專利名稱：一種表達重組nisin-rbLF-N融合基因的大腸桿菌工程菌的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，具體地說，涉及一種高效表達重組nisin-rbLF-N融合 基因的大腸桿菌工程菌、其構建方法及誘導培養(yǎng)方法。
背景技術：
乳酸鏈球菌素(Nisin)是一種高效、無毒的天然防腐劑，也是唯一一種可作為防 腐劑應用于食品的細菌素。Nisin又稱乳酸鏈球菌肽，是由乳酸鏈球菌產(chǎn)生的一種多肽物 質，它能有效抑殺嗜熱脂肪芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特氏菌、肉毒梭 菌、乳酸菌等各種革蘭氏陽性菌的營養(yǎng)細胞和芽孢。加入食品中，可大大地降低食品的滅菌 溫度、縮短食品滅菌時間，使食品保持原有營養(yǎng)成份、風味、色澤，同時還可節(jié)約大量能源。 可廣泛應用于肉制品、乳制品、植物蛋白食品、罐裝食品、果汁飲料及經(jīng)熱處理密閉包裝食 品的防腐保鮮，同時也可應用于化妝品和醫(yī)療保健品等領域。乳鐵蛋白肽(LFcin)是乳鐵蛋白在酸性環(huán)境下經(jīng)胃蛋白酶作用N端釋放的一段多 肽，廣泛存在于動物的乳汁、體液、淚液、唾液、血漿、中性粒細胞及多種組織中。具有抗菌、 抗病毒、抗氧化、消炎、抗癌、調節(jié)機體免疫、促進骨細胞生長等多種生物功能，在眾多的功 能中，抗菌功能是最引人注目的，而對真核細胞幾乎沒有毒性。且牛乳鐵蛋白氨基末端多肽 (rbLF-N)的抗菌活性較其它的乳鐵蛋白肽活性高具有很好的應用前景。Nisin應用前景廣闊，但也存在局限性，如不能夠抑制G-菌、酵母菌以及霉菌，在 中性及堿性環(huán)境中溶解度低、不穩(wěn)定而且抗菌效果大大降低等，因此擴大nisin抗菌譜的 研究不僅具有理論價值，而且具有十分重要的應用價值。本發(fā)明針對乳鏈菌肽(nisin)抑菌譜窄的缺點，選擇抗菌譜較廣且具有較強抗性 的牛乳鐵蛋白氨基末端多肽(rbLF-N)為材料，構建融合基因nisin-rbLF-N，并在畢赤酵母 GS115宿主中進行表達，獲得具有較廣抗菌譜的融合蛋白。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種能在大腸桿菌中高效表達的重組nisin-rbLF-N融合基 因。本發(fā)明的另一目的是提供一種含有所述重組nisin-rbLF-N融合基因的表達載 體。本發(fā)明的再一目的是提供能夠高效表達重組nisin-rbLF-N融合基因的大腸桿菌 工程菌及其構建方法。本發(fā)明的進一步目的是提供所述大腸桿菌工程菌的誘導培養(yǎng)方法。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種融合基因，其含有編碼乳酸鏈球菌素的 nisin基因和編碼牛乳鐵蛋白氨基末端多肽的rbLF-N基因。前述的融合基因為Nisin-rbLF-N，其具有Seq ID No. 1所示的核苷酸序列或該序 列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個核苷酸形成的具有編碼同等功能蛋白質的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供含有上述融合基因的表達載體，優(yōu)選地，其出發(fā)載體為PGEX-4T1。本發(fā)明還提供含有上述表達載體的工程菌。優(yōu)選地，所述工程菌為大腸桿菌BL21。本發(fā)明另外提供構建上述大腸桿菌BL21工程菌的方法。根據(jù)密碼子的簡并性，設計并合成適于在BL21中表達的nisin基因，并在5’端和 3’端設計EcoRI和BamHI酶切位點，將優(yōu)化后的nisin基因克隆于pMD19_T載體。根據(jù)目 的序列分別設計引物。在上游引物設計酶切位點BamHI (下劃線標記)和保護堿基。上游引物Fl :5，-CGGGATCCATGAGCACCAAAGAT-3’ ；下游引物Rl :5，-TTTGCTCACATGAATGCTGC-3，。根據(jù)牛乳鐵蛋白cDNA序列，設計引物。在上游引物設計與nisin互補配對的序列 (下劃線標記)，下游引物設計酶切位點EcoR I (下劃線標記)、終止密碼子和保護堿基。上游引物F2 :5，-GCAGCATTCATGTGAGCAAATGTCTGGCTGCCCCGA-3’ ；下游引物R2 5，-CGGAATTCTTACCGGATACATGCCAAGGC-3，。以合成的pMD19-T/niSin質粒為模板，用引物Fl、Rl進行PCR擴增nisin基因 為179bp，純化回收PCR產(chǎn)物；以牛肉中提取的總DNA為模板，用引物F2、R2進行PCR擴增 rbLF-N基因為181bp，純化回收PCR產(chǎn)物；以純化回收后的nisin基因和rbLF_N基因為模 板，用引物Fl、R2進行PCR擴增nisin-rbLF-N融合基因約為340bp。PCR產(chǎn)物純化回收后 與 pGEM-T easy 載體連接，得到 pGEM-T easy/nisin-rbLF-N 質粒。以表達GST融合蛋白的pGEX-4Tl作為表達載體，將經(jīng)過DNA序列分析正確的質粒 pGEM-T easy/nisin-rbLF-N和表達載體pGEX-4Tl分別用限制性內切酶BamH I和EcoR I 進行雙酶切，酶切反應采用20 μ L體系。以上各溶液經(jīng)瞬間離心混勻后，于37°C水浴酶切6h，取6 μ L酶切產(chǎn)物用1 %瓊脂 糖凝膠電泳檢測酶切條帶，切膠回收該目的片段，回收片段置于-20°C下保存。將上述酶切 的目的基因片段連接到PGEX-4T1表達載體中，連接反應采用10 μ L體系。本發(fā)明選用的pEGX-4Tl質粒是表達GST融合蛋白的大腸桿菌高效表達載體，選擇 該載體的主要原因是(1)它含有非常強的tac啟動子，IPTG可誘導目的基因的高效表達； (2)表達產(chǎn)物利于分離純化融合蛋白可通過谷胱甘肽S-轉移酶(GST)親和層析純化，溫 和的抽提條件對融合蛋白的抗原性和功能活性影響極小，再用凝血酶或Xa因子將GST切 除，可方便地獲得目的蛋白。將上述pGEX-4Tl/niSin-rbLF-N原核表達載體轉入大腸桿菌BL21 (DE3)，然后進 行重組克隆的篩選。為了獲得Nisin-rbLF-N重組蛋白的高效表達，所述重組大腸桿菌BL21(DE3)工程 菌在如下條件下誘導培養(yǎng)1)挑取重組大腸桿菌BL21的白色菌落接種于含Amplr的LB液體培養(yǎng)基中37°C過 夜培養(yǎng)；2)按接種量將步驟1)過夜培養(yǎng)的菌液接種于LB液體培養(yǎng)基中，于37°C 擴大培養(yǎng)至菌液OD6tltl值達0. 6 0. 8 ；3)向步驟2)培養(yǎng)得到的菌液中加入IPTG，使其終濃度為lmmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)4h， 離心收集菌體。為了分離純化nisin-rbLF-N重組蛋白，本發(fā)明還提供了由上述工程菌所表達的nisin-rbLF-N重組蛋白的純化方法，包括如下步驟1)用超聲波冰浴破碎重組大腸桿菌BL21的菌體，提取并溶解含有nisin-rbLF-N 重組蛋白的包涵體；2)將步驟1)得到的包涵體進行梯度透析，得到復性的nisin-rbLF-N重組蛋白。具體地說，本發(fā)明nisin-rbLF-N重組蛋白的純化方法包括如下步驟1)向重組大腸桿菌BL21的菌體中加入磷酸鹽緩沖液PBS及溶菌酶，超聲破碎，提 取并溶解含有nisin-rbLF-N重組蛋白的包涵體；將得到的懸濁液用超聲波冰浴破碎2次， 然后用水洗滌2次，得到包涵體蛋白；所述磷酸鹽緩沖液PBS 含有 150mmol/L Tris-HCl, 32mmol/LNa2HP04,4mmol/L NaH2PO4, pH 值為 7.3 ；2)將步驟1)得到的包涵體蛋白用8mol/L尿素溶解，采用濃度梯度透析復性，復性 透析溶液 I 至 VI 分別是 6、4、2、1、0. 5、0mol/L尿素與 20mmol/L Tris-HCl, 500mmol/L NaCl 配制的PH值8. 0的溶液，各濃度的復性透析溶液透析8h，復性后的溶液于5000 X g，離心 20min收集上清。由于尿素能夠使包涵體蛋白變性、溶解，而在短時間內大幅降低尿素濃度會使包 涵體蛋白出現(xiàn)大量沉淀，因此使用尿素緩沖液梯度透析，可以使nisin-rbLF-N重組蛋白慢 慢回復天然結構及活性。本發(fā)明針對Msin抑菌譜窄的缺點，選擇對抗菌譜較廣且具有較強抗性的rbLF-N 為材料，構建nisin-rbLF-N融合基因，并在原核表達系統(tǒng)中表達，獲得具有G+菌抗性的融 合蛋白。其優(yōu)點在于(1)本發(fā)明針對乳鏈菌肽(nisin)抑菌譜窄的缺點，選擇對抗菌譜較廣且具有較 強抗性的牛乳鐵蛋白氨基末端多肽(rbLF-N)為材料，通過特異引物的設計用PCR技術成功 獲得融合蛋白基因nisin-rbLF-N，并能夠由大腸桿菌高效表達，且融合蛋白的表達量占到 菌體蛋白總量的25. 3%，產(chǎn)率為1. 63g/L。(2)使用pEGX-4Tl作為表達載體，經(jīng)過EcoR I和BamH I雙酶切驗證和測序分析， 結果表明與目的基因片段(340bp)的序列相吻合，其編碼的氨基酸閱讀框不變。(3)本發(fā)明將融合基因克隆到原核表達載體PGEX-4T1中，轉化E. coli BL21 (DE3) 進行誘導表達，重組菌經(jīng)誘導后可表達出可觀的融合蛋白，融合蛋白大小為38kD左右。融 合蛋白以包涵體形式存在，包涵體經(jīng)洗滌，尿素溶解，復性后具有干酪乳桿菌(G+菌)抗菌 生物活性。


圖1為本發(fā)明以合成的pMD19-T/niSin質粒為模板，用引物Fl、Rl進行PCR擴增 的nisin基因片段和以牛肉中提取的總DNA為模板，用引物F2、R2進行PCR擴增的rbLF_N 基因片段；其中1為擴增目的片段nisin ；2為陰性對照；3為擴增目的片段rbLF_N ；4為陰 性對照；5 為 DL2000Marker。圖2為本發(fā)明以純化回收后的nisin基因片段和rbLF-N基因片段為模板，用引物 Fl、R2進行PCR擴增nisin-rbLF-N融合基因片段；其中1為nisin-rbLF-N的PCR產(chǎn)物；2 為 DL2000Markero
6
圖3為本發(fā)明重組質粒pGEM-T easy/nisin-rbLF-N的酶切鑒定電泳圖，其中，1為 DL2000Marker ；2為目的基因nisin-rbLF-N的PCR產(chǎn)物對照；3為重組質粒雙酶切產(chǎn)物；4 為重組表達質粒 pGEX-4Tl/nisin-rbLF-N。圖4為本發(fā)明用特異引物Fl和R2從pGEM_T easy/nisin-rbLF-N質粒中擴增到 長度約為 340bp 的融合基因；其中，1 為 DL2000Marker ；2 為 pGEM_T easy/nisin-rbLF-N 質 粒的PCR產(chǎn)物。圖5為本發(fā)明重組表達質粒pGEX-4Tl/niSin-rbLF-N雙酶切鑒定電泳圖，其 中，1為DL2000Marker ；2為重組表達質粒；3為重組表達質粒雙酶切產(chǎn)物；4為目的基因 nisin-rbLF-N 的 PCR 產(chǎn)物對照。圖6為本發(fā)明重組大腸桿菌BL21表達的GST-Ni sin-rbLF-N融合蛋白的SDS-PAGE 分析，其中，M為蛋白Marker ；1為包涵體復性后的上清；2為帶有空載體pGEX_4Tl的大腸 桿菌BL21經(jīng)12000 Xg離心后的上清；3為IPTG誘導含有pGEX-4Tl/nisin-rbLF_N的重組 大腸桿菌BL21，經(jīng)12000 X g離心后的上清；4為IPTG誘導含有pGEX-4Tl/nisin-rbLF_N的 重組大腸桿菌BL21，經(jīng)12000 X g離心后的沉淀。圖7為本發(fā)明nisin-rbLF-N融合蛋白對G+菌的抑菌活性示意圖，其中，1和2為 陽性對照乳酸鏈球菌素IOyL ;3為陰性對照8mol/L尿素經(jīng)透析后的溶液100yL;4為復 性后上清融合蛋白復性后上清100 μ L。圖8為本發(fā)明nisin-rbLF-N融合蛋白對G-菌的抑菌活性示意圖，其中，1為對照 乳酸鏈球菌素10μ L ;2為復性后上清融合蛋白復性后上清100 μ L。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例Inisin基因及牛乳鐵蛋白基因引物的設計、合成根據(jù)nisin基因序列及蛋白序列，使目的基因獲得穩(wěn)定表達，用適于在BL21中表 達的密碼子代替那些不適合于在其中表達的密碼子優(yōu)化nisin基因，并在5’端和3’端設 計EcoR I和BamH I酶切位點。優(yōu)化后的nisin基因序列合成并克隆于pMD19_T載體。根 據(jù)目的序列分別設計引物。在上游引物設計酶切位點BamH I (下劃線標記)和保護堿基。上游引物Fl :5，-CGGGATCCATGAGCACCAAAGAT-3’ ；下游引物Rl :5，-TTTGCTCACATGAATGCTGC-3，。根據(jù)牛乳鐵蛋白cDNA序列，設計引物。在上游引物設計與nisin互補配對的序列 (下劃線標記)，下游引物設計酶切位點EcoR I (下劃線標記)、終止密碼子和保護堿基。上游引物F2:5， -GCAGCATTCATGTGAGCAAATGTCTGGCTGCCCCGA-3’ ；下游引物R2:5，-CGGAATTCTTACCGGATACATGCCAAGGC-3’。實施例2重組質粒pGEM-T easy/nisin-rbLF-N的構建與鑒定以合成的pMD19-T/niSin質粒為模板，用引物Fl、Rl進行PCR擴增nisin基因為 179bp，純化回收PCR產(chǎn)物(圖1)；以牛肉中提取的總DNA為模板，用引物F2、R2進行PCR擴 增rbLF-N基因為181bp，純化回收PCR產(chǎn)物(圖1)；以純化回收后的nisin基因和rbLF_N基因為模板，用引物F1、R2進行PCR擴增ηi sin-rbLF-N融合基因約為340bp，純化回收PCR 產(chǎn)物(圖2)后與pGEM-T easy載體連接，并轉化E. coli DH5 α，用PCR及EcoRI和BamHI 雙酶切鑒定陽性克隆。(圖4)實施例3niSin-rbLF-N基因表達載體的構建以表達GST融合蛋白的pGEX-4Tl作為表達載體，將經(jīng)過DNA序列分析正確的質粒 pGEM-T easy/nisin-rbLF-N和表達載體pGEX-4Tl分別用限制性內切酶BamH I和EcoR I 進行雙酶切，酶切反應采用20 μ L體系。(圖3)以上各溶液經(jīng)瞬間離心混勻后，于37°C水浴酶切6h，取6 μ L酶切產(chǎn)物用1 %瓊脂 糖凝膠電泳檢測酶切條帶，并切膠回收該目的片段，回收片段置于-20°C下保存。將上述酶 切的目的基因片段連接到PGEX-4T1表達載體中，連接反應采用IOyL體系。反應條件為 95°C，4min ；94°C，30s，退火溫度 58°C，60s，延伸 72°C，30s，35 個循環(huán)；72°C保溫 IOmin。(圖 5)實施例4大腸桿菌BL21 (DE3)的轉化及重組菌的篩選、誘導表達(1)取出-80°C凍存的大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞50 μ L于冰上解凍。(2)將5 μ L連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細胞中，輕輕混勻后，于冰上放置30min。(3)將轉化體系于42°C，熱激90s后，立即放回冰上靜置5min。(4)由冰上取出并加入900 μ L不含Amp的LB培養(yǎng)液，輕混勻后，于150rpm，37 °C 搖床預培養(yǎng)1. 5h。(5)于室溫，5000 X g 離心 8min，棄去上清液，加入 IPTG (24mg/mL)和 X_gal (20mg/ mL)各10 μ L，將溶液輕輕混勻后，取100 μ L均勻涂布于含有Amp的LB平板上。(6) 370C，倒置培養(yǎng)12 18h后，在含有Amp的LB平板(Amp的濃度為60mg/mL) 上挑白色菌落提取質粒，并進行雙酶切鑒定。(7)挑取大腸桿菌BL21的白色菌落(轉化子)接種于5mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C 過夜培養(yǎng)，用重組表達質粒pGEX-4Tl/niSin-rbLF-N為模板，F(xiàn)U R2為引物進行PCR反應。 PCR 反應條件95°C 4min ；94°C 30s，退火溫度 58°C 60s，延伸 72°C 30s, 35 個循環(huán)；72°C保 溫lOmin。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，擴增的片段長度為336bp。重組大腸桿菌的誘導表達挑取含有重組質粒的大腸桿菌BL21白色菌落接種于 Ampr的LB液體培養(yǎng)基中37°C過夜培養(yǎng)，按5v/v%的接種量吸取菌液，接種于LB液體培養(yǎng) 中于37°C擴大培養(yǎng)直至菌液0D_值達到0. 6 0. 8 ；加入IPTG使其終濃度為lmmol/L，繼 續(xù)培養(yǎng)4h;將菌液離心(5000Xg，10min)收集菌體。實施例5提取包涵體將離心收集的菌體重懸于pH為7. 3的0. 01mol/L的磷酸鹽緩沖液PBS (150mmol/ L Tris-HCl，32mmol/L Na2HPO4,4mmol/L NaH2PO4)中，使其含量為 100g/L，加入溶菌酶至 0. lmg/mL, 37°C消化lOmin。懸濁液超聲波冰浴破碎，220 400W每次破碎時間為7s，各次 間隔10s，15次；4°C 12000g離心IOmin沉淀包涵體，除去上清。用包涵體洗滌液重懸沉淀， 再進行超聲離心。然后用水洗滌，并且于12000 Xg離心收集沉淀，重復兩次，收集沉淀(包 涵體)，凍干，-80°C保存。實施例6復性重組蛋白將收集的包涵體用8mol/L尿素溶解，采用濃度梯度透析復性。復性透析溶液I至
8VI 分別是 6、4、2、1、0. 5、0mol/L 尿素與 20mmol/LTris-HCl，500mmol/L NaCl 配制的 pH 值 8. 0的溶液，各濃度的復性透析溶液透析8h，復性后的溶液于5000Xg，離心20min收集上清。實施例7鑒定重組蛋白收集后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE 電泳，Tricine-SDS-PAGE 分析發(fā)現(xiàn)，GST-nisin-rbLF-N 重組融合蛋白主要以包涵體的形式存在。(圖6)實施例8重組蛋白抗菌活性的初步檢測取復性后上清液，采用瓊脂擴散法檢測抗菌活性，測試菌株為干酪乳桿菌 (G+菌)和大腸桿菌(G-菌)，抗菌活性如圖7和圖8所示?？咕钚詸z測結果表明， GST-nisin-rbLF-N融合蛋白具有革蘭氏陽性菌抗性。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
權利要求
含有nisin rbLF N融合基因的表達載體，所述nisin rbLF N融合基因含有編碼乳酸鏈球菌素的nisin基因和編碼牛乳鐵蛋白氨基末端多肽的rbLF N基因。
2.如權利要求1所述的表達載體，所述nisin-rbLF-N融合基因具有SeqID No. 1所示 的核苷酸序列或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個核苷酸形成的具有編碼同等功能蛋 白質的核苷酸序列。
3.如權利要求1或2所述的表達載體，其特征在于，其出發(fā)載體為PGEX-4T1。
4.含有權利要求1-3任一項所述表達載體的工程菌。
5.如權利要求4所述的工程菌，其特征在于，其為大腸桿菌BL21。
6.構建權利要求5所述工程菌的方法，其特征在于，包括如下步驟1)根據(jù)密碼子的簡并性，設計并合成適于在BL21中表達的nisin基因，將優(yōu)化后的 nisin基因克隆于pMD19-T載體，以合成的pMD19-T/niSin質粒為模板，用引物F1、R1進行 PCR擴增nisin基因，純化回收PCR產(chǎn)物；以從牛肉中提取的總DNA為模板，用引物F2、R2 進行PCR擴增rbLF-N基因，純化回收PCR產(chǎn)物；以純化回收后的nisin基因和rbLF_N基因 為模板，用引物Fl、R2進行PCR擴增nisin-rbLF-N融合基因，純化回收PCR產(chǎn)物；其中，F(xiàn)l :5，-CGGGATCCATGAGCACCAAAGAT-3，；Rl :5’ -TTTGCTCACATGAATGCTGC-3’ ；F2 5' -GCAGCATTCATGTGAGCAAATGTCTGGCTGCCCCGA-3'；R2 :5’ -CGGAATTCTTACCGGATACATGCCAAGGC-3’ ；2)將步驟1)中合成的nisin-rbLF-N融合基因插入到載體pGEX-4Tl中；3)將步驟2)的含有nisin-rbLF-N融合基因的pGEX_4Tl載體轉入大腸桿菌BL21中， 然后進行重組克隆的篩選，獲得重組大腸桿菌BL21工程菌。
7.權利要求5所述工程菌的誘導培養(yǎng)方法，包括如下步驟1)挑取重組大腸桿菌BL21的白色菌落接種于含Amplr的LB液體培養(yǎng)基中37°C過夜培養(yǎng)；2)按接種量將步驟1)過夜培養(yǎng)的菌液接種于LB液體培養(yǎng)基中，于37°C擴大 培養(yǎng)至菌液OD6tltl值達0. 6 0. 8 ；3)向步驟2)培養(yǎng)得到的菌液中加入IPTG，使其終濃度為lmmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)4h，離心 收集菌體。
8.權利要求5所述工程菌表達的nisin-rbLF-N重組蛋白的純化方法，包括如下步驟1)用超聲波冰浴破碎重組大腸桿菌BL21的菌體，提取并溶解含有nisin-rbLF-N重組 蛋白的包涵體；2)將步驟1)得到的包涵體進行梯度透析，得到復性的nisin-rbLF-N重組蛋白。
9.如權利要求8所述的純化方法，其特征在于，包括如下步驟1)向重組大腸桿菌BL21的菌體中加入磷酸鹽緩沖液PBS及溶菌酶，超聲破碎，提取并 溶解含有nisin-rbLF-N重組蛋白的包涵體；將得到的懸濁液用超聲波冰浴破碎2次，然后 用水洗滌2次，得到包涵體蛋白；所述磷酸鹽緩沖液 PBS 含有 150mmol/L Tris-HC 1, 32mmo 1 /LNa2HPO4, 4mmo 1 /L NaH2PO4, ρΗ值為7. 3 ；2)將步驟1)得到的包涵體蛋白用8mol/L尿素溶解，采用濃度梯度透析復性，復性透析溶液 I 至 VI 分別是6、4、2、1、0. 5、0mol/L尿素與 20mmol/L Tris-HCl, 500mmol/L NaCl 配制 的pH值8. 0的溶液，各濃度的復性透析溶液透析8h，復性后的溶液于5000 X g，離心20min收集上清。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種Nisin-rbLF-N融合基因、含有該基因序列的表達載體，以及能夠高效表達Nisin-rbLF-N融合基因的重組大腸桿菌工程菌；另外，本發(fā)明還提供了所述重組大腸桿菌工程菌的誘導培養(yǎng)方法。本發(fā)明通過PCR方法，將融合基因Nisin-rbLF-N克隆到原核表達載體pGEX-4T1中，轉化大腸桿菌BL21后進行誘導表達，能夠表達出可觀的融合蛋白。融合蛋白以包涵體形式存在，包涵體經(jīng)溶解、復性后具有干酪乳桿菌(G+菌)抗菌生物活性。
文檔編號C07K1/14GK101974548SQ201010258789
公開日2011年2月16日 申請日期2010年8月20日 優(yōu)先權日2010年8月20日
發(fā)明者王海峰, 田文瑩, 田洪濤, 羅云波, 袁曉宇, 許文濤, 黃昆侖 申請人:中國農業(yè)大學