專利名稱：：含有木聚糖酶的動物料添加劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及動物飼料添加劑，該添加劑含有一種單組分木聚糖酶，該木聚糖酶源于腐殖霉屬(Humicola)的菌株、嗜熱子囊菌屬(Thermoasous)菌株、毛殼菌屬(Chaetomium)菌株、毛霉屬(Mucor)菌株、藍(lán)霉菌屬(Talaromyces)菌株、Malbranchea屬菌株、毀絲霉屬(Myceliophthora)的菌株、梭孢殼屬(Thielavia)菌株、絲衣霉屬(Byssochlamus)菌株或擬青霉屬(Paecilomyces)菌株。本發(fā)明的其它方面涉及單組分木聚糖酶制劑、DNA結(jié)構(gòu)、重組表達(dá)載體、宿主細(xì)胞、以及生產(chǎn)單組分木聚糖酶制劑的方法?？捎米鲃游镲暳系慕M分的植物原料的種類和數(shù)量通常受到動物消化該原料能力的制約。飼料增強(qiáng)酶通常為源于微生物的酶，它能夠通過改善飼料的可消化性而提高其利用效率。木聚糖分解酶(EC3.2.1.8)是眾所周知的飼料增強(qiáng)酶。曾報(bào)導(dǎo)過獲自芽胞桿菌屬(Bacillus)菌株、曲霉屬(Aspergillus)菌株、木霉屬(Trichoderma)菌株、枝頂孢屬(Acremonium)菌株的木聚糖酶。另外，一種通過Humicolainsolens的深層發(fā)酵而獲得的一種酶制劑已經(jīng)商品化(Bio-FeedTMPlus，由NovoNordisKA/S出售，Denmark)。已報(bào)導(dǎo)了獲自真菌疏綿狀高溫霉(Thermomyceslanuginosus)(同Humicolalanuginosa)的木聚糖酶制劑〔參見LischnigT，PurkarthoferH和SteinerW；BiotechnologyLetters199315(4)411-414；GomesJ，PurkarthoferH，HaynM，KapplmüllerJ，SinnerM，和SteinerW，Appl.Microbiol.Biotechnol.1993，39，700-707〕。但是，從未披露過將疏綿狀高溫霉木聚糖酶用作飼料增強(qiáng)酶。另外，現(xiàn)有技術(shù)中所披露的木聚糖酶制劑均涉及含有多種酶組分的復(fù)合酶制劑。也未見利用重組DNA技術(shù)由高溫霉屬獲得單組分木聚糖酶制劑的報(bào)導(dǎo)。對于很多種應(yīng)用來說，復(fù)合酶制劑的使用被認(rèn)為是有益的，因?yàn)槎喾N組分的共同作用可產(chǎn)生協(xié)同作用。對于某些用途來說，例如，木素纖維素轉(zhuǎn)化成液體貯存物或燃料，食品加工，特別是對于提高動物飼料的可消化性而言，木聚糖分解酶和纖維素分解酶的混合物被認(rèn)為具有最佳性能(AlamM，GomesI，MohiuddinG，&HoqMM；EnzymeMicrob.Technol.1994，16，298-302)。根據(jù)本發(fā)明，業(yè)已發(fā)現(xiàn)源于疏綿狀高溫霉的木聚糖酶與常規(guī)飼料增強(qiáng)酶相比，是一種優(yōu)良的飼料增強(qiáng)酶，當(dāng)將其加入動物飼料中時可明顯改善飼料的可利用性。此外，由于源于疏綿狀高溫霉的木聚糖酶制劑具有良好的熱穩(wěn)定性，特別適于在防止微生物感染，特別是沙門氏菌(Salmonella)感染的條件下將其加工成飼料添加劑。還發(fā)現(xiàn)，源于疏綿狀高溫霉的木聚糖酶能顯著降低消化物粘度，這表明在雞飼料的轉(zhuǎn)化效率方面有明顯改善。最后，我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，重組生產(chǎn)的高溫霉屬木聚糖酶的熱穩(wěn)定性明顯高于天然木聚糖酶的，這使得重組生產(chǎn)的木聚糖酶特別適于在防止微生物感染，特別是沙門氏菌感染的條件下被加工成飼料添加劑。因此，本發(fā)明的目的是提供一種單組分木聚糖酶制劑，該木聚糖酶組分是通過重組DNA技術(shù)從高溫霉屬或相關(guān)屬的菌株獲得的。因此，本發(fā)明的第一方面提供了一種動物飼料添加劑，該添加劑含有一種單組分木聚糖酶，該木聚糖酶源于腐質(zhì)霉屬的菌株、嗜熱子囊菌屬的菌株、毛殼菌屬菌株、毛霉屬菌株、藍(lán)霉菌屬菌株、Malbranchea屬菌株、毀絲霉屬菌株、梭孢殼屬菌株、絲衣霉屬菌株或擬青霉屬菌株。另一方面，本發(fā)明提供了一種單組分木聚糖酶制劑，在該制劑中，所述木聚糖酶組分源于腐殖霉屬菌株、嗜熱子囊菌屬株、毛殼菌屬菌株、毛霉屬菌株、藍(lán)霉菌屬菌株、Malbranchea屬菌株、毀絲霉屬菌株、梭孢殼屬菌株、絲衣霉屬菌株或擬青霉屬菌株。再一方面，本發(fā)明涉及一種含有編碼一種木聚糖酶組分的DNA序列的DNA結(jié)構(gòu)，該DNA序列包括a)序列1所示的DNA序列的木聚糖酶編碼部分，或可從釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株DSM10133里的質(zhì)粒獲得的DNA序列；或b)一個類似于序列1所示DNA序列的木聚糖酶編碼部分、或類似于可從釀酒酵母菌株DSM10133里的質(zhì)粒獲得的DNA序列的DNA序列，該類似的DNA序列或i)同源于序列1所示DNA序列的木聚糖酶編碼部分，或同源于可從釀酒酵母菌株DSM10133里的質(zhì)粒獲得的DNA序列；或ii)能與和序列1所示DNA序列的木聚糖酶編碼部分相同的寡核苷酸探針雜交，或與可從釀酒酵母菌株DSM10133里的質(zhì)粒獲得的DNA序列雜交；或iii)能編碼一種多肽，該多肽與由序列1所示的DNA序列所編碼的多肽或可從釀酒酵母菌株DSM10133里的質(zhì)粒獲得的DNA序列同源性至少為70％；iv)能編碼一種多肽，該多肽能與抗純化木聚糖酶的抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)，該純化木聚糖酶源于疏綿狀高溫霉菌株DSM4109、或由序列1所示的DNA序列或可從釀酒酵母菌株DSM10133里的質(zhì)粒獲得的DNA序列編碼。又一方面，本發(fā)明涉及一種具有本發(fā)明DNA結(jié)構(gòu)的表達(dá)載體，一種含有該DNA結(jié)構(gòu)或表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，和一種生產(chǎn)本發(fā)明單組分木聚糖酶制劑的方法，該方法包括在能產(chǎn)生所述木聚糖酶的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，并從培養(yǎng)物中回收所述木聚糖酶。將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，其中圖1表示在30℃下，在pH2.5-9的范圍內(nèi)測得的本發(fā)明單組分木聚糖酶的相對木聚糖分解活性(％)。它表明該酶的最佳pH范圍為4.5-7.5，尤其是在5.0-6.5的范圍內(nèi)，在pH6左右；圖2表示在pH5.5和30-80℃的溫度范圍內(nèi)測得的本發(fā)明單組分木聚糖酶的相對木聚糖分解活性。圖中顯示該酶的最佳溫度范圍為50-70℃，在60℃左右；圖3表示本發(fā)明單組分木聚糖酶制劑(I)的相對殘余活性(％)與天然疏綿狀高溫霉木聚糖酶制劑(II)的相對殘余活性(％)的比較。殘余活性是在pH6.0和溫度分別為60、65、70和75℃的條件下測得；圖4表示天然疏綿狀高溫霉木聚糖酶(·)與通過培養(yǎng)Humicolainsolens所獲得的多組分酶制劑(×)對小麥粘度降低的效率的比較結(jié)果(樣品中劑量(FXU/g小麥))；圖5表示重組生產(chǎn)的單組分疏綿狀高溫霉木聚糖霉(I)與天然疏綿狀高溫霉木聚糖酶(II)的小麥粘度降低效率的比較結(jié)果(樣品中劑量(FXU/g小麥))；圖6表示作為木聚糖酶加入量(FXU/kg飼料)函數(shù)的小麥AMEn值(MJ/kg)；(A)疏綿狀高溫霉單組分木聚糖酶制劑；(B)天然疏綿狀高溫霉木聚糖酶制劑；(C)參比物(Bio-FeedPlusCT，NovoNordiskA/S的一種產(chǎn)品，Denmark；通過培養(yǎng)Humicolainsolens而獲得的一種多組分酶制劑)；和圖7以木聚糖酶加入量(FXU/kg飼料)的函數(shù)形式表示實(shí)驗(yàn)食物中脂肪消化率(％)；(A)疏綿狀高溫霉單組分木聚糖酶制劑；(B)天然疏綿狀高溫霉木聚糖酶制劑；(C)參比物(Bio-FeedPlusCT，NovoNordiskA/S的一種產(chǎn)品，Denmark；通過培養(yǎng)Humicolainsolens而獲得的一種多組分酶制劑)。動物飼料添加劑當(dāng)把飼料增強(qiáng)酶加入動物飼料中時，其可以改善對植物細(xì)胞壁的體內(nèi)分解能力，部分原因是，其可以降低腸道粘度(Bedford等，Proceedingsofthe1stSymposiumonEnzymesinAnimalNutrition，1993，pp.73-77)，從而實(shí)現(xiàn)動物對植物養(yǎng)分的較好利用。從而改善了動物的生長速度和/或飼料轉(zhuǎn)化率(即攝入的飼料重量與體重增加之比)。在本文中，動物飼料添加劑是一種酶制劑，它含有一種或幾種飼料增強(qiáng)酶，以及合適的載體和/或賦形劑，該酶制劑以適于加入動物飼料中的形式提供。本發(fā)明的動物飼料添加劑可以用本領(lǐng)域公知的方法制備，可以制成干燥或液體制劑形式。對于待加入所述制劑中的酶來說，可選擇性地用本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行穩(wěn)定化。在本文中，一種含有單組分木聚糖酶的動物飼料添加劑是以一種適于加入動物飼料中的形式提供的酶制劑，在該酶制劑中，基本上所有的木聚糖分解活性(即可檢測到的木聚糖分解活性)是由一種單一的木聚糖酶組分產(chǎn)生的。本發(fā)明的動物飼料添加劑可以是一種顆?；拿钢破?，它可以與飼料組分方便地混合，或者，更理想的是形成一種預(yù)混組分。所述顆?；钢破房梢允前碌幕蚍前碌?。理想的是，酶顆粒的粒度與飼料和預(yù)混組分的粒度相當(dāng)。這樣可以為將酶摻入飼料中提供一種安全而又方便的方式。另外，本發(fā)明的動物飼料添加劑可以是一種穩(wěn)定化液體組合物，它可以是一種水基或油基漿體。本發(fā)明的動物飼料添加劑可以在體外(通過對飼料組分改性)或體內(nèi)發(fā)揮其作用。本發(fā)明的飼料添加劑特別適于加入含有大量阿拉伯糖基木聚糖和葡糖醛木聚糖的動物飼料組合物中，如含有諸如大麥、小麥、黑麥或燕麥或玉米之類的谷物的飼料。單組分木聚糖酶制劑本發(fā)明提供了一種動物飼料添加劑，該添加劑含有一種單組分木聚糖酶，該木聚糖酶源于腐殖霉屬菌株、嗜熱子囊菌屬菌株、毛殼菌屬菌株、毛霉屬菌株、藍(lán)霉菌屬菌株、Malbranchea屬菌株、毀絲霉屬菌株、梭孢殼屬菌株、絲衣霉屬菌株或擬青霉屬菌株。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的動物飼料添加劑含有一種單組分木聚糖酶，該酶源于一種高溫霉屬菌株，特別是一種疏綿狀高溫霉菌株，最好是疏綿狀高溫霉菌株DSM4109，或該菌株的突變體或突變型。在一種更具體的實(shí)施方案中，所述木聚糖酶是有相同于或部分相同于(即至少部分相同于)一種純化木聚糖酶的免疫化學(xué)特性，所述純化木聚糖酶或a)源于疏綿狀高溫霉菌株DSM4109；或b)由序列1所示的DNA序列的木聚糖酶編碼部分編碼；或c)由可從釀酒酵母菌株DSM10133中的質(zhì)粒獲得的DNA序列編碼。理想的是，所述單組分木聚糖酶是源于一種攜帶一個編碼該木聚糖酶組分的基因的宿主細(xì)胞。具體地講，所述單組分木聚糖酶可以是a)由序列1所示的DNA序列編碼，或由可從釀酒酵母菌株DSM10133中的質(zhì)粒獲得的DNA序列編碼；或b)由一個類似于序列1所示DNA序列的木聚糖酶編碼部分的DNA序列或類似于可從釀酒酵母菌株DSM10133中的質(zhì)粒獲得的DNA序列的DNA序列編碼，該類似的DNA序列或i)與序列1所示DNA序列的木聚糖酶編碼部分同源，或與可從釀酒酵母菌株DSM10133中的質(zhì)粒獲得的DNA序列同源；或ii)能與和序列1所示DNA序列的木聚糖酶編碼部分相同的寡核苷酸探針雜交，或與可從釀酒酵母菌株DSM10133中的質(zhì)粒獲得的DNA序列雜交；或iii)能編碼一種多肽，這種多肽與由序列1所示DNA序列編碼的多肽的同源性或與可從釀酒酵母菌株DSM10133中的質(zhì)粒獲得的DNA序列的同源性至少為70％；或iv)能編碼一種多肽，該多肽能與一種抗純化的木聚糖酶抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)，該純化木聚糖酶源于疏綿狀高溫霉菌株DSM4109，或由序列1所示DNA序列或可從釀酒酵母菌株DSM10133中的質(zhì)粒獲得的DNA序列編碼。在更好的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述單組分木聚糖酶還具有以下特征a)在pH6.0和60℃溫度下溫育60分鐘后，其殘余酶活性高于96％；b)在pH6.0和65℃溫度下溫育60分鐘后，其殘余酶活性高于83％；c)在pH6.0和70℃溫度下溫育60分鐘后，其殘余酶活性高于20％；和/或d)在pH6.0和75℃溫度下溫育60分鐘后，其殘余酶活性高于10％。類似的DNA序列在本文中，類似于序列1所示DNA序列的木聚糖酶編碼部分的DNA序列是指編碼一種木聚糖分解酶的任何DNA序列，該酶具有上文(i)-(iv)所述特征中的一種或幾種。理想的是，所述類似的DNA序列可從其它的或相關(guān)的(如相同的)能產(chǎn)生木聚糖酶組分的生物中提取，所提取的序列基于序列1所示DNA序列的木聚糖酶編碼部分或其合適的序列(如20-500bp)，例如可以用本文所述的方法進(jìn)行提取，而且，所述類似序列可以是含有本文所示DNA序列的等位突變型或種突變型。另外，可以根據(jù)序列1所示DNA序列的木聚糖酶編碼部分或其任何亞序列構(gòu)建所述類似的DNA序列，例如，通過引入核苷酸置換，這種置換不會產(chǎn)生由所述DNA序列所編碼的另一種木聚糖分解酶的氨基酸序列，但它相關(guān)于用于生產(chǎn)這種酶的宿主生物的密碼子使用，或者通過引入能產(chǎn)生不同氨基酸序列的核苷酸置換。當(dāng)進(jìn)行核苷酸置換時，氨基酸的變化最好是微不足道的，即保守的氨基酸置換，不會對蛋白的折疊或活性造成明顯影響，小的缺失，一般為1-大約30個氨基酸；小的氨基-或羧基-末端延伸，如一個氨基末端蛋氨酸殘基，一個最多為約20-25個殘基的小的連接肽，一個有利于提純的小的延伸部分，如一個聚組氨酸片段、一個抗原表位或一個結(jié)合域。保守置換的例子是在堿性氨基酸(如精氨酸、賴氨酸、組氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(如谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(如亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)和小的氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸)組內(nèi)進(jìn)行置換。關(guān)于核苷酸置換的一般性描述，參見Ford等，ProteinExpressionandPurification，2，1991，95-107。本領(lǐng)域技術(shù)人員十分清楚的是，上述置換可以在對該分子功能很關(guān)鍵的部分以外進(jìn)行，因此，仍然能得到活性木聚糖分解酶。最好不要對由本發(fā)明DNA結(jié)構(gòu)編碼的木聚糖酶的活性所必需的氨基酸進(jìn)行置換，這些氨基酸可以按照本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行確定，如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變(例如，參見CunninghamandWells，Science，1989，244，1081-1085)。在后一種技術(shù)中，將突變引入分子的每一個殘基，并測定所得突變型分子的生物學(xué)(即蛋白分解)活性，以確定對該分子的活性關(guān)鍵的氨基酸。通過分析晶體結(jié)構(gòu)可以測定底物-酶互作位點(diǎn)，如通過諸如核磁共振分析技術(shù)、晶體學(xué)技術(shù)或光親和標(biāo)記技術(shù)(例如，參見deVos等，Science1992，255，306-312；Smith等，J.Mol.Biol.1992，224，899-904；Wlodaver等，F(xiàn)EBSLett.1992，309，59-64)進(jìn)行測定?？梢岳斫猓蛄?所示DNA序列的木聚糖酶編碼部分或其任何亞序列，均可用作分離編碼木聚糖分解酶的完整DNA序列，如序列1所示DNA序列的探針。在上文i)所提及的同源性是以兩種序列之間的相同程度來確定的，表示第一個序列是由第二個序列衍生而來。理想的是，用本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)程序，如在GCG程序包里所提供的GAP進(jìn)行測定(NeedlemanSB&WunschCD；J.Mol.Biol.1970，48，443-453)。利用GAP及以下參數(shù)進(jìn)行DNA序列比較GAP產(chǎn)生損失5.0，GAP延伸損失0.3，該DNA序列的編碼部分與序列1所示DNA序列的木聚糖酶編碼部分或可從釀酒酵母菌株DSM10133中的質(zhì)粒獲得的DNA序列的相同程度以至少70％為宜，特別是至少為80％、至少85％、至少90％或者至少為95％。上文(ii)部分所提及的雜交是指在某種特定條件下，所述類似的DNA序列能與和編碼木聚糖酶組分的DNA序列相同的寡核苷酸探針雜交，雜交條件在下文的材料和方法部分將作詳細(xì)說明。所采用的探針可以序列1所示DNA序列的木聚糖酶編碼部分或其能編碼該酶的至少6-7個氨基酸的亞序列為基礎(chǔ)或以序列2所示的推定氨基酸序列為基礎(chǔ)方便地進(jìn)行構(gòu)建。在后一種情形下，所述探針是由一種相當(dāng)于大量低簡并密碼子的氨基酸亞序列制備的。通常，類似的DNA序列與所述DNA序列高度同源，如與編碼本發(fā)明木聚糖酶組分的序列1所示序列的同源性至少為70％，以至少80％為宜，尤其是至少85％、至少90％、或者甚至與序列1所示序列的同源性至少為95％。在上文(iii)部分所提及的同源程度是以兩種序列間的相同程度進(jìn)行確定的，它表示第一種序列由第二種序列衍生而來。理想的是，用本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)程序，如在GCG程序包里所提供的GAP進(jìn)行測定(NeedlemanSB&WunschCD；J.Mol.Biol.，1970，48，443-453)。利用GAP及以下參數(shù)進(jìn)行多肽序列比較GAP產(chǎn)生損失3.0，GAP延伸損失0.1，由一種類似的DNA序列編碼的多肽與由含有序列1所示DNA序列的編碼部分的DNA結(jié)構(gòu)或可從釀酒酵母菌株DSM10133中的質(zhì)粒獲得的DNA序列編碼的酶的同源性以70％為宜，尤其是至少為80％，至少為85％，甚至至少為90％。按照本發(fā)明上述方法，本發(fā)明木聚糖酶與大多數(shù)已有木聚糖酶的DNA同源性是用計(jì)算機(jī)程序GAP測定的。本發(fā)明木聚糖酶與獲自Trichodermareessi的木聚糖酶I的DNA同源性僅為63％(TorronenA等，Biotechnology1992，10，11，1461-1465)，而與源于碳黑旋孢腔菌(Cochlioboluscarbonum)的木聚糖酶I的DNA同源性為63％(ApelPC等；Mol.PlantMicrob.Interact.，1993，6，467-473)。上文特征(iv)所提及的“源于”不僅是指由疏綿狀高溫霉菌株DSM4109所產(chǎn)生的木聚糖酶組分，而且還指由從該菌株中提取的DNA序列編碼并在由該DNA序列轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的木聚糖酶組分。免疫反應(yīng)性可以用在下文的材料和方法部分所述的方法測定。飼料增強(qiáng)酶在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的飼料添加劑可以包括額外的飼料增強(qiáng)酶。在本發(fā)明的內(nèi)容中，飼料增強(qiáng)酶包括，但不限于α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶，特別是乳糖酶、植酸酶、β-葡聚糖酶，特別是內(nèi)-β-1，4-葡聚糖酶和內(nèi)-β-1，3(4)-葡聚糖酶、木聚糖酶、木糖苷酶、半乳聚糖酶，特別是阿拉伯半乳聚糖內(nèi)-1，4-β-半乳糖苷酶和阿拉伯半乳聚糖內(nèi)-1，3-β-半乳糖苷酸、內(nèi)葡聚糖酶，特別是內(nèi)-1，2-β-葡聚糖酶、內(nèi)-1，3-α-葡聚糖酶、和內(nèi)-1，3-β-葡聚糖酶、果膠降解酶，特別是果膠酶、果膠酯酶、果膠裂解酶、聚半乳糖醛酶、阿聚糖酶、鼠李半乳糖醛酶、鼠李半乳糖醛乙酰脂酶、鼠李半乳糖醛-α-鼠李糖苷酶、果糖酸鹽裂解酶、和α-半乳糖醛酸苷酶、甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、甘露聚糖乙酰酯酶、木聚糖乙酰酯酶、蛋白酶和脂解酶，如脂肪酶和角質(zhì)酶。微生物源本發(fā)明涉及一種動物飼料添加劑，該添加劑包括一種木聚糖酶，該酶源于屬于嗜熱真菌類的菌株，即高溫霉屬或相關(guān)的屬。高溫霉屬包括幾個種〔Appinis&Eggins；1966〕，特別是疏綿狀高溫霉(同疏綿狀腐質(zhì)霉)的種，這些種通常與嗜熱真菌類相關(guān)[Cooney&Emerson；1964]。有幾個屬屬于這一類型，例如，業(yè)已證實(shí)腐質(zhì)霉屬、嗜熱子囊菌屬、毛殼菌屬、毛霉屬、藍(lán)霉菌屬、Malbranchea屬、毀絲霉屬、梭孢殼屬的種是很有潛力的酶生產(chǎn)菌。而且，絲衣霉屬和擬青霉屬也與這一類型相關(guān)。一般認(rèn)為高溫霉屬的分類關(guān)系不確定。不過，theNationalInstituteofHealthdatabaseEntrez(最近為1996年1月)將高溫霉屬分類為有絲分裂核菌類(Pyrenomycete)(即一種僅對其做過不全面鑒定的核菌，缺乏足夠的資料將其與具體的目或具體的科聯(lián)系在一起)。最近的分子研究試圖闡明高溫霉屬的18S-RNA的序列，以便利用該資料進(jìn)一步澄清該屬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。對現(xiàn)有資料的暫時的解釋表明，高溫霉屬與不整囊菌綱(Plectomycetes)下面的真菌類，特別是散囊菌目(Erotiales)密切相關(guān)。通過對數(shù)據(jù)庫所做的同源性分析發(fā)現(xiàn)，絲衣霉屬18S-RNA的序列與所公開的疏綿狀高溫霉的序列最為相關(guān)(NovoNordisk1996，資料未發(fā)表)。如果對屬于高溫霉屬的分離種群所作的研究支持最初的發(fā)現(xiàn)，則有理由將高溫霉屬轉(zhuǎn)移到不整囊菌的目下面。因此，本發(fā)明還涉及源于不整囊菌綱、特別是散囊菌目的木聚糖酶制劑。對本發(fā)明的木聚糖酶的核苷酸和蛋白的資料進(jìn)行了同源性分析。同源性分析表明，最相關(guān)的木聚糖酶是源于Trichodermareesei的木聚糖酶I和源于碳黑旋胞腔菌的木聚糖酶I。兩種木聚糖酶均屬于糖基水解酶的家族II(HenrissatB；Biochem.J.1991，280，309-316)，這表明，本發(fā)明的木聚糖酶也屬于該科。已對疏綿狀高溫霉的幾種樣品進(jìn)行了保藏，并要從被布達(dá)佩斯條約所認(rèn)可的國際保藏機(jī)構(gòu)公開獲得，這些保藏機(jī)構(gòu)如美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)，12301ParklawnDrive，Rockville，Maryland20852，USA。已根據(jù)國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約將疏綿狀高溫霉屬菌株保存在德國微生物和培養(yǎng)物保藏所(DSM)，MascheroderWeg16，DE-3300Braunschweig，Germany，保存日為1987年5月4日，保藏號為DSM4109。已根據(jù)國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約將釀酒酵母菌株DSM10133保存在德國微生物和培養(yǎng)物保藏所(DSM)，MascheroderWeg1b，DE-3300Braunschweig，Germany，保存日為1995年7月19日，保藏號為DSM10133。該菌株含有包括序列1所示全長DNA序列的質(zhì)粒DNA，該DNA編碼本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶，并結(jié)合在酵母載體pYES2.0上。DNA結(jié)構(gòu)另一方面，本發(fā)明提供了一種含有編碼一種木聚糖酶組分的DNA序列的DNA結(jié)構(gòu)，該DNA序列包括a)序列1所示DNA序列的木聚糖酶編碼部分，或可從釀酒酵母菌株DSM10133中的質(zhì)粒獲得的DNA序列；或b)一個類似于序列1所示DNA序列的木聚糖酶編碼部分的DNA序列，或類似于可從釀酒酵母菌株10133中的質(zhì)粒獲得的DNA序列的DNA序列，該類似DNA序列或i)同源于序列1所示DNA序列的木聚糖酶編碼部分，或同源于可從釀酒酵母菌株DSM10133中的質(zhì)粒獲得的DNA序列；或ii)能與和序列1所示DNA序列的木聚糖酶編碼部分相同的寡核苷酸探針雜交，或與可從釀酒酵母菌株DSM10133中的質(zhì)粒獲得的DNA序列雜交；或iii)能編碼一種多肽，該多肽與由序列1所示的DNA序列編碼的多肽或可從釀酒酵母菌株DSM10133中的質(zhì)粒獲得的DNA序列的同源性至少為70％；或iv)能編碼一種多肽，該多肽能與抗純化木聚糖酶的抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)，所述純化木聚糖酶源于疏綿狀高溫霉菌株DSM4109或由序列1所示DNA序列或可從釀酒酵母菌株DSM10133中的質(zhì)粒獲得的DNA序列編碼。在本文中，“DNA結(jié)構(gòu)”是指來源于cDNA、基因組DNA、合成DNA或RNA的任何核酸分子。“結(jié)構(gòu)”一詞是指單鏈或雙鏈核酸片段，它可以是以完整的或部分天然存在的編碼感興趣的木聚糖酶的核苷酸序列為基礎(chǔ)。所述結(jié)構(gòu)可選擇性地含有其它核酸片段。本發(fā)明的編碼木聚糖分解酶的DNA結(jié)構(gòu)以來源于基因組DNA或cDNA為宜，例如，可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如，參見Sambrook等，MolecularCloning.ALaboratoryManual，ColdSpringHarbor，N.Y.，1989)獲得這種DNA結(jié)構(gòu)制備基因組或cDNA文庫，并用合成寡核苷酸探針通過雜交篩選編碼全部或部分木聚糖分解酶的DNA序列。也可以用已建立的標(biāo)準(zhǔn)方法合成本發(fā)明編碼木聚糖分解酶的核酸結(jié)構(gòu)，例如，由Beaucage和Caruthers所披露的亞磷酰胺法(TetrahedronLetters，1981，22，1859-1869)，或由Matthes等所披露的方法(EMBOJournal，1984，3，801-805)。按照亞磷酰胺法，在諸如自動DNA合成儀之類的儀器上合成寡核苷酸，純化、退火、連接并克隆到合適的載體上。另外，所述核酸結(jié)構(gòu)可以是按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過連接合成的、基因組或cDNA來源的片段(合適的話)、相當(dāng)于完整核酸結(jié)構(gòu)的各部分的片段而制成的混合的合成和基因組結(jié)構(gòu)、混合的合成和eDNA結(jié)構(gòu)、或混合的基因組和cDNA結(jié)構(gòu)。所述核酸結(jié)構(gòu)還可以用特殊的引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)制成，例如，在US4,683,202中披露的或由Saiki等(Science1988，239，487-491)所披露的方法進(jìn)行。編碼木聚糖酶組分的DNA序列可源于腐質(zhì)霉菌株、嗜熱子囊菌屬菌株、毛殼菌屬菌株、毛霉屬菌株、藍(lán)霉菌屬菌株、Malbranchea屬菌株、毀絲霉屬菌株、梭孢殼屬菌株或擬青霉屬菌株。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，編碼木聚糖酶組分的DNA序列源于高溫霉屬菌株，特別是疏綿狀高溫霉菌株。在一種最佳實(shí)施方案中，所述DNA序列源于或者是由疏綿狀高溫霉的DNA文庫或其突變體或突變型產(chǎn)生。可以用常規(guī)方法分離編碼木聚糖分解酶的DNA序列，該方法一般包括-將例如源于疏綿狀高溫霉菌株DSM4109或源于釀酒酵母菌株DSM10133中的質(zhì)粒的cDNA文庫克隆在一種合適的載體上，-用所述載體轉(zhuǎn)化一種合適的宿主細(xì)胞，-在適于表達(dá)由所述cDNA文庫中的一個或幾個克隆編碼的目的木聚糖分解酶的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，-通過測定由所述克隆所產(chǎn)生的酶的任何木聚糖酶分解活性篩選陽性克隆，和-從所述克隆中分離編碼目的木聚糖酶的DNA。在WO93/11249中披露了一種一般方法，該文獻(xiàn)的內(nèi)容被作為本發(fā)明
背景技術(shù)：
。對篩選方法的更詳細(xì)的說明參見下文的例1。例如，編碼一種木聚糖酶組分的DNA序列可以用以下方法分離篩選疏綿狀高溫霉菌株的一個cDNA文庫，和選擇表達(dá)木聚糖酶的克隆(如，通過該酶水解1，4-β木聚糖中1，4-β-木糖苷連鍵的能力確定)。然后用標(biāo)準(zhǔn)方法，如例1中所述的方法從該克隆中分離合適的DNA序列。在本文的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸結(jié)構(gòu)包括序列1所示的DNA序列的木聚糖酶編碼部分，或其任何亞序列，但它由于遺傳密碼的簡并而又不同于序列1所示的DNA序列。本發(fā)明還包括能在下述條件下與編碼序列2所示氨基酸序列或其任何亞序列的核酸分子(基因組、合成的或cDNA或RNA)雜交的核酸序列。重組表達(dá)載體另一方面，本發(fā)明提供了一種含有本發(fā)明DNA結(jié)構(gòu)的重組表達(dá)載體。本發(fā)明的重組表達(dá)載體可以是任何可以方便地用于重組DNA技術(shù)的載體，而載體的選擇通常取決于該載體有待導(dǎo)入其中的宿主細(xì)胞。因此，所述載體可以是自主復(fù)制的載體，即作為染色體外的實(shí)體存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體的復(fù)制，如質(zhì)粒。另外，所述載體也可以是這樣的當(dāng)它被導(dǎo)入宿主細(xì)胞后，整合到宿主細(xì)胞基因組上，并與其所整合的染色體一起復(fù)制。在本發(fā)明的表達(dá)載體中，編碼木聚糖分解酶的DNA序列最好是可操作地連接于該DNA轉(zhuǎn)錄所需的其它片段上。一般，所述表達(dá)載體源于質(zhì)?；虿《綝NA，或者含有以上兩種因子?！翱刹僮鞯剡B接”這一用語表示所述片段被設(shè)計(jì)成能發(fā)揮其預(yù)定的功能，例如在一個啟動子中啟動轉(zhuǎn)錄，并實(shí)現(xiàn)編碼木聚糖酶的DNA序列的轉(zhuǎn)錄。因此，在本發(fā)明的表達(dá)載體中，編碼木聚糖分解酶的DNA序列應(yīng)當(dāng)可操作地連接于合適的啟動子和終止序列上。所述啟動子可以是能在所選擇的宿主細(xì)胞中表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，而且，可源于編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的蛋白的基因。適于在細(xì)菌宿主細(xì)胞中指導(dǎo)編碼本發(fā)明木聚糖酶的DNA轉(zhuǎn)錄的啟動子的例子包括嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillusstearothermophilus)生麥淀粉酶基因，地衣型芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶基因、解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)BAN淀粉酶基因、枯草桿菌堿性蛋白酶基因或短小芽胞桿菌木聚糖酶或木糖苷酶基因的啟動子，或入噬菌體PR或PL啟動子或大腸桿菌lac、trp或tac啟動子。適用于酵母宿主細(xì)胞的啟動子的例子包括源于酵母糖解基因(Hitzman等，J.Biol.Chem.255(1980)，12073-12080；Alber和Kawasaki，J.Mol.Appl.Gen.1(1982)，419-434)或醇脫氫酶基因(Young等，GeneticEngineeringofMicroorganismforchemicals(Hollaender等著)，PlenumPress，NewYork，1982)或TPI1(US4,599,311)或ADH2-4C(Russell等，Nature304(1983)，652-654)的啟動子。適用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的啟動子的例子有，例如，ADH3啟動子(Mcknight等，TheEMBOJ.，4(1985)，2093-2099)或tpiA啟動子。其它有用啟動子的例子有源于以下基因的啟動子編碼米曲霉(Aspergillusoryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillusniger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillusawamori)葡糖淀粉酶(gluA)、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉磷酸三糖異構(gòu)酶或構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)乙酰胺酶的基因。優(yōu)選TAKA淀粉酶和gluA啟動子。本發(fā)明的表達(dá)載體還可以包括一個使得該載體能夠在相關(guān)的宿主細(xì)胞中表達(dá)的DNA序列。該表達(dá)載體還可以包括一個選擇標(biāo)記，如一個一基因，其產(chǎn)物可彌補(bǔ)宿主細(xì)胞的某種缺陷，如編碼二氫葉酸還原酶(DHFR)的基因或釀酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)TPI基因(由RussellPR，Gene1985，40，125-130公開)，或能對某種藥物，如氨芐青霉素、卡那霉素、四環(huán)素、氯霉素、新霉素、潮霉素或氨甲喋呤產(chǎn)生抗性的基因。對于絲狀真菌來說，選擇標(biāo)記包括amdS、pyrG、ArgB、niaD和sC。為了引導(dǎo)木聚糖分解酶進(jìn)入宿主細(xì)胞的分泌通道，可以在表達(dá)載體上設(shè)置一個分泌信號序列(又被稱作前導(dǎo)序列、前原序列或前序列)。所述分泌信號序列以正確讀框與編碼木聚糖分解酶的DNA序列連接。分泌信號序列通常位于編碼木聚糖分解酶的DNA序列的5’末端。所述分泌信號序列可以是與木聚糖分解酶正常結(jié)合的，或是源于一種編碼另一種分泌蛋白的基因。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的表達(dá)載體可以包括一個分泌信號序列，其與地衣型芽胞桿菌α-淀粉酶基因的分泌信號編碼序列大致相同，如在WO86/05812中所披露的。另外，擴(kuò)增表達(dá)的方法可以用諸如串聯(lián)擴(kuò)增技術(shù)之類的方式進(jìn)行，該技術(shù)涉及單交換或雙交換，或通過多拷貝技術(shù)進(jìn)行，如在US4,959,316或91/09129中披露的技術(shù)。另外，所以表達(dá)載體可以包括一個對溫度敏感的復(fù)制起點(diǎn)，如在EP283,075中所披露的。用于分別連接編碼木聚糖分解酶的DNA序列、啟動子和選擇性地連接終止序列和/或分泌信號序列的方法，以及將其插入含有復(fù)制所需信息的合適載體上的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(例如，參見Sambrook等，molecularCloning.ALaboratoryManual，ColdSpringHarber，MY.1989)。宿主細(xì)胞在本發(fā)明的又一方面，提供了一種含有本發(fā)明DNA結(jié)構(gòu)和/或本發(fā)明重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)可以與相關(guān)的宿主同源或異源。如果與宿主細(xì)胞同源，即由宿主細(xì)胞天然產(chǎn)生，它一般會與另一個啟動子序列可操作地連接，或者，如果可能，與另一個分泌信號序列和/或終止序列在其非自然的環(huán)境中連接。在本文中，“同源”一詞意在包括有關(guān)宿主生物所固有的編碼木聚糖分解酶的cDNA序列?！爱愒础币庠诎ㄒ环N不是由宿主細(xì)胞天然表達(dá)的DNA序列。因此，所述DNA序列可來自其它生物或是一種合成序列。本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)或重組表達(dá)載體有待導(dǎo)入其中的本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以是任何能夠產(chǎn)生木聚糖分解酶的細(xì)胞，包括細(xì)菌、酵母、真菌和高等真核細(xì)胞。在培養(yǎng)時能產(chǎn)生本發(fā)明木聚糖分解酶的細(xì)菌宿主細(xì)胞的例子包括革蘭氏陽性細(xì)菌，如芽胞桿菌屬菌株，特別是枯草桿菌、地衣型芽胞桿菌、遲緩芽胞桿菌(Bacilluslentus)、短芽胞桿菌(Bacillusbrevis)、嗜熱脂肪芽胞桿菌、嗜堿芽胞桿菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽胞桿菌、凝結(jié)芽胞桿菌(Bacilluscoagulans)、環(huán)狀芽胞桿菌(Bacilluscirculans)、Bacilluslautus、巨大芽胞桿菌(Bacillusmegatherium)、短小芽胞桿菌、蘇云金桿菌(Bacillusthuringiensis)或Bacillusagaradherens菌株，或鏈霉菌屬菌株，特別是變鉛青鏈霉菌(Streptomyceslividans)或鼠灰鏈霉菌(Streptomycesmurinus)菌株，或革蘭氏陰性細(xì)菌，如大腸桿菌。細(xì)菌的轉(zhuǎn)化可以通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化或用感受態(tài)細(xì)胞以本身已知的方式進(jìn)行(參見Sambrook等，MolecularCloning.ALaboratoryManual，ColdSpringHarbor，N.Y.1989)。當(dāng)在諸如大腸桿菌之類的細(xì)菌中表達(dá)所述木聚糖分解酶時，該木聚糖酶可能存留在該細(xì)胞質(zhì)中，通常為不溶性顆粒(被稱為包含體)，或者被一種細(xì)菌分泌序列引導(dǎo)至外周質(zhì)間隙。在前一種情況下，將細(xì)胞裂解，回收顆粒并變性，此后，通過稀釋變性劑對木聚糖分解酶進(jìn)行重折疊。在后一種情況下，可以通過裂解細(xì)胞從外周質(zhì)間隙中回收木聚糖分解酶，例如，通過超聲或滲透休克以釋放出外周質(zhì)間隙的內(nèi)含物，并回收木聚糖分解酶。合適的酵母細(xì)胞的例子包括酵母菌細(xì)胞，特別是釀酒酵母菌株、克魯維酵母(Saccharomyceskluyveri)菌株、和葡萄汁酵母菌株，裂殖酵母菌細(xì)胞，如粟酒裂殖酵母菌，克魯維酵母菌屬細(xì)胞，如乳酸克魯維酵母(Kluveromyceslactis)，漢遜酵母菌屬細(xì)胞，如多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)，畢亦酵母細(xì)胞，如巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)(參見Gleesen等，J.Gen.Microbiol.132，1986，pp.3459-3465；US4,992,279)和Yarrowia菌細(xì)胞，如Yarrowialipolytica細(xì)胞。用異源DNA轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞的方法，以及由轉(zhuǎn)化的細(xì)胞生產(chǎn)異源多肽的方法披露于諸如US4,599,311、US4,931,373、US4,870,008、US5,037,743和US4,845,075的文獻(xiàn)中，以上文獻(xiàn)均被收作本文的背景資料。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是根據(jù)由一種選擇標(biāo)記決定的表型進(jìn)行選擇，選擇標(biāo)記通常為藥物抗性或在缺乏某種特殊營分，如亮氨酸的條件下生長的能力。用于酵母中的一種優(yōu)選載體是披露于US4,931,373中的POT1載體。編碼本發(fā)明木聚糖分解酶的DNA序列可以一個信號序列為前導(dǎo)，并選擇性地有一個前導(dǎo)序列，如上文所述。其它真菌細(xì)胞的例子有絲狀真菌細(xì)胞，如曲霉菌，特別是日本曲霉(Aspergillusjaponicus)菌株、米曲霉菌株、構(gòu)巢曲霉菌株或黑曲霉菌株，鏈孢霉菌，鐮孢菌，特別是尖鐮孢(Fusariumoxysporum)或禾本科鐮孢(Fusariumgraminearum)，或木霉菌。真菌細(xì)胞可用如下方法轉(zhuǎn)化，該方法包括原生質(zhì)體生成和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，接著是細(xì)胞壁再生，該方法本身是已知的。將曲霉菌用于表達(dá)蛋白的方法披露于諸如EP272,277和EP230,023之類的文獻(xiàn)中。例如，尖鐮孢的轉(zhuǎn)化可以按照Malardier等披露的方法(Gene，1989，78，147-156)進(jìn)行。在EP238023中披露了將曲霉屬用作宿主微生物的構(gòu)思，該專利的內(nèi)容被收作本文的背景資料。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是米曲霉菌株。生產(chǎn)單組分制劑的方法再一方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)本發(fā)明木聚糖分解酶的方法，其中，用編碼木聚糖分解酶的DNA序列轉(zhuǎn)化過的一種合適的宿主細(xì)胞在能夠產(chǎn)生所述酶的條件下培養(yǎng)，并從培養(yǎng)物中回收所得到的酶。又一方面，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)一種單組分木聚糖酶制劑的方法，其中，用編碼所述酶的DNA序列轉(zhuǎn)化過的一種合適的宿主細(xì)胞在能夠產(chǎn)生所述木聚糖酶組分的條件下培養(yǎng)，并從培養(yǎng)物中回收該木聚糖酶組分。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，編碼所述酶的DNA序列是一種按上述方法獲得的DNA結(jié)構(gòu)。在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述DNA結(jié)構(gòu)與一個合適的表達(dá)信號在上述表達(dá)載體里結(jié)合。在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是上述細(xì)胞中的一種。用于培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是適合于所述宿主細(xì)胞生長的任何常規(guī)培養(yǎng)基。所表達(dá)的木聚糖分解酶可以方便地分泌到培養(yǎng)基中，并可通過純化方法從培養(yǎng)基中回收。眾所周知的純化方法包括通過離心或過濾從培養(yǎng)基中分離細(xì)胞，用諸如硫酸銨之類的鹽沉淀培養(yǎng)基里的蛋白類組分，以及諸如離子交換層析、親和層析之類的層析方法。實(shí)施例將結(jié)合以下實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，這些實(shí)施例與權(quán)利要求不同，其意圖不在于限定本發(fā)明的范圍。材料和方法供體生物從疏綿狀高溫霉DSM4109中分離mRNA，所述微生物生長于含有木聚糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)期間進(jìn)行振動，以保證通氣充分。生長3-5天后收獲菌絲體，迅速冰凍于液氮中并儲存在-80℃下。酵母菌株下面用到的釀酒酵母菌株為JG169(MATα；ura3-52；Leu2-3，112；his3-D200；pep4-113；prc1HIS3；prb1∷LEU2；cir+)。質(zhì)粒將市售酵母質(zhì)粒pYES2.0(invitrogen)用于表達(dá)。曲霉屬表達(dá)載體pHD414是質(zhì)粒p775的衍生物，披露于EP238023中。在WO93/11249中對pHD414有進(jìn)一步描述。提取全RNA全RNA的提取是用硫氰酸胍進(jìn)行的，隨后超速離心通過5.7MCsCl墊層，并通過oligo(dT)-纖維素親和層析分離poly(A)+RNA，所用方法披露于WO93/11249中。cDNA合成與修飾通過RNaseH方法(GublerU，HoffmanBJ，Gene1983，25，263-269；Sambrook等，MolecularcloningALaboratoryManual，ColdSpringHarborLab.，ColdSpringHarbor，NY，1989)利用發(fā)夾修飾方法由5μgpoly(A)+RNA合成雙鏈cDNA。該方法進(jìn)一步披露于WO93/11249中。在用綠豆核酸酶處理過以后，用T4DNA聚合酶(Invitrogen)將所述dscDNA補(bǔ)成平端，并按照生產(chǎn)商的說明將該cDNA連接于非回文型BstXI銜接子(1μg/μl，Invitrogen)上。cDNA文庫的構(gòu)建離心回收銜接后的dscDNA，用70％EtOH洗滌，并重新懸浮于25mlH2O中。在進(jìn)行大規(guī)模文庫連接之前，在10μl連接緩沖液(同上)中進(jìn)行4次試驗(yàn)連接，每次連接用緩沖液中含有1μldscDNA(反應(yīng)試管#1-#3)，2單位T4連接酶(Invitrogen)和50ng(試管#1)，100ng(試管#2)和200ng(試管#3和#4)BstXI切過的酵母表達(dá)載體(或?yàn)閜YES2.0載體，Invitrogen，或?yàn)閥HD13)。采用合適條件在40μl連接緩沖液中進(jìn)行大規(guī)模連接。將1μl樣品轉(zhuǎn)化到電感受態(tài)大腸桿菌1061細(xì)胞中，對轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行滴定，并將文庫置板于LB+氨芐青霉素的培養(yǎng)皿上，菌落形成單位為5000-7000c.f.u./皿。向每個培養(yǎng)皿中加3ml培養(yǎng)基。刮取細(xì)菌，加入1ml甘油，并作為原料庫于-80℃下保存。其余2ml用于DNA分離。有關(guān)該方法的進(jìn)一步細(xì)節(jié)，參見WO94/14952。構(gòu)建酵母文庫為了保證所有細(xì)菌克隆是在酵母中檢驗(yàn)的，將酵母轉(zhuǎn)化體數(shù)為細(xì)菌克隆數(shù)的5倍定為原始材料庫的極限。將自單個庫中提取的1μl純化質(zhì)粒DNA(140ng/μl)樣品通過電擊法(200Ω，1.5KV，25μF)轉(zhuǎn)移到40μl感受態(tài)釀酒酵母JG169細(xì)胞中在500mlYPD中OD600＝1.5，用冷DIW洗2次，用冷的1M山梨醇洗1次，重新懸浮于0.5ml1M山梨醇(BeckerDM，GuaranteL，MethodsEnzymol.1991，194，182-187)中)。在加入1ml1M冷山梨醇后，將80μl的樣品置板于SC+葡萄糖-尿嘧啶上，使菌落形成單位為250-400c.fu/皿，并在30℃下培養(yǎng)3-5天。鑒定陽性菌落在生長3-5天以后，將瓊脂板復(fù)制鋪板于SC-尿嘧啶板上，其含有0.2％天青蛋白交聯(lián)的樺木聚糖(AZCLTM樺木聚糖，MegazymeTM，Australia)，和2％半乳糖，然后在30℃下培養(yǎng)2-4天以檢驗(yàn)?zāi)揪厶欠纸饣钚?。培養(yǎng)以后，將周圍有藍(lán)色暈圈的菌落確定為木聚糖分解酶陽性菌落。將來自酶陽性菌落的細(xì)胞展開，以便在瓊脂上進(jìn)行單菌落分離，選擇能產(chǎn)生酶的單菌落分別進(jìn)行木聚糖分解酶產(chǎn)生菌落的鑒定。陽性克隆的鑒定以單菌落形式獲得陽性克隆。從用兩個陽性酵母克隆制備的細(xì)胞培養(yǎng)物中分離質(zhì)粒DNA。將質(zhì)粒DNA導(dǎo)入(轉(zhuǎn)化)大腸桿菌中，分離，并對各cDNA克隆的5’-末端測序進(jìn)行個別鑒定，測序采用鏈終止法(Sanger等，Proc.Natl，Acad.Sci.U.S.A.1977，74，5463-5467)和SequenaseTMSystem(UnitedStatesBiochemical)。分離用于在曲霉屬中表達(dá)的cDNA基因?qū)?個或幾個木聚糖分解酶產(chǎn)生酵母菌落接種到盛于50ml玻璃試管的20mlYNB-1培養(yǎng)液中。在30℃下振動該試管2天。3000rpm離心10分鐘收集細(xì)胞。按WO94/14952所述分離的DNA被溶解在50μl水中。按WO94/14952中所述方法用DNA樣品轉(zhuǎn)化大腸桿菌。用標(biāo)準(zhǔn)方法從大腸桿菌中分離質(zhì)粒DNA，并用限制酶分析法進(jìn)行分析。用合適的限制酶切下cDNA插入片段，并連接到曲霉屬表達(dá)載體上。轉(zhuǎn)化米曲霉或黑曲霉一般方法用米曲霉或黑曲霉孢子接種100mlYPD(Sherman等，MethodsinYeastGenetics，ColdSpringHarborLaboratory，1981)，并在37℃下?lián)u動培養(yǎng)約2天。過濾收集菌絲體，并用200ml0.6MMgSO4洗滌。將菌絲體懸浮于15ml1.2MMgSO4和10mMNaH2PO4，pH5.8的溶液中。在冰上冷卻懸浮液，并加入1ml含有120mgNovozymTM234，批號1687的緩沖液。5分鐘后加入1ml12mg/mlBSA(Sigma，typeH25)，并在37℃下培養(yǎng)1.5-2.5小時，同時伴以輕微振動，直至在顯微鏡下檢查樣品時可見到大量原生質(zhì)體。通過miracloth過濾懸浮液，將濾液轉(zhuǎn)移到消毒試管中，并在其上堆疊5ml0.6M山梨醇，100mMTris-HCl，pH7.0。在100g下離心15分鐘，從MgSO4墊層上部收集原生質(zhì)體。將2倍體積的STC(1.2M山梨醇、10mMTris-HCl，pH7.5，10mMCaCl2)加入該原生質(zhì)體懸浮液中，在1000g下離心該混合物5分鐘。將原生質(zhì)體沉淀重新懸浮于3mlSTC中并進(jìn)行再沉淀。重復(fù)以上過程。最后將原生質(zhì)體重新懸浮在0.2-1mlSTC中。將100μl原生質(zhì)體懸浮液與5-25μg合適的DNA在10μlSTC中混合。將原生質(zhì)體與p3SR2(一種帶有構(gòu)巢曲霉amdS基因的質(zhì)粒)。該混合物在室溫下放置25分鐘。加入0.2ml60％PEG4000(BDH29576)、10mMCaCl2和10mMTris-Hcl，pH7.5，并小心混合(2次)，最后加入0.85ml相同的溶液，并小心混合。將混合物在室溫下放置25分鐘，2500g離心15分鐘，將沉淀重新懸浮于2ml1.2M山梨醇中。再經(jīng)過一次沉淀之后，將原生質(zhì)體涂布在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)皿上。將原生質(zhì)體涂布在含有1.0M蔗糖，pH7.0，10mM乙酰胺作為氯源和20mMCsCl抑制背景生長的極限培養(yǎng)皿(Cove，Biochem.Biophys.Acta1966，113，51-56)上。在37℃下培養(yǎng)4-7天后，挑取孢子，并展布成單菌落。重復(fù)以上過程，再次分離單菌落的孢子，然后作為確定的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行保存。檢驗(yàn)米曲霉轉(zhuǎn)化體將各種轉(zhuǎn)化體接種到10mlYPM(見下文)中，并進(jìn)行繁殖。在30℃下培養(yǎng)2-5天，然后除去上清液。將10μl上清液加至在含有0.2％AZCLTM樺木聚糖(MegazymeTM，Australia)的瓊脂皿上打出的直徑為4mm的孔中，以鑒定木聚糖分解活性。用藍(lán)色暈圈確定木聚糖分解活性。雜交條件可以按下述方法確定寡核苷酸探針與本發(fā)明“類似的”DNA序列雜交的合適條件。用于雜交的合適寡核苷酸探針可以基于序列1所示DNA序列的木聚糖酶編碼部分或其任何亞序列或基于序列2所示的推定氨基酸序列進(jìn)行制備。一種合適探針的例子是相當(dāng)于序列1所示木聚糖編碼部分的DNA序列，即序列1中31位至705位的核苷酸。在5×SSC中對待雜交的含有DNA片段的濾膜進(jìn)行預(yù)浸，并在50℃左右預(yù)雜交1小時，預(yù)雜交溶液中含有5×SSC、5×Denhardt’s溶液，50mM磷酸鈉，pH6.8，和50μg變性的超聲波處理的小牛胸腺DNA。在45℃左右，在補(bǔ)充了50μCi32-P-dCTP標(biāo)記的探針的相同溶液中雜交18小時，在2×SSC、0.2％SDS的溶液中洗滌該制品3次、30分鐘、溫度以不超過55℃為宜，尤其是不超過60℃、不超過65℃、不超過70℃、不超過75℃，最好不超過80℃。在上述條件下能與所述寡核苷酸探針雜交的分子可以用X光片進(jìn)行檢測。免疫交叉反應(yīng)性可以用純化的木聚糖分解酶制備用于測定免疫交叉反應(yīng)性的抗體。更具體地講，可以按照Axelsen等的方法(AManualofQuantitativeImmunoelectrophoresis，BlackwellScientificPublications，1973，特別是第23章)或Johnson和Thorpe的方法(ImmunochemistryinPractice，BlackwellScientificPublications，1982，特別是pp.27-31)通過免疫兔(或其它嚙齒類動物)制備抗本發(fā)明酶的抗血清。可以從抗血清中獲得純化的免疫球蛋白，例如，通過鹽沉淀((NH4)2SO4)，接著進(jìn)行透析和離子交換層析，例如，在DEAE-Sephadex上進(jìn)行層析?？梢酝ㄟ^Outcherlong雙擴(kuò)散分析(OuchterlonyO；HandbookofExperimentalImmunology(D.M.Weir著)，BlackwellScientificpublications，1967，PP.655-706；或Roittl；EssentialImmunology，BlackwellScientificPublications，1984，Pp.145-147)、交叉免疫電泳(Axelsen等，同上，第3、4章)或火箭免疫電泳(Axelsen等，同上，第2章)進(jìn)行蛋白的免疫化學(xué)鑒定。培養(yǎng)基YPM培養(yǎng)基10g酵母提取物，20g胨，加水至810ml。對90ml麥芽糖糊精進(jìn)行高壓滅菌和滅菌過濾，然后加入上述溶液中。YPD培養(yǎng)基10g酵母提取物，20g胨，加水至810ml。對90ml20％葡萄糖進(jìn)行高壓滅菌和滅菌過濾，然后加入上述溶液中。10X基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基66.8g酵母氮堿，100g琥珀酸、60gNaOH，加水1000ml，滅菌過濾。SC-URA90ml10×基礎(chǔ)鹽，22.5ml20％水解酷蛋白氨基酸，9ml1％色氨酸，加水806ml，高壓滅菌，加入3.6ml5％蘇氨酸和90ml20％葡萄糖或20％半乳糖。SC-H液7.5g/l無氨基酸的酵母氮堿，11.3g/l琥珀酸，6.8g/lNaOH，5.6g/l無維生素的水解酪蛋白氨基酸，0.1g/l色氨酸。在121℃下高壓滅菌20分鐘。高壓滅菌以后向每100ml培養(yǎng)基中加入10ml30％半乳糖溶液，5ml30％葡萄糖溶液和0.4ml5％蘇氨酸溶液。SC-H瓊脂7.5g/l無氨基酸的酵母氮堿，11.3g/l琥珀酸，6.8g/lNaOH，5.6g/l無維生素的水解酪蛋白氨基酸，0.1g/l色氨酸，和20g/l瓊脂(BactoTM)。在121℃下高壓滅菌20分鐘。滅菌以后向每450ml瓊脂中加入55ml22％半乳糖溶液和1.8ml5％蘇氨酸溶液。YNB-1瓊脂3.3g/lKH2PO4，16.7g/l瓊脂，調(diào)pH至7。在121℃下高壓滅菌20分鐘。高壓滅菌以后向每450ml瓊脂中加入25ml13.6％的無氨基酸酵母氨堿，25ml40％葡萄糖溶液，1.5ml1％L-亮氨酸溶液和1.5ml1％組氨酸溶液。YNB-1液配方同YNB-1瓊脂，只是沒有瓊脂。木聚糖分解活性木聚糖分解活性可以FXU-單位表示，是在pH6.0下以remazol-木聚糖(4-O-甲基-D-葡糖醛-D-木聚糖，用RemazolBrilliantBlueR，F(xiàn)luka染色)為底物測定的。將木聚糖酶樣品與remazol-木聚糖底物一起培養(yǎng)。用乙醇沉淀非降解染色底物的背景。上清液中殘余藍(lán)色(在585mm進(jìn)行分光光度法測定)與木聚糖酶活性成比例，然后與酶標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較測定木聚糖酶單位，測定是在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下進(jìn)行，即50.0℃，pH6.0，30分鐘反應(yīng)時間。一份編號為AF293.6/1的文件對該分析方法有更詳細(xì)的說明，可以向NovoNordiskA/S，Denmark索取該文件，該文件被收作本文的背景資料。例1基因分離構(gòu)建一個疏綿狀高溫霉文庫，該文庫由在150個庫中的大約1.5×106個單一克隆組成。從該文庫的20個單一克隆中分離DNA，并進(jìn)行cDNA插入分析。發(fā)現(xiàn)插入的頻率＞90％，平均插入大小約為1400bp。將得自上述一些庫的DNA轉(zhuǎn)化到酵母中，由每個庫獲得50-100塊含有200-500個酵母菌落的培養(yǎng)皿。生長3-5天，然后將所述瓊脂板復(fù)制置板到幾組瓊脂板上。然后在30℃下將一組合有0.1％AZCLTM木聚糖(MegazymeTM，Australia)的板培養(yǎng)3-5天，以檢測木聚糖酶的活性。將由藍(lán)色暈圈環(huán)繞的菌落確認(rèn)為陽性菌落。用含有0.1％AZCLTM木聚糖和1％瓊脂糖的由具有合適pH的緩沖液制成的木聚糖疊層凝膠疊層之前將一組板在30℃下培養(yǎng)3-5天。在30℃下培養(yǎng)1-2天后即可將由藍(lán)色暈圈環(huán)繞的菌落確定為陽性菌落。將來自酶陽性菌落的細(xì)胞涂布在瓊脂上進(jìn)行單菌落分離，選擇能產(chǎn)生酶的單菌落進(jìn)行木聚糖酶產(chǎn)生菌落鑒定。陽性克隆的鑒定以單菌落形式獲得陽性克隆。用生物素?；亩嘟宇^引物直接由酵母菌落擴(kuò)增cDNA插入片段，用磁珠(DynabeadTMM-280，Dynal)系統(tǒng)進(jìn)行純化并用鏈終止法(SangerF，NicklenS&amp;CoulsonAR；Pro.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1977，74，5463-5467)和SequenaseTMSystem(UnitedStatesBiochemical)對各個cDNA克隆的5’-末端測序而分別進(jìn)行鑒定。DNA序列如序列1所示，它與序列2所示的氨基酸序列相應(yīng)。酵母DNA的分離為了避免在待克隆的基因上出現(xiàn)PCR失誤，用標(biāo)準(zhǔn)方法從酵母質(zhì)粒中分離cDNA，例如，用WO93/11249的例1中所披露的方法，該文獻(xiàn)的內(nèi)容被收作本文的背景資料。將酵母DNA溶于50μl水中，使終濃度大約為100μl/ml。用標(biāo)準(zhǔn)方法將所述DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。從每次轉(zhuǎn)化中分離2個大腸桿菌菌落，并用以能裂解DNA插入片段的限制酶HindIII和XbaI進(jìn)行分析。將來自上述克隆之一的DNA再次轉(zhuǎn)化到酵母菌株JG169中。對幾個陽性克隆的DNA序列進(jìn)行部分測定。本發(fā)明木聚糖酶的DNA序列如序列1所示，該序列相應(yīng)于序列2所示的氨基酸序列。例2在曲霉屬中表達(dá)為了在曲霉屬中表達(dá)該基因，通過用HindIII/Xbal或其它合適的限制酶消化從上述克隆之一中分離cDNA，在凝膠上進(jìn)行大小分級和純化，然后連接到pHD414上，得到質(zhì)粒pA2XITI。在大腸桿菌中擴(kuò)增以后，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到米曲霉菌株中，轉(zhuǎn)化按照在上文的材料和方法部分中所披露的一般方法進(jìn)行。檢驗(yàn)米曲霉轉(zhuǎn)化體將各轉(zhuǎn)化體接種到10mlYPM培養(yǎng)基中。在30℃和250rpm的轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)3-5天，然后除去上清液。將10μl上清液加入在瓊脂板上打出的直徑為4mm的孔中，以測定木聚糖分解活性，在40℃下培養(yǎng)過夜，瓊脂板中含有0.2％AZCLTM木聚糖(MegazymeTM，Australia)，用具有合適pH的緩沖液配制而成。按上述方法鑒定木聚糖酶活性。某些轉(zhuǎn)化體的暈圈明顯大于米曲霉背景，這證實(shí)了木聚糖酶在米曲霉中能有效表達(dá)。選擇8個具有最大木聚糖酶活性的轉(zhuǎn)化體，接種并維持在YPG-瓊脂上。將所選擇的8個轉(zhuǎn)化體的每一個從YPG-瓊脂斜面接種到裝有FG-4和MDU-2培養(yǎng)基的500ml搖瓶中。發(fā)酵3-5天，充分振動以保證良好的通氣性，然后2000g離心培養(yǎng)液10分鐘，并分析上清液。將體積為15μl的每種上清液加入在0.1％AZCLTM木聚糖疊層凝膠(在直徑13cm的培養(yǎng)皿中盛有25ml)上打出的直徑為4mm的孔中。根據(jù)在培養(yǎng)中藍(lán)色暈圈的形成鑒定木聚糖酶活性。然后，在一種培養(yǎng)基中對木聚糖酶進(jìn)行發(fā)酵，培養(yǎng)基中含有作為碳源的麥芽糖糊精、作為氮源的尿素和酵母提取物。發(fā)酵是這樣進(jìn)行的將米曲霉宿主細(xì)胞的搖瓶培養(yǎng)物接種到含有3.5％碳源和0.5％氮源的培養(yǎng)基中。在pH5.0和34℃下培養(yǎng)24小時，然后開始連續(xù)補(bǔ)充額外的碳源和氮源。保持碳源為限制因子并確保有過量的氧氣。繼續(xù)培養(yǎng)4天，然后通過離心、超濾、澄清過濾和細(xì)菌過濾回收所述酶。例3純化實(shí)施例對來自例2所述表達(dá)重組酶的米曲霉發(fā)酵的培養(yǎng)上清液進(jìn)行離心，并通過0.2μm的濾膜過濾，以除去菌絲體。在配有3kDa膜的FiltronTMUltracette或AmiconTM超濾裝置上對100ml過濾的上清液進(jìn)行超濾，得到10倍濃縮液。在同一裝置上所進(jìn)行的連續(xù)兩輪超濾中用20mMTRIS，pH8.0將濃縮物稀釋100倍。以2ml/分的速度將上述超濾樣品加注到一個PharmaciaXK26/20FastFlowQSepharoseTM陰離子交換柱上，該交換柱在20mMTRIS，pH8.0中平衡。上樣以后，用2倍柱體積的25mMTRIS，pH8.0洗柱，并用在25mMTRIS，pH8.0中配制的從0到0.5MNaCl的線性增加的NaCl梯度洗脫結(jié)合蛋白。收集各級分，并按上述方法測定所述級分中的木聚糖酶活性。合并含有木聚糖酶的級分，并超濾濃縮于10mM檸檬酸鈉，pH4.0中。以1.5ml/分的速度將該材料加注到一個XK16/20FastFlowSSepharoseTM柱上。用0-0.4MNaCl的線性梯度洗脫所述酶，并合并含有木聚糖酶的級分，濃縮并用于鑒定和下述其它實(shí)驗(yàn)。例4酶鑒定對按照例3方法得到的木聚糖酶進(jìn)行以下的酶鑒定。SDS-PAGE電泳SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉/聚丙烯酰胺凝膠電泳)在一臺Mini-Leak4電泳裝置(Kem-En-Tec.，Copenhagen)上進(jìn)行，該方法為Laemmli方法(LaemmliUK；Nature1970，227，680-685；Christgau等，1991，J.Biol.Chem.1991，266p.21157-212664)的改進(jìn)形式。測得其分子量(MW)大約為26kDa。等電點(diǎn)聚焦等電點(diǎn)聚焦是在一臺MultiphorTM電泳裝置中，在AmpholineTMPAG板上，pH3.5-9.5(Pharmacia，Sweden)按照生產(chǎn)商的推薦進(jìn)行的。電泳以后，按照本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色。測得等電點(diǎn)(PI)大約為4.5。pH和溫度最佳值根據(jù)從AZCLTM樺木聚糖(Megazyme，Australia)中釋放的藍(lán)色測定酶促活性。將0.5ml0.4％AZCLTM底物與0.5ml合適pH的0.1M檸檬酸鹽/磷酸鹽緩沖液混合，并加入10μl適當(dāng)稀釋的酶溶液。在30℃下，在EppendorphThermomixer中培養(yǎng)15分鐘，然后在95℃下加熱20分鐘滅活。酶的培養(yǎng)做3個重復(fù)。作一個空白對照，其中加過酶但立即滅活。離心以后在620mm波長下在微量滴定板上測光吸收，并扣除空白對照的吸收值。將0.1M的不同pH的檸檬酸鹽/磷酸鹽緩沖液用于測定最佳pH值。將0.1M，pH5.5的檸檬酸鹽/磷酸鹽緩沖液在不同溫度下培養(yǎng)15分鐘，以便測定最佳溫度值。結(jié)果如圖1-2所示。圖1表示在30℃下，在pH2.5-9范圍內(nèi)測得的相對木聚糖分解活性(％)。從圖中可以看出，該酶的最佳pH值范圍為4.5-7.5，特別是在5.0-6.5的范圍內(nèi)，pH6左右。圖2表示在pH5.5和30-80℃的溫度范圍內(nèi)測得的相對木聚糖分解活性(％)。從圖中可以看出，溫度最佳值在50-70℃范圍內(nèi)，60℃左右。例5熱穩(wěn)定性比較在該實(shí)施例中，對按照例1-3所述方法獲得的單組分木聚糖酶制劑的熱穩(wěn)定性和天然疏綿狀高溫霉的木聚糖酶制劑的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了比較。天然疏綿狀高溫霉木聚糖酶按如下方法制備。將疏綿狀高溫霉菌株DSM4109在200lYPG培養(yǎng)基中接種24小時，該培養(yǎng)基的配方如下(g/l)酵母提取物，50％10葡萄糖5KH2PO43Na2HPO4，2H2O2FeSO40.25MgSO4，7H2O2Pluronic0.7調(diào)pH至6.0接種以后，將接種物加至2000l下列培養(yǎng)基中(g/l)，并再發(fā)酵3天酪蛋白酸鈉10大豆粉20Na2HPO4，2H2O3木聚糖3木糖500調(diào)pH至7.5離心除去細(xì)胞，并通過超濾(用10,000MW的截?cái)嗄?濃縮上清液，通過冷凍干燥將UF濃縮物轉(zhuǎn)化成粗制粉狀物。用pH6.0的100mM檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液稀釋上述制劑，以便在用于進(jìn)行下述酶促活性分析時該酶的活性在線性分析范圍內(nèi)。稀釋的樣品等分成2ml試樣，分別置于60、65、70和75℃的水浴中。對照保持在冰水中。培養(yǎng)60分鐘后將樣品取出并放入冰水中。將獲自山毛櫸的remazol-木聚糖作為底物(4-O-甲基-D-葡糖醛-D-木聚糖，用RemazolBrilliantBlueR，F(xiàn)luka染色)。用pH6.0的l00mM檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液溶解上述底物，制成0.5％(W/V)的溶液。為了測定殘余酶活性，將0.9ml底物加入4支試管(2個主值，2個空白)中，并在50℃的水浴中預(yù)熱5分鐘。t＝0時，將0.1ml的酶樣品加至所有組成主值的試管中并混合。60分鐘后，加入5ml乙醇試劑(150ml99.9％的乙醇與1ml2NHCl的混合物)終止培養(yǎng)，接著在Whirlimixer上搖10秒鐘。先向所有組成空白的試管中加入5ml乙醇試劑，接著再加入0.1ml酶樣品，并在Whirlimixer上搖10秒鐘。將所有試管在環(huán)境溫度下放置約15分鐘，然后以4,000rpm的速度離心10分鐘。最后，在585nm光波長下測光密度，將兩次測定的結(jié)果加以平均，并扣除空白值。作為培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間的函數(shù)測定的相對殘余酶活性，以對照值的百分比形式計(jì)算(對照值被定為“100％”)。結(jié)果如圖3所示。在圖中，對比給出了本發(fā)明單組分木聚糖酶制劑的殘余活性(空白柱)和天然疏綿狀高溫霉木聚糖酶制劑的殘余活性(影線柱)。給出了在pH6.0下，在60、65、70和75℃溫度下分別培養(yǎng)30和60分鐘以后的殘余活性。從圖中可以看出，本發(fā)明的木聚糖酶組分在pH6.0和60℃下培養(yǎng)60分鐘以后的殘余酶活性高于96％，尤其是高于97％，大致為100％。本發(fā)明的木聚糖酶組分在pH6.0和65℃下培養(yǎng)60分鐘后的殘余酶活性高于83％，特別是高于85％，尤其是高于90％，大致為100％。本發(fā)明的木聚糖酶組分在pH6.0和70℃下培養(yǎng)60分鐘以后的殘余酶活性高于20％，高于30％較好，高于40％更好，高于50％還要好，約為63％。本發(fā)明的木聚糖酶組分在pH6.0和75℃下培養(yǎng)60分鐘后的殘余酶活性高于9％，特別是高于10％，高于20％更好，高于30％還要好，約為48％。從圖中還可以看出，與天然疏綿狀高溫霉木聚糖酶制劑相比，本發(fā)明單組分木聚糖酶制劑的熱穩(wěn)定性明顯改善。本發(fā)明單組分木聚糖酶制劑在熱穩(wěn)定性方面出人預(yù)料的改善，除了使其可以作為優(yōu)良的飼料增強(qiáng)酶之外，還特別適于加入動物飼料添加劑中。當(dāng)加入動物飼料添加劑中時，該酶的熱穩(wěn)定性在防止微生物感染飼料方面起著重要作用。例6降低體外粘度業(yè)已證實(shí)前腸消化物粘度是影響小麥和大麥基烤雞飼料可消化性的主要營養(yǎng)制約因素。業(yè)已發(fā)現(xiàn)消化物粘度降低結(jié)果與雞飼料轉(zhuǎn)化效率之間的密切相關(guān)的關(guān)系(例如，參見GrahamH，BedfordM和ChoctM；Feedstuffs，1993，65(5)14-15)。在該實(shí)驗(yàn)中，分別檢驗(yàn)了用(i)按例1-3方法獲得的重組生產(chǎn)的單組分疏綿狀高溫霉木聚糖酶制劑，(ii)按例5方法培養(yǎng)獲得的天然疏綿狀高溫霉木聚糖酶制劑和(iii)通過培養(yǎng)Humicolainsolens獲得的市售多組分酶制劑(Bio-FeedPlusCT，NovoNordiskA/S的一種產(chǎn)品，Denmark)獲得的小麥粘度的降低。在t＝0時，將12g細(xì)度為1mm的磨碎的干小麥(“StatensHusdyrbrugsforsΦg”，F(xiàn)oulum，Denmark)與38ml萃取緩沖液混合，該緩沖液為pH1.5的0.5MHCl-KCl，保持在40℃并伴以持續(xù)攪拌。在培養(yǎng)期間，用錫泊覆蓋樣品。t＝89分鐘時，用1MNaOH調(diào)pH至6.0(±0.15)。當(dāng)t＝90分鐘時，加入總體積為40ml的酶溶液。對上述(i)-(iii)的酶制劑進(jìn)行稀釋，使酶的終濃度為0.16-5.19FXU/g小麥。所有的實(shí)驗(yàn)都作兩次，即，未加入任何酶的溶液總是包括在兩次實(shí)驗(yàn)內(nèi)。培養(yǎng)30分鐘之后，取樣進(jìn)行粘度測定。采用一臺BrookfieldLVDV-III粘度計(jì)，其裝配有一個小型樣品銜接頭和型號為SC4-31的錠子，在250rpm時相當(dāng)于剪切速度為85S-1。在每次測定時，將約13ml懸浮液迅速注入所述小型樣品銜接頭中，該接頭被置于水套管中，由恒溫水將其加熱至40℃。進(jìn)行3次獨(dú)立的cP讀數(shù)，每次15秒，采用平均值。在任何情況下加酶所獲得的結(jié)果資料都是以相對粘度形式表示，即相對于在對照樣品中測得的粘度，將其定為“1”。在圖4中，給出了(ii)天然疏綿狀高溫霉木聚糖酶，劑量為0.16、0.32、0.65、1.29和2.58FXU/g小麥的小麥粘度降低效率(·)和(iii)通過培養(yǎng)Humicolainsolens獲得的多組分酶制劑，劑量為0.32、0.65、1.29、2.58和5.19FXU/g小麥的小麥粘度降低效率(×)的對比。以圖中可以看出，與通過培養(yǎng)Humicolainsolens獲得的多組分酶制劑(iii)相比，天然疏綿狀高溫霉木聚糖酶(ii)能明顯降低小麥懸浮液的粘度，以FXU為基礎(chǔ)計(jì)算。另外，在圖5中，對(i)重組生產(chǎn)的單組分疏綿狀高溫霉木聚糖酶(I)和(ii)天然疏綿狀高溫霉木糖酶(II)之間的小麥粘度降低效率進(jìn)行了比較。結(jié)果是基于兩種類似的劑量，0.65和2.58FXU/g小麥。從圖中可以看出，對小麥懸浮液粘度的影響十分相似?？v觀該實(shí)施例，可以明顯看出，與現(xiàn)有飼料添加劑相比，源于疏綿狀高溫霉的木聚糖酶具有卓越的降低小麥懸浮液粘度的能力，因此，具有作為飼料增強(qiáng)酶的巨大潛力。例7疏綿狀高溫霉木聚糖酶作為飼料增強(qiáng)酶在該實(shí)施例中，將疏綿狀高溫霉單組分木聚糖酶制劑加入動物飼料中并與常規(guī)消化性增強(qiáng)酶制劑進(jìn)行比較。按例1-3的方法獲得單組分木聚糖酶制劑。參比制劑為現(xiàn)有的飼料添加劑，即一種通過培養(yǎng)Humicolainsolens而獲得的多組分酶制劑(Bio-FeedPlusCT，NovoNordiskA/S的一種產(chǎn)品，Denmark)。用有和沒有酶的實(shí)驗(yàn)飼料飼養(yǎng)適于烤制的小雞3周。飼料的配方如下列表1所示。將動物分成5個大組，并進(jìn)行5種不同的處理。每一大組又分成由30只小雞(每種性別各15只)組成的8個小組(籠)。分別對每小組(籠)稱重。5種不同的處理中包括無酶的對照處理和如下的加酶處理參比制劑為400和800FXU/kg飼料(Ref)，本發(fā)明的單組分木聚糖酶制劑為200和400FXU/kg飼料(Inv.)。表1飼料配方</tables>對初生的小雞開始進(jìn)行處理。處理3周以后測定重量增加和飼料的消耗，并計(jì)算飼料轉(zhuǎn)化率(FCR)，參見下面的表2(其中，給出了3周齡小雞的重量和飼料的攝入量)。從表2中可以看出，在接受200FXU/kg飼料的本發(fā)明酶制劑(Inv.)的組中FCR降低，其參比對象為對照組和接受400FXU參比制劑(Ref.)的組。不過，使用200FXU的本發(fā)明酶制劑后計(jì)算出的FCR與使用800FXU參比制劑后計(jì)算出的FCR處于同一水平，這表明，與參比制劑相比，本發(fā)明的酶制劑在其1/4FXU的劑量水平上有相同的效果。因此，本發(fā)明的酶被認(rèn)為在改善飼料的可消化性方面比參比制劑的效果好。盡管本發(fā)明的制劑是一種單組分制劑，但它與現(xiàn)有飼料添加劑相比具有卓越的提高可消化性的能力，它能產(chǎn)生多種酶組分的作用。表20-3周的產(chǎn)量參數(shù)</tables>例8提高雞飼料中小麥的可代謝能量該實(shí)施例對本發(fā)明的兩種動物飼料添加劑和現(xiàn)有飼料添加劑對小麥的表現(xiàn)可代謝能(AME)值進(jìn)行了比較。本發(fā)明的兩種動物飼料添加劑為(A)按照例1-3中所述的重組DNA技術(shù)所獲得的疏綿狀高溫霉單組分木聚糖酶制劑，和(B)通過例5方法獲得的天然疏綿狀高溫霉木聚糖酶制劑?，F(xiàn)有的飼料添加劑為通過培養(yǎng)Humicolainsolens獲得的一種多組分酶制劑(C)(Bio-FeedPlusCT，NovoNordiskA/S的一種產(chǎn)品，Denmark)。使用從市售孵化器中輸出的初生雄性Ross烤雞。第1-16天用一種市售幼雛飼料飼養(yǎng)。在第16天時單獨(dú)稱重。將體重太大或太小的小雞剔除，并將其余的安置到成組的籠中。第16-23天在籠中飼養(yǎng)。從第24-28天進(jìn)行平衡試驗(yàn)，試驗(yàn)按照體內(nèi)測定可代謝能AME的EuropeanReferenceMethod進(jìn)行(Bourdillon等，Br.Pouly.Sci.1990，31，557-565)。該試驗(yàn)包括9種處理的5個重復(fù)，每個重復(fù)4只烤雞。基礎(chǔ)飼料中含有56％高梁、32.5％大豆粉、6％動物脂肪、1％大豆油和5％礦物質(zhì)、維生素、微量元素和氨基酸。在實(shí)驗(yàn)飼料中，1/2基礎(chǔ)飼料被小麥所取代。用醪液含量為90％的飼料飼養(yǎng)這些雞，讓雞任意攝食。每日定量收集排泄物。分析飼料樣品和凍干的排泄物中的脂肪、總能量(GE)和氮。由其相應(yīng)的排泄物/飼料比及其相應(yīng)的GE含量計(jì)算飼料的AME含量。用保留的34.36kJ/gN的能量當(dāng)量將N-保留量校正為0(AMEn)。從飼料和凍干的排泄物中提取脂肪測定脂肪的可消化性，考慮了排泄物/飼料比。通過對用LSD-多范圍試驗(yàn)確認(rèn)為顯著差異的方差進(jìn)行單因子分析，分析所述結(jié)果，采用Statgraphics5版。結(jié)果示于下面的表3和圖6-7中。圖6表示作為木聚糖酶加入量(FXU/kg飼料)函數(shù)的小麥AMEn值(MJ/kg)(A)疏綿狀高溫霉單組分木聚糖酶制劑；(B)天然疏綿狀高溫霉木聚糖酶制劑；(C)參比物(Bio-FeedPlusCT，NovoNordiskA/S的一種產(chǎn)品，Denmark；一種通過培養(yǎng)Humicolainsolens獲得的多組分酶制劑)。圖7表示實(shí)驗(yàn)飼料中的脂肪消化率(％)，其作為木聚糖酶添加量(FXU/kg飼料)的函數(shù)；(A)疏綿狀高溫霉單組分木聚糖酶制劑；(B)天然疏綿狀高溫霉木聚糖酶制劑；(C)參比物(Bio-FeedPlusCT，NovoNordiskA/S的一種制品，Denmark；一種通過培養(yǎng)Hunicolainsolens獲得的多組分酶制劑)。用200FXU/kg飼料的(A)或(B)補(bǔ)充基礎(chǔ)飼料，會導(dǎo)致AMEn平均值以及脂肪消化率的較小的增加和無明顯增加(見表3)。結(jié)果，在計(jì)算小麥的AMEn值時，無須對木聚糖酶對基礎(chǔ)成分的活性進(jìn)行校正。在實(shí)驗(yàn)飼料中，(A)和(B)的劑量為100和200FXU/kg飼料，而(C)的劑量為400FXU/kg飼料。從表3中可以看出，與僅用實(shí)驗(yàn)飼料相比，兩種劑量的本發(fā)明動物飼料添加劑都能明顯提高AMEn。加入本發(fā)明的酶后，可將小麥的AMEn值提高4.9-8.6％。參比添加劑(C)能將小麥的AMEn提高4.9％。通過比較本發(fā)明的動物飼料添加劑和現(xiàn)有添加劑可以清楚地看出，以FXU基重為劑量計(jì)，本發(fā)明動物飼料添加劑的表現(xiàn)明顯優(yōu)于參比添加劑的。200FXU/kg(B)明顯好于400FXU/kg(C)。實(shí)驗(yàn)飼料的脂肪消化率與AMEn值的變化形式類似。表3序列表序列1資料(i)序列特征(A)長度983bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(vi)起源(A)生物疏綿狀高溫霉(B)菌株DSM4109(ix)特征(A)名稱/鍵詞CDS(B)位置31..705(xi)序列描述序列1TCGGCCCGACGTCTTGCAATCCTTGCAGTGATGGTCGGCTTTACCCCCGTTGCC54MetValGlyPheThrProValAla15CTTGCGGCCTTAGCCGCGACTGGGGCCCTGGCCTTCCCGGCAGGGAAT102LeuAlaAlaLeuAlaAlaThrGlyAlaLeuAlaPheProAlaGlyAsn101520GCCACGGAGCTCGAAAAGCGACAGACAACCCCCAACTCGGAGGGCTGG150AlaThrGluLeuGluLysArgGlnThrThrProAsnSerGluGlyTrp25303540CACGATGGTTATTACTATTCCTGGTGGAGTGACGGTGGAGCGCAGGCC198HisAspGlyTyrTyrTyrSerTrpTrpSerAspGlyGlyAlaGlnAla455055ACGTACACCAACCTGGAAGGCGGCACCTACGAGATCAGCTGGGGAGAT246ThrTyrThrAsnLeuGluGlyGlyThrTyrGluIleSerTrpGlyAsp606570GGCGGTAACCTCGTCGGTGGAAAGGGCTGGAACCCCGGCCTGAACGCA294GlyGlyAsnLeuValGlyGlyLysGlyTrpAsnProGlyLeuAsnAla758085AGAGCCATCCACTTTGAGGGTGTTTACCAGCCAAACGGCAACAGCTAC342ArgAlaIleHisPheGluGlyValTyrGlnProAsnGlyAsnSerTyr9095100CTTGCGGTCTACGGTTGGACCCGCAACCCGCTGGTCGAGTATTACATC390LeuAlaValTyrGlyTrpThrArgAsnProLeuValGluTyrTyrIle105110115120GTCGAGAACTTTGGCACCTATGATCCTTCCTCCGGTGCTACCGATCTA438ValGluAsnPheGlyThrTyrAspProSerSerGlyAlaThrAspLeu125130135GGAACTGTCGAGTGCGACGGTAGCATCTATCGACTCGGCAAGACCACT486GlyThrValGluCysAspGlySerIleTyrArgLeuGlyLysThrThr140145150CGCGTCAACGCACCTAGCATCGACGGCACCCAAACCTTCGACCAATAC534ArgValAsnAlaProSerIleAspGlyThrGlnThrPheAspGlnTyr155160165TGGTCGGTCCGCCAGGACAAGCGCACCAGCGGTACCGTCCAGACGGGC582TrpSerValArgGlnAspLysArgThrSerGlyThrValGlnThrGly170175180TGCCACTTCGACGCCTGGGCTCGCGCTGGTTTGAATGTCAACGGTGAC630CysHisPheAspAlaTrpAlaArgAlaGlyLeuAsnValAsnGlyAsp185190195200CACTACTACCAGATCGTTGCAACGGAGGGCTACTTCAGCAGCGGCTAT678HisTyrTyrGlnIleValAlaThrGluGlyTyrPheSerSerGlyTyr205210215GCTCGCATCACCGTTGCTGACGTGGGCTAAGACGTAACCTGGTGGTG725AlaArgIleThrValAlaAspValGly220225ATCTCGCGAGGCAACAGCCAAGAATGTCGTCAGATGTGCCGGTTGAAGGTATTCAATCAG785CATATCTGTCTGCCCTTGCGAGTGATACTTTGGAGGACTGTGGAGAACTTTGTGCGAGCC845TGGCCAGGATCAGTAGTTGCTTTGCGGTGTTTTGCTCCCTATTCTCGTGAAAAAATTGTT905ATTGCTTCGTTGTCTAGTGTACATAGCCGAGCAATTGAGGCCTCACGCTTGGGAAAAAAA965AAAAAAAAAAAAAAAAAA983序列2資料(i)序列特征(A)長度225個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)；線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述序列2MetValGlyPheThrProValAlaLeuAlaAlaLeuAlaAlaThrGly151015AlaLeuAlaPheProAlaGlyAsnAlaThrGluLeuGluLysArgGln202530ThrThrProAsnSerGluGlyTrpHisAspGlyTyrTyrTyrSerTrp354045TrpSerAspGlyGlyAlaGlnAlaThrTyrThrAsnLeuGluGlyGly505560ThrTyrGluIleSerTrpGlyAspGlyGlyAsnLeuValGlyGlyLys65707580GlyTrpAsnProGlyLeuAsnAlaArgAlaIleHisPheGluGlyVal859095TyrGlnProAsnGlyAsnSerTyrLeuAlaValTyrGlyTrpThrArg100105110AsnProLeuValGluTyrTyrIleValGluAsnPheGlyThrTyrAsp115120125ProSerSerGlyAlaThrAspLeuGlyThrValGluCysAspGlySer130135140IleTyrArgLeuGlyLysThrThrArgValAsnAlaProSerIleAsp145150155160GlyThrGlnThrPheAspGlnTyrTrpSerValArgGlnAspLysArg165170175ThrSerGlyThrValGlnThrGlyCysHisPheAspAlaTrpAlaArg180185190AlaGlyLeuAsnValAsnGlyAspHisTyrTyrGlnIleValAlaThr195200205GluGlyTyrPheSerSerGlyTyrAlaArgIleThrValAlaAspVal210215220Gly225INDICATIONSRELATNGTOADEPOSITEDMICROORGANISM(PCTRule13bis)權(quán)利要求1.一種動物飼料添加劑，該添加劑含有一種單組分木聚糖酶，該木聚糖酶源于腐質(zhì)霉屬菌株、嗜熱子囊菌屬菌株、毛殼菌屬菌株、毛霉屬菌株、藍(lán)霉菌屬菌株、Malbranchea屬菌株、毀絲霉屬菌株、梭孢殼屬菌株、絲衣霉屬菌株、或擬青霉屬菌株。2.如權(quán)利要求1的動物飼料添加劑，其中，所述單組分木聚糖酶源于高溫霉屬菌株。3.如權(quán)利要求2的動物飼料添加劑，其中，所述單組分木聚糖酶源于疏綿狀高溫霉菌株。4.如權(quán)利要求3的飼料添加劑，其中，所述單組分木聚糖酶源于疏綿狀高溫霉菌株DSM4109或其突變體或突變型。5.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的飼料添加劑，其中，所述單組分木聚糖酶的免疫化學(xué)特性相同于或部分相同于下列純化木聚糖酶的免疫化學(xué)特性，該純化木聚糖酶或a)源于疏綿狀高溫霉菌株DSM4109；或b)由序列1所示的DNA序列編碼；或c)由可從釀酒酵母菌株DSM10133中的質(zhì)粒獲得的DNA序列編碼。6.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的飼料添加劑，其中，所述單組分木聚糖酶源于一種帶有編碼所述木聚糖酶組分的基因的宿主細(xì)胞。7.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的飼料添加劑，其中，所述單組分木聚糖酶是a)由序列1所示DNA序列編碼，或由可從釀酒酵母菌株DSM10133中的質(zhì)粒獲得的DNA序列編碼；或b)由類似于序列1所示DNA序列的木聚糖酶編碼部分或類似于可從釀酒酵母菌株DSM10133中的質(zhì)粒獲得的DNA序列的DNA序列編碼，該類似DNA序列或i)同源于序列1所示DNA序列的木聚糖酶編碼部分，或同源于可從釀酒酵母菌株DSM10133中的質(zhì)粒獲得的DNA序列；或ii)能與同序列1所示DNA序列的木聚糖酶編碼部分相同的寡核苷酸探針雜交，或與可從釀酒酵母菌株DSM10133中的質(zhì)粒獲得的DNA序列雜交；或iii)能編碼一種多肽，該多肽與由序列1所示DNA序列編碼的多肽或與可從釀酒酵母菌株DSM10133中的質(zhì)粒獲得的DNA序列的同源性至少為70％；或iv)能編碼一種多肽，該多肽能與抗純化木聚糖酶的抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)，該純化木聚糖酶源于疏綿狀高溫霉菌株DSM4109或由序列1所示DNA序列或可從釀酒酵母菌株DSM10133中的質(zhì)粒獲得的DNA序列編碼。8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的飼料添加劑，其中，所述單組分木聚糖酶的其它特征為在pH6.0和60℃下培養(yǎng)60分鐘后的殘余酶活性高于96％。9.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的飼料添加劑，其中，所述單組分木聚糖酶的其它特征為在pH6.0和65℃下培養(yǎng)60分鐘后的殘余酶活性高于83％。10.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的飼料添加劑，其中，所述單組分木聚糖酶的其它特征為在pH6.0和70℃下培養(yǎng)60分鐘后的殘余酶活性高于20％。11.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的飼料添加劑，其中，所述單組分木聚糖酶的其它特征為在pH6.0和75℃下培養(yǎng)60分鐘后的殘余酶活性高于10％。12.如權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的飼料添加劑，其含有一種或幾種其它的飼料增強(qiáng)酶。13.如權(quán)利要求12的飼料添加劑，其含有一種或幾種其它的飼料增強(qiáng)酶，所述酶選自α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、植酸酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶和蛋白酶。14.如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的飼料添加劑，以干組合物形式提供，優(yōu)選為包衣或未包衣的顆粒，或以穩(wěn)定化液體組合物形式提供，優(yōu)選為水基或油基組合物。15.一種單組分木聚糖酶制劑，其中，木聚糖酶組分源于腐質(zhì)霉屬菌株、嗜熱子囊菌屬菌株、毛殼菌屬菌株、毛霉屬菌株、藍(lán)霉菌屬菌株、Malbranchea屬菌株、毀絲霉屬菌株、梭孢殼屬菌株、絲衣霉屬菌株或擬青霉屬菌株。16.如權(quán)利要求15的單組分木聚糖酶制劑，其中，所述木聚糖酶組分源于高溫霉屬菌株。17.如權(quán)利要求16的單組合木聚糖酶制劑，其中，所述木聚糖酶組分源于疏綿狀高溫霉菌株。18.如權(quán)利要求17的單組分木聚糖酶制劑，其中，所述木聚糖酶組分源于疏綿狀高溫霉菌株DSM4109或其突變體或突變型。19.如權(quán)利要求15-18中任一項(xiàng)的單組分木聚糖酶制劑，其中，所述木聚糖酶組分的免疫化學(xué)特性相同于或部分相同于一種純化木聚糖酶的免疫化學(xué)特性，所述純化木聚糖酶或a)源于疏綿狀高溫霉菌株DSM4109；或b)由序列1所示DNA序列編碼；或c)由可從釀酒酵母菌株DSM10133中的質(zhì)粒獲得的DNA序列編碼。20.如權(quán)利要求15-19中任一項(xiàng)的單組分木聚糖酶制劑，其中，所述木聚糖酶組分源于一種帶有編碼該木聚糖酶組分的基因的宿主細(xì)胞。21.如權(quán)利要求22的單組分酶制劑，其中，所述木聚糖酶組分是a)由序列1所示DNA序列編碼，或由可從釀酒酵母菌株DSM10133中的質(zhì)粒獲得的DNA序列編碼；或b)由類似于序列1所示DNA序列的木聚糖酶編碼部分或類似于可從釀酒酵母菌株DSM10133中的質(zhì)粒獲得的DNA序列的DNA序列編碼，該類似DNA序列或i)同源于序列1所示DNA序列的木聚糖酶編碼部分，或同源于可從釀酒酵母菌株DSM10133中的質(zhì)粒獲得的DNA序列；或ii)能與和序列1所示DNA序列的木聚糖酶編碼部分相同的寡核苷酸探針雜交，或與可從釀酒酵母菌株DSM10133中的質(zhì)粒獲得的DNA序列雜交；或iii)能編碼一種多肽，該多肽與由序列1所示DNA序列編碼的多肽或可從釀酒酵母菌株DSM10133中的質(zhì)粒獲得的DNA序列的同源性至少為70％；或iv)能編碼一種多肽，該多肽能與抗純化木聚糖酶的抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)，該純化木聚糖酶源于疏綿狀高溫霉菌株DSM4109或由序列1所示DNA序列或可從釀酒酵母菌株DSM10133中的質(zhì)粒獲得的DNA序列編碼。22.如權(quán)利要求15-21中任一項(xiàng)的單組分木聚糖酶制劑，其中，所述木聚糖酶組分在pH6.0和60℃下培養(yǎng)60分鐘后的殘余酶活性高于96％。23.如權(quán)利要求15-21中任一項(xiàng)的單組分木聚糖酶制劑，其中，所述木聚糖酶組分在pH6.0和65℃下培養(yǎng)60分鐘后的殘余酶活性高于83％。24.如權(quán)利要求15-21中任一項(xiàng)的單組分木聚糖酶制劑，其中，所述木聚糖酶組分在pH6.0和70℃下培養(yǎng)60分鐘后的殘余酶活性高于20％。25.如權(quán)利要求15-21中任一項(xiàng)的單組分木聚糖酶制劑，其中，所述木聚糖酶組分在pH6.0和75℃下培養(yǎng)60分鐘后的殘余酶活性高于10％。26.一種DNA結(jié)構(gòu)，含有編碼一種木聚糖酶組分的DNA序列，該DNA序列包括a)序列1所示DNA序列的木聚糖酶編碼部分，或可從釀酒酵母菌株DSM10133中的質(zhì)粒獲得的DNA序列；或b)類似于序列1所示DNA序列的木聚糖酶編碼部分或類似于可從釀酒酵母菌株DSM10133中的質(zhì)粒獲得的DNA序列的DNA序列，該類似DNA序列或i)同源于序列1所示DNA序列的木聚糖酶編碼部分，或同源于可從釀酒酵母菌株DSM10133中的質(zhì)粒獲得的DNA序列；或ii)能與和序列1所示DNA序列的木聚糖酶編碼部分相同的寡核苷酸探針雜交，或與可從釀酒酵母菌株DSM10133中的質(zhì)粒中獲得的DNA序列雜交；或iii)能編碼一種多肽，該多肽與由序列1所示DNA序列編碼的多肽或可從釀酒酵母菌株DSM10133中的質(zhì)粒獲得的DNA序列的同源性至少為70％；或iv)能編碼一種多肽，該多肽能與抗純化木聚糖酶的抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)，該純化木聚糖酶源于疏綿狀高溫霉菌株DSM4109或由序列1所示DNA序列或可從釀酒酵母菌株DSM10133中的質(zhì)粒獲得的DNA序列編碼。27.如權(quán)利要求26的DNA結(jié)構(gòu)，其中，所述編碼木聚糖酶組分的DNA序列源于腐質(zhì)霉屬菌株、嗜熱子囊菌屬菌株、毛殼菌屬菌株、毛霉屬菌株、藍(lán)霉菌屬菌株、Malbranchea屬菌株、毀絲霉屬菌株、梭孢殼屬菌株、絲衣霉屬菌株或擬青霉屬菌株。28.如權(quán)利要求27的DNA結(jié)構(gòu)，其中，所述編碼木聚糖酶組分的DNA序列源于高溫霉屬菌株。29.如權(quán)利要求28的DNA結(jié)構(gòu)，其中，所述編碼木聚糖酶組分的DNA序列源于疏綿狀高溫霉菌株。30.如權(quán)利要求29的DNA結(jié)構(gòu)，其中，所述DNA序列源于疏綿狀高溫霉DSM4109或其突變體或突變型的DNA文庫或由其產(chǎn)生。31.一種重組表達(dá)載體，含有權(quán)利要求26-30中任一項(xiàng)的DNA結(jié)構(gòu)。32.一種宿主細(xì)胞，含有權(quán)利要求26-30中任一項(xiàng)的DNA結(jié)構(gòu)或權(quán)利要求31的重組表達(dá)載體。33.如權(quán)利要求32的宿主細(xì)胞，它是一種真核細(xì)胞，特別是真菌細(xì)胞，優(yōu)選為酵母細(xì)胞或絲狀真菌細(xì)胞。34.如權(quán)利要求32的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞屬于曲霉屬菌株，特別是黑曲霉或米曲霉菌株。35.一種生產(chǎn)權(quán)利要求15-25的單組分木聚糖酶制劑的方法，該方法包括在適于所述木聚糖酶組分產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求32-34中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，然后從培養(yǎng)物中回收所述木聚糖酶組分。全文摘要本發(fā)明涉及動物飼料添加劑,設(shè)添加劑含有一種單組分木聚糖酶,該木聚糖酶源于腐質(zhì)霉屬菌株、嗜熱子囊菌屬菌株、毛殼菌屬菌株、毛霉屬菌株、藍(lán)霉菌屬菌株、Malbranchea屬菌株、毀絲霉屬菌株、梭孢殼屬菌株、絲衣霉屬菌株或擬青霉屬菌株。本發(fā)明的其它方面涉及單組分木聚糖酶制劑、DNA結(jié)構(gòu)、重組表達(dá)載體、宿主細(xì)胞、以及生產(chǎn)單組分木聚糖酶制劑的方法。文檔編號C12N15/00GK1169752SQ9619160公開日1998年1月7日申請日期1996年1月26日優(yōu)先權(quán)日1995年1月26日發(fā)明者P·K·漢森,P·瓦格爾,A·穆勒特茨,I·H·克納普申請人:諾沃挪第克公司