因子。在本文中，待整合所述DNA結(jié)構(gòu)的細(xì)胞是指宿主細(xì)胞、宿主菌株、受體菌株或細(xì)胞、或修飾細(xì)胞?？梢岳斫獾氖?，這些名詞可以交替使用。IR(1)和IR(2)在細(xì)胞基因組中的存在對細(xì)胞的功能并非必須，但它是表明該細(xì)胞是通過轉(zhuǎn)座作用而構(gòu)成的依據(jù)，即，通過轉(zhuǎn)座子的應(yīng)用而構(gòu)成。因此，僅有通過轉(zhuǎn)座作用進(jìn)行過修飾的細(xì)胞含有上述結(jié)構(gòu)。如果必要，可以用常規(guī)方法將IR(1)和/或IR(2)從細(xì)胞中缺失或失活。再一方面，本發(fā)明涉及一種細(xì)菌細(xì)胞，在其基因組上整合了至少兩個(gè)拷貝的含有結(jié)構(gòu)IR(1)-P-IR(2)的DNA結(jié)構(gòu)，其中IR(1)和IR(2)表示轉(zhuǎn)座酶靶序列，而P為一個(gè)感興趣的DNA序列，該結(jié)構(gòu)還包括一個(gè)重組靶序列R或共同的同源重組序列R′/R″，它位于IR(1)和IR(2)之間。目前認(rèn)為，本文所披露的內(nèi)容是首次公開將轉(zhuǎn)座作用用于構(gòu)建多拷貝革蘭氏陽性細(xì)胞，特別是芽胞桿菌屬細(xì)胞。多個(gè)、正常情況下隨機(jī)定位的結(jié)構(gòu)IR(1)-P-IR(2)還包括位于細(xì)胞基因組上的R或R′/R″，表明該細(xì)胞是通過轉(zhuǎn)座作用而構(gòu)建的。從上述說明可以了解，本發(fā)明是構(gòu)建多拷貝革蘭氏陽性細(xì)菌菌株，即在其基因組上整合了多拷貝的感興趣的DNA序列的細(xì)菌細(xì)胞的極為方便和有效的方法。用本發(fā)明方法生產(chǎn)的細(xì)胞是a)在其基因組上整合了至少兩個(gè)拷貝的含有結(jié)構(gòu)IR(1)-P-IR(2)的DNA結(jié)構(gòu)的細(xì)胞，該結(jié)構(gòu)還含有位于IR(1)和IR(2)之間的重組靶序列R或共同的同源重組序列R′/R″，該結(jié)構(gòu)不含任何編碼不需要的諸如抗生素抗性標(biāo)記的任何基因。特別感興趣的是在其基因組上(在結(jié)構(gòu)IR(1)-P-IR(2)外面還含有一段DNA序列R或R′/R″)不含編碼抗生素抗性標(biāo)記或另一種不需要的標(biāo)記的基因的細(xì)胞。所述基因的存在通常是用常規(guī)方法構(gòu)建多拷貝菌株的結(jié)果，當(dāng)根據(jù)已知的轉(zhuǎn)座輸送載體時(shí)，該方法包括轉(zhuǎn)座作用。盡管本發(fā)明細(xì)胞最好是不含任何導(dǎo)入的選擇標(biāo)記，但它可以含有編碼一種無害的(即并非不需要的)選擇標(biāo)記，如生長抑制標(biāo)記或抗生素抗性標(biāo)記的基因。這些類型的標(biāo)記在上述題為“選擇標(biāo)記”部分做過詳細(xì)說明。本發(fā)明的細(xì)胞可以是任何革蘭氏陽性細(xì)菌菌種，特別是芽胞桿菌或乳桿菌。合適的芽胞桿菌屬細(xì)胞的例子可以選自枯草芽胞桿菌、地衣型芽胞桿菌、遲緩芽胞桿菌、短芽胞桿菌(Bacillusbrevis)、嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillusstearothermophilus)、嗜堿芽胞桿菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、凝固芽胞桿菌(Bacilluscoagulans)、環(huán)狀芽胞桿菌(Bacilluscirculans)、Bacilluslautus、巨大芽胞桿菌(Bacillusmegaterium)、蘇云金芽胞桿菌。就遲緩芽胞桿菌的應(yīng)用而言，應(yīng)當(dāng)指出的是，以前從未披露或提示過轉(zhuǎn)座作用可以在該菌種的細(xì)胞里起作用。關(guān)于存在于本發(fā)明細(xì)胞里的感興趣的DNA序列，參見上面所討論的“感興趣的DNA序列”部分。最后，應(yīng)當(dāng)理解，在不需要構(gòu)建無標(biāo)記的單拷貝或多拷貝菌株的條件下，M2在起到鑒定其基因組中含有一個(gè)或幾個(gè)拷貝的感興趣的DNA序列的細(xì)胞的目的后不必被清除。在這種場合，轉(zhuǎn)座作用是一種用于將至少一個(gè)，優(yōu)選多個(gè)拷貝的感興趣的DNA序列導(dǎo)入細(xì)胞的基因組的便捷方法。感興趣的多肽的生產(chǎn)含有一個(gè)以上拷貝的結(jié)構(gòu)IR(1)-P-IR(2)、還含有整合在其基因組上的位于IR(1)和IR(2)之間的DNA序列R或R′/R″的本發(fā)明的細(xì)胞或用上述本發(fā)明方法制備的細(xì)胞適用于生產(chǎn)由感興趣的DNA序列P編碼的感興趣的多肽的方法。所述方法包括在允許所述多肽表達(dá)的條件下在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)相關(guān)的細(xì)胞，然后從培養(yǎng)物中回收所得到的多肽。用于培養(yǎng)所述細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是任何適于生長細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)基，如含有合適的添加劑的極限培養(yǎng)基或復(fù)合培養(yǎng)基。合適的培養(yǎng)基可自供應(yīng)商那里購買或按照公開的配方(例如，參見美國模式培養(yǎng)物保藏所的商品目錄)制備。然后用常規(guī)方法從培養(yǎng)基中回收由所述細(xì)胞產(chǎn)生的多肽，包括通過離心或過濾從培養(yǎng)基中分離細(xì)胞，用諸如硫酸銨的鹽使上清液或?yàn)V液里的蛋白類成分沉淀，通過多種層析方法進(jìn)行純化，例如，離子交換層析、凝膠過濾層析或親和層析等，所用方法取決于相關(guān)的多肽類型。所述多肽優(yōu)選為轉(zhuǎn)位多肽，特別是諸如分泌酶的分泌多肽。或者，所述轉(zhuǎn)位多肽為PrsA。在上文的題為“感興趣的DNA序列”的部分給出了可以用本發(fā)明方法生產(chǎn)的多肽的具體例子。結(jié)論通過本發(fā)明的以上說明可以了解，基于下列原因的一種或幾種，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比是新穎的和具有創(chuàng)造性的1)將轉(zhuǎn)座子用于插入一個(gè)以上拷貝的，和固定的、預(yù)定拷貝數(shù)目的編碼一種感興趣的產(chǎn)物的基因，2)轉(zhuǎn)座的DNA含有使部分轉(zhuǎn)座DNA進(jìn)行位點(diǎn)專一性缺失的因子，3)所得到的菌株含有轉(zhuǎn)座的DNA，但在轉(zhuǎn)座的DNA上無選擇標(biāo)記基因，和/或4)轉(zhuǎn)座子被用于一種重復(fù)的方法，使其可以與一種特異性缺失標(biāo)記基因的方法組合。從工業(yè)角度看，用本發(fā)明方法構(gòu)建的細(xì)菌菌株具有三重優(yōu)點(diǎn)i)由于有多個(gè)基因拷貝而高產(chǎn)，ii)遺傳上極為穩(wěn)定，因?yàn)樗龆鄠€(gè)拷貝不是串連的重復(fù)，而是分散在染色體上，和iii)無標(biāo)記，使其比傳統(tǒng)的含有抗生素抗性基因的重組生產(chǎn)菌株更有利于環(huán)境保護(hù)。下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，在這些附圖中采用了以下縮寫形式“bla”表示β-內(nèi)酰胺酶基因，編碼氨芐青霉素抗性，源于pUC19?！癳rm”表示pE194的紅霉素抗性基因?！癱at”表示源于pC194的氯霉素抗性基因?！癐R”表示源于Tn10的轉(zhuǎn)座子反向重復(fù)序列?！癟nase”表示源于Tn10的轉(zhuǎn)座酶，被修飾成能在芽胞桿菌屬中表達(dá)?！癙amyQ-sav”表示Savinase基因，由解淀粉芽胞桿菌α-淀粉酶基因的啟動(dòng)子表達(dá)?！皁riT(pUB110)”表示移動(dòng)所需的pUB110的順式作用序列。“ermR”表示源于pAMβ1的紅霉素抗性基因?！皉epE”表示pAMβ1的復(fù)制蛋白基因?！皉esB”表示pAMβ1的解離酶基因?！皌opB”表示pAMβ1的拓樸異構(gòu)酶。“amy′”表示枯草芽胞桿菌α-淀粉酶基因的5′末端?！發(fā)acZ”表示源于大腸桿菌的β-半乳糖苷酶?！皉es”表示源于pAMβ1的解離酶的靶位點(diǎn)。“spc”表示源于Tn554的壯觀霉素抗性基因?！啊鋋my”表示枯草芽胞桿菌淀粉酶基因的3′末端?！?oripUB110”表示pUB110的復(fù)制起點(diǎn)(缺口位點(diǎn))?！皉ep”表示pUB110的復(fù)制蛋白基因?！発an”表示pUB110的卡那霉素抗性基因?！癙amyL”表示地衣型芽胞桿菌α-淀粉酶基因的啟動(dòng)子?！発an′”表示pUB110的卡那霉素抗性基因的5′末端?！啊鋋myL”表示地衣型芽胞桿菌α-淀粉酶基因的3′末端?！皉epF”表示pE194的復(fù)制蛋白基因?！癙lac”表示pUC19上的β-半乳糖苷酶啟動(dòng)子?！癮myL”表示源于地衣型芽胞桿菌的α-淀粉酶基因。圖1是質(zhì)粒pMOL553的限制圖；圖2是質(zhì)粒pSJ3282的限制圖；圖3是質(zhì)粒pWT的限制圖；圖4是質(zhì)粒pMAP29的限制圖；圖5是質(zhì)粒pSJ3157的限制圖；圖6是質(zhì)粒pSJ2739的限制圖；圖7是質(zhì)粒pSJ3279-pSJ3281的限制圖；圖8是用于構(gòu)建res-cat-res-IR片段的寡核苷酸引物和擴(kuò)增的DNA片段的示意圖，該片段最終被整合到質(zhì)粒pSJ3389-pSJ3390中。圖9是質(zhì)粒pSJ3372-pSJ3376的限制圖；圖10是質(zhì)粒pSJ3389-pSJ3390的限制圖；圖11A表示對Savinase進(jìn)行Mancini免疫擴(kuò)散分析的結(jié)果；圖11B表示對Sayinase進(jìn)行Mancini免疫擴(kuò)散分析的結(jié)果；圖12A是用源于所示菌株的DNA的Southern印跡；圖12B是用源于圖12A所示菌株的DNA的Southern印跡；圖13是質(zhì)粒pSJ3216的限制圖；圖14是質(zhì)粒pSJ3318的限制圖；圖15是質(zhì)粒pSJ3328-pSJ3329的限制圖；圖16是質(zhì)粒pSJ3326-pSJ3327的限制圖；圖17是質(zhì)粒pSJ3341-pSJ3342的限制圖18是質(zhì)粒pSJ3358-pSJ3359的限制圖；圖19是質(zhì)粒pSJ3354-pSJ3355的限制圖；圖20是質(zhì)粒pSJ3444-pSJ3445的限制圖；圖21是質(zhì)粒pSJ3475的限制圖；圖22是質(zhì)粒pSJ3476的限制圖；圖23是質(zhì)粒pSJ3316-pSJ3317的限制圖；圖24是質(zhì)粒pSJ3339-pSJ3340的限制圖；圖25是質(zhì)粒pSJ3356-pSJ3357的限制圖；圖26是質(zhì)粒pSJ3385的限制圖；圖27是質(zhì)粒pSJ3459-pSJ3460的限制圖；圖28是質(zhì)粒pSJ3586-pSJ3587的限制圖；圖29是質(zhì)粒pSJ3524-pSJ3527的限制圖；下面的實(shí)施例將對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，這些實(shí)施例并非如權(quán)利要求那樣從任何角度限定本發(fā)明。材料和方法體外DNA操作、細(xì)菌菌株轉(zhuǎn)化等是用分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行的(Maniatis，T.，F(xiàn)ritsch，E.F.，Sambrook，J.“MolecularCloningALaboratorymanual”.ColdSpringHarborLaboratories，1982；Ausubel，F(xiàn).M.，等(著)“CurrentProtocolsinMolecularBiology”.JohnWileyandSons，1995；Harwood，C.R.，和Cutting，S.M.(著)“MolecularBiologicalMethodsforBacillus”.JohnwileyandSons，1990)。用于DNA操作的酶是按照供應(yīng)商的說明使用的。所采用的培養(yǎng)基(TY，BPX和LB瓊脂)被露于EP0506780中。LBPSG瓊脂是補(bǔ)充了磷酸鹽(0.01MK3PO4)、葡萄糖(0.4％)和淀粉(0.5％)的LB瓊脂。例1構(gòu)建用于對Savinase基因進(jìn)行轉(zhuǎn)座的轉(zhuǎn)座子輸送系統(tǒng)將轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒pHVl248(Petit，M.-A.，Bruand，C.，Janniere，L.，Ehrlich，S.D.(1990)Tn10-derivedtransposonsactiveinBacillussubtilis.J.Bacteriol.，172，6736-6740)用作原材料。該質(zhì)粒含有pE194復(fù)制子，該復(fù)制子的復(fù)制是熱敏感性的，并帶有源于Tn10的轉(zhuǎn)座酶基因，對其進(jìn)行修飾以便在枯草芽胞桿菌中表達(dá)，并有源于Tn10的IS10因子的足夠序列在氯霉素抗性基因側(cè)翼(小型-Tn10)，以便小型-Tn10能轉(zhuǎn)座到枯草芽胞桿菌染色體上。將pHV1248導(dǎo)入大腸桿菌SJ6(Diderichsen等，1990，J.Bacteriol.172，4315-4321)，選擇氨芐青霉素抗性(100μg/ml)，得到SJ1609。已根據(jù)布達(dá)佩斯條約將菌株SJ1609作為專利保藏物交由DSM保存，保存號(hào)為DSM10445，保存日為1995年12月22日。Savinase是源于遲緩芽胞桿菌的細(xì)胞外的堿性蛋白酶。用于通過轉(zhuǎn)座作用輸送該基因的載體是pMOL553。該質(zhì)粒的構(gòu)建是分兩步進(jìn)行的。步驟1將SOEPCR(Horton，R.M.，Hunt，H.D.，Ho，S.N.，Pullen.J.K.，Pease，L.R.(1989)EngineeringHybridgeneswithouttheuseofrestrictionenzymesgenesplicingbyoverlapextension.Gene，77，61-68)用于把一個(gè)BamHI位點(diǎn)插在pHV1248上的cat基因上游。以pHV1248為模板進(jìn)行兩個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)。在第一個(gè)反應(yīng)中采用引物1(LWN5037)CCCACTGGATCCAATTTTCGTTTGTTG和引物2LWN5038GCAAATTGATCCAAGAGAACCAAC。引物1中劃線的堿基表示BamHI位點(diǎn)的位置。第二個(gè)PCR反應(yīng)基于引物3(LWN5036)CAACAAACGAAAATTGGATCCAGTGGG和引物4(LWN5039)GCACATCATCATCATAAGC。兩個(gè)PCR反應(yīng)是用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行的，在變性步驟采用96℃的溫度，在退火步驟采用55℃的溫度，在延伸步驟采用72℃的溫度。一共進(jìn)行20輪反應(yīng)。從瓊脂糖中純化兩種片段，并將每種片段各500ng用于第二個(gè)5輪次的PCR反應(yīng)96℃2分鐘，50℃5分鐘，和72℃1分鐘。在96℃下加入引物2和引物4(100pmol)，并開始第三個(gè)25輪次的PCR反應(yīng)96℃30秒，55℃30秒，72℃90秒。用HindIII消化1330bp的最終PCR片段，將其連接到HindIII消化的pHV1248上，并將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌SJ2中(Diderichsen等，1990，J.Bacteriol.172，4315-4321)。所保存的轉(zhuǎn)化體MOL612含有質(zhì)粒pMOL610。通過限制性消化證實(shí)了pMOL610上的BamHI位點(diǎn)的位置。步驟2在該步驟中將完整的Savinase基因克隆到pMOL610的BamHI位點(diǎn)。通過PCR由質(zhì)粒pSX222(WO92/11357)擴(kuò)增Savinase基因和一個(gè)啟動(dòng)子片段，采用有BamHI限制位點(diǎn)(劃線部分)的引物，引物5(LWN5136)CCGGCGGATCCAAGGGGTGATCG和引物6(LWN2043)GGGGTACTAGTAACCCGGGCCCGGCGTAGAGGATCCATACACAAA。該Savinase基因編碼野生型Savinase酶，但對該DNA序列進(jìn)行修飾以便在Savinase編碼序列中含有若干限制酶位點(diǎn)。PCR反應(yīng)是按以下方法進(jìn)行的96℃30秒，55℃30秒，72℃120秒。在20輪反應(yīng)后用BamHI消化PCR片段，將其純化并克隆到pMOL610的BamHI位點(diǎn)。將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌SJ2中，將一種轉(zhuǎn)化體作為MOL553保存(SJ2/pMOL553)。通過限制性消化和在枯草芽胞桿菌中獨(dú)特的蛋白酶表型(例如，在菌株DN1885(Diderichsen等，1990，J.Bacteriol.172，4315-4321)或該菌株的蛋白酶缺陷型衍生物中的表型)證實(shí)克隆。由此構(gòu)建的編碼Savinase的轉(zhuǎn)座子輸送載體是pMOL553。在序列1中給出了該質(zhì)粒的完整序列，在圖1中給出了其限制圖。例2將Savinase基因轉(zhuǎn)座到遲緩芽胞桿菌染色體中，采用氯霉素抗性選擇。用轉(zhuǎn)座子輸送質(zhì)粒pMOL553將額外的蛋白酶基因隨機(jī)插入遲緩芽胞桿菌的染色體中。通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法用質(zhì)粒pMOL553轉(zhuǎn)化嗜堿性遲緩芽胞桿菌菌株C360的突變型(CA954807)，所用方法基本上相同于由Akamatsu所披露的HCP-1，5疊層法(Akamatsu，T.等(1984)，Agric.Biol.Chem.48(3)，651-655)。僅有的大的差別為將HCP-1，5培養(yǎng)基和瓊脂的pH改變成pH9，使所述嗜堿性桿菌能在更適宜的條件下再生。在30℃下將含有10μg/ml氯霉素或5μg/ml紅霉素的再生培養(yǎng)皿培養(yǎng)5-10天。在含有2μg/ml紅霉素的LB9板(含有0.05MNaHCO3緩沖液pH9.0的LB培養(yǎng)基)上對轉(zhuǎn)化體進(jìn)行再分離，然后，用由Petit等(1990)所披露的方法使含有蛋白酶基因以及cat基因的小型Tn10轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座。在46℃下在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜后，在46℃下將培養(yǎng)物鋪板于LB9+6μg/ml氯霉素上，并篩選對紅霉素敏感的菌落。選擇出11個(gè)對紅霉素敏感的氯霉素抗性菌落。對自這11個(gè)菌落中分離的染色體DNA進(jìn)行Southern分析揭示，其各含有一個(gè)插在染色體上的單拷貝小型轉(zhuǎn)座子。10個(gè)菌株含有相同的插入片段，而1個(gè)含有插在不同位置上的插入片段。那10個(gè)菌株很可能是早期轉(zhuǎn)座行為的代表性同胞。無轉(zhuǎn)座子插入位于遲緩芽胞桿菌染色體上的編碼天然蛋白酶的基因。例3將Sayinase基因轉(zhuǎn)座到遲緩芽胞桿菌染色體上，無需選擇氯霉素抗性在一個(gè)大體上與例2相同的實(shí)驗(yàn)中，用上述原生質(zhì)體方法，用pMOL553轉(zhuǎn)化在其堿性蛋白酶基因上有一個(gè)染色體缺失的遲緩芽胞桿菌菌株。在該實(shí)驗(yàn)中，選擇壓力僅針對由pMOL553的載體部分所產(chǎn)生的紅霉素抗性。其用意是通過篩選其在LB(9)瓊脂板上降解脫脂奶的能力，分離通過帶有蛋白酶的小型轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座到染色體上而獲得了活性蛋白酶基因的細(xì)胞。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和再分離步驟是僅通過紅霉素選擇進(jìn)行的。在30℃下允許轉(zhuǎn)座子整合的整合時(shí)間為在含有2μg/ml紅霉素的LB(9)培養(yǎng)基上1天。在46℃下在無選擇壓力的條件下在LB(9)培養(yǎng)基上培養(yǎng)1天，然后將細(xì)胞展布在含有1％脫脂奶，但無抗生素的LB(9)板上。在600個(gè)菌落中，有59個(gè)是蛋白酶陽性的。然后對這59個(gè)菌落的抗生素抗性表型進(jìn)行分析。有19個(gè)菌落同時(shí)具有抗紅霉素和氯霉素抗性，表明其仍含有pMOL553，而40個(gè)菌落僅抗氯霉素，表明其是通過cat和Savinase基因轉(zhuǎn)座到染色體上而產(chǎn)生的。通過Southern雜交分析2個(gè)氯霉素抗性和紅霉素敏感型菌落。兩種細(xì)胞含有2個(gè)拷貝的帶有蛋白酶的小型轉(zhuǎn)座子，其在染色體上的定位不同于天然蛋白酶基因的定位(在這種情況下部分缺失)。所有4個(gè)小型轉(zhuǎn)座子都整合在遲緩芽胞桿菌染色體上的不同位置。因此，該實(shí)施例說明了含有多個(gè)轉(zhuǎn)座拷貝的編碼轉(zhuǎn)位多肽的感興趣的序列的菌株的構(gòu)建，并說明了含有轉(zhuǎn)座子插入片段的菌株的分離，在該菌株的分離過程中不使用選擇標(biāo)記。例4構(gòu)建用于含有源于pUB110的oriT的質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移的供體菌株通過接合作用可將質(zhì)粒pLS20和pBC16從枯草芽胞桿菌菌株P(guān)SL1UM13轉(zhuǎn)移到各種芽胞桿菌屬受體菌株中(Koehler，T.M.和Thorne，C.B.(1987).Bacillussubtilis(natto)plasmidpLS20mediatesinterspeciesplasmidtramsfer.J.Bacteriol.，169，5272-5278)。DN1280是枯草芽胞桿菌168的衍生物，其含有da1基因上的一個(gè)缺失(Diderichsen，B.(1986)，AgeneticsystemforstabilizationofclonedgenesinBacillussubtilis，p35-46.見A.T.Ganesan和J.A.Hoch(著)，Bacillusmoleoulargeneticsandbiotechnologyapplications.AcademicPress，Inc.，NewYork)。使DN1280變成感受態(tài)，并用質(zhì)粒pHV1248轉(zhuǎn)化，在30℃下篩選紅霉素抗性(5μg/ml)。將所得到的菌株用作與pSL1UM13接合的受體。從培養(yǎng)過夜的板上取兩種菌株，在含有D-丙氨酸(100μg/ml)的LBPSG板(補(bǔ)充了磷酸鹽(0.01MK3PO4)、葡萄糖(0.4％)和淀粉(0.5％))上混合，并在30℃下培養(yǎng)5小時(shí)。將該板復(fù)制到上述LBPSG板上，但其另外含有紅霉素(5μg/ml)和四環(huán)素(5μg/ml)。分析出現(xiàn)在復(fù)制板上的單菌落的將pBC16轉(zhuǎn)移至枯草芽胞桿菌DN1885中的能力。通過在上述LBPSG板上混合所述菌株進(jìn)行接合，并在30℃下培養(yǎng)5小時(shí)。復(fù)制到含有四環(huán)素(5μg/ml)，但不含D-丙氨酸的LBPSG板上。去掉D-丙氨酸可以對dal-供體菌株有效地進(jìn)行反選擇。所分析的菌落很少能夠?qū)etR標(biāo)記轉(zhuǎn)入DN1885。這表明這些菌落除了具有pBC16外還獲得了pLS20。在50℃下，在含有四環(huán)素(5μg/ml)和D-丙氨酸(100μg/ml)的液體TY的培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述菌落之一，然后鋪板于含有四環(huán)素(5μg/ml)和D-丙氨酸(100μg/ml)的LB上，并分別復(fù)制鋪板于含有D-丙氨酸(100μg/ml)和紅霉素(5μg/ml)或氯霉素(6μg/ml)的LB上。將一個(gè)四環(huán)素抗性，紅霉素和氯霉素敏感型分離物以PP289-5形式保存。該菌株是da1--型，并含有pLS20和pBC16，可以用作接合供體菌株，它可以讓含有pUB110oriT的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到各種受體菌株中。例5構(gòu)建用于Savinase基因轉(zhuǎn)座的可移動(dòng)的轉(zhuǎn)座子輸送載體由pLS20或其衍生物產(chǎn)生的質(zhì)粒pUB110的移動(dòng)性業(yè)已披露，并做過一些詳細(xì)分析(Koehler，T.M.和Thorne，C.B.(1987).Bacillussubtilis(natto)plasmidpLS20mediatesinterspeciesplasmidtransfer.J.Bacteriol.，169，5271-5278；selinger，L.B.，McGregor，N.F.，Khachatourians，G.G.和Hynes，M.F.(1990).MobilizationofcloselyrelatedplasmidspUB110andpBC16byBacillusplasmidpXO503requiestrans-actingopenreadingframeβ.J.Bacteriol.，172，3290-3297)。在本發(fā)明中，源于所述質(zhì)粒的因子被用于使轉(zhuǎn)座子輸送系統(tǒng)移動(dòng)化。pUB110的移動(dòng)性取決于位于orfβ5′端的順式作用片段(oriT)(Selinger等，1990)。采用引物L(fēng)WN5232和LWN5233對一個(gè)源于pUB110的，從pUB110序列的1020位延伸到1575位的555bp的片段(Mckenzie，T.Hoshino，T.，Tanaka，T.，Sueoka，N.(1986)ThenucleotidesequenceofpUB110somesalientfeaturesinrelationtoreplicationanditsregulation.Plasmid15，93-103)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。LWN52325′-GTCGGAGCTCATTATTAATCTGTTCAGCAATCGGGC-3′LWN52335′-GTCGGAGCTCTGCCTTTTAGTCCAGCTGATTTCAC-3′用SacI消化擴(kuò)增的片段，并首先克隆在大腸桿菌質(zhì)粒(一種pUC19衍生物)的SacI位點(diǎn)。然后再用SacI將該片段切除，并將其克隆到上述質(zhì)粒pMOL553的獨(dú)特SacI位點(diǎn)上。將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌SJ2中，選擇氨芐青霉素抗性(100μg/ml)。由收集的轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒，并將該質(zhì)?；旌衔镛D(zhuǎn)化到PP289-5，在含有D-丙氨酸(100μg/ml)的LBPSG板上選擇四環(huán)素(5μg/ml)、氯霉素(6μg/ml)和紅霉素(5μg/ml)抗性。再次收集轉(zhuǎn)化體，并通過接合作用將收集物用于將pMOL553的oriT衍生物轉(zhuǎn)移到DN1885中，采用在例4中所披露的方法。最后，通過限制性作圖證實(shí)反式接合體上所述質(zhì)粒的身份，保留含有正確質(zhì)粒的菌株，為SJ3282(DN1885/pSJ3282(＝pMOL553-oriT；圖2))。例6構(gòu)建能表達(dá)pAMβ1解離酶的可移動(dòng)質(zhì)粒將質(zhì)粒pWT和pMAP29用作以下實(shí)驗(yàn)的原料。pWT是一種多拷貝數(shù)pAMβ1衍生物，具有圖3所示的限制圖。將其轉(zhuǎn)化到枯草芽胞桿菌DN1885中，并將一個(gè)轉(zhuǎn)化體以菌株SJ3008形式保存。按照布達(dá)佩斯條約將該菌株作為專利保存物交由DSM保存，保存號(hào)為DSM10444，保存日為1995年12月22日。pMAP29含有2個(gè)直接重復(fù)的解離位點(diǎn)(res)，其側(cè)翼為壯觀霉素抗性決定子，并允許res/spc/res結(jié)構(gòu)插入枯草芽胞桿菌的amy基因座。它具有圖4所示的限制圖。將其保存在大腸桿菌菌株SJ3007中。該菌株按照布達(dá)佩斯條約作為專利保藏物交由DSM保存，保存號(hào)為DSM10446，保存日為1995年12月22日。用ScaI消化pMAP29，并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)DN1885中，選擇壯觀霉素抗性(60μg/ml)。將所述轉(zhuǎn)化體之一作為SJ3109保存。使SJ3109成為感受型，并作為感受態(tài)細(xì)胞維持其壯觀霉素抗性。由SJ3008制備的pWT被轉(zhuǎn)化SJ3109中，在30℃下選擇紅霉素抗性(5μg/ml)。在24個(gè)檢驗(yàn)過的轉(zhuǎn)化體菌落中，有2個(gè)是壯觀霉素敏感性的。在30℃下，在含有紅霉素(2μg/ml)的TY培養(yǎng)基中繁殖5個(gè)壯觀霉素抗性轉(zhuǎn)化體2天。通過這些培養(yǎng)物的復(fù)制鋪板揭示，僅在3種轉(zhuǎn)化體中有壯觀霉素敏感型細(xì)胞，但在其他2個(gè)轉(zhuǎn)化體中仍有壯觀霉素抗性細(xì)胞。通過在50℃下再劃線2次，能輕易將質(zhì)粒pWT從細(xì)胞中清除。因此，由pWT所表達(dá)的解離酶能輕易地將壯觀霉素抗性基因從SJ3109的染色體上切除。pAMβ1解離酶基因的序列是已知的，因?yàn)樵摻怆x酶是由ORFH編碼的，如由Swinfield等所披露的(Swinfield，T.J.Janniere，L.，Ehrlich，S.D.，Minton，N.P.(1991)。CharacterizationofaregionoftheEnterococcusfaecalisplasmidpAMβ1whichenhancesthesegregationalstabilityofpAMβ1-derivedcloningvectorsinBacillussubtilis.Plasmid26，209-221)。以pWT為模板，并采用以下引物通過PCR反應(yīng)進(jìn)行基因擴(kuò)增BamHIPstI<5102-5129位>LWN78395′-GACGGGATCCCTGCAGTATCCAATTTATTTTTTTCTTAACAAGG-3′EcoRIHindIII<5820-5797位>LWN78405′-GACGGAATTCAAAGCTTAAAGCACTTGCATAGGCTAATGCC-3′其中的序列編號(hào)由上述文獻(xiàn)而來。用限制性酶PstI和HindIII消化擴(kuò)增的DNA片段，然后與自pDN1981上分離的4.1kb的PstI-HindIII片段連接(Jφrgensen，P.L.，Hansen，C.K.，Poulsen，G.B.，Diderichsen，B.(1990).Invivogeneticengineeringhomologousrecombinationasatoolforplasmidconstruction.Gene96，37-41)，并轉(zhuǎn)化到枯草芽胞桿菌DN1885中，選擇卡那霉素抗性(10μg/ml)。保存兩個(gè)轉(zhuǎn)化體含有pSJ3157的SJ3157(圖5)，和含有pSJ3158的SJ3158(在克隆時(shí)破壞了pSJ3158上的PstI位點(diǎn)，除此之外該質(zhì)粒是相同的)。pSJ3157和pSJ3158是質(zhì)粒pAmyLres的例子，其含有由地衣型芽胞桿菌amyL啟動(dòng)子表達(dá)的解離酶基因，位于pUB110衍生的載體上，能產(chǎn)生卡那霉素抗性。將上述兩種質(zhì)粒和作為對照的pDN1981轉(zhuǎn)化到SJ3109中。在30℃下在含有卡那霉素的TY培養(yǎng)基中培養(yǎng)卡那霉素和壯觀霉素抗性菌落(每種質(zhì)粒5個(gè))3天，然后分散用于復(fù)制鋪板所得到的所有含pSJ3157或pSJ3158的菌落都是壯觀霉素敏感性的，而含有pDN1981的菌落是壯觀霉素抗性的。因此，由Termamyl(amyL)啟動(dòng)子表達(dá)的解離酶可有效地用于促進(jìn)芽胞桿菌染色體上res位點(diǎn)之間的重組。在隨后的步驟中，將amyL啟動(dòng)子和解離酶基因轉(zhuǎn)移到可移動(dòng)的、溫度敏感型克隆載體pSJ2739(圖6)上。該載體含有pE194的復(fù)制功能基因和紅霉素抗性基因(Horinouchi，S.，和Weisblum，B.(1982)。NucleotidesequenceandfunctionalmapofpE194，aplasmidthatspecifiesinducibleresistancetomacrolide，lincosamide，andstreptogramintypeBantibiotics.J.Bacteriol.，150，804-814)，pUB110的oriT，pUB110的部分卡那霉素抗性基因，和源于地衣型芽胞桿菌的α-淀粉酶基因(amyL)的一個(gè)片段。其全序列如序列2所示。可以用Bg1II和例如HindIII將由位于例如pDN1981上的amyL啟動(dòng)子表達(dá)的基因轉(zhuǎn)移到pSJ2739中。這一克隆過程能恢復(fù)其卡那霉素抗性基因。用Bg1III和HindII分別消化pSJ3157和pSJ3158，將其2.3kb的片段和pSJ2739的5.4kb的Bg1II-HindIII片段連接，并將該混合物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)DN1885中，在30℃下選擇卡那霉素(10μg/ml)和紅霉素(5μg/ml)抗性。所保存的3個(gè)轉(zhuǎn)化體為SJ3279(pSJ3279；源于pSJ3157)SJ3280(pSJ3280；源于pSJ3157)和SJ3281(pSJ3281；源于pSJ3158)。其限制圖示于圖7中。這些質(zhì)粒是質(zhì)粒pAmyLres(ts)的例子。通過對菌株SJ3109的轉(zhuǎn)化分析所述質(zhì)粒的功能；繁殖含有每種質(zhì)粒的SJ3109，會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)壯觀霉素敏感型細(xì)胞，隨后通過在46℃下，在沒有抗生素的培養(yǎng)基中生長能輕易地將所述質(zhì)粒從細(xì)胞中清除。例7構(gòu)建用于解離酶表達(dá)質(zhì)粒的供體菌株將在例6中構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到接合供體菌株P(guān)P289-5(da1-，pLS20，pBC16)的感受態(tài)細(xì)胞中，使其容易通過接合作用轉(zhuǎn)移到芽胞桿菌菌株中。保存以下菌株SJ3308＝PP289-5/pSJ3279SJ3309＝PP289-5/pSJ3280SJ3310＝PP289-5/pSJ3281上述菌株能夠?qū)⒔怆x酶表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到菌株SJ3109中，采用上述接合方法，其中它能起到將壯觀霉素抗性基因從其染色體上切除的作用。例8將解離酶靶位點(diǎn)，res插在可移動(dòng)的、用于Sayinase基因的轉(zhuǎn)座的轉(zhuǎn)座子輸送載體的cat標(biāo)記附近。pMOL553(見圖1)上的MluI和SacII位點(diǎn)是單一的。因此，可以構(gòu)建修飾形式的MluI-SacII片段，以使cat基因的每一端含有res位點(diǎn)，并可以連接到MluI+SacII消化過的pMOL553上。所述構(gòu)建可以通過PCR擴(kuò)增進(jìn)行，采用若干寡核苷酸引物，使用圖8所示的SOE方法。res位點(diǎn)曾位于pAMβ1序列上(Swinfield，T.J.，Oultram，J.D.，Thompson，D.E.，Brehm，J.K.，Minton，N.P.(1990)physicalCharacterizationofthereplicationregionofthestreptococcusfaecalisplasmidpAMβ1，Gene87，pp.79-90)的4841-4951位(Janniere，L.，Gruss，A.，Ehrlich，S.D.(1993)，plasmids，pp.625-644inSonenshein，A.L.，Hoch，J.A.，Losick，R.(著)Bacillussubtilisandothergfam-positivebacteriaBiochemistry，physiology，andMolecularGenetics.AmericanSocietyforMicrobiology，Washington，D.C.)。因此，用于圖8所示的構(gòu)建的PCR引物具有如下序列LWN7794KpnIMluI5′-GACGGGTACCACGCGTTAATCAATAAAAAAACGCTGTGCGGTTAAA-BamHI<-X17092位4840-4863-->GGGCACAGCGTTTTTTTGTGTATGGATCCTTCTATCTTTTATAGGTCATTAG-3′LWN7790pMOL553位3942-3920><X17092位4975-49565′-TATATATTTTAAAAATATCCCACGGTTCTTCAAATATTTCTCC-3′LWN7789x17092位4956-4975><pMOL553位3920-39435′-GGAGAAATATTTGAAGAACCGTGGGATATTTTTAAAATATATAT-3′LWN7788x17092位4829-4808><pMOL553位4795-47735′-CAAGTGTTCGCTTCGCTCTCACGGAGCTGTAATATAAAAACCTTC-3′LWN7787pMOL553位4773-4795><X17092位4808-48295′-GAAGGTTTTTATATTACAGCTCCGTGAGAGCGAAGCGAACACTTG-3′LWN7784pMOL553位4819-4796><x17092位4953-49335′-CATATGATCAAATGGTTCGGATCTGATTTTCCTCCTCTAATATGC-3′LWN8197X17092位4933-4953><pMOL553位4796-48195′-GCATATTAGAGGAGGAAAATCAGATCCGAACCATTTGATCATATGACAAGATGTG-3′LWN7791EcoRISacII5′-GACGGAATTCCCGCGGTAAATAGCAATAAATTGGC-3′LWN7780KpnIMluI5′-GACGGGTACCACGCGTTAATC-3′在一個(gè)采用Taq聚合酶的標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)中(25輪)，用10pmole的每種引物，按如下方法制備PCR片段A、B、C和D(圖8)。A引物L(fēng)WN7794和LWN7790，模板pWT(源于SJ3008)，退火溫度49℃。從瓊脂糖凝膠中純化所得到的230bp的片段。B引物L(fēng)WN7789和LWN7788，模板pMOL553，退火溫度51℃。從瓊脂糖凝膠中純化所得到的900bp的片段。C引物L(fēng)WN7787和LWN7784，模板pWT(源于SJ3008)，退火溫度53℃。從瓊脂糖凝膠中純化所得到的180bp的片段。D引物L(fēng)WN8197和LWN7791，模板pMOL553，退火溫度55℃。從瓊脂糖凝膠中純化所得到的275bp的片段。上述片段分兩步進(jìn)行裝配。在第一步，混合純化的A和B片段樣品，并將其用作采用了引物L(fēng)WN7780和LWN7788的PCR反應(yīng)的模板，退火溫度為55℃。從瓊脂糖凝膠中純化所得到的1100bp的組合片段(AB)。與此同時(shí)，混合純化的片段C和D的樣品，并用作采用了引物L(fēng)WN7787和LWN7791的PCR反應(yīng)的模板，退火溫度為55℃。從瓊脂糖凝膠中純化所得到的440bp的組合片段(CD)。在第二步，混合兩種純化的組合片段AB和CD，并將其用作采用了引物L(fēng)WN7780和LWN7791的PCR反應(yīng)的模板，退火溫度為55℃。從瓊脂糖凝膠中純化所得到的1500bp的組合片段(ABCD)。用EcoRI和KpnI消化純化的片段(ABCD)，連接于用EcoRI+KpnI消化過的pUC19上，將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌SJ2中，選擇氨芐青霉素抗性(100μg/ml)和氯霉素抗性(6μg/ml)，所保存的5種轉(zhuǎn)化體為SJ3372＝SJ2/pSJ3372SJ3373＝SJ2/pSJ3373SJ3374＝SJ2/pSJ3374SJ3375＝SJ2/pSJ3375SJ3376＝SJ2/pSJ3376.通過限制性分析證實(shí)所述質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)，并在一臺(tái)AppliedBiosystems自動(dòng)測序儀上用引物L(fēng)WN89065′-GGTTTTTCGCATGTATTGCG-3′和LWN89075′-GTTCATTTGATATGCCTCC-3′對插入片段的res和IR部分進(jìn)行測序。在圖9中給出了pSJ3372-76的限制圖。DNA測序表明，在質(zhì)粒pSJ3372和pSJ3376上的res和IR片段不含因PCR擴(kuò)增失誤而產(chǎn)生的突變。將源于質(zhì)粒pSJ3372或質(zhì)粒pSJ3376的1.5kbSacII-MluI片段連接在源于pSJ3282的9.6kb的SacII-MluI片段上，構(gòu)建最終的轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒。通過電擊將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌SJ2中，并在30℃下將細(xì)胞鋪板于氨芐青霉素(100μg/ml)+氯霉素(6μg/ml)或紅霉素(5μg/ml)+氯霉素(6μg/ml)的培養(yǎng)基上，并將轉(zhuǎn)化體在所有3個(gè)抗生素上再劃線。保存兩種轉(zhuǎn)化體SJ3389＝SJ2/pSJ3389(源于pSJ3376)和SJ3390＝SJ2/pSJ3390(源于pSJ3372)。通過PCR擴(kuò)增和限制性分析證實(shí)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)。pSJ3389-90的限制圖如圖10所示。例9構(gòu)建用于例8的轉(zhuǎn)座子輸送系統(tǒng)的接合轉(zhuǎn)移的供體菌株用pSJ3389轉(zhuǎn)化枯草芽胞桿菌菌株P(guān)P289-5的感受態(tài)細(xì)胞，在含有D-丙氨酸(100μg/ml)的LPPSG板上選擇抗四環(huán)素(5μg/ml)抗性、紅霉素(6μg/ml)抗性和氯霉素(6μg/ml)抗性。所保存的轉(zhuǎn)化體為SJ3503＝PP289-5/pSJ3389和SJ3504＝PP289-5/pSJ3389例10將例8的轉(zhuǎn)座子輸送系統(tǒng)導(dǎo)入枯草芽胞桿菌中，并分離發(fā)生了轉(zhuǎn)座作用的菌株用質(zhì)粒pSJ3389或pSJ3390轉(zhuǎn)化枯草芽胞桿菌DN1885感受態(tài)細(xì)胞，在30℃下選擇紅霉素(5μg/ml)和氯霉素(6μg/ml)抗性。保存4個(gè)含有每種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體，其在含有脫脂奶的板上均表現(xiàn)出獨(dú)特的蛋白酶陽性表型SJ3431＝DN1885/pSJ3389SJ3432＝DN1885/pSJ3389SJ3433＝DN1885/pSJ3389SJ3434＝DN1885/pSJ3389SJ3435＝DN1885/pSJ3390SJ3436＝DN1885/pSJ3390SJ3437＝DN1885/pSJ3390SJ3438＝DN1885/pSJ3390將所述菌株接種在含有3μg/ml氯霉素的10mlTY培養(yǎng)基中，在30℃下振蕩過夜。將100μl轉(zhuǎn)移到新的含有3μg/ml氯霉素的10mlTY培養(yǎng)基試管中，并在50℃下振蕩4小時(shí)。將各試管的稀釋系列鋪板于含有6μg/ml氯霉素的LBPSG上，并在50℃下培養(yǎng)2天。然后將這些板復(fù)制鋪板到i)含有紅霉素(5μg/ml)和氯霉素(6μg/ml)的板上，和ii)僅含有氯霉素(6μg/ml)的板上，并在30℃下培養(yǎng)這些板過夜。在氯霉素抗性菌落中僅有10-20％具有保留的紅霉素抗性，表明所述轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒繼續(xù)存在于這些細(xì)胞中。從8個(gè)菌株中各保存1個(gè)氯霉素抗性、紅霉素敏感型分離體源于SJ3431的SJ3465，源于SJ3432的SJ3466，源于SJ3433的SJ3467，源于SJ3434的SJ3468，源于SJ3435的SJ3469，源于SJ3436的SJ3470，源于SJ3437的SJ3471，和源于SJ3438的SJ3472。SJ3470在液體TY培養(yǎng)基中為明顯的紅色。用上述菌株進(jìn)行對照PCR反應(yīng)，采用引物L(fēng)WN51365′-CCGGCGGATCCAAGGGGTGATCG-3′和LWN50675′-CCAGAACCTGTCAATCCACG-3′，退火溫度為55℃。得到1個(gè)900bp的片段，正如所預(yù)計(jì)的轉(zhuǎn)座DNA上的Savinase結(jié)構(gòu)擴(kuò)增的結(jié)果，證實(shí)在這些菌株的基因組中存在Savinase基因。例11解離酶介導(dǎo)的例10中菌株的標(biāo)記缺失例7所述菌株SJ3309能夠通過接合作用將解離酶表達(dá)質(zhì)粒供給芽胞桿菌屬受體菌株。將SJ3309在含有D-丙氨酸(100μg/ml)、四環(huán)素(5μg/ml)和紅霉素(5μg/ml)的LBPSG板上劃線，并在30℃下培養(yǎng)過夜。將SJ3465-SJ3472的每種菌株在含有氯霉素(6μg/ml)的LBPSG板上劃線，并在37℃下培養(yǎng)過夜。在含有D-丙氨酸(100μg/ml)的獨(dú)立LBPSG板上將SJ3465-SJ3472中的每一菌株與菌株SJ3309混合，并在30℃下培養(yǎng)這些板5小時(shí)。然后將細(xì)胞再懸浮于TY培養(yǎng)基中，并鋪板于含有紅霉素(5μg/ml)和氯霉素(6μg/ml)或僅含紅霉素的LBPSG板上。在30℃下將這些板培養(yǎng)3天。受體菌株為SJ3465-SJ3468的反式接合體在僅含紅霉素的板上生長良好，但在含有氯霉素和紅霉素的板上生長較差。受體菌株為SJ3469-SJ3472的反式接合體在兩種類型的板上均生長良好。當(dāng)進(jìn)行再分離時(shí)，源于SJ3465-SJ3468的反式接合體僅能在紅霉素上生長，表明其喪失了氯霉素抗性基因。源于SJ3469-SJ3472的反式接合體能夠在兩種類型的板上生長。為了從所述細(xì)胞中清除解離酶表達(dá)質(zhì)粒，將源于SJ3465-SJ3468的反式接合體接種到TY培養(yǎng)基中，并在50℃下振蕩培養(yǎng)5小時(shí)。用這些培養(yǎng)物的樣品在LBPSG板上劃線，將這些板在50℃下培養(yǎng)過夜，然后復(fù)制到LBPSG、含有氯霉素(10μg/ml)的LBPSG和含有紅霉素(5μg/ml)的LBPSG上。將這些板在37℃下培養(yǎng)過夜，對來自每種培養(yǎng)物的1個(gè)紅霉素敏感型、氯霉素敏感型分離體進(jìn)行保存源于SJ3465的SJ3461源于SJ3466的SJ3462源于SJ3467的SJ3463源于SJ3468的SJ3464。將源于SJ3469-SJ3472的保留了其氯霉素抗性的反式接合體接種到含有2μg/ml紅霉素的TY培養(yǎng)基中，在30℃下振蕩培養(yǎng)3天。在30℃下將樣品鋪板于LBPSG上，并將這些板復(fù)制到LBPSG、含有氯霉素(10μg/ml)的LBPSG和含有紅霉素(5μg/ml)的LBPSG上。所有菌落均為紅霉素抗性，但源于SJ3470的90％的菌落和源于其他3種菌株的所有菌落均為氯霉素敏感型，這再次表明氯霉素抗性基因的丟失。解離酶表達(dá)質(zhì)粒如上述被從所述菌株中清除。保存以下菌株源于SJ3469的SJ3489源于SJ3470的SJ3490源于SJ3472的SJ3491。采用引物L(fēng)WN5136和LWN5067通過例10所述的PCR證實(shí)了Savinase基因的存在。例12將例8的轉(zhuǎn)座子輸送載體再次導(dǎo)入例11的無標(biāo)記菌株中，并分離發(fā)生了轉(zhuǎn)座作用的菌株通過在板上的接合作用將pSJ3389從SJ3503和SJ3504中轉(zhuǎn)移到菌株SJ3461中，如上文所述。在D-丙氨酸板上培養(yǎng)混合菌株，然后對細(xì)胞進(jìn)行再懸浮，并在30℃下鋪板于含有氯毒素(6μg/ml)和紅霉素(5μg/ml)的LBPSG上。檢查菌落的四環(huán)素抗性，證實(shí)pBC16的存在。在30個(gè)檢查過的菌落中有3個(gè)是四環(huán)素敏感型的，保存這些菌株SJ3486＝SJ3461/pSJ3389，SJ3487＝SJ3461/pSJ3389，和SJ3488＝SJ3461/pSJ3389.基本上按上述方法分離在其基因組上插入了新拷貝的Savinase基因的菌株，所不同的是將BPX用作液體培養(yǎng)基。將菌株SJ3486、SJ3487和SJ3488(枯草芽胞桿菌菌株DN1855，含有一個(gè)染色體Savinase基因拷貝+轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒)、以及對照菌株SJ3431(枯草芽胞桿菌DN1885，僅含有轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒)接種到含有氯霉素(6μg/ml)的10mlBPX中，在30℃下振蕩培養(yǎng)4天。將樣品(約100μl)轉(zhuǎn)移到含有氯霉素(6μg/ml)的新的100mlBPX試管中，在50℃下振蕩培養(yǎng)4小時(shí)，然后將這些培養(yǎng)物的樣品于37℃下涂在含有氯霉素(6μg/ml)的LBPSG上，并通過復(fù)制鋪板檢查所得菌落的紅霉素抗性。源于SJ3431的所有菌落均為紅霉素敏感型。源于菌株SJ3486和SJ3488的所有菌落均為紅霉素抗性。源于SJ3487的約半數(shù)菌落為紅霉素敏感型，保存其中的10個(gè)菌株，為SJ3537-SJ3546例13解離酶介導(dǎo)的例12菌株中的標(biāo)記缺失選擇菌株SJ3537，3539，3541和3546用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。通過接合作用將解離酶表達(dá)質(zhì)粒從菌株SJ3309中導(dǎo)入上述菌株，如在例11中接合單拷貝菌株所述。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，通過復(fù)制鋪板在紅霉素板上選擇的所有反式接合菌落均為氯霉素敏感型，僅少數(shù)源于SJ3541受體的菌落除外。由此發(fā)現(xiàn)由解離酶介導(dǎo)的氯霉素抗性基因的切除是十分有效的。約有50％的菌落為四環(huán)素敏感型，表明其缺乏pBC16(其作為輔助因子存在于供體菌株中)。將來自每種受體的1個(gè)四環(huán)素敏感型、氯霉素敏感型反式接合菌落置于TY中，在50℃下繁殖4小時(shí)，然后在50℃下鋪板于LBPSG上，并檢查所得菌落中解離酶表達(dá)質(zhì)粒的缺乏，檢查是通過將其復(fù)制鋪板于含有紅霉素(5μg/ml)的LBPSG板上進(jìn)行的。均為紅霉素敏感型。保存來自每種受體菌株的1個(gè)菌落源于SJ3537的SJ3565，源于SJ3539的SJ3566，源于SJ3541的SJ3567，和源于SJ3546的SJ3568。例14顯示例10-13的菌株的Savinase產(chǎn)率暈圈在板上的形成將菌株DN1885(枯草芽胞桿菌Savinase陰性受體菌株)、SJ3465-SJ3472(1.轉(zhuǎn)座，CamR、Sav+)、SJ3461(1.轉(zhuǎn)座CamS，Sav+(源于SJ3465))、SJ3537-SJ3546(2.轉(zhuǎn)座(在SJ3461上)，CamR，Sav+)、和SJ3565-SJ3568(2.轉(zhuǎn)座，CamS，Sav+)在含有1％脫脂奶的LBPSG板上劃線。在37℃下培養(yǎng)過夜，然后觀察暈圈形成的差異。DN1885幾乎沒有任何暈圈，1.轉(zhuǎn)座菌株有清晰的暈圈，而2.轉(zhuǎn)座菌株似乎具有略大于1.轉(zhuǎn)座菌株的暈圈。由于cat基因的消除未發(fā)現(xiàn)暈圈大小的差異。Mancini免疫擴(kuò)散分析將菌株接種到100mlBPX搖瓶(加入0.5ml1MNaoH)中，并以300rpm的速度在30℃下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)4天。在含有抗Savinase抗體的瓊脂糖凝膠上對上清液進(jìn)行Mancini免疫擴(kuò)散分析。未觀察到DN1885的沉淀區(qū)域，符合該菌株中缺乏Savinase基因的事實(shí)。在1.轉(zhuǎn)座菌株(SJ3465-3472)觀察到大小略有差異的沉淀區(qū)。cat基因的消除不會(huì)明顯影響這些區(qū)域(SJ3461)。在2.轉(zhuǎn)座菌株(SJ3537-3546)中觀察到明顯較大的沉淀區(qū)域，cat基因的消除不會(huì)明顯影響這些區(qū)域(SJ3565-3568)。在圖11的A和B中對所述免疫擴(kuò)散板進(jìn)行重復(fù)。結(jié)論上述表型試驗(yàn)由此揭示了菌株構(gòu)建的結(jié)果一個(gè)(至少)拷貝的Savinase基因可通過轉(zhuǎn)座作用插入，產(chǎn)生Savinase產(chǎn)物。可以用解離酶將轉(zhuǎn)座的DNA上的氯霉素抗性基因除去，所得到的菌株仍能以原有水平產(chǎn)生Savinase?？梢栽俅卫糜糜诓迦氲谝粋€(gè)拷貝的相同轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒將1個(gè)(或幾個(gè))額外拷貝的Savinase基因插入單拷貝菌株。這會(huì)導(dǎo)致Savinase產(chǎn)率的提高。然后可以再次利用解離酶將轉(zhuǎn)座的DNA上的氯霉素抗性基因除去，而所得到的菌株保留其產(chǎn)生較高Savinase產(chǎn)量的能力。例15例10-13菌株的Southern分析將例10-13的菌株在TY培養(yǎng)基中生長過夜，并通過標(biāo)準(zhǔn)方法(苯酚/氯仿萃取)提取染色體DNA。用EcoRI消化該DNA，該酶能裂解轉(zhuǎn)座DNA的Savinase基因部分的內(nèi)部，并用BglI、PstI和SacII酶進(jìn)行消化，這些酶不會(huì)裂解轉(zhuǎn)座DNA的內(nèi)部。為了得到適度大小的DNA片段，將幾種酶一起使用，這些片段能在凝膠上很好地分離。電泳之后，通過真空吸印將DNA片段轉(zhuǎn)移到Immobilon-N(Millipore)膜上，并用生物素化標(biāo)記的探針檢測該膜，采用的是購自NewEnglandBolabs的NEBlotPhototopeKit和PhototopeDetectionKit。用幾組探針檢測同一張膜。首先，采用可識(shí)別轉(zhuǎn)座DNA上半部的探針，即pSJ3389上2000位附近的IR與3600位附近的EcoRI位點(diǎn)之間的片段。該探針是采用引物L(fēng)WN5136和LWN5067通過PCR擴(kuò)增由pMOL553制備的。預(yù)計(jì)該探針能夠識(shí)別一個(gè)源于各轉(zhuǎn)座子插入片段的片段，而該片段不會(huì)受隨后的解離酶作用的影響。這種情形恰如圖12A所示。在第一輪轉(zhuǎn)座之后分離菌株SJ3465-SJ3472，其含有cat和Savinase基因。由于其是通過不同的轉(zhuǎn)座作用而產(chǎn)生的，觀察到大小不同的片段。從SJ3465中分離出菌株SJ3461，其僅含有Savinase基因。在該菌株中觀察到相同的雜交片段(2.0kb)。在第二輪轉(zhuǎn)座后分離到菌株SJ3537-3546。其含有與SJ3461相同的片段(2.0kb)，但額外獲得了一個(gè)1.8kb的雜交片段。在菌株SJ3565-3568中觀察到兩個(gè)相同的雜交片段，其中，解離酶基因被用于缺失cat基因(用核酸酶降解源于SJ3565的DNA)。然后去除所述膜上的探針，并用兩個(gè)探針進(jìn)行再雜交。其中一個(gè)探針與上述探針相同。另一個(gè)是含有res-cat-res-IR的PCR片段，在例8中被稱為ABCD。第一個(gè)探針應(yīng)當(dāng)識(shí)別與前面相同的片段。新探針應(yīng)當(dāng)識(shí)別新的片段，而且該片段由于解離酶介導(dǎo)的cat基因的缺失而變小。這正是在圖12B中所觀察到的情形。在菌株SJ3465中約3.7kb的片段在菌株SJ3461中被減少至約2.7kb。菌株SJ3537-46中含有另一個(gè)3.3kb的片段，它在SJ3566-68中被減少至2.3kb。在Southern印跡的較上部可見一些片段，這是由于一種或幾種酶對染色體DNA的不完全消化而形成的。同樣，在圖12A中確實(shí)看到了含有轉(zhuǎn)座子的res-cat-res-IR部分的片段。這是因?yàn)樵谟糜跇?biāo)記的材料中存在某些質(zhì)粒pMOL553(PCR片段未經(jīng)凝膠純化)。例16構(gòu)建含有res-spc-res框的可移動(dòng)轉(zhuǎn)座子輸送載體A)擴(kuò)增spc抗性基因。壯觀霉素抗性基因是從質(zhì)粒pMAP29(圖4)中獲得的，它位于1.2kb的SalI-BamHI片段上。從瓊脂糖凝膠中純化該片段，并連接于XhoI+BamHI消化的pDN3000(Diderichsen等，1990，J.Bacteriol.172，4315-4321)，得到質(zhì)粒pSJ3216(圖13)。通過電擊將連接混合物導(dǎo)入大腸桿菌SJ2中，并選擇氨芐青霉素(100μg/ml)和壯觀霉素(60μg/ml)抗性。spc基因是由pSJ3216PCR擴(kuò)增的，采用引物L(fēng)WN85245′-GACTGAATTCGGATCCACGCGTATAATAAAGAATAATTATTAATCTGTAG-3′，和LWN85285′-GACTAAGCTTGAGCTCCACTAATATTAATAAACTATCGAAGG-3′；退火溫度為50℃。在瓊脂糖凝膠上純化所述片段，用EcoRI和HindIII消化，并連接到EcoRI+HindIII消化的pUC19上。通過電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌SJ2，在含有IPTG和X-gal的板上選擇氨芐青霉素抗性(100μg/ml)。在含有氨芐青霉素(100μg/ml)和壯觀霉素(60μg/ml)的板上對白色菌落進(jìn)行再分離。保存的菌株為SJ3318(SJ2/pSJ3318)和SJ3319(SJ2/pSJ3319)。pSJ3318的限制圖如圖14所示。B)用多接頭擴(kuò)增res位點(diǎn)。在PCR反應(yīng)中以質(zhì)粒pWT(圖3)為模板，采用引物L(fēng)WN85295′-GACTGAATTCCTGCAGGAGCTCAGTGAGAGCGAAGC-GAACAC-3′和LWN85315′-GACTAAGCTTTGATCAAATGGTTGCGGCCGCGT-CGACTCTAGACCCGGGTACCAGATCTGGATCCTCGGGTTCTTCAAATATTTCTCC-3′；退炎溫度為59℃。從瓊脂糖凝膠中純化該片段，用EcoRI和HindIII消化，并連接于EcoRI+HindIII消化的pUC19上。通過電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌SJ2，在含有IPTG和X-gal的板上選擇氨芐青霉素抗性(100μg/ml)。在類似的板上對白色菌落進(jìn)行再分離。用引物L(fēng)WN71915′-GTTTTCCCAGTCACGAC對由選擇的轉(zhuǎn)化體中制備的質(zhì)粒進(jìn)行DNA測序。保存2個(gè)具有正確的插入片段序列的質(zhì)粒SJ3328(SJ2/pSJ3328)和SJ3329(SJ2/pSJ3329)(圖15)。C)res位點(diǎn)擴(kuò)增。在PCR反應(yīng)中以質(zhì)粒pWT為模板，采用引物L(fēng)WN85185′-GACTAAGCTTACGCGTTCGGGTTCTTCAAATATTTCTCC-3′和LWN85275′-GACTGAATTCTGATCAAATGGTTCAGTGAGAGCGAAGCGAACAC-3′；退火溫度為59℃。從瓊脂糖凝膠中純化該片段，用EcoRI和HindIII消化，并連接到EcoRI+HindIII消化的pUC19上。通過電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌SJ2，在含有IPTG和X-gal的板上選擇氨芐青霉素抗性(100μg/ml)。在類似的板上對白色菌落進(jìn)行再分離。用引物L(fēng)WN71915′-GTTTTCCCAGTCACGAC對由選擇的轉(zhuǎn)化體中制備的質(zhì)粒進(jìn)行DNA測序。保存2個(gè)具有正確的插入片段序列的質(zhì)粒SJ3326(SJ2/pSJ3326)和SJ3327(SJ2/pSJ3327)(圖16)。D)構(gòu)建spc-res片段。從瓊脂糖凝膠中分離pSJ3318的1.1kb的SacI-EcoRI片段，并連接于SacI+EcoRI消化的pSJ3328上。通過電擊把連接混合物導(dǎo)入大腸桿菌SJ6中，并在含有氨芐青霉素(100μg/ml)和壯觀霉素(60μg/ml)的板上選擇轉(zhuǎn)化體。保存2個(gè)轉(zhuǎn)化體SJ3341(SJ6/pSJ3341)和SJ3342(SJ6/pSJ3342)(圖17)。E)構(gòu)建res-spc-res片段。從瓊脂糖凝膠中純化pSJ3326的0.2kb的EcoRI-MluI片段，并連接于EcoRI+MluI消化的pSJ3341上。通過電擊將連接混合物導(dǎo)入大腸桿菌SJ6中，并在含有氨芐青霉素(100μg/ml)和壯觀霉素(60μg/ml)的板上選擇轉(zhuǎn)化體。保存2個(gè)轉(zhuǎn)化體SJ3358(SJ6/pSJ3358)和SJ3359(SJ6/pSJ3359)(圖18)。F)將小型轉(zhuǎn)座子(IR-cat-IR)克隆在pUC上。將小型轉(zhuǎn)座子片段(無轉(zhuǎn)座酶基因)從pHV1248上切除，該片段位于1.2kb的HindIII片段上，將該片段與HindIII消化的pUC19連接，并用于通過電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌SJ6，以產(chǎn)生氨芐青霉素(100μg/ml)和氯霉素(10μg/ml)抗性。保存2個(gè)轉(zhuǎn)化體SJ3354(SJ6/pSJ3354)和SJ3355(SJ6/pSJ3355)(圖19)。G)將res-spc-res片段插入小型轉(zhuǎn)座子。小型轉(zhuǎn)座子在IR序列中含有BsaBI位點(diǎn)，位于轉(zhuǎn)座必需的末端片段之外。這些位點(diǎn)被用于res-spc-res片段的插入。將res-spc-res片段從pSJ3358上切除，其位于1.6kb的HincII-PvuII片段上，從瓊脂糖凝膠中純化，并連接到pSJ3354的2.8kb的BsaBI片段上。通過電擊法將連接混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌SJ6，以產(chǎn)生氨芐青霉素(100μg/ml)和壯觀霉素(60μg/ml)抗性。保存兩種轉(zhuǎn)化體SJ3444(SJ6/pSJ3444)和SJ3445(SJ6/pSJ3445)(圖20)。H)構(gòu)建含有res-spc-res的轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒。將位于1.8kbHindIII片段上的轉(zhuǎn)座框從pSJ3444上切除，將其連接到pSJ3282的7.85kb的HindIII片段上。通過電擊將連接混合物導(dǎo)入大腸桿菌SJ6中，選擇氨芐青霉素(100μg/ml)和壯觀霉素(60μg/ml)抗性。保存2個(gè)轉(zhuǎn)化體，其具有相對于載體部分取向不同的轉(zhuǎn)座框SJ3475(SJ6/pSJ3475；圖21)和SJ3476(SJ6/pSJ3476；圖22)。檢驗(yàn)該轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒的官能度。將質(zhì)粒pSJ3475和pSJ3476轉(zhuǎn)化到感受態(tài)枯草芽胞桿菌DN1885中，選擇紅霉素(5μg/ml)和壯觀霉素(60μg/ml)抗性。在一輪轉(zhuǎn)座中得到具有每種質(zhì)粒的4個(gè)轉(zhuǎn)化體將其置于含有壯觀霉素(60μg/ml)的10mlTY中生長過夜。將50μl培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到新的含有壯觀霉素(60μg/ml)的10mlTY中，在50℃下培養(yǎng)4小時(shí)(pSJ3475轉(zhuǎn)化體生長良好，pSJ3476轉(zhuǎn)化體生長較差)，并在50℃下鋪板于含有壯觀霉素(60μg/ml)的LBPSG上。將來自每個(gè)板的10個(gè)單菌落分別在含有紅霉素(5μg/ml)和壯觀霉素(60μg/ml)的重復(fù)的板上劃線。大部分菌落為紅霉素敏感型，表明了IR-res-spc-res-IR片段的正確轉(zhuǎn)座和供體質(zhì)粒的丟失。將源于各pSJ3475和pSJ3476轉(zhuǎn)化體的2個(gè)SpcR、Erms菌落用作與作為供體的pSJ3309接合的受體，并在30℃下，在含有卡那霉素(10μg/ml)和有或沒有壯觀霉素(60μg/ml)的板上選擇反式接合體。在卡那霉素板上觀察到良好的生長，但源于四種菌株中三種的反式接合體在含有兩種抗生素的板上生長較差。在任何情況下，通過從卡那霉素板上再分離均能得到壯觀霉素敏感型、卡那霉素抗性菌落。因此，所述修飾過的轉(zhuǎn)座子可以在枯草芽胞桿菌中起作用，并且隨后可以用解離酶將壯觀霉素抗性基因缺失。例17構(gòu)建一種含有res-kan-res框的可移動(dòng)的轉(zhuǎn)座子輸送載體A)擴(kuò)增kan抗性基因由pUB110通過PCR擴(kuò)增kan基因，采用引物L(fēng)WN85165′-GACTGAATTCGGATCCACGCGTGAGTAGTTCAACAAACGGGCC-3′和LWN85175′-GACTAAGCTTGAGCTCCAACATGATTAACAATTATTAGAGG-3′；退火溫度為59℃。從瓊脂糖凝膠中純化該片段，用EcoRI和HindIII消化，并連接于EcoRI+HindIII消化的pUC19。通過電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌SJ2。在含有IPTG和X-gal的板上選擇氨芐青霉素(100μg/ml)抗性。在含有氨芐青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(20μg/ml)的板上對白色菌落進(jìn)行再分離。保存菌株SJ3316(SJ2/pSJ3316)和SJ3317(SJ2/pSJ3317)(圖23)。B)構(gòu)建kan-res片段從瓊脂糖凝膠中分離pSJ3316的1.0kb的SacI-EcoRI片段，并連接于SacI+EcoRI消化的pSJ3328上。通過電擊將連接混合物導(dǎo)入大腸桿菌SJ6中，在含有氨芐青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(10μg/ml)的板上選擇轉(zhuǎn)化體。保留兩個(gè)轉(zhuǎn)化體SJ3339(SJ6/pSJ3339)和SJ3340(SJ6/pSJ3340)(圖24)。C)構(gòu)建res-kan-res片段。從瓊脂糖凝膠中純化pSJ3326的2.0kbEcoRI-MluI片段，并連接于EcoRI+MluI消化的pSJ3340上。通過電擊將連接混合物導(dǎo)入大腸桿菌SJ6，并在含有氨芐青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(10μg/ml)的板上選擇轉(zhuǎn)化體。保存兩個(gè)轉(zhuǎn)化體SJ3356(SJ6/pSJ3356)和SJ3357(SJ6/pSJ3357)(圖25)。D)構(gòu)建含有res-kan-res的轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒i)克隆一個(gè)轉(zhuǎn)座子IR序列。以pMOL553為模板通過PCR擴(kuò)增“下游”轉(zhuǎn)座子IR序列，采用引物L(fēng)WN87605′-GACGGAATTCTC-TAGAGTCGACAGATCCGAACCATTTGATCATATGACAAGATGTG-3′和LWN87615′-GACGGAATTCGCGGCCGCGGTAAATAGCAATAAATTGGCC-3′.用EcoRI消化純化片段，連接于EcoRI消化的pUC19上，并通過電擊導(dǎo)入大腸桿菌SJ2，在含有IPTG和X-gal的板上選擇氨芐青霉素抗性(100μg/ml)。從500個(gè)菌落中獲得約20個(gè)白色菌落。采用引物L(fēng)WN41235′-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3′對來自其中3個(gè)菌落的質(zhì)粒進(jìn)行DNA測序。保存2個(gè)正確的克隆SJ3385(SJ2/pSJ3385)(圖26)和SJ3386(SJ2/pSJ3386)。ii)將一個(gè)IR與res-kan-res序列結(jié)合。將IR序列以0.3kb的NotI-XbaI片段的形式從pSJ3385上切除，連接于NotI+XbaI消化的、磷酸酶處理的pSJ3356上，并通過電擊導(dǎo)入SJ6，選擇氨芐青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(10μg/ml)抗性。保存兩個(gè)轉(zhuǎn)化體SJ3459(SJ6/pSJ3459)SJ3460(SJ6/pSJ3460)(圖27)。iii)構(gòu)建最終的轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒。在這一步，用pSJ3459的相應(yīng)的kan-res片段取代供體質(zhì)粒pSJ3476上的spc-res片段。因此，用MluI和BamHI從pSJ3459上切除1.15kb的片段，并將純化過的該片段與pSJ3476的8.2kb的MluI-BamHI片段連接。通過電擊將混合物導(dǎo)入大腸桿菌SJ6中，選擇氨芐青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(10μg/ml)抗性。保存兩個(gè)轉(zhuǎn)化體SJ3586(SJ6/pSJ3586)和SJ3587(SJ6/pSJ3587)(圖28)。例18用例16的轉(zhuǎn)座子輸送載體將淀粉酶基因轉(zhuǎn)座到枯草芽胞桿菌基因組中以3.2kbBgIII-BclI片段形式將地衣型芽胞桿菌淀粉酶基因(amyL)從pDN1981上切除，并連接于BamHI消化的pSJ3476上。將連接混合物轉(zhuǎn)化到枯草芽胞桿菌DN1885中，在30℃下選擇紅霉素抗性(5μg/ml)。在紅霉素(5μg/ml)和壯觀霉素(60μg/ml)板上對4個(gè)淀粉酶陽性菌落進(jìn)行再分離，并保存SJ3524(DN1885/pSJ3524)、SJ3525(DN1885/pSJ3525)、SJ3526(DN1885/pSJ3526)和SJ3527(DN1885/SJ3527)(圖29)。檢驗(yàn)菌株SJ3524-SJ3527的轉(zhuǎn)座作用。將各菌株接種到含有紅霉素(5μg/ml)和壯觀霉素(6μg/ml)的LB中，在30℃下培養(yǎng)過夜，并將樣品轉(zhuǎn)移到含有壯觀霉素(60μg/ml)的LB中。將所述培養(yǎng)物在50℃下?lián)u5小時(shí)，然后鋪板于壯觀霉素板上(60μg/ml)并在30℃下培養(yǎng)過夜。SJ3524-SJ3526的板幾乎過分生長；對各菌株的8個(gè)菌落進(jìn)行檢驗(yàn)，并發(fā)現(xiàn)紅霉素抗性。對SJ3527的板進(jìn)行復(fù)制鋪板，并發(fā)現(xiàn)幾個(gè)紅霉素敏感型、壯觀霉素抗性和淀粉酶陽性菌落。保存其中的一個(gè)SJ3549。例19由解離酶介導(dǎo)的例18菌株的標(biāo)記缺失通過上述接合作用將解離酶表達(dá)質(zhì)粒從SJ3309導(dǎo)入SJ3549。在卡那霉素(10μg/ml)和壯觀霉素(60μg/ml)上選擇反式接合體，并在有卡那霉素(10μg/ml)、有或沒有壯觀霉素(60μg/ml)的培養(yǎng)基上進(jìn)行再分離。在含有兩種抗生素的板上生長比較差，在有卡那霉素的板上生長比較好。在LBPSG上對來自卡那霉素板的10個(gè)菌落進(jìn)行再分離，然后復(fù)制鋪板。將由此分離到的8個(gè)壯觀霉素敏感型、卡那霉素抗性菌落接種到TY中，并在50℃下培養(yǎng)過夜，然后鋪板于LBPSG上，在37℃下培養(yǎng)過夜，然后對這些板進(jìn)行復(fù)制。除了培養(yǎng)物1的某些菌落外，所有菌落均為卡那霉素敏感型。再分離證實(shí)了對卡那霉素(10μg/ml)和紅霉素(5μg/ml)的敏感性。保存3個(gè)菌株SJ3558(SpcS，ErmS，KanS，Amy+)SJ3559(SpcS，ErmS，KanS，Amy+)SJ3560(SpcS，ErmS，KanS，Amy+)這3個(gè)菌株是四環(huán)素敏感型的，表明其缺乏pBC16，而pBC16存在于接合供體菌株中。例20構(gòu)建用于接合轉(zhuǎn)移例18的轉(zhuǎn)座子輸送載體的供體菌株將質(zhì)粒pSJ3524和pSJ3526轉(zhuǎn)化到用于接合的枯草芽胞桿菌供體菌株的感受態(tài)細(xì)胞(dal，px0503(ermR)，pBC16(tetR))，在30℃下鋪板于含有紅霉素(5μg/ml)、四環(huán)素(5μg/ml)、壯觀霉素(60μg/ml)和D-丙氨酸(100μg/ml)的LBPSG上，保存含有每種質(zhì)粒的1個(gè)菌株含有pSJ3524的SJ3547和含有pSJ3526的SJ3548。例21將例18的轉(zhuǎn)座子輸送載體再次導(dǎo)入例19的無標(biāo)記菌株，并分離其中發(fā)生了轉(zhuǎn)座作用的菌株通過上述接合作用將質(zhì)粒pSJ3524從SJ3547中轉(zhuǎn)移到在例19中構(gòu)建的無標(biāo)記的amyL表達(dá)菌株SJ3559中。保存1個(gè)四環(huán)素敏感型反式接合體SJ3592。在30℃下于含有壯觀霉素(60μg/ml)的TY中將該菌株搖動(dòng)培養(yǎng)過夜，用新的含有壯觀霉素(60μg/ml)的TY培養(yǎng)液將其稀釋100倍，并在30℃下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)3小時(shí)。然后用新的含有壯觀霉素(60μg/ml)的TY培養(yǎng)基將其稀釋50倍，并在50℃下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)3小時(shí)，隨后在50℃下鋪板于含有壯觀霉素(60μg/ml)的LBPSG上。通過復(fù)制鋪板發(fā)現(xiàn)，幾乎所有得到的菌落均為紅霉素敏感型。保存其中的4個(gè)，為SJ3626-SJ3629。在1個(gè)類似實(shí)驗(yàn)中，通過接合作用將pSJ3524從SJ3547中轉(zhuǎn)移到SJ3560中，保存2個(gè)四環(huán)素敏感型反式接合體SJ3593和SJ3594。在30℃下將所述菌株置于含有壯觀霉素(60μg/ml)的TY中搖動(dòng)培養(yǎng)過夜。用新的含有壯觀霉素(60μg/ml)的TY培養(yǎng)液將其稀釋100倍，在50℃下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)6小時(shí)，并在50℃下鋪板于含有壯觀霉素(60μg/ml)的LBPSG上。通過復(fù)制鋪板從SJ3593(作為SJ3599保存)中發(fā)現(xiàn)1個(gè)壯觀霉素抗性和紅霉素敏感型菌落，而在SJ3594(作為SJ3600和SJ3601保存)中發(fā)現(xiàn)2個(gè)此類菌落。例22解離酶介導(dǎo)的例21菌株的標(biāo)記缺失將菌株SJ3626-SJ3629用作受體，通過接合作用從菌株SJ3309中接收解離酶表達(dá)質(zhì)粒。在含有卡那霉素(10μg/ml)的LBPSG上選擇反式接合體。將這些板上的菌落復(fù)制到卡那霉素(10μg/ml)和壯觀霉素(60μg/ml)上，發(fā)現(xiàn)所有菌落均為壯觀霉素敏感型。將源于各受體菌株的4個(gè)菌落通過在30℃下過夜的TY培養(yǎng)物進(jìn)行3次連續(xù)轉(zhuǎn)移，在30℃下鋪板于LBPSG上，并復(fù)制鋪板于含有紅霉素的LBPSG上。在每種情況下均能得到敏感型菌落，然后檢查其卡那霉素抗性。保存源于各受體菌株的1個(gè)紅霉素、卡那霉素和壯觀霉素敏感型分離體SJ3634(源于SJ3626)，SJ3635(源于SJ3627)，SJ3636(源于SJ3628)，和SJ3637(源于SJ3629)。將來自1和2轉(zhuǎn)座輪的菌株接種到BPX搖瓶中，在37℃下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)6天。用購自KabiPharmacia的PhadebasAmylaseTest測定其α-淀粉酶活性。下面給出其結(jié)果，采用相對任意單位單位/ml枯草芽胞桿菌DN1885宿主菌株0.4(3個(gè)重復(fù))0.260.25SJ3549(1.轉(zhuǎn)座，SpcR)2.45(2個(gè)重復(fù))2.42SJ3559(1.轉(zhuǎn)座，SpcS)2.4(3個(gè)重復(fù))2.16SJ3626)3.28sJ3627)(2.轉(zhuǎn)座，3.6SJ3628)SpcR)3.25SJ3629)3.14SJ3634)3.21sJ3635)(2.轉(zhuǎn)座，3.3SJ3636)Spcs)3.38SJ3637)3.1很顯然，從1.轉(zhuǎn)座菌株中得到了一定的α-淀粉酶產(chǎn)量，其含量未受隨后的由解離酶介導(dǎo)的壯觀霉素抗性基因缺失的影響，在2.轉(zhuǎn)座菌株中的含量被提高，而且當(dāng)發(fā)生由解離酶介導(dǎo)的壯觀霉素抗性基因缺失時(shí)，仍能保持這一較高含量。在一個(gè)類似實(shí)驗(yàn)中，將菌株SJ3599-3601用作受體，通過接合作用從菌株SJ3309中接收解離酶表達(dá)質(zhì)粒。在含有卡那霉素(10μg/ml)的LBPSG上選擇反式接合體。將來自這些板的菌落復(fù)制到卡那霉素(10μg/ml)、壯觀霉素(60μg/ml)和四環(huán)素(5μg/ml)。從每種受體菌株中均可分離到卡那霉素抗性但為壯觀霉素和四環(huán)素敏感型的菌落。然后通過在30℃下在液體TY培養(yǎng)基(無抗生素)中進(jìn)行連續(xù)轉(zhuǎn)移，可以將賦予卡那霉素和紅霉素抗性的解離酶表達(dá)質(zhì)粒從所述細(xì)胞中清除，通過復(fù)制鋪板于含有紅霉素(5μg/ml)的板上分離無質(zhì)粒細(xì)胞。保存1個(gè)從SJ3600的卡那霉素抗性反式接合體中分離的這樣的紅霉素敏感型菌株SJ3640。例23將例18的轉(zhuǎn)座子輸送載體導(dǎo)入例13的無標(biāo)記菌株，并分離發(fā)生了轉(zhuǎn)座作用的菌株在該實(shí)施例和以下實(shí)施例中將在前面的實(shí)施例中開發(fā)出的工具組合用于形成枯草芽胞桿菌菌株，該菌株無抗生素抗性標(biāo)記，在其基因組上含有2個(gè)拷貝的Savinase基因和1個(gè)拷貝的地衣型芽胞桿菌淀粉酶基因。將各自含有2個(gè)拷貝的Savinase基因的菌株SJ3565和SJ3566用作與菌株SJ3547接合的受體。在含有壯觀霉素(60μg/ml)和紅霉素(5μg/ml)的LBPSG上選擇反式接合體。均為淀粉酶陽性和蛋白酶陽性。約半數(shù)為四環(huán)素敏感型，表明其缺乏pBC16。保存2個(gè)源于各受體菌株的四環(huán)素敏感型菌落源于SJ3565的SJ3595和SJ3596，和源于SJ3566的SJ3597和SJ3598。在30℃下將所述菌株置于含有壯觀霉素(60μg/ml)的TY中搖動(dòng)培養(yǎng)過夜，用新的含有壯觀霉素(60μg/ml)的TY培養(yǎng)液將其稀釋100倍，在50℃下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)6小時(shí)，并在50℃下鋪板于含有壯觀霉素(60μg/ml)的LBPSG上。然后將這些板復(fù)制到含有壯觀霉素(60μg/ml)或紅霉素(5μg/ml)的板上。由SJ3598不能得到紅霉素敏感型菌落，而來自其他3個(gè)菌株的約90％的菌落為壯觀霉素抗性，紅霉素敏感型。保存來自各菌株的1個(gè)這樣的菌落SJ3602(源于SJ3595)，SJ3603(源于SJ3596)，和SJ3604(源于SJ3597)。例24解離酶介導(dǎo)的例23菌株的標(biāo)記缺失通過上述接合作用，將解離酶表達(dá)質(zhì)粒從菌株SJ3309轉(zhuǎn)移到菌株SJ3602-SJ3604的每一菌株中。在30℃下，在含有卡那霉素(10μg/ml)的LBPSG板上選擇反式接合體，并復(fù)制鋪板于含有卡那霉素(10μg/ml)，壯觀霉素(60μg/ml)或四環(huán)素(5μg/ml)的板上。由各受體菌株得到壯觀霉素和四環(huán)素敏感型菌落。然后，通過在30℃下在液體TY培養(yǎng)基(無抗生素)中進(jìn)行幾次連續(xù)轉(zhuǎn)移，可以將賦予卡那霉素和紅霉素抗性的解離酶表達(dá)質(zhì)粒從所述細(xì)胞中清除，并通過復(fù)制鋪板于含有紅霉素(5μg/ml)的板上分離無質(zhì)粒細(xì)胞。保存自菌株SJ3602-SJ3604中每一種的卡那霉素抗性反式接合體中分離的1個(gè)這樣的紅霉素敏感型菌株SJ3641(源于SJ3602)，SJ3642(源于SJ3603)和SJ3643(源于SJ3604)。例25含有轉(zhuǎn)座酶基因以及其側(cè)翼為res序列的標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒的構(gòu)建和應(yīng)用該實(shí)施例的目的是制備并應(yīng)用一種轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒，其中，轉(zhuǎn)座酶和標(biāo)記一起位于res序列之間。然后將該質(zhì)粒用于分離發(fā)生了轉(zhuǎn)座作用而供體質(zhì)粒又丟失了的菌株。該轉(zhuǎn)座片段能夠進(jìn)行進(jìn)一步的轉(zhuǎn)座，可以通過較高的抗生素抗性對其進(jìn)行選擇。當(dāng)?shù)玫较胍木曛?，可按照上述?shí)施例的方法用解離酶將抗性基因和轉(zhuǎn)座酶缺失。先前構(gòu)建的res-標(biāo)記-res框(例16和例17)含有1個(gè)單一Mlul位點(diǎn)轉(zhuǎn)座酶可插入其中。(1)由pHV1248PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)座酶，采用引物BamHIMluI<-pHV1248125-142->Tnasel5′-TGACGGATCCACGCGTGGCGCACTCCCGTTCTGG-3′和BamHIMluI<-pHV12481550-1531->Tnase25′-GTACGGATCCACGCGTAAAGGCACCTTTGGTCACGG-3′對該P(yáng)CR片段進(jìn)行凝膠純化，用BamHI消化，并克隆用BamHI消化的pUC19上，對某些克隆進(jìn)行DNA測序，并將一個(gè)正確克隆用于進(jìn)一步操作。(2)通過將上述來自(1)的MluI片段克隆到pSJ3444上構(gòu)建1個(gè)具有轉(zhuǎn)座酶的壯觀霉素抗性框。(3)分兩步構(gòu)建具有轉(zhuǎn)座酶的卡那霉素抗性框i)將來自pSJ3586的HindIII片斷克隆到pUC19上。ii)將(1)的MluI片段克隆到i)上。然后可以將所述HindIII片段克隆到pSJ3476或pSJ3282上。所得到的質(zhì)粒將具有兩個(gè)轉(zhuǎn)座酶基因，具有反平行方向的上述基因的克隆可用作轉(zhuǎn)座子輸送載體，可將諸如地衣型芽胞桿菌淀粉酶或Savinase基因插入其中。僅有1個(gè)轉(zhuǎn)座酶基因的載體質(zhì)粒的制備如下(4)pSJ3475的NheI-XbaI片段含有該質(zhì)粒的大腸桿菌載體的部分，而轉(zhuǎn)座酶已缺失，然后將該質(zhì)粒用作克隆含有上述res-標(biāo)記-轉(zhuǎn)座酶-res片段的HindIII片段的載體。(5)用pUC18的ScaI-HindIII片段取代pSJ3282的ScaI-HindIII片段(由此使整個(gè)轉(zhuǎn)座子部分缺失)。然后將該新質(zhì)粒用于按上述方法克隆HindIII片段。序列表(1)一般資料(i)申請人(A)名稱NovoNordiskA/S(B)街道NovoAllc(C)市DK-2880Bagsvaerd(E)國家丹麥(F)郵編(ZIP)DK-2880(G)電活+4544448888(H)傳真+4544493256(I)電傳37304(ii)發(fā)明名稱標(biāo)題(iii)序列數(shù)36(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBMPC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOC/MS-DOs(D)軟件PatentInRelease#1.0，Version#1.30(EPO)(2)序列1資料(i)序列特征(A)長度10216bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝“pMOL553”(xi)序列描述序列1TTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGACTGCACGGTGCACCAATGCTTCTGGCGTCAGGC60AGCCATCGGAAGCTGTGGTATGGCTGTGCAGGTCGTAAATCACTGCATAATTCGTGTCGC120TCAAGGCGCACTCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGCGCCGACATCATAACGGTTCTGGCA180AATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTG240AGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCAAATGGTTTCGAATTCATTAAAGAGGA300GAAATTAACTATGTGCGAACTCGATATTTTACACGACTCTCTTTACCAATTCTGCCCCGA360ATTACACTTAAAACGACTCAACAGCTTAAC6TTGGCTTGCCACGCATTACTTGACTGTAA420AACTCTCACTCTTACCGAACTTGGCCGTAACCTGCCAACCAAAGCGAGAACAAAACATAA480CATCAAACGAATCGACCGATTGTTAGGTAATCGTCACCTCCACAAAGAGCGACTCGCTGT540ATACCGTTGGCATGCTAGCTTTATCTGTTCGCGCAATACGATGCCCATTGTACTTGTTGA600CTGGTCTGATATTCGTGAGCAAAAACGACTTATGGTATTGCGAGCTTCAGTCGCACTACA660CGGTCGTTCTGTTACTCTTTATGAGAAAGCGTTCCCGCTTTCAGAGCAATGTTCAAAGAA720AGCTCATGACCAATTTCTAGCCGACCTTGCGAGCATTCTACCGAGTAACACCACACCGCT780CATTGTCAGTGATGCTGGCTTTAAAGTGCCATGGTATAAATCCGTTGAGAAGCTGGGTTG840GTACTGGTTAAGTCGAGTAAGAGGAAAAGTACAATATGCAGACCTAGGAGCGGAAAACTG900GAAACCTATCAGCAACTTACATGATATGTCATCTAGTCACTCAAAGACTTTAGGCTATAA960GAGGCTGACTAAAAGCAATCCAATCTCATGCCAAATTCTATTGTATAAATCTCGCTCTAA1020AGGCCGAAAAAATCAGCGCTCGACACGGACTCATTGTCACCACCCGTCACCTAAAATCTA1080CTCAGGGTCGGCAAAGGAGCCATGGTTCTAGCAACTAACTTACCTGTTGAAATTCGAACA1140CCCAAACAACTTGTTAATATCTATTCGAAGCGAATGCAGATTGAAGAAACCTTCCGAGAC1200TTGAAAAGTCCTGCCTACGGACTAGGCCTACGCCATAGCCGAACGAGCAGCTCAGAGCGT1260TTTGATATCATGCTGCTAATCGCCCTGATGCTTCAACTAACATGTTGGCTTGCGGGCGTT1320CATGCTCAGAAACAAGGTTGGGACAAGCACTTCCAGGCTAACACAGTCAGAAATCGAAAC1380GTACTCTCAACAGTTCGCTTAGGCATGGAAGTTTTGCGGCATTCTGGCTACACAATAACA1440AGGGAAGACTTACTCGTGGCTGCAACCCTACTAGCTCAAAATTTATTCACACATGGTTAC1500GCTTTGGGGAAATTATGAGGGGATCTTCGACCGTGACCAAAGGTGCCTTTTATCATCACT1560TTAAAAATAAAAAACAATTACTCAGTGCCTGTTATAAGCAGCAATTAATTATGATTGATG1620CCTACATCACAACAAAAACTGATTTAACAAATGGTTGGTCTGCCTTAGAAAGTATATTTG1680AACATTATCTTGATTATATTATTGATAATAATAAAAACCTTATCCCTATCCAAGAAGTGA1740TGCCTATCATTGGTTGGAATGAACTTGAAAAAATTAGCCTTGAATACATTACTGGTAAGG1800TAAACGCCATTGTCAGCAAATTGATCCAAGAGAACCAACTTAAAGCTTTCCTGACGGAAT1860GTTAATTCTCGTTGACCCTGAGCACTGATGAATCCCCTAATGATTTTGGTAAAAATCATT1920AAGTTAAGGTGGATACACATCTTGTCATATGATCCCGGATCTGGGCAATAGTTACCCTTA1980TTATCAAGATAAGAAAGAAAAGGATTTTTCGCTACGCTCAAATCCTTTAAAAAAACACAA2040AAGACCACATTTTTTAATGTGGTCTTTATTCTTCAACTAAAGCACCCATTAGTTCAACAA2100ACGAAAATTGGATCCAAGGGGTGATCGGTCGGCGGAAATGAAGGCCTGCGGCGAGTGCGG2160GCCTTCTGTTTTGAGGATTATAATCAGAGTATATTGAAAGTTTCGCGATCTTTTCGTATA2220ATTGTTTTAGGCATAGTGCAATCGATTGTTTGAGAAAAGAAGAAGACCATAAAAATACCT2280TGTCTGTCATCAGACAGGGTATTTTTTATGCTGTCCAGACTGTCCGCTGTGTAAAAATAA2340GGAATAAAGGGGGGTTGTTATTATTTTACTGATATGTAAAATATAATTTGTATAAGAAAA2400TGAGAGGGAGAGGAAACATGATTCAAAAACGAAAGCGGACAGTTTCGTTCAGACTTGTGC2460TTATGTGCACGCTGTTATTTGTCAGTTTGCCGATTACAAAAACATCAGCCGTAAATGGCA2520CGCTGATGCAGTATTTTGAATGGTATACGCCGAACGACGGCCAGCATTGGAAACGATTGC2580AGAATGATGCGGAACATTTATCGGATTAACTTAACGTTAATATTTGTTTCCCAATAGGCA2640AATCTTTCTAACTTTGATACGTTTAAACTACCAGCTTGGACAAGTTGGTATAAAAATGAG2700GAGGGAAACCGAATGAAGAAACCGTTGGGGAAAATTGTCGCAAGCACCGCACTACTCATT2760TCTGTTGCTTTTAGTTCATCGATCGCATCGGCTGCTGAAGAAGCAAAAGAAAAATATTTA2820ATTGGCTTTAATGAGCAGGAAGCTGTCAGTGAGTTTGTAGAACAAGTAGAGGCAAATGAC2880GAGGTCGCCATTCTCTCTGAGGAAGAGGAAGTCGAAATTGAATTGCTTCATGAATTTGAA2940ACGATTCCTGTTTTATCCGTTGAGTTAAGCCCAGAAGATGTGGACGCGCTTGAACTCGAT3000CCAGCGATTTCTTATATTGAAGAGGATGCAGAAGTAACGACAATGGCGCAATCGGTACCA3060TGGGGAATTAGCCGTGTGCAAGCCCCAGCTGCCCATAACCGTGGATTGACAGGTTCTGGT3120GTAAAAGTTGCTGTCCTCGATACAGGGATATCCACTCATCCAGATCTAAATATTCGTGGT3180GGCGCAAGCTTTGTACCAGGGGAACCGTCGACTCAAGATGGGAATGGGCATGGCACGCAT3240GTGGCCGGGACGATCGCTGCTTTAAACAATTCGATTGGCGTTCTTGGCGTAGCGCCGAGC3300GCTGAGCTATACGCTGTTAAAGTCCTAGGGGCGAGCGGTTCAGGTTCGGTCAGCTCGATT3360GCCCAAGGATTGGAATGGGCAGGGAACAATGGCATGCACGTTGCTAATTTGAGTTTAGGA3420AGCCCTTCGCCAAGTGCCACACTCGAGCAAGCTGTTAATAGCGCGACTTCTAGAGGCGTT3480CTTGTTGTAGCGGCATCTGGGAATTCAGGTGCAGGCTCAATCAGCTATCCGGCGCGCTAT3540GCGAACGCAATGGCAGTCGGAGCTACTGATCAAAACAACAACCGCGCTAGCTTTTCACAG3600TATGGCGCAGGCCTTGACATTGTCGCACCCGGGGTAAACGTGCAGAGCACATACCCAGGT3660TCAACATATGCCAGCTTAAACGGTACATCGATGGCTACTCCTCATGTTGCAGGTGCGGCC3720GCCCTTGTTAAACAAAAGAACCCATCTTGGTCTAATGTACAAATTCGAAATCATCTAAAG3780AATACGGCAACTAGTTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGACTTGTTAACGCAGAA3840GCGGCAACGCGTTAATCAATAAAAAAACGCTGTGCGGTTAAAGGGCACAGCGTTTTTTTG3900TGTATGGATCCAGTGGGATATTTTTAAAATATATATTTATGTTACAGT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CCACGGTTCTTCAAATATTTCTCC43(2)序列15資料(i)序列特征(A)長度44bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝“LWN7789”(xi)序列描述序列15GGAGAAATATTTGAAGAACCGTGGGATATTTTTAAAATATATAT44(2)序列16資料(i)序列特征(A)長度45bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝“LWN7788”(xi)序列描述序列16CAAGTGTTCGCTTCGCTCTCACGGAGCTGTAATATAAAAACCTTC45(2)序列17資料(i)序列特征(A)長度45bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝“LWN7787”(xi)序列描述序列17GAAGGTTTTTATATTACAGCTCCGTGAGAGCGAAGCGAACACTTG45(2)序列18資料(i)序列特征(A)長度45bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝“LWN7784”(xi)序列描述序列18CATATGATCAAATGGTTCGGATCTGATTTTCCTCCTCTAATATGC45(2)序列19資料(i)序列特征(A)長度55bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝“LWN8197”(xi)序列描述序列19GCATATTAGAGGAGGAAAATCAGATCCGAACCATTTGATCATATGACAAGATGTG55(2)序列20資料(i)序列特征(A)長度35bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝“LWN7791”(xi)序列描述序列20GACGGAATTCCCGCGGTAAATAGCAATAAATTGGC35(2)序列21資料(i)序列特征(A)長度21bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝“LWN7780”(xi)序列描述序列21GACGGGTACCACGCGTTAATC21(2)序列22資料(i)序列特征(A)長度20bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝“LWN5067”(xi)序列描述序列22CCAGAACCTGTCAATCCACG20(2)序列23資料(i)序列特征(A)長度50bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝“LWN8524”(xi)序列描述序列23GACTGAATTCGGATCCACGCGTATAATAAAGAATAATTATTAATCTGTAG50(2)序列24資料(i)序列特征(A)長度42bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝“LWN8528”(xi)序列描述序列24GACTAAGCTTGAGCTCCACTAATATTAATAAACTATCGAA6G42(2)序列25資料(i)序列特征(A)長度42bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝“LWN8529”(xi)序列描述序列25GACTGAATTCCTGCAGGAGCTCAGTGAGAGCGAAGCGAACAC42(2)序列26資料(i)序列特征(A)長度88bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝“LWN8531”(xi)序列描述序列26GACTAAGCTTTGATCAAATGGTTGCGGCCGCGTCGACTCTAGACCCGGGTACCAGATCTG60GATCCTCGGGTTCTTCAAATATTTCTCC88(2)序列27資料(i)序列特征(A)長度39bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝“LWN8518”(xi)序列描述序列27GACTAAGCTTACGCGTTCGGGTTCTTCAAATATTTCTCC39(2)序列28資料(i)序列特征(A)長度44bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝“LWN8527”(xi)序列描述序列28GACTGAATTCTGATCAAATGGTTCAGTGAGAGCGAAGCGAACAC44(2)序列29資料(i)序列特征(A)長度17bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝“LWN7191”(xi)序列描述序列29GTTTTCCCAGTCACGAC17(2)序列30資料(i)序列特征(A)長度43bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝“LWN8516”(xi)序列描述序列30GACTGAATTCGGATCCACGCGTGAGTAGTTCAACAAACGGGCC43(2)序列31資料(i)序列特征(A)長度41bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝“LWN8517”(xi)序列描述序列31GACTAAGCTTGAGCTCCAACATGATTAACAATTATTAGAGG41(2)序列32資料(i)序列特征(A)長度56bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝“LWN8760”(xi)序列描述序列32GACGGAATTCTCTAGAGTCGACAGATCCGAACCATTTGATCATATGACAAGATGTG56(2)序列33資料(i)序列特征(A)長度40bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝“LWN8761”(xi)序列描述序列33GACGGAATTCGCGGCCGCGGTAAATAGCAATAAATTGGCC40(2)序列34資料(i)序列特征(A)長度24bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝“LWN4123”(xi)序列描述序列34AGCGGATAACAATTTCACACAGGA24(2)序列35資料(i)序列特征(A)長度34bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝“Tnasel”(xi)序列描述序列35TGACGGATCCACGCGTGGCGCACTCCCGTTCTGG34(2)序列36資料(i)序列特征(A)長度36bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝“Tnase2”(xi)序列描述序列36GTACGGATCCACGCGTAAAGGCACCTTTGGTCACGG3權(quán)利要求1.一種DNA結(jié)構(gòu)，含有結(jié)構(gòu)IR(1)-P-R-M2-R-IR(2)或IR(1)-R-M2-R-P-IR(2)，其中IR(1)和IR(2)表示轉(zhuǎn)座酶靶序列，P為感興趣的DNA序列，R為位點(diǎn)專一性重組酶的靶序列，和M2為選擇標(biāo)記基因，所述結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)座酶基因T相關(guān)，該基因位于所述結(jié)構(gòu)外面的任一側(cè)。2.一種DNA結(jié)構(gòu)，含有結(jié)構(gòu)IR(1)-R-M2-T-R-P-IR(2)、IR(1)-P-R-M2-T-R-IR(2)、IR(1)-R-T-M2-R-P-IR(2)或IR(1)-P-R-T-M2-R-IR(2)，其中IR(1)和IR(2)表示轉(zhuǎn)座酶靶序列，P為感興趣的DNA序列，R為位點(diǎn)專一性重組酶的靶序列，M2為選擇標(biāo)記基因，和T為轉(zhuǎn)座酶基因T。3.如權(quán)利要求1或2的DNA結(jié)構(gòu)，其中，R是來自質(zhì)粒pAMβ1的res-位點(diǎn)或來自噬菌體P1的lox位點(diǎn)。4.一種DNA結(jié)構(gòu)，含有結(jié)構(gòu)IR(1)-P-R′-M2-R″-IR(2)或IR(1)-R′-M2-R″-P-IR(2)，其中IR(1)和IR(2)表示轉(zhuǎn)座酶靶序列，P為感興趣的DNA序列，R′和R″為平行重復(fù)序列，和M2為選擇標(biāo)記基因，所述結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)座酶基因T相關(guān)，該基因位于所述結(jié)構(gòu)外面的任一側(cè)。5.一種DNA結(jié)構(gòu)，含有結(jié)構(gòu)IR(1)-R′-M2-T-R″-P-IR(2)，IR(1)-P-R′-M2-T-R″-IR(2)，IR(1)-R′-T-M2-R″-P-IR(2)或IR(1)-P-R′-T-M2-R″-IR(2)，其中IR(1)和IR(2)表示轉(zhuǎn)座酶靶序列，P為感興趣的DNA序列，R′和R″為平行重復(fù)序列，M2為選擇標(biāo)記基因，和T為轉(zhuǎn)座酶基因T。6.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的DNA結(jié)構(gòu)，還包括一個(gè)選擇標(biāo)記基因M1，它可以不同于或相同于M2，它位于所述結(jié)構(gòu)外面的任一側(cè)，該結(jié)構(gòu)位于IR(1)和IR(2)里面，并且包括IR(1)和IR(2)。7.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的DNA結(jié)構(gòu)，它可以在革蘭氏陽性細(xì)菌，特別是芽胞桿菌屬的細(xì)胞中轉(zhuǎn)座。8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的DNA結(jié)構(gòu)，還包括一個(gè)順式作用DNA序列，該序列為在反式作用移動(dòng)因子存在條件下通過接合作用而把該DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞里所必需。9.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的DNA結(jié)構(gòu)，其中，所述DNA序列P編碼一種感興趣的多肽。10.如權(quán)利要求9的DNA結(jié)構(gòu)，其中，所述DNA序列P編碼一種轉(zhuǎn)位多肽。11.如權(quán)利要求10的DNA結(jié)構(gòu)，其中，所述DNA序列P編碼一種分泌多肽。12.如權(quán)利要求9的DNA結(jié)構(gòu)，其中，所述多肽是一種酶。13.如權(quán)利要求12的DNA結(jié)構(gòu)，其中，所述酶選自淀粉分解酶、脂肪分解酶、蛋白分解酶、纖維素分解酶、氧化還原酶或植物細(xì)胞壁降解酶。14.如權(quán)利要求10的DNA結(jié)構(gòu)，其中，所述多肽是PrsA。15.一種載體，含有權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的DNA結(jié)構(gòu)。16.如權(quán)利要求15的載體，含有一個(gè)條件復(fù)制起點(diǎn)。17.如權(quán)利要求16的載體，其中，所述條件復(fù)制起點(diǎn)是溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)。18.一種細(xì)菌細(xì)胞，在其組成DNA上整合了至少2個(gè)拷貝的含有結(jié)構(gòu)IR(1)-P-IR(2)的DNA結(jié)構(gòu)，其中，IR(1)和IR(2)表示轉(zhuǎn)座酶靶序列，而P為一個(gè)感興趣的DNA序列，該結(jié)構(gòu)還包括一個(gè)作為一種位點(diǎn)專一性重組酶的靶序列的DNA序列，它的存在是位于兩個(gè)R序列之間的DNA片段受一種解離酶作用的結(jié)果，或者該DNA序列是通過DNA序列R′/R″之間的同源重組所致。19.如權(quán)利要求18的細(xì)胞，它不含任何不需要的選擇標(biāo)記基因。20.如權(quán)利要求19的細(xì)胞，它不含編碼一種可選擇的抗生素抗性標(biāo)記的DNA序列。21.如權(quán)利要求18-20中任一項(xiàng)的細(xì)胞，它是一種革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞。22.如權(quán)利要求21的細(xì)胞，它是一種芽胞桿菌或乳桿菌的細(xì)胞。23.如權(quán)利要求22的細(xì)胞，它是一種芽胞桿菌細(xì)胞，所述芽胞桿菌選自枯草芽胞桿菌、地衣型芽胞桿菌、遲緩芽胞桿菌、短芽胞桿菌、嗜熱脂肪芽胞桿菌、嗜堿性芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿菌、凝固芽胞桿菌、環(huán)狀芽胞桿菌、Bacilluslautus、巨大芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌。24.如權(quán)利要求18-23中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中，所述DNA序列P編碼一種感興趣的多肽。25.如權(quán)利要求24的細(xì)胞，其中，所述DNA序列P編碼一種轉(zhuǎn)位多肽。26.如權(quán)利要求20的細(xì)胞，其中，所述DNA序列P編碼一種分泌多肽。27.如權(quán)利要求24的細(xì)胞，其中，所述多肽是一種酶。28.如權(quán)利要求27的細(xì)胞，其中，所述酶選自淀粉分解酶、脂肪分解酶、蛋白分解酶、纖維素分解酶、氧化還原酶或植物細(xì)胞壁降解酶。29.一種構(gòu)建細(xì)菌細(xì)胞的方法，在該細(xì)胞的基因組DNA上整合了一個(gè)以上拷貝的感興趣的DNA序列，而且它不含編碼不需要的選擇標(biāo)記的DNA序列，該方法包括a)將含有權(quán)利要求1、3和6-14中任一項(xiàng)的DNA結(jié)構(gòu)的第一載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，所述DNA結(jié)構(gòu)含有結(jié)構(gòu)IR(1)-P-R-M2-R-IR(2)或IR(1)-R-M2-R-P-IR(2)，該結(jié)構(gòu)與1個(gè)轉(zhuǎn)座酶基因T相關(guān)，并選擇性地與1個(gè)選擇標(biāo)記基因M1相關(guān)，b)選擇M1-、M2+細(xì)胞，在該細(xì)胞的基因組中含有結(jié)構(gòu)IR(1)-P-R-M2-R-IR(2)或IR(1)-R-M2-R-P-IR(2)，c)將含有編碼一種位點(diǎn)專一性重組酶的DNA序列的第二載體導(dǎo)入在步驟b)中所選擇的細(xì)胞中，以便將結(jié)構(gòu)R-M2或M2-R從該細(xì)胞的基因組中切除，使所得到的細(xì)胞具有整合的結(jié)構(gòu)IR(1)-R-P-IR(2)或IR(1)-P-R-IR(2)，d)從步驟c)所得到的細(xì)胞中消除第二質(zhì)粒，并選擇性地e)重復(fù)步驟a-d1次或幾次，以產(chǎn)生含有1個(gè)或幾個(gè)額外拷貝的結(jié)構(gòu)IR(1)-R-P-IR(2)或IR(1)-P-R-IR(2)的細(xì)菌細(xì)胞。30.一種構(gòu)建細(xì)菌細(xì)胞的方法，在該細(xì)胞的基因組DNA中整合了一個(gè)以上拷貝的感興趣的DNA序列，它不含編碼不需要的選擇標(biāo)記的DNA序列，該方法包括a)將含有權(quán)利要求2、3和6-14中任一項(xiàng)的DNA結(jié)構(gòu)的第一載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，所述DNA結(jié)構(gòu)含有結(jié)構(gòu)IR(1)-R-M2-T-R-P-IR(2)，IR(1)-P-R-M2-T-R-IR(2)，IR(1)-R-T-M2-R-P-IR(2)或IR(1)-P-R-T-M2-R-IR(2)，該結(jié)構(gòu)選擇性地與1個(gè)選擇標(biāo)記基因M1相關(guān)，b)選擇M1-、M2+細(xì)胞，該細(xì)胞的基因組中含有a)中所確定的結(jié)構(gòu)之一，c)選擇具有增多拷貝數(shù)目的選擇標(biāo)記基因M2的細(xì)胞，d)將含有編碼一種位點(diǎn)專一性重組酶的DNA序列的第二載體導(dǎo)入在步驟b)中選擇的細(xì)胞，以便將結(jié)構(gòu)R-M2-T、R-T-M2、M2-T-R或T-R-M2從該細(xì)胞基因組中切除，使所得到的細(xì)胞具有整合的結(jié)構(gòu)IR(1)-R-P-IR(2)或IR(1)-P-R-IR(2)，e)從步驟d)所得到的細(xì)胞中清除第二質(zhì)粒，并選擇性地f)重復(fù)步驟a-el次或幾次，以產(chǎn)生含有1個(gè)或幾個(gè)額外拷貝的結(jié)構(gòu)IR(1)-R-P-IR(2)或IR(1)-P-R-IR(2)的細(xì)菌細(xì)胞。31.如權(quán)利要求29或30的方法，其中，所述第二質(zhì)粒是可清除的。32.一種構(gòu)建細(xì)菌細(xì)胞的方法，在該細(xì)胞的基因組DNA上整合了1個(gè)以上拷貝的感興趣的DNA序列，而且它不含編碼不需要的選擇標(biāo)記的DNA序列，該方法包括a)將含有權(quán)利要求4和6-14中任一項(xiàng)的DNA結(jié)構(gòu)的第一載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，所述DNA結(jié)構(gòu)含有結(jié)構(gòu)IR(1)-P-R′-M2-R″-IR(2)或IR(1)-R′-M2-R″-P-IR(2)，該結(jié)構(gòu)與1個(gè)轉(zhuǎn)座酶基因T相關(guān)，并選擇性地與1個(gè)選擇標(biāo)記基因M1相關(guān)，其中R′和R″表示平行重復(fù)序列，b)選擇M1-、M2+細(xì)胞，在該細(xì)胞的基因組中含有結(jié)構(gòu)IR(1)-P-R′-M2-R″-IR(2)或IR(1)-R′-M2-R″-P-IR(2)，c)使DNA序列R′和R″之間發(fā)生同源重組，以便將選擇標(biāo)記基因M2切除，使所得到的細(xì)胞具有整合的結(jié)構(gòu)IR(1)-R′/R″-P-IR(2)或IR(1)-P-R′/R″-IR(2)(其中R′/R″表示共同的重組序列)，并選擇性地d)重復(fù)步驟a-c1次或幾次，以產(chǎn)生含有1個(gè)或幾個(gè)額外拷貝的DNA結(jié)構(gòu)IR(1)-R′/R″-P-IR(2)或IR(1)-P-R′/R″-IR(2)的細(xì)菌細(xì)胞。33.一種構(gòu)建細(xì)菌細(xì)胞的方法，在該細(xì)胞的基因組DNA上整合了1個(gè)以上拷貝的感興趣的DNA序列，而且它不含編碼不需要的選擇標(biāo)記的DNA序列，該方法包括a)將含有權(quán)利要求5-14中任一項(xiàng)的DNA結(jié)構(gòu)的第一載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，所述DNA結(jié)構(gòu)含有結(jié)構(gòu)IR(1)-R′-M2-T-R″-P-IR(2)、IR(1)-P-R′-M2-T-R″-IR(2)、IR(1)-R′-T-M2-R″-P-IR(2)或IR(1)-P-R′-T-M2-R″-IR(2)，該結(jié)構(gòu)選擇性地與1個(gè)選擇標(biāo)記基因M1相關(guān)，其中，R′和R″表示平行重復(fù)序列，b)選擇M1、M2+細(xì)胞，在該細(xì)胞的基因組中含有在a)中所確定的相關(guān)結(jié)構(gòu)，c)選擇具有增多拷貝數(shù)目的選擇標(biāo)記基因M2的細(xì)胞，d)使DNA序列R′和R″之間發(fā)生同源重組，以便將選擇標(biāo)記基因M2和轉(zhuǎn)座酶基因T切除，使所得到的細(xì)胞具有整合的結(jié)構(gòu)IR(1)-R′/R″-P-IR(2)或IR(1)-P-R′/R″-IR(2)(其中R′/R″表示共同的重組序列)，并選擇性地e)重復(fù)步驟a-d1次或幾次，以產(chǎn)生含有1個(gè)或幾個(gè)額外拷貝的DNA結(jié)構(gòu)IR(1)-R′/R″-P-IR(2)或IR(1)-P-R′/R″-IR(2)的細(xì)菌細(xì)胞。34.如權(quán)利要求32或33的方法，其中，所述選擇標(biāo)記基因M2是一種諸如amdS基因或thy基因的反選擇標(biāo)記，而且在步驟c)之后對該反選擇標(biāo)記的缺乏進(jìn)行選擇。35.如權(quán)利要求29-34中任一項(xiàng)的方法，其中，步驟a)是通過接合作用實(shí)現(xiàn)的，第一載體另外含有1個(gè)順式作用DNA序列，該序列為在有1個(gè)反式作用移動(dòng)因子的條件下通過接合作用將載體轉(zhuǎn)移到細(xì)菌細(xì)胞中所必需，該第一載體存在于一群供體細(xì)胞中，該細(xì)胞還含有至少1個(gè)編碼所述反式作用移動(dòng)因子的DNA序列，將該供體細(xì)胞群與一群受體細(xì)菌細(xì)胞混合，混合是在使所述載體能夠通過接合作用從供體細(xì)胞群轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞群的條件下進(jìn)行的。36.如權(quán)利要求29-35中任一項(xiàng)的方法，其中，按步驟a)導(dǎo)入的DNA結(jié)構(gòu)還包括1個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。37.如權(quán)利要求36的方法，其中，所述復(fù)制起點(diǎn)是條件復(fù)制起點(diǎn)。38.如權(quán)利要求29-37中任一項(xiàng)的方法，其中，將步驟a)-e)重復(fù)1次或幾次。39.如權(quán)利要求29-38中任一項(xiàng)的方法，其中，所述DNA序列R和編碼位點(diǎn)專一性重組酶的DNA是源于質(zhì)粒pAMβ1。40.如權(quán)利要求29-39中任一項(xiàng)的方法，其中對所述整合的選擇性地包括R或R′/R″的DNA結(jié)構(gòu)IR(1)-P-IR(2)進(jìn)行擴(kuò)增，以得到含有2個(gè)或2個(gè)以上拷貝的所述DNA結(jié)構(gòu)的細(xì)胞。41.如權(quán)利要求29-40中任一項(xiàng)的方法，其中，所述待構(gòu)建的細(xì)胞是一種革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞。42.如權(quán)利要求41的方法，其中所述細(xì)胞是芽胞桿菌或乳桿菌細(xì)胞。43.如權(quán)利要求42的方法，其中所述細(xì)胞是選自枯草芽胞桿菌、地衣型芽胞桿菌、遲緩芽胞桿菌、短芽胞桿菌、嗜熱脂肪芽胞桿菌、嗜堿性芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿菌、凝固芽胞桿菌、環(huán)狀芽胞桿菌、Bacilluslautus、巨大芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌的芽胞桿菌的細(xì)胞。44.一種生產(chǎn)由DNA序列P編碼的一種感興趣的蛋白的方法，該方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求18-28中任一項(xiàng)的細(xì)胞和/或用權(quán)利要求29-43中任一項(xiàng)的方法生產(chǎn)的細(xì)胞，該細(xì)胞含有一個(gè)以上拷貝的DNA序列P，培養(yǎng)是在適于所述多肽產(chǎn)生的條件下進(jìn)行的，還包括從所得到的細(xì)胞培養(yǎng)液中回收所述多肽。45.一種無標(biāo)記的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞，特別是芽胞桿菌細(xì)胞，其含有多個(gè)拷貝的感興趣的DNA序列P。全文摘要革蘭氏陽性細(xì)菌的多拷貝菌株,含有多拷貝感興趣的DNA序列,該菌株通過以下方法構(gòu)建:通過轉(zhuǎn)座將含有感興趣的DNA序列的DNA結(jié)構(gòu)導(dǎo)入受體細(xì)胞基因組,然后通過一個(gè)解離系統(tǒng)使用于選擇具有接收到的DNA結(jié)構(gòu)的細(xì)胞的標(biāo)記基因缺失。該多拷貝菌株最好沒有編碼不需要的標(biāo)記如抗生素抗性標(biāo)記的基因。文檔編號(hào)C12N15/75GK1177380SQ9619209公開日1998年3月25日申請日期1996年1月23日優(yōu)先權(quán)日1995年1月23日發(fā)明者S·T·喬根森申請人:諾沃挪第克公司