專利名稱：紫貽貝Hydramacin-1基因及其重組蛋白和制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及克隆基因和抗菌肽，具體涉及紫貽貝Hydramacin-1基因及其重組蛋白和制備方法。
背景技術：
抗菌肽是一類廣泛存在于整個生物界中的雙親性小分子堿性多肽，是機體先天免疫的關鍵因子。根據抗菌肽的序列、二級結構和抗菌特性等，將已發(fā)現(xiàn)的抗菌肽分為三大類(1)不含半胱氨酸的線型抗菌肽，如天蠶素、馬蓋寧等；( 具有半胱氨酸的環(huán)型抗菌肽，如防御素，抗真菌肽等；C3)富含某一種或兩種氨基酸的抗菌肽，主要包括富含脯氨酸的抗菌肽以及富含甘氨酸的抗菌肽等。此外，近年來發(fā)現(xiàn)某些抗菌肽可由前體大分子酶解產生，如淡水螯蝦(Pacifastacus leniusculus)的血藍蛋白C-端酶解后可產生具有抗菌活性的多肽。抗菌肽的作用機理與傳統(tǒng)抗生素不同，它的靶位點主要是病原體細胞膜，因此不易產生抗性，并且抗菌肽對真核細胞幾乎沒有毒副作用，僅僅作用于原核細胞和發(fā)生病變的真核細胞?？咕牟粌H作用于革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌，而且也作用于真菌、原蟲、某些病毒和腫瘤細胞，同時，還能加速免疫和傷口愈合過程。由于病原菌對抗生素逐步產生抗藥性，抗菌肽為開發(fā)新的抗細菌、抗真菌、抗病毒和抗腫瘤藥物開辟了廣闊的前景。 軟體動物抗菌肽的研究始于1996年，Charlet等從貽貝(Mytilusedulis)中分離到了富含半胱氨酸的貽貝素(mytilin，具有8個保守的半胱氨酸殘基)和貽貝霉素(mytimicin，具有12個半胱氨酸)，序列比對表明與昆蟲抗菌肽有較高的相似性。Hubert從貽貝(Mytilus galloprovincialis)中純化到含4對二硫鍵的MGDl (含有38個氨基酸殘基，含有2個半胱氨酸)，其具有廣譜的抗G+和G—活性。

發(fā)明內容
本發(fā)明從紫貽貝中克隆得到如序列表SEQ ID NO. 1所示的Hydramacin-I基因，該克隆基因的表達得到如序列表SEQ ID NO. 2所示的重組蛋白，該重組蛋白為新的紫貽貝抗菌肽，對革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌等具有抗菌效果。本發(fā)明還提供了紫貽貝Hydramacin-1基因和重組蛋白的制備方法，該制備方法能得到純度較高的紫貽貝抗菌肽，紫貽貝抗菌肽具有開發(fā)抗菌藥物應用的前景。本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案為本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案為一種紫貽貝Hydramacin-I基因，為克隆基因，該Hydramacin-I基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示；該克隆基因表達的重組蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0. 2所示，該重組蛋白即為紫貽貝抗菌肽，對革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌等具有抗菌效果。紫貽貝抗菌肽的制備方法，包括下述步驟1)總RNA提取用Trizol試劑從感染鰻弧菌的紫貽貝的血淋巴中提取總RNA，得到RNA，存于_80°C備用；提取方法依hvitrogen公司的Trizol試劑說明書進行；
2)mRNA純化用Oligotex mRNA純化試劑盒將上述總RNA純化得到mRNA ；純化方法依據QIAGENE公司的Oligotex mRNA純化試劑盒說明書進行；3) cDNA模板溶液制備用cDNA Synthesis Kit試劑盒(購于Mratagene公司)將上述mRNA逆轉錄并酶切為酶切片段，具體操作方法依試劑盒說明書進行包括雙鏈cDNA經末端補平、EcoR I接頭連接、EcoR I末端磷酸化、Β ο I內切酶酶切等，用QIAEX IIAgarose Gel Extraction Kit純化試劑盒(購于QIAGEN公司)對大于IOObp的酶切片段進行回收， 回收的酶切片段與Uni-ZAP XRvector載體(購于hvetrogen公司)連接，得到是cDNA質粒，用 ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit 試劑盒(購于 Mratagene 公司)對 cDNA質粒進行噬菌體包裝、滴度測定、噬菌體文庫擴增，擴增后的噬菌體文庫加入體積百分終濃度為7%的二甲基亞砜(DMSO)，得到含抗菌肽基因的cDNA模板溶液，存于_80°C ；具體包裝、測定和擴增方法依試劑盒說明書進行；4)抗菌肽基因篩選紫貽貝cDNA文庫EST序列的大規(guī)模測定從已構建文庫中篩選陽性克隆，使用載體通用引物T3在MegaBACElOOO測序儀上進行序列測定，將得到的原始峰圖文件(*. abi, *· abd文件)數據經Phred程序處理轉化為序列文件(*. seq)和質量文件(*. seq. qual)， 依據質量文件提供的數值確定獲得序列的誤差概率，去除低質量的堿基，用cross-mach程序屏蔽數據中的載體序列，從得到的數據中選取連續(xù)堿基質量大于Q13 (準確率大于95% ) 且長度大于IOObp的序列作為EST數據。紫貽貝EST序列的同源性分析及Hydramacin-1基因片段的篩選將獲得的全部有效的EST數據進行聚類拼接，生成Contigs和Singletons，分別將所獲的Contigs與 Singletons在數據庫中進行BLAST分析，根據相似性分析結果尋找出與Hydramacin-I基因同源的EST序列。5)基因克隆紫貽貝Hydramacin-I基因cDNA全長序列的獲得采用cDNA末端快速擴增技術 (Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE)，根據已經獲得的目的基因的部分片段設計基因特異性引物 Pl (5 ‘ GTGGGATTCT ATTGGGTTTG 3')禾口 P2(5' GAAGCGAATG TGATTGGTGA 3')，以接頭通用引物Adapter dT在M-MLV反轉錄酶的作用下引導反轉錄合成cDNA。用接頭通用引物Universal primer分別和基因特異性引物進行Nested-PCR，擴增基因3 ‘末端。PCR產物用膠回收試劑盒(購于上海中科開瑞生物芯片公司)進行回收和純化得到PCR 純化產物，將所述PCR純化產物與pMD-18T載體(購于大連寶生生物工程有限公司)連接， 連接產物轉化E. coli ToplO感受態(tài)細胞(購于北京全氏金生物技術有限公司)中，陽性轉化子經PCR篩選后測序，序列拼接得到全長cDNA序列的克隆質粒，即為抗菌肽基因的克隆質粒；3 ’ RACE所用反應體系及條件一擴體系IOXPCR Buffer 2. 5 μ LMgCl2(25mM)1. 2μ LdNTP (2. 5mM)2. O μ LUniversal primer 0. 5 μ L
水 17. 05 μ LcDNA (模板) 1 μ LTaq0. 25μ LPl (引物) 0. 5μ L條件首先94°C預變性5分鐘，然后進入下列循環(huán)94°C變性45秒，60°C至56°C每循環(huán)降低0. 5°C，退火30秒，72°C延伸1分鐘，共進行10個循環(huán)，再進入下列循環(huán)94°C變性45秒，56 °C退火1分鐘，72 °C延伸1分鐘，共進行20個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘二擴體系IOXBuffer 2. 5 μ LMgCl2(25mM) 1. 2μ LdNTP (2. 5mM) 2. 0 μ LUniversal primer 0. 5 μ L/K17. 05 μ LTaq0. 25 μ LP20· 5 μ L稀釋后的一擴產物 IyL條件首先94°C預變性5分鐘，然后進入下列循環(huán)94°C變性30秒，56°C退火45 秒，72 °C延伸1分鐘，共進行30個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。)上述PCR buffer溶液、dNTP、PCR水、iTaq DNA聚合酶均購自Promega公司，通用引物購自上海生工科技有限公司。6)重組質粒構建對抗菌肽基因的克隆質粒進行擴增反應，擴增反應正向引物為含有Nde I酶切位點的核苷酸序列(5，-CATATGAATG TGATTGGTGA TTGCTG-3，，其中劃線上的序列表示Nde I酶切位點)，反向引物為含Β ο I酶切位點和6個His純化標簽的 5，-CTCGAGTTA |G TGGTGGTGGT GGTGGTC^ AAA ACCGCACCAC CATG-3，，其中下劃線為Bio I酶切位點，方框為His純化標簽)核苷酸序；將擴增片段純化回收，導入PMD18-T simple (購于大連寶生生物工程有限公司)載體，構建亞克隆質粒，轉入大腸桿菌T0P10感受態(tài)細胞(購于北京全式金生物技術有限公司)中，篩選陽性亞克隆質粒，提取陽性亞克隆質粒，用Nde I和B10 I (均購于NEB公司)雙酶切亞克隆質粒，用膠回收純化試劑盒(大連寶生生物工程有限公司)對酶切產生的目的片段純化回收，得到編碼重組蛋白的抗菌肽重組基因，測序該抗菌肽重組基因，該抗菌肽重組基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1 所示，將該抗菌肽重組基因導入經同樣雙酶切的表達載體pET_21a(購于Novagen公司)，得到重組質粒；重組質粒構建具體依《分子克隆第三版》操作方法擴增反應條件為首先94°C 預變性5分鐘，然后進入下列循環(huán)94°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸30秒，共進行 30個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；7)抗菌肽重組基因表達將上述重組質粒轉入表達宿主菌BL21 (DE3) -plysS (購于北京全式金生物技術有限公司)，篩選陽性重組質粒，測序確認，挑取單克隆重組質粒，將單克隆重組質粒接種于200ml Super Optimal Broth (S0B，購于上海生工科技有限公司)培養(yǎng)基中，接種濃度為220rpm，37°C培養(yǎng)至0D600 = 0. 5-0. 7，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，使終濃度達到lmmol/ml，繼續(xù)培養(yǎng)汕，4°C，5000rpm,離心lOmin，收集菌液；
8)重組蛋白純化對上述菌液超聲破碎、離心、提取、GE的HisTrap螯合柱層析純化、洗脫，得到重組蛋白，即本發(fā)明的紫貽貝抗菌肽，經測序，該重組蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示，具體純化方法依蛋白純化試劑盒的說明書操作。本發(fā)明的引物由上海生工科技有限公司合成。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于從紫貽貝中克隆得到如序列表SEQ ID NO. 1 所示的Hydramacin-I基因，該克隆基因的表達得到如序列表SEQ ID NO. 2所示的重組蛋白，該重組蛋白為新的紫貽貝抗菌肽，對海洋來源的多種革蘭氏陽性和陰性病原微生物均具有很強的抑制活性，具有開發(fā)為廣譜抗菌類藥物、遺傳選育和飼料添加劑等方面的應用價值；該紫貽貝克隆基因和重組蛋白的制備方法，通過總RNA提取、mRNA純化、cDNA模板溶液制備、抗菌肽基因篩選、基因克隆、重組質粒構建、重組基因表達和重組蛋白純化步驟，能得到純度較高的重組的紫貽貝抗菌肽。
具體實施例方式以下結合實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。實施例紫貽貝抗菌肽的制備一、用Trizol試劑從感染鰻弧菌的紫貽貝的血淋巴中提取總RNA，得到總RNA， 提取方法依^witrogen公司的Trizol試劑說明書進行取紫貽貝血細胞50ml，2000g離心lOmin，棄上清，向沉淀細胞中加入20ml的TRIZOL (Invitrogen)中，用高速分散器將細胞分散，室溫下劇烈震蕩10秒；加入細1氯仿，劇烈震蕩30秒；4°C 10，OOOg高速離心IOmin ；吸取上清液于一個新離心管中，加入冰浴過的等體積異丙醇(約15ml)，置于-20°C靜置1小時以上；4°C 10，OOOg高速離心10分鐘；小心棄去上清液；用5ml 70% 的乙醇清洗沉淀；4°C 10，OOOg高速離心10分鐘，小心棄去上清液；真空干燥5分鐘，用約 600 μ lRNase-free water溶解RNA，待完全溶解后儲存于_80°C備用。二、用Oligotex mRNA純化試劑盒將上述總RNA純化得到mRNA，具體純化方法依QIAGENE公司的01 igotex mRNA純化試劑盒說明書進行包括在37 V水浴加熱 OligotexSuspension,震蕩混勻，室溫放置；70°C水浴加熱OEB Buffe ；向500 μ 1總RNA溶液(RNA含量約為 2mg)中加入650 μ 1 of OBB buffer, 135 μ 1 of Oligotex Suspension, 650 μ 1 ofRNase-free water，70°C加熱體系3分鐘；取出反應體系后，室溫下放置10分鐘， 15，OOOg離心2分鐘，小心吸走上清液，用600 μ 1 0W2重懸Oligotex-mRNA沉淀，劇烈震蕩。 然后將懸濁液移入放在1. 5ml離心管中的spin column內，15，000g離心1分鐘，將spin column轉移到一個新的1. 5ml離心管中，加入600 μ 1 0W2，15，000g離心1分鐘，將進入離心管的液體丟棄，將spin column轉移到另一新的1. 5ml離心管中；向spin column中加入 50 μ 1已經加熱到700C的OEB buffer,輕輕混勻，15，OOOg離心1分鐘；向spin column再加入50 μ 1 OEBbuffer,混勻后15，OOOg離心1分鐘；回收離心管中的mRNA溶液約100 μ 1。三、用cDNA Synthesis Kit試劑盒將上述mRNA逆轉錄并酶切為酶切片段，具體操作依試劑盒說明書進行包括雙鏈cDNA經末端補平、EcoR I接頭連接、EcoR I末端磷酸化、 Xho I內切酶酶切等，用QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit純化試劑盒對大于IOObp 的酶切片段進行回收，回收的酶切片段與Uni-ZAP XR vector載體連接，得到cDNA質粒，用ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit試劑盒對cDNA質粒進行噬菌體包裝、 滴度測定和噬菌體文庫擴增，具體方法參照說明書進行，擴增后的文庫加入終濃度為7%的 DMSO溶液，得到cDNA模板溶液，存于_80°C備用。第一鏈cDNA合成在RNase-free的200 μ 1離心管中依次需用試劑混勻，然后加入30μ 1 poly (A)引物+RNA (5 μ g)，混勻，室溫下放置10分鐘后，向體系中加入1.5μ 1的一鏈合成酶MratMcript RT (50U/ μ 1)，終體積達到50 μ 1，輕輕混勻反應體系，離心數秒， 42°C溫育1小時。二鏈合成在冰上依次向含有一鏈cDNA的離心管中加入需用反應物反應，再向反應體系中加入 2μ 1 RNase Η(1· 5U/μ 1)，11 μ 1 DNA polymerase 1(9. OU/μ 1), 輕輕混勻反應體系，離心數秒，16°C放置2. 5小時后立即將反應體系置于冰上。補平cDNA末端向二鏈合成體系中加入需用反應物，快速震蕩反應體系離心后，于72°C反應30分鐘；加入200 μ 1酚-氯仿[1 1 (ν/ν)]，震蕩混勻體系，室溫下高速離心2分鐘，轉移上清至新的離心管中；加入等體積的氯仿，震蕩混勻，室溫下高速離心2分鐘，然后轉移上清至新管中； 加入下列試劑使cDNA沉淀，并震蕩體系20μ 1 3Μ sodium acetate, 400 μ 1 100% (ν/ν) ethanol, _20°C沉淀過夜；4°C高速離心60分鐘，小心棄去上清，保留沉淀；加入500 μ 1的 70%乙醇輕輕洗滌沉淀，室溫高速離心2分鐘；輕輕吸去乙醇，在真空離心機中干燥沉淀； 用9 μ 1含有EcoR I adapters的溶液溶解沉淀并于4°C放置至少30分鐘。EcoR I接頭的連接向體系中加入下列成分1 μ 1 IOXligase buffer, 1 μ 1 IOmM rATP, 1 μ 1 T4DNA ligaseGU/μ 1)，離心后8°C放置過夜；70°C 30分鐘滅活連接酶。磷酸化EcoRI末端離心反應物2秒，室溫放置5分鐘冷卻，加入下列反應物用于磷酸化接頭1 μ IlOXligase buffer,2 μ 1 IOmM rATP,5 μ 1 sterile water,2 μ 1 T4polynucleotide kinase (5U/μ 1), 37°C溫育30分鐘，70°C 30分鐘滅活激酶，離心2秒后室溫放置5分鐘冷卻。Bio I內切酶酶切向體系中加入下列成分 μ 1 Xho I buffer supplement, 3 μ 1 Xho I (40U/ μ 1), 37°C溫育1. 5小時，加入125 μ 1的100% (ν/ν)乙醇，_20°C放置過夜，4°C離心60分鐘，棄去上清，完全干燥沉淀，用50 μ 1 ddH20溶解沉淀。cDNA片段回收方法從濃度為1. 0%的瓊脂糖凝膠上將DNA帶切下，將大約250mg 的膠塊放入1. 5ml離心管中，加入相當于3倍膠塊體積的Buffer QXlJf QIAEX II劇烈震蕩30秒，充分混勻，向含有膠塊的Buffer QXl中加入60 μ 1 QIAEX II，50°C加熱10分鐘， 溶解膠塊；每2分鐘震蕩一次，保持溶液始終為黃色；13，OOOrpm離心30秒，小心吸去上清液；用500 μ 1 Buffer QXl清洗沉淀，重懸沉淀，13，OOOrpm離心30秒并小心吸去上清液； 用500 μ 1 PE Buffer清洗沉淀2次，重懸沉淀，13，OOOrpm離心30秒，棄上清液，真空干燥 15分鐘至沉淀變白，加入20 μ 1 ρΗ8. 5的IOmM Tris-Cl溶液室溫下溶解5分鐘。cDNA 與載體(Uni-ZAP XR vector, Invetrogen)連接在另一干凈的 200 μ 1 離心管中依次加入下列試劑2· 5μ 1 resuspended cDNA( > 100ng) ,0. 5μ 1 IOXligase buffer,0. 5 μ 1 IOmM rATP(pH7. 5),1. 0 μ 1 Uni-ZAP XR vector (1 μ g),0.5 μ 1 T4DNA ligase (4U/ μ 1)。12°C放置過夜。噬菌體文庫的包裝從-80°C冰箱中取出包裝蛋白，迅速用手握住融化，立即加入 4 μ 1重組cDNA,用微量移液器吸頭混勻體系(不要產生氣泡)，離心5秒，室溫(22°C )溫育2小時，加入500 μ 1的SM buffer和20 μ 1氯仿，輕輕混勻反應體系?？焖匐x心數秒，沉淀蛋白碎片，轉移上清至新管中。
包裝反應的滴度測定在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基(1升培養(yǎng)基含有氯化鈉10g，胰蛋白胨log，酵母提取物5g，瓊脂粉15g，pH7. 5)上將菌株XLl-Blue MRF，劃線培養(yǎng)，37°C過夜培養(yǎng)；用LB液體培養(yǎng)基(1升培養(yǎng)基含有氯化鈉10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，pH7. 5)培養(yǎng)單克隆菌落，30°C，200rpm搖床培養(yǎng)過夜；4°C，IOOOg下離心10分鐘沉淀細菌。用25ml IOmM MgSO4重懸細菌；用IOmM MgSO4重懸XLl-BlueMRF’細胞，使?jié)舛冗_到 0D600 = 0. 5 ；將包裝產物按下列比例與宿主菌混合(1) 1 μ 1包裝產物+200 μ 1 XLl-Blue MRF，(OD600 = 0 . 5) ； (2)0. 1 μ 1 包裝產物 +200 μ IXLl-Blue MRF，(OD600 = 0 . 5)；將混合體系置于37°C溫育15分鐘使噬菌體充分附著在宿主細胞表面；加入3ml融化狀態(tài)下約48°C 的NYZ上層培養(yǎng)基(1升培養(yǎng)基含有氯化鈉5g，MgSO4 · 7H20 2g，NZ胺10g，酵母提取物5g， 瓊脂糖7g，pH7. 5)；迅速鋪在干燥預熱過的NYZ瓊脂培養(yǎng)基(1升培養(yǎng)基含有氯化鈉5g， MgSO4 · 7H20 2g，NZ胺10g，酵母提取物5g，瓊脂粉15g，ρΗ7· 5)上，靜置10分鐘后，倒置于 37°C過夜培養(yǎng)；8小時后可見噬菌斑；分別計數兩個平板的噬菌斑數目，計算其滴度(每毫升生長的噬菌斑數目，pfu/ml)。30°C 200rpm條件下，用LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)XLl-Blue MRF，細胞50ml ； IOOOg 離心宿主細胞10分鐘；用25ml IOmM MgSO4重懸細胞，測定600納米可見光下菌液吸光度， 然后用IOmM MgS04將菌液稀釋至濃度為0D600 = 0.5;將含有大約5X104pf·u噬菌體顆粒的懸濁液與600 μ 1濃度為0D600 = 0. 5的XLl-Blue MRF’細胞混合，置于Falcon 2059聚丙烯管中，37°C溫育混合液15分鐘，使噬菌體充分附著在宿主菌表面；將混合液加入約48°C的
6.5ml液態(tài)NZY上層培養(yǎng)基中，混勻后倒入新鮮的150mmNZY瓊脂糖培養(yǎng)基平板上，靜置平板10分鐘，倒轉平板置于37°C約8小時(噬菌斑直徑不超過2mm)；在每塊平板上倒入大約 10ml SM 緩沖液(1 升緩沖液中含有 5. 8g NaCl, 2. 0gMgS04 ·7Η20，50. 0ml IM Tris-HCl [ρΗ
7.5], 5. 0ml 2% [w/v]白明膠)，4°C放置過夜；將所有平板上的SM緩沖液回收入新的聚丙烯管中，每塊平板再用anl SM緩沖液清洗一次并回收上清液；向回收液中加入終濃度為 5% (ν/ν)的氯仿，室溫下放置15分鐘，混勻，500g離心10分鐘去除細胞碎片，將上清液轉移至新聚丙烯管中，并重復步驟8、9至上清液澄清，加入終濃度為7% (v/v)DMS0，儲存于-80°C。測定擴增文庫滴度(方法同前)。四、cDNA模板溶液中抗菌肽基因的確認用Exassist Helper Phage和SOLR菌株均購于Mratagene公司)從Uni- ZAP XR Vector上體外切割pBluescript噬菌粒(進行體外切割；然后質粒cDNA的大規(guī)模提取和測序分析獲得目的EST序列，對上述EST測序結果，用BLASTn和BLASTx程序分析，根據相似性分析結果尋找出抗菌肽基因片段。五、對上述含抗菌肽基因的cDNA模板溶液進行巢式PCR擴增得到PCR產物，PCR 擴增的特異性引物Pl的核苷酸序列為5’-GTGGGATTCT ATTGGGTTTG-3’，特異性引物P2的核苷酸序列為5’ -GAAGCGAATG TGATTGGTGA-3’，PCR產物用膠回收試劑盒進行回收和純化得到PCR純化產物，將所述PCR純化產物與pMD-18T載體連接得到克隆質粒，克隆質粒轉入大腸桿菌T0P10F感受態(tài)細胞中，挑選陽性轉化子經PCR篩選后測序，序列拼接得到抗菌肽 Hydramacin-I基因的全長cDNA序列；陽性克隆質粒提取，得到Hydramacin-1基因的克隆質粒；3 ’端PCR擴增一擴的反應體系和反應條件為10XPCRbuffer溶液2. 5μ 1、摩爾濃度為25mM的MgCl2溶液 1. 2 μ 1、摩爾濃度為2. 5mM的dNTP溶液2. 0 μ 1、摩爾濃度為IOpmol/ μ 1的特異性引物Pl溶液0.5 μ 1、摩爾濃度為lOpmol/μ 1的通用引物溶液0. 5 μ 1、濃度為5U/μ 1 WhqDNA polymerase 0. 25μ 1, cDNA模板(文庫)溶液1 μ 1，用PCR水定容到25 μ 1 ；反應在ABI Veriti PCR儀中進行，反應條件為首先94°C預變性5分鐘，然后進入下列循環(huán)94°C變性45秒，60°C至56°C每循環(huán)降低0. 5°C，退火30秒，72°C延伸1分鐘，共進行10個循環(huán)， 再進入下列循環(huán)94°C變性45秒，56°C退火1分鐘，72°C延伸1分鐘，共進行20個循環(huán)， 最后72°C延伸10分鐘；3，端PCR擴增二擴反應體系和反應條件為10XPCR buffer溶液 2. 5 μ 1、摩爾濃度為25mM的MgCl2溶液1. 2 μ 1、摩爾濃度為2. 5mM的dNTP溶液2. 0 μ 1、摩爾濃度為lOpmol/μ 1的特異性引物Ρ2溶液0. 5 μ 1、摩爾濃度為lOpmol/μ 1的通用引物溶液 0. 5 μ 1、濃度為 5υ/μ 1 的 Taq DNA polymerase 0. 25 μ 1，模板溶液 1 μ 1，用 PCR 水定容到25 μ 1，反應在ABIVeriti PCR儀中進行，反應條件為首先94°C預變性5分鐘，然后進入下列循環(huán)94°C變性30秒，56°C退火45秒，72°C延伸1分鐘，共進行30個循環(huán)，最后72°C 延伸10分鐘。六、對抗菌肽基因的克隆質粒再進行擴增反應，(擴增反應正向引物為含有Nde I 酶切位點的核苷酸序列5’ -CATATGAATGTGATTGGTGA TTGCTG-3’，反向引物為含Β ο I酶切位點和6個His純化標簽的核苷酸序列5’ -CTCGAGTTA G TGGTGGTGGT GGTGGTG AAA ACCGCACCAC CATG-3’)；將擴增片段純化回收，導入pMD18_T載體，構建亞克隆質粒，轉入大腸桿菌T0P10F、感受態(tài)細胞中，篩選陽性亞克隆質粒，提取陽性亞克隆質粒，用Nde I和)(h0 I雙酶切亞克隆質粒，用膠回收純化試劑盒對酶切產生的目的片段純化回收，得到編碼重組蛋白的抗菌肽重組基因，測序該抗菌肽重組基因，該抗菌肽重組基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示，將該抗菌肽重組基因導入經同樣雙酶切的表達載體pET-21a，得到重組質粒；重組質粒構建具體依《分子克隆第三版》操作方法擴增反應條件為首先94°C預變性5分鐘，然后進入下列循環(huán)94°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸30秒，共進行30 個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。七、將上述重組質粒轉入表達宿主菌BL21_plysS中，篩選陽性重組質粒，測序確認，挑取單克隆重組質粒，將單克隆重組質粒接種于200ml Super Optimal Broth培養(yǎng)基中，接種濃度為220rpm，37°C培養(yǎng)至OD600 = 0. 5-0. 7，加入IPTG，使終濃度達到lmmol/ml, 繼續(xù)培養(yǎng)汕，40C，5000rpm,離心lOmin，收集菌液。八、對上述菌液超聲破碎、離心、提取、GE的HisTrap螯合柱層析純化、洗脫，得到重組蛋白，即本發(fā)明的紫貽貝抗菌肽，經測序，該重組蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0. 2所示；在收集的菌體沉淀，加入適量的菌體裂解液(0.5M NaCl，5mM咪唑，IOmM Tris-HCl pH 8. 0，lmg/ml溶菌酶)重懸沉淀，向體系中加入lmg/ml的溶菌酶，室溫放置半小時；超聲波處理，條件為20W，處理60次，每次2秒，間隔14秒；用15%的SDS-PAGE分離膠電泳分析(Laemmli，1970)上清和沉淀，Coomassie brilliant blueR-250后用凝膠成像系統(tǒng)照相。應用例將紫貽貝抗菌肽加入試管中制成濃度為2. 2mg/ml抗菌肽液共9管，分別接種產氣腸桿菌，奇異變形桿菌，枯草芽孢桿菌，滕黃微球菌，海洋真菌鏈孢粘帚菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌，惡臭假單胞菌以及鰻弧菌各5 μ 1，使每管最終菌液濃度約為5X IO5CFU/ ml，培養(yǎng)M小時后，利用酶標儀測定600nm的光吸收值，確定MIC值，得到如表1所示的結果，從表1中可以看出，紫貽貝抗菌肽對上述3種革蘭氏陽性菌和上述6種革蘭氏陰性菌都有效，說明本發(fā)明的紫貽貝抗菌肽是一種廣譜抗菌肽，且療效較好。其中產氣腸桿菌，奇異變形桿菌，枯草芽孢桿菌，滕黃微球菌，海洋真菌鏈孢粘帚菌以及金黃色葡萄球菌37°C培養(yǎng)；副溶血弧菌，惡臭假單胞菌以及鰻弧菌培養(yǎng)；具體步驟調節(jié)各菌至OD6tltl為1后，稀釋1000倍備用。在96孔板中每孔中加入 100 μ 1 LB液體培養(yǎng)基，再在每一行第一個孔中加入100 μ 1抗菌肽，混勻后從第一個孔中吸出100 μ 1加到第二個空中，混勻后吸出100 μ 1加到第三個孔中，依此類推，第10個孔中吸出的100 μ 1不再加到第11孔中。每行1-11孔中都接種稀釋好的相應菌種5 μ 1，第12 孔為只含培養(yǎng)基的對照。培養(yǎng)Mh以上，測定吸光值，并計算相應MIC。最終測得如表1所示的紫貽貝抗菌肽對各菌的MIC值表紫貽貝抗菌肽對以上各種菌都有一定的抑制作用，其中藤黃微球菌、 枯草芽孢桿菌、產氣腸桿菌、副溶血弧菌的作用最為顯著，最小抑菌濃度分別為1. lmg/mL、 0. 28mg/mL、l. lmg/mL、0. 55mg/ml0表1 紫貽貝抗菌肽對各菌的MIC值表
權利要求
1.紫貽貝Hydramacin-I基因，為克隆基因，其特征在于該Hydramacin-I基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示。
2.權利要求1所述的紫貽貝Hydramacin-1基因表達的重組蛋白，其特征在于該重組蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示。
3.制備權利要求2所述的紫貽貝Hydramacin-1基因表達的重組蛋白的方法，其特征在于包括下述步驟1)總RNA提取用Trizol試劑從感染鰻弧菌的紫貽貝的血淋巴中提取總RNA，得到總 RNA，存于-80°C備用；2)mRNA純化用OligotexmRNA純化試劑盒將上述總RNA純化得到mRNA ；3)cDNA模板溶液制備用cDNA Synthesis Kit試劑盒將上述mRNA逆轉錄并酶切為酶切片段，用QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit純化試劑盒對大于IOObp的酶切片段進行回收，回收的酶切片段與Uni-ZAP XR vector載體連接，得到是cDNA質粒，用 ZAP- cDNA Gigapack 111 Gold Cloning Kit試劑盒對cDNA質粒進行噬菌體包裝、滴度測定、噬菌體文庫擴增，擴增后的噬菌體文庫加入體積百分終濃度為7%的二甲基亞砜，得到含抗菌肽基因的cDNA模板溶液，存于-80°C ；4)基因篩選從上述已構建文庫中篩選陽性克隆，使用載體通用引物T3在 MegaBACElOOO測序儀上進行序列測定，將得到的原始峰圖文件數據經Phred程序處理轉化為序列文件和質量文件，依據質量文件提供的數值確定獲得序列的誤差概率，去除低質量的堿基，用cross-mach程序屏蔽數據中的載體序列，從得到的數據中選取連續(xù)堿基質量大于Q13且長度大于IOObp的序列作為EST數據；將獲得的全部有效的EST數據進行聚類拼接，生成Contigs和Singletons，分別將所獲的Contigs與Singletons在數據庫中進行 BLAST分析，根據相似性分析結果尋找出與Hydramacin-1基因同源的EST序列；5)基因克隆采用cDNA末端快速擴增技術，根據已經獲得的目的基因的部分片段設計基因特異性引物Pl 如序列表SEQ ID N0. 3所示，P2 如序列表SEQ ID N0. 4所示，以接頭通用引物Adapter dT在M-MLV反轉錄酶的作用下引導反轉錄合成cDNA ；用接頭通用引物 Universal primer分別和基因特異性引物進行Nested-PCR，擴增基因3 ‘末端，PCR產物用膠回收試劑盒進行回收和純化得到PCR純化產物，將所述PCR純化產物與pMD-18T載體連接，連接產物轉化E. coli ToplO感受態(tài)細胞中，陽性轉化子經PCR篩選后測序，序列拼接得到全長cDNA序列的克隆質粒；擴增反應體系及條件，一擴體系10XPCR Buffer :2. 5 μ L，MgCl2 (25mM) :1. 2 μ L， dNTP (2. 5mM) 2. O μ L, Universal primer 0. 5μ L,PCR/jC :17. 05μ L,cDNA|ffe. 1 μ L,Taq 0. 25 μ L，P1引物0. 5 μ L ；條件首先94°C預變性5分鐘，然后進入下列循環(huán)94°C變性45 秒，60°C至56°C每循環(huán)降低0. 5°C，退火30秒，72°C延伸1分鐘，共進行10個循環(huán)，再進入下列循環(huán)94°C變性45秒，56°C退火1分鐘，72°C延伸1分鐘，共進行20個循環(huán)，最后72°C 延伸 10 分鐘；二擴體系10 XBuffer 2. 5 μ LjMgCl2 (25mM) 1. 2 μ L, dNTP (2. 5mM) :2. O μ L， Universal primer 0. 5μ L,PCR/jC :17. 05 μ L, Taq 0. 25 μ L, P2 弓|物0. 5 μ L，稀釋后的一擴產物1 μ L ；條件首先94°C預變性5分鐘，然后進入下列循環(huán)94°C變性30秒，56°C退火 45秒，72 °C延伸1分鐘，共進行30個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；6)重組質粒構建對上述克隆質粒進行擴增反應，擴增反應正向引物為含有NdeI酶切位點的如序列表SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列，反向引物為含B10 I酶切位點和6 個His純化標簽的如序列表SEQ ID NO. 6所示的核苷酸序列；將擴增片段純化回收，導入 PMD18-T simple載體，構建亞克隆質粒，轉入大腸桿菌TOPlO感受態(tài)細胞中，篩選陽性亞克隆質粒，提取陽性亞克隆質粒，用Nde I和B10 I雙酶切亞克隆質粒，用膠回收純化試劑盒對酶切產生的目的片段純化回收，得到編碼重組蛋白的重組基因紫貽貝Hydramacin-1基因，測序該重組基因，該重組基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示，將該重組基因導入經同樣雙酶切的表達載體pET-21a，得到重組質粒；7)重組基因表達將上述重組質粒轉入表達宿主菌BL21(DE;3)-plysS，篩選陽性重組質粒，測序確認，挑取單克隆重組質粒，將單克隆重組質粒接種于200ml Super OptimalBroth培養(yǎng)基中，接種濃度為220rpm，37 °C培養(yǎng)至0D600 = 0. 5-0. 7，加入異丙基-β -D-硫代半乳糖苷，使終濃度達到lmmol/ml，繼續(xù)培養(yǎng)3h，4°C，5000rpm,離心lOmin， 收集菌液；8)重組蛋白純化對上述菌液超聲破碎、離心、提取、GE的HisTrap螯合柱層析純化、洗脫，得到重組蛋白，該重組蛋白為紫貽貝抗菌肽，經測序，該重組蛋白的氨基酸序列如序列表 SEQ ID NO. 2 所示。
全文摘要
本發(fā)明公開了從紫貽貝中克隆得到如序列表SEQIDNO.1所示的Hydramacin-1基因，該克隆基因的表達得到如序列表SEQIDNO.2所示的重組蛋白，該重組蛋白為新的紫貽貝抗菌肽，對海洋來源的多種革蘭氏陽性和陰性病原微生物均具有很強的抑制活性，具有開發(fā)為廣譜抗菌類藥物、遺傳選育和飼料添加劑等方面的應用價值；該紫貽貝克隆基因和重組蛋白的制備方法，通過總RNA提取、mRNA純化、cDNA模板溶液制備、抗菌肽基因篩選、基因克隆、重組質粒構建、重組基因表達和重組蛋白純化步驟，能得到純度較高的重組的紫貽貝抗菌肽。
文檔編號C07K14/435GK102206646SQ20111007538
公開日2011年10月5日 申請日期2011年3月28日 優(yōu)先權日2011年3月28日
發(fā)明者母昌考, 王春琳, 趙建民, 陳磊磊 申請人:寧波大學