一種防治植物病害的生防菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物防治和生物工程技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種防治植物病害的生防菌 株、由上述菌株制備的植物病害防治劑、防治植物病害的方法、以及上述菌株或植物病害防 治劑的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 伴隨著農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的迅猛發(fā)展,農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的植物病蟲(chóng)害防治越來(lái)越依賴于化學(xué)農(nóng) 藥的廣泛應(yīng)用。但是在化學(xué)農(nóng)藥大量使用的同時(shí),環(huán)境污染問(wèn)題也隨之而來(lái),由此人們對(duì)現(xiàn) 代農(nóng)業(yè)的防治技術(shù)提出了更高的要求。生防農(nóng)藥作為一種新型的綠色農(nóng)藥,以其安全可靠、 不污染環(huán)境、抗菌效果好的特點(diǎn),近年來(lái)受到世界各國(guó)的廣泛關(guān)注,因此尋找有效的生防菌 株也成為人們?nèi)找骊P(guān)注的熱點(diǎn)。
[0003] 鑒于此,克服以上現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷,提供一種新的防治植物病害的生防菌株成 為本領(lǐng)域亟待解決的技術(shù)問(wèn)題。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷,提供一種防治植物病害的生防菌 株、由上述菌株制備的植物病害防治劑、防治植物病害的方法、以及上述菌株或植物病害防 治劑的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明的目的可通過(guò)以下的技術(shù)措施來(lái)實(shí)現(xiàn):
[0006] -種防治植物病害的生防菌株,該菌株為保藏號(hào)為CCTCC Μ 2015385的枯草芽孢 桿菌 SY-BA2。
[0007] 本發(fā)明第二方面提供了一種植物病害防治劑,其包括上述的保藏號(hào)為CCTCC Μ 2015385的枯草芽孢桿菌SY-BA2。
[0008] 優(yōu)選地,包括保藏號(hào)為CCTCC Μ 2015385的枯草芽孢桿菌SY-BA2菌株的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞 或完整培養(yǎng)物。
[0009] 優(yōu)選地,包括保藏號(hào)為CCTCC Μ 2015385的枯草芽孢桿菌SY-BA2菌株的培養(yǎng)物濃 縮物或細(xì)菌懸液或發(fā)酵液或發(fā)酵清液。
[0010] 優(yōu)選地,由SY-BA2菌株的發(fā)酵液、載體、濕潤(rùn)劑和分散劑混合后干燥制成,其中, 所述發(fā)酵液中活菌數(shù)量在1X 10scfu/mL~1X K^cfu/mL,所述載體與所述發(fā)酵液重量比 為1:1~1:5,所述載體與所述濕潤(rùn)劑重量比為1:0. 0001~1:0. 1,所述載體與所述分散劑 重量比為1:0. 0001~1:0. 1。
[0011] 優(yōu)選地,所述載體選自娃藻土、高嶺土、膨潤(rùn)土、稻殼粉、草炭土、白炭黑、輕質(zhì)碳酸 鈣、凹凸棒土或滑石粉,所述濕潤(rùn)劑選自十二烷基苯磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉、烷基萘磺酸 鹽中的一種或多種;所述分散劑選自烷基萘磺酸鹽縮聚物鈉鹽、羧甲基纖維素鈉中的一種 或多種。
[0012] 本發(fā)明第三方面提供了一種防治植物病害的方法,其特征在于,將上述的菌株或 上述的植物病害防治劑施用給植物以防止植物受到植物病原菌的侵染。
[0013] 優(yōu)選地,所述植物病害選自玉米銹病、小麥白粉病、黃瓜霜霉病或黃瓜炭疽病。
[0014] 優(yōu)選地,所述菌株或植物病害防治劑施用時(shí)作用于植物的葉、生根區(qū)和/或種子。
[0015] 本發(fā)明第四方面提供了上述菌株或上述的植物病害防治劑在植物病害防治中的 應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明的枯草芽孢桿菌菌株以及植物病害防治劑生防效果好、生產(chǎn)成本低廉、易 于生產(chǎn)、實(shí)際應(yīng)用操作簡(jiǎn)單、對(duì)化學(xué)藥劑難以防控的土傳病害防治效果明顯,在無(wú)公害大田 作物和蔬菜種植中可發(fā)揮重要作用。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白,下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本 發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解,此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明,并不用 于限定本發(fā)明。
[0018] 術(shù)語(yǔ)"發(fā)酵培養(yǎng)液"是指液體培養(yǎng)基;術(shù)語(yǔ)"發(fā)酵液"是指菌株在液體培養(yǎng)基中發(fā) 酵培養(yǎng)一段時(shí)間后所形成的液體(包括了培養(yǎng)液);術(shù)語(yǔ)"發(fā)酵清液"是指發(fā)酵液離心去除 菌體沉淀后所得上清液;術(shù)語(yǔ)"細(xì)菌懸液"是發(fā)酵液經(jīng)過(guò)離心處理后收集沉淀(菌株培養(yǎng) 物或菌體),將沉淀溶于水或緩沖液中,經(jīng)過(guò)震蕩或吹打使得沉淀狀的菌株培養(yǎng)物懸浮起來(lái) 所形成的均一的懸濁液。
[0019] 當(dāng)將本發(fā)明的枯草芽孢桿菌SY-BA2菌株用于防治植物病害時(shí),通??梢允褂每?草芽孢桿菌SY-BA2菌株的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、完整培養(yǎng)物等??梢酝ㄟ^(guò)常規(guī)方法培養(yǎng)屬于枯草芽孢 桿菌SY-BA2菌株以獲得培養(yǎng)物,再由上述培養(yǎng)物制備植物病害防治劑。例如,通過(guò)對(duì)完整 培養(yǎng)物按照原狀進(jìn)行冷凍干燥可以將所得完整培養(yǎng)物制備成完整培養(yǎng)物粉末。再例如,可 以通過(guò)下列步驟將營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞制備成細(xì)胞沉淀:在培養(yǎng)后離心整個(gè)培養(yǎng)物以去除污染物,進(jìn) 一步離心所得上清液,然后洗滌沉淀細(xì)胞。再例如,可以通過(guò)將以上所獲得的細(xì)胞沉淀懸浮 于蒸餾水中并且冷凍干燥所得混懸液將孢子制備成凍干孢子粉。
[0020] 現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)有多株枯草芽孢桿菌作為生防菌在植物病害中應(yīng)用,部分進(jìn)行了 產(chǎn)品登記。本發(fā)明的特點(diǎn)在于提供的枯草芽孢桿菌SY-BA2菌株分離自渤海灣海邊土壤,由 于海洋環(huán)境的特殊性,海洋微生物及其代謝產(chǎn)物都具有不同于陸地微生物的特點(diǎn),那么利 用海洋微生物開(kāi)發(fā)的生物制劑具有其獨(dú)特性,可以為生防制劑增加多樣性,從而減輕、減緩 病原微生物產(chǎn)生的抗藥性問(wèn)題。
[0021] 本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌SY-BA2菌株繁殖快、生長(zhǎng)周期短、芽孢產(chǎn)生量大、易 于工業(yè)化生產(chǎn);本發(fā)明提供的由SY-BA2菌株制備的植物病害防治劑抗菌譜廣、環(huán)境兼容性 好、可防治多種植物病害,尤其對(duì)化學(xué)藥劑難以防控的土傳病害具有理想的防治效果。
[0022] 在篩選枯草芽孢桿菌SY-BA2菌株時(shí)首先采用高溫濕熱條件將土壤樣品處理 lOmin,篩選掉大部分不耐高溫抗性差的菌株,再增加碳氮源激活剩余存活菌株,采用常規(guī) 平板稀釋法分離獲得純菌株樣品,通過(guò)該方法獲得的抗病菌株比例高,而且菌體本身抗性 強(qiáng)、耐高溫,利于菌劑后期加工和儲(chǔ)存。因此該分離篩選方法可極大減輕分離大量菌株所需 工作量,縮短工作時(shí)間,提高工作效率。具體如下:一種快速分離篩選具有生防功能菌株的 方法,所述方法為將采集土壤樣品用錫箱紙包好高溫濕熱65°C處理20min待冷卻后倒入裝 有50mL無(wú)菌水的250mL三角瓶中,補(bǔ)加少量葡萄糖和硫酸銨,30°C搖床振蕩2d,取5 mL系 列稀釋至10 4、10 5、10 6、10 7,各取0. 2mL涂布于改進(jìn)的蛋白胨培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g,酵母 粉3g,葡萄糖5g,NaCl 5g,pH 7. 0),30°C培養(yǎng)2d,挑取單菌落反復(fù)劃線純化,獲得純系菌 株。
[0023] 利用離體平板對(duì)峙培養(yǎng)法測(cè)試篩選菌株的抑菌活性,選擇離體抑菌譜寬的菌株作 為重點(diǎn)篩選對(duì)象,并結(jié)合菌株的生長(zhǎng)速度和生長(zhǎng)要求明確生防菌株。
[0024] 本發(fā)明提供了一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)SY-BA2,保藏號(hào)為CCTCC Μ 2015385。
[0025] 本發(fā)明中發(fā)酵細(xì)菌SY-BA2分離自渤海灣海邊土壤,經(jīng)16S rDNA基因測(cè)序法鑒定 為枯草芽孢桿菌,已于2015年6月17日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(地址:湖北省 武漢市武昌區(qū)八一路珞珈山),保藏號(hào)為CCTCC Μ 2015385。該菌為革蘭氏陽(yáng)性好氧菌,平 板培養(yǎng)為圓形或近圓形,乳白色,伴隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),菌落有褶皺和突起,顯微鏡下觀察菌 體桿狀,大小為1.2-1.4以111\0.6-〇.8以111,內(nèi)生芽抱??莶菅勘U菌(13&(3;[11118 811131:;[118) SY-BA2CCTCC Μ 2015385 簡(jiǎn)稱枯草芽孢桿菌 SY-BA2。
[0026] 本發(fā)明另一方面提供了一種由上述菌株制備的植物病害防治劑,所述植物病害 防治劑可以直接以發(fā)酵液形式施用,也可以制成可濕性粉劑,可濕性粉劑是由枯草芽孢桿 菌SY-BA2發(fā)酵液、載體、濕潤(rùn)劑和分散劑組成。具體制備步驟為,首先發(fā)酵枯草芽孢桿菌 SY-BA2生產(chǎn)發(fā)酵液,用于培養(yǎng)本發(fā)明菌株的營(yíng)養(yǎng)源沒(méi)有特別的限制,碳源可以是葡萄糖、蔗 糖、乳糖、麥芽糖、各種淀粉、甘油、肌醇、甘露醇其中的一種或幾種。氮源可以是蛋白胨、酵 母粉、牛肉膏、大豆粉、玉米粉、麥皮其中的一種或幾種。另外還可添加無(wú)機(jī)氮源如硝酸銨、 硫酸銨、氯化銨,還有無(wú)機(jī)鹽如氯化鈉、碳酸鈣、硫酸鎂、磷酸鹽一種或幾種。通常采用常規(guī) LB培養(yǎng)基。本發(fā)明不局限于本文中列舉的這些培養(yǎng)基配方。
[0027] 培養(yǎng)本發(fā)明菌株的培養(yǎng)條件亦沒(méi)有特別限制,培養(yǎng)溫度、pH、振蕩速度、裝液量、通 氣比等適合所述菌株生長(zhǎng)即可。通常溫度控制在25-30°C、pH在6. 0-8. 0之間,振蕩速度在 120-200rpm/min、裝液量一般250mL裝80~120mL培養(yǎng)基,培養(yǎng)24~72h,最終菌體濃度在 lX10s~lX1010cfu/mL〇
[0028] 本發(fā)明的生物制劑可以直接以發(fā)酵液形式施用,包括分離獲得的活菌體和去菌體 的發(fā)酵清液,也可以制成載體形式的微生物制劑,所述載體為不影響枯草芽孢桿菌SY-BA2 活性的常用載體,如硅藻土、高嶺土、膨潤(rùn)土、稻殼粉、草炭土、白炭黑、輕質(zhì)碳酸鈣、凹凸 棒土、滑石粉等,載體宜事先研磨加工成粒度在300目,載體與含活菌數(shù)量在IX 10s~ 1 X K^cfu/mL的發(fā)酵液重量比在1:1至1:5,另外添加適當(dāng)助劑,濕潤(rùn)劑如十二烷基苯磺酸 鈉、十二烷基硫酸鈉、烷基萘磺酸鹽中的一種或多種,分散劑如烷基萘磺酸鹽縮聚物鈉鹽、 羧甲基纖維素鈉中的一種或幾種,載體與濕潤(rùn)劑重量百分比為1:0. 0001~1:0. 10,載體與 分散劑重量比為1:0. 0001~1:0. 10,載體與枯草芽孢桿菌SY-BA2發(fā)酵液、濕潤(rùn)劑、分散劑 混合后干燥,干燥方法不限,含水量控制在6%以下。
[0029] 枯草芽孢桿菌菌株SY-BA2以及生物制劑在植物病害防治中的應(yīng)用。將枯草芽孢 桿菌生物制劑噴施于植株上可防治多種植物病害,如將枯草芽孢桿菌SY-BA2發(fā)酵液(菌體 濃度達(dá)到1X 10s~1X 10 Ifu/mL)或者將載體形式枯草芽孢桿菌SY-BA2稀釋100倍至500 倍液直接噴施于玉米、小麥、黃瓜葉片上,可有效防治玉米銹病、小麥白粉病、黃瓜霜霉病、 黃瓜炭疽??;將枯草芽孢桿菌SY-BA2發(fā)酵液(菌體濃度達(dá)到1 X 105-1 X 106cfu/mL)或者將 載體形式枯草芽孢桿菌SY-BA2稀釋100倍至800倍液浸種處理黃瓜種子0. 5h至1. 5h,然 后將處理后的黃瓜種子種植于土壤中可有效防治黃瓜枯萎病。
[0030] 本發(fā)明還涉及所述枯草芽孢桿菌生物制劑用于防治植物苗期各種土傳病害,如青 枯病、立枯病、枯萎病。
[0031] 實(shí)施例1:
[0032] 枯草芽孢桿菌SY-BA2的獲得和鑒