高活性纖維二糖水解酶的制備方法及高活性纖維二糖水解酶的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物煉制化iorefinery)的糖化酶。特別是設(shè)及提高了活性的纖維二 糖水解酶的制備方法W及具有高活性的纖維二糖水解酶。
【背景技術(shù)】
[0002] 通過(guò)基因重組技術(shù)，能夠進(jìn)行各種各樣的蛋白質(zhì)改性。針對(duì)酶也進(jìn)行了提高活性、 增加表達(dá)量等增強(qiáng)酶活性的嘗試。采取如下手法作為提高酶活性的手法：改變氨基酸，向酶 與底物結(jié)合的活性中屯、的氨基酸導(dǎo)入變異，從中選擇高活性的酶。
[0003] 酶的底物結(jié)合部位在大多數(shù)情況下被比作鑰匙-鎖狀。另一方面，人們已知在對(duì) 纖維素等高分子底物起作用的酶當(dāng)中，雖然僅限于極少部分的酶，但它們?yōu)榫哂懈叻肿拥?物嵌入的隧道狀或溝狀的相對(duì)較長(zhǎng)的底物結(jié)合部位的酶。
[0004] 從端部切斷纖維素鏈的酶、即外切葡聚糖酶的反應(yīng)產(chǎn)物是纖維二糖，也被稱為纖 維二糖水解酶。纖維二糖水解酶的活性中屯、形成如上所述的隧道狀，通過(guò)酶反應(yīng)而被切斷 的纖維二糖從隧道的相反一側(cè)出來(lái)，因此，酶反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行，而纖維二糖水解酶不會(huì)從纖維 素鏈脫離。
[0005] 至今為止一直在進(jìn)行提高纖維二糖水解酶的酶活性的嘗試，并已經(jīng)報(bào)道了幾種變 異體。例如，籃狀菌燈alaromyces)相關(guān)的變異體（參照美國(guó)專利第8790894號(hào)說(shuō)明書(shū)）、 來(lái)源于革菌（Phanerochaete)的纖維二糖水解酶的變異體相關(guān)的變異體（參照日本專利公 開(kāi)公報(bào)特開(kāi)2010-046034號(hào)公報(bào)）等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 然而，在生物煉制領(lǐng)域中需要一種更高效的酶，而在現(xiàn)有技術(shù)中活性提高的效果 并不充分。因此，有必要制備一種活性更高的纖維二糖水解酶變異體。
[0007] 更進(jìn)一步，像纖維二糖水解酶那樣，在保持高分子底物的同時(shí)進(jìn)行催化反應(yīng)的進(jìn) 行性酶（processive enzyme)在大范圍上存在的部位構(gòu)成底物結(jié)合部位，因此，還大量存在 其效果沒(méi)有得到研究的氨基酸。因此，本發(fā)明的課題在于對(duì)未被研究的氨基酸部位的置換 效果進(jìn)行調(diào)查，獲取一種具備較高活性的纖維二糖水解酶。
[0008] 本發(fā)明的制備提高了活性的纖維二糖水解酶的方法的特征在于：將作為從序列號(hào) 1所示纖維二糖水解酶的N末端起第62位氨基酸的天口冬酷胺、或者在與所述纖維二糖水 解酶具有同源性的纖維二糖水解酶的氨基酸序列中的對(duì)應(yīng)于該位置的天口冬酷置換為丙 氨酸。
[0009] 使用作為確定影響蛋白質(zhì)功能的部位的一方法的丙氨酸掃描 (Alanine-scanning)進(jìn)行解析后發(fā)現(xiàn)：通過(guò)將作為由序列號(hào)1所示的纖維二糖水解酶的第 62位氨基酸的天口冬酷胺置換為丙氨酸，能夠獲得一種具備高活性的纖維二糖水解酶。該 氨基酸殘基位于纖維二糖水解酶的隧道結(jié)構(gòu)內(nèi)。
[0010] 因此，可W推測(cè)只要是與由序列號(hào)1所示的纖維二糖水解酶具有同源性的纖維二 糖水解酶，通過(guò)將與該位置對(duì)應(yīng)的位置的天口冬酷胺置換為丙氨酸，同樣能夠獲得高活性 的纖維二糖水解酶。
[0011] 另外，本發(fā)明的提高了活性的纖維二糖水解酶的特征在于具備下述變異：將作為 從序列號(hào)1所示纖維二糖水解酶的N末端起第62位氨基酸的天口冬酷胺、或者在與所述纖 維二糖水解酶具有同源性的纖維二糖水解酶的氨基酸序列中的對(duì)應(yīng)于該位置的天口冬酷 置換為丙氨酸。
[0012] 將序列號(hào)1所示的序列的第62位的天口冬酷胺置換為丙氨酸后的纖維二糖水解 酶具有高活性。因此，通過(guò)將第62位的天口冬酷胺或者對(duì)應(yīng)于該位置的天口冬酷胺置換為 丙氨酸后的變異體、或者除了包括該置換還進(jìn)一步組合已知酶活性增強(qiáng)的氨基酸置換，能 夠獲得活性更高的纖維二糖水解酶。
[0013] 本發(fā)明的提高了活性的纖維二糖水解酶的特征在于，其序列由序列號(hào)2所示。由 序列號(hào)2所示的纖維二糖水解酶與野生型酶相比具有12倍的比活。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1為示意性地表示纖維二糖水解酶的立體結(jié)構(gòu)W及表示各氨基酸殘基（amino acid residue)位置的圖。
[0015] 圖2為表示利用丙氨酸掃描（alanine scanning)獲得的纖維二糖水解酶變異體 相對(duì)野生型的相對(duì)活性比的圖。
[0016] 圖3為表示通過(guò)置換了從N末端起第62位的氨基酸后相對(duì)野生型的相對(duì)活性比 的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 人們已知纖維二糖水解酶的晶體結(jié)構(gòu)。纖維二糖水解酶與作為底物的纖維素相互 作用的部位受長(zhǎng)環(huán)（loop)包圍，因而被稱為隧道結(jié)構(gòu)。與纖維素結(jié)合并發(fā)生分解反應(yīng)的活 性中屯、位于隧道結(jié)構(gòu)內(nèi)部。所W，可W認(rèn)為通過(guò)獲得隧道結(jié)構(gòu)內(nèi)的氨基酸具有變異的酶，就 能夠獲得高活性變異體。
[0018] 然而，由于隧道結(jié)構(gòu)跨越了大范圍，要對(duì)與底物結(jié)合并影響活性的氨基酸都進(jìn)行 解析是比較困難的。因此，基于立體結(jié)構(gòu)，選擇預(yù)測(cè)存在于隧道結(jié)構(gòu)內(nèi)、并且對(duì)相對(duì)作為 底物的纖維素的移動(dòng)構(gòu)成障礙從而影響活性的可能性較高的氨基酸，通過(guò)丙氨酸掃描進(jìn) 行解析。首先，為了導(dǎo)入變異，分離纖維二糖水解酶基因，構(gòu)建通過(guò)米曲霉（Aspergillus cxryzae)表達(dá)的載體。
[0019] (1)構(gòu)建通過(guò)米曲霉表達(dá)纖維二糖水解酶的載體（vector)(提取纖維頂抱霉 (Acremonium cellulolyticus)的基因組DNA)將纖維頂抱霉的H1 菌株（陽(yáng)RM BP-11508, W 下簡(jiǎn)稱"化菌株"）接種到PDB瓊脂培養(yǎng)基（在PDA培養(yǎng)基度D Difco公司制，PDA broth) 中添加了 1.5% (質(zhì)量/體積）的瓊脂糖（agarose)的平板培養(yǎng)基）上，在30°C下培養(yǎng)一 周。將得到的菌體W每個(gè)瓊脂直徑5mm為單位進(jìn)行切取，并接種于PDA培養(yǎng)基中，W 30°C 下、130巧m進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)（shaking culUire)。W 15000巧m對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行10分鐘離屯、分 離處理，由此回收菌體。更進(jìn)一步，通過(guò)PDA培養(yǎng)基重復(fù)清洗回收的菌體兩次，從而獲取菌 體試樣。
[0020] 在裝入有該菌體的2mL容量的塑料試管中加入研磨珠，利用臺(tái)式珠磨粉碎機(jī) (Shake master,生物科學(xué)社制）實(shí)施90秒的粉碎處理Ξ次，將菌體試樣磨成粉末狀后，使 用 Nucleon (Amersham 公司制）提取 DNA。
[0021] (纖維頂抱霉的野生型纖維二糖水解酶的DNA克?。?br>[0022] 將獲得的基因組作為模板，使用序列號(hào)3、4(參照下述表1)所示的引物 (primer) 1、2,通過(guò)PCR擴(kuò)增編碼野生型的纖維二糖水解酶的序列。使用K0D-plus(東洋紡 公司制備）作為DNA聚合酶值NA polymerase)，PCR通過(guò)W下方式進(jìn)行，W 94°C、2分鐘進(jìn) 行1個(gè)循環(huán)后，W 96°C、20秒，接著60°C、30秒，進(jìn)一步72°C、5分鐘進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。得到 的 PCR 產(chǎn)物利用 QIA 快速 PCR 產(chǎn)物純化試劑盒（QIAquick PCR purification kit, QIAGEN 公司制備）進(jìn)行提純。得到的纖維頂抱霉的野生型纖維二糖水解酶的氨基酸序列示于序列 號(hào)1。
[0023] (地R-enoAP-agdAT-niaD 的制備）
[0024] 在作為大腸桿菌質(zhì)?；痗ol i plasmid)的地R322中整合來(lái)源于米曲霉 Aspergillus oryzae的硝酸還原酶基因 niaD、來(lái)源于米曲霉的agdA基因的終止區(qū) (terminator region) W及來(lái)源于米曲霉的enoA基因的啟動(dòng)區(qū)（promoter region),制成 載體地R-enoAP-agdAT-niaD。通過(guò)表達(dá)硝酸還原酶基因 niaD，能夠選擇導(dǎo)入了使得即使在 硝酸存在的情況下米曲霉也能夠增殖的質(zhì)粒（plasmid)的菌。W下簡(jiǎn)述制備方法。
[00巧]首先，構(gòu)建整合了來(lái)源于米曲霉Aspergillus oryzae的硝酸還原酶基因 niaD基 因的質(zhì)粒。通過(guò)獨(dú)立行政法人制品評(píng)價(jià)技術(shù)基盤(pán)機(jī)構(gòu)（N口巧獲取米曲霉Aspergillus oryzae RIB40菌株（NBRC號(hào)：100959, W下稱為"RIB40菌株"）。W RIB40菌株的基因組 DNA為模板，使用序列號(hào)5、6所示的引物3、4,通過(guò)PCR對(duì)硝酸還原酶基因 niaD的DNA進(jìn)行 擴(kuò)增。
[0026] 通過(guò)Aval及Ndel對(duì)擴(kuò)增后的niaD的DNA進(jìn)行消化，提純后，將其插入到地R322 的Aval、Ndel位點(diǎn)，構(gòu)建地R-niaD。
[0027] 接著，來(lái)源于米曲霉的agdA基因的終止區(qū)整合到地R-niaD中。
[002引 W RIB40菌株的基因組DNA為模板，使用序列號(hào)7、8所示的引物5、6,通過(guò)PCR對(duì) 來(lái)源于米曲霉的agdA基因的終止區(qū)下有時(shí)還稱為"agdA終止子"）的DNA進(jìn)行擴(kuò)增。
[0029] 使用限制酶Sail及Aval消化得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并將其插入到地R-niaD的 Sail、Aval 位點(diǎn)，得到地R-agdAT-niaD 質(zhì)粒。
[0030] 接著，將來(lái)源于米曲霉的enoA基因的啟動(dòng)區(qū)整合到所得到的地R-agdAT-niaD中。
[0031] W RIB40菌株的基因組DNA為模板，使用序列號(hào)9、10所示的引物7、8，進(jìn)行PCR，對(duì) 來(lái)源于米曲霉的enoA基因的啟動(dòng)區(qū)（W下有時(shí)還稱為"enoA啟動(dòng)子"）的DNA進(jìn)行擴(kuò)增。 [003引使用限制酶化el及Sail消化得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并將其插入到 地R-agdAT-niaD 的 Miel、Sail 位點(diǎn)，得到地R-enoAP-agdAT-agdAT-niaD 質(zhì)粒。
[0033] [表 1]
[0034]

[0036] (野生型纖維二糖水解酶DM向地R-enoAP-agdAT-niaD的整合）
[0037] 使用限制酶 Smal 消化地R-enoAP-agdAT-niaD，獲得地R-enoAP-agdAT-niaD 的 Smal處理片段。
[0038] 使用In-Fusion(注冊(cè)商標(biāo)）皿克隆試劑盒（Clontech公司制）將編碼野生型纖 維二糖水解酶的序列克隆到該Smal處理片段上，獲得地R-enoAP-CBH-agdAT-niaD(CBH米 曲霉表達(dá)用載體）
[0039] (變異型纖維二糖水解酶DNA向地R-enoAP-agdAT-niaD的整合）
[0040] 對(duì)于變異型纖維二糖水解酶，通過(guò)PCR制備纖維二糖水解酶基因的從5' -側(cè)到變 異位點(diǎn)W及從變異位點(diǎn)到基因3' -側(cè)的兩個(gè)片段。通過(guò)將所得到的兩個(gè)片段的DNA整合 到地R-enoAP-agdAT-niaD中來(lái)進(jìn)行構(gòu)建。此時(shí)，由于包含變異位點(diǎn)的引物被設(shè)計(jì)成能夠進(jìn) 行退火（annealing)，變異型纖維二糖水解酶基因除了在整合到地R-enoAP-agdAT-niaD中 時(shí)包含變異位點(diǎn)之外，具有從5' -側(cè)到3' -側(cè)與野生型纖維二糖水解酶相同的氨基酸序 列，并處于相連狀態(tài)。
[00川 實(shí)施例
[004引（實(shí)施例1)
[0043] (丙氨酸置換變異體的制作）
[0044] W纖維頂抱霉的纖維二糖水解酶的立體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，將位于具備由序列號(hào)1所示 的氨基酸序列的、來(lái)源于頂抱霉屬（Acremonium)的纖維二糖水解酶的隧道結(jié)構(gòu)內(nèi)的30處 的氨基酸置換為丙氨酸，解析其活性，選擇酶活性提高的位點(diǎn)。在30處的置換中，有6處與 野生型纖維二糖水解酶相比活性有所提高。
[0045] 通過(guò)丙氨酸置換，活性略