一種全食副球菌菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物及用途，具體地說是一種全食副球菌菌株及其在含吡啶廢水治 理中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 啦啶（/yrii/ifle)是含有一個(gè)氮原子的六元雜環(huán)化合物，屬難降解有機(jī)污染物；其 分子式為C5H5N，易燃，有害。吡啶存在于煤焦油中，在化工行業(yè)常用作原料和溶劑。吡啶毒 性大，吸入就能夠?qū)θ梭w產(chǎn)生危害，還會(huì)對(duì)眼及上呼吸道產(chǎn)生刺激作用，嚴(yán)重時(shí)會(huì)麻醉中樞 神經(jīng)系統(tǒng)。
[0003] 吡啶在醫(yī)藥和農(nóng)藥領(lǐng)域使用較為廣泛，多用于制造維生素、抗組胺類藥、除草劑及 塑料等。吡啶是?；磻?yīng)的優(yōu)良溶劑，還能夠以絡(luò)合物的形式催化一些氧化反應(yīng)、聚合反應(yīng) 和羰基化的反應(yīng)。隨著吡啶需求量的增加，吡啶的排放量勢(shì)必增長(zhǎng)，含吡啶的廢水如不經(jīng)過 任何處理而隨意排放，不但會(huì)對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染，更會(huì)影響人類健康。目前，現(xiàn)有技術(shù)中 對(duì)含吡啶的廢水的處理主要采用物理化學(xué)法。如CN 105000616 A公開了一種廢水中殘余 吡啶的去除方法，是采用氣體吹脫方法將空氣通入含吡啶廢水中，使廢水中的殘余吡啶由 液相轉(zhuǎn)為氣相，然后收集含吡啶氣體用RT0焚燒爐焚燒。該方法利用吹脫法將空氣通入廢 水中，改變有機(jī)物吡啶溶解于水中所建立的平衡關(guān)系，將水相中的吡啶轉(zhuǎn)移到氣相中，使吡 啶鹽轉(zhuǎn)化為吡啶，收集吹脫出的含吡啶空氣采用RT0焚燒爐焚燒處理，氣相中的吡啶經(jīng)焚 燒后氧化成水、二氧化碳和二氧化氮排放于大氣中。該方法去除效率較高，從根本上去除了 廢水中的吡啶，消除了環(huán)境污染；但是存在需要專門的焚燒設(shè)備、碳排量較高、處理過程能 耗大、成本高、焚燒過程具有較大的安全隱患等弊端?？梢?，我們非常有必要探究更為安全、 環(huán)保、實(shí)用的降解處理方法。與物理化學(xué)方法相比，生物降解法可實(shí)現(xiàn)無害化治理，具有處 理量大，成本低，條件溫和，不產(chǎn)生二次污染等特點(diǎn)，是目前應(yīng)用最廣、最有效的降解有害物 質(zhì)的處理方法，但是生物降解法的有效性往往取決于高效降解菌株，因此，從自然環(huán)境中篩 選得到能夠去除吡啶的有效菌種并將其應(yīng)用于工業(yè)廢水的處理中將具有十分重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的之一是提供一種全食副球菌菌株，以期高效降解廢水中含有的吡啶 有害物質(zhì)，為采用生物降解法治理含吡啶廢水提供基礎(chǔ)；本發(fā)明的目的之二是提供一種降 解廢水中吡啶的方法，以解決現(xiàn)有方法處理廢水中的吡啶存在成本高、處理過程復(fù)雜以及 存在安全隱患的問題。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種全食副球菌菌株，所述菌株保藏 名稱是全食副球菌/Λ3Λ ?ο B21 -3，該菌株保藏于中國(guó)微生物菌種保藏 管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期為2015年10月9日，保藏編號(hào)為CGMCC Ν0. 11474 ; 保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
[0006] 本發(fā)明所述的全食副球菌B21-3的細(xì)胞形態(tài)為球形，菌落呈淡粉色，表面粘質(zhì)，邊 緣整齊，易挑起；為革蘭氏陰性細(xì)菌，其氧化酶和接觸酶為陽性；甲基紅和VP試驗(yàn)結(jié)果呈陰 性。
[0007] 本發(fā)明所述全食副球菌jOawioiTOjOAiAs·) B21-3 米用細(xì)菌 16S rRNA 基 因通用引物27f和1492r對(duì)16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)北京寶銳通生物技術(shù) 有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，其16S rRNA基因序列如SEQ ID N0:1所示；測(cè)定結(jié)果提交GenBank 數(shù)據(jù)庫經(jīng)Blast同源性比對(duì)，結(jié)果表明全食副球菌（/kracocciA? 的 16S rRNA基因序列與全食副球菌ATCC355121")的同源性為 99. 49%〇
[0008] 本發(fā)明提供的全食副球菌（/kracocciA? /Λ3/7 ?ο B21 -3將實(shí)驗(yàn)證明其能 以吡啶為唯一碳源、氮源進(jìn)行生長(zhǎng)，并將其氧化為氨氮，由此完成了全食副球全食副球菌 (/Λ3/7 ?ο B21-3 在降解吡啶中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明提供的全食副球菌（/^aracocciA? /Λ3/7 ?ο Β21 -3具有Ρ比啶降解作用， 其生長(zhǎng)速度快、長(zhǎng)勢(shì)好、穩(wěn)定期長(zhǎng)，同時(shí)在降解過程中對(duì)高濃度底物有較強(qiáng)的耐受性，遺傳 穩(wěn)定性好，降解率高。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種降解廢水中吡啶的方法，將保藏名稱為全食副球菌Β21-3的 種子液加入到含有吡啶的廢水中，于pH值為6-8、20-42°C的條件下靜置或振蕩降解2-4天； 所述全食副球菌（/bracocciA? /Λ3/7?ο?7?/7Α?/6·)Β21-3保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員 會(huì)普通微生物中心，保藏日期為2015年10月9日，保藏編號(hào)為CGMCC Ν0. 11474 ;保藏地址 是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
[0011] 本發(fā)明所述的降解廢水中吡啶的方法中使用的全食副球菌B21-3的種子液的菌 種優(yōu)選為全食副球菌B21-3經(jīng)過濃度由100mg/L逐漸增大到1000mg/L的吡啶馴化后的菌 種。
[0012] 本發(fā)明更為優(yōu)選的降解方式為振蕩降解，振蕩速率為180rpm。
[0013] 本發(fā)明提供的降解廢水中吡啶的方法中所述全食副球菌B21-3的種子液是將菌 株全食副球菌B21-3或高濃度的吡啶馴化后的菌株全食副球菌B21-3接種于LB液體培養(yǎng) 基，30°C，180 r/min培養(yǎng)2d，將培養(yǎng)液在10000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，棄去上清液，洗滌 菌體2-3次，將菌體重懸于無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，即得種子液；特別地，當(dāng)所述廢水中吡啶 的濃度優(yōu)選為< l〇〇mg/L，所述馴化后的全食副球菌B21-3的種子液每mL的懸浮液中的活 性菌為10s個(gè)，其接種量為含吡啶廢水重量的8-10% ;在優(yōu)選降解溫度為25-32°C，更優(yōu)選為 32°C ;優(yōu)選pH值為7時(shí)，其菌株對(duì)吡啶的降解率可達(dá)90%以上。
[0014] 本發(fā)明提供的降解廢水中吡啶的方法，操作簡(jiǎn)單，不僅能夠?qū)U水中的吡啶高效 分解掉，而且不會(huì)造成進(jìn)一步的污染，有效解決了現(xiàn)有技術(shù)中處理廢水中吡啶的需要專門 的處理設(shè)備、成本高以及存在安全隱患的問題。
【附圖說明】
[0015] 圖1為篩選的全食副球菌B21-3的平板菌落圖。
[0016] 圖2為篩選的全食副球菌B21-3的革蘭氏染色圖。
[0017] 圖3為溫度對(duì)全食副球菌B21-3生長(zhǎng)的影響。
[0018] 圖4為溫度對(duì)全食副球菌Β21-3降解吡啶的影響。
[0019] 圖 5 為 pH 對(duì)全食副球菌（/taracocciAS1 B21-3 生長(zhǎng)的影響。
[0020] 圖6為pH對(duì)全食副球菌（/^aracocciA? jOaoioiro/^iAs·) B21-3降解吡啶的影響。
[0021] 圖7為馴化和未馴化的全食副球菌（/^aracocciA? jOawioiro/^iAs·) B21-3降解P比啶 的結(jié)果。
[0022] 圖8為菌株連續(xù)傳代15代對(duì)全食副球菌（/^aracocciA? /Λ3/7?ο?7?/7Α?/6·)Β21-3降解 吡啶的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面實(shí)施例用于進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
[0024] 實(shí)施例 1 :全食副球菌（/^aracocciA? Β21-3 的篩選。
[0025] (1)培養(yǎng)基的配制 無機(jī)鹽培養(yǎng)基的配制：先稱取 NaH2P04 1. 42 g、ΚΗ2Ρ04 1. 36 g、MgS04 · 7H20 0. 216 g、 CaCl2 0.006 g，混合，得無機(jī)鹽混合物；按如下配方配制微量元素混合液：MnS04*H20 1.69 g/L，CoCl2 · 6H20 0· 24 g/L，Η3Β301· 16 g/L，Na2Mo04 · 2H20 0· 024 g/L，F(xiàn)eS04 · 7H20 2. 78 g/L，ZnS04 · 7H20 1. 15 g/L，CuS04 · 5H20 0. 38 g/L ;吸取 1 mL 微量元素混合液加入到無機(jī) 鹽混合物中，蒸餾水定容至1000 mL，pH 7. 0-7. 2,經(jīng)有機(jī)濾膜（0. 22 μ m)過濾除菌后即得 無機(jī)鹽培養(yǎng)基。
[0026] 吡啶無機(jī)鹽培養(yǎng)基的配制：在上述無機(jī)鹽培養(yǎng)基加入吡啶，使培養(yǎng)基中吡啶含量 為 100、200、300、400、500、600、700、800、900 或 1000 mg/L，經(jīng)有機(jī)濾膜（0· 22 μπι)過濾除 菌后即得吡啶無機(jī)鹽培養(yǎng)基。
[0027] (2)菌株的分離：采集石家莊某污水處理廠曝氣池的活性污泥10 g，加入到100 mL 吡啶含量為100 mg/L的吡啶無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在30°C、180 r/min培養(yǎng)5 d后，吸取5 mL 的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)接至相同濃度的吡啶無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，連續(xù)轉(zhuǎn)接3次；用生理鹽水將富集后的 培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，分別稀釋至10 4、10 5、10 6倍，充分震蕩，再從每個(gè)濃度的稀釋液中分 別吸取200 μ L菌懸液，涂布于吡啶無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，每個(gè)濃度設(shè)置三個(gè)平行，在恒溫生化 培養(yǎng)箱中30Γ培養(yǎng)，挑取顏色、大小不同的單菌落劃線純化，斜面保存； (3)菌株的篩選：將分離純化的菌株接種至吡啶無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，搖床180 r/min，30°C 震蕩培養(yǎng)3 d;吸取適量菌懸液于1.5 mL離心管中，10000 r/min離心8 min，吸取上清，采 用紫外分光光度法進(jìn)行吡啶含量的定量測(cè)定，挑取吡啶降解率高于50%的菌株，即獲得所 述全食副球菌（ParacocciA? B21-3。以未接種任何菌株的吡啶無機(jī)鹽培養(yǎng) 基為對(duì)照。
[0028] 降解率計(jì)算公式為：降解率=[(對(duì)照吸光值-樣品吸光值）/對(duì)照吸光 值]X 100% 實(shí)施例2全食副球菌Β21-3的鑒定 (1)菌株形態(tài)觀察及革蘭氏染色鑒定： 菌落及菌株觀察：全食副球菌（ParacocciA? B21-3在LB培養(yǎng)基30 °C 培養(yǎng)48h，觀察其菌落呈淡粉色，表面粘質(zhì)，邊緣整齊，易挑起；細(xì)胞形態(tài)為球形，不產(chǎn)芽孢， 無鞭毛。平板菌落圖如圖1所示。
[0029] (2)生理生化檢測(cè)： 根據(jù)《常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)》中屬、種鑒定的相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行了氧化酶、接觸酶測(cè)定，VP試