專利名稱：在畢赤酵母細胞器中表達的重組酪氨酸激酶及其基因、衍生融合蛋白和制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程和蛋白質(zhì)分離純化領(lǐng)域，特別涉及一種在畢赤酵母(Pichia pastoris)細胞器中表達的重組酪氨酸激酶及其基因、衍生融合蛋白和制備方法。
背景技術(shù)：
酪氨酸激酶(Tyrosine kinase)是一種能選擇性地使不同底物的酪氨酸殘基磷酸化的酶，可大致分為受體型酪氨酸激酶和非受體型酪氨酸激酶。受體型酪氨酸激酶代表如表皮生長因子受體(EGFR)、血小板衍生生長因子受體(PDGFR)、成纖維細胞生長因子受體(FGFR)、人激酶插入?yún)^(qū)受體(Homo sapiens kinase insert domain receptor，簡稱KDR)等。其中，KDR也稱為人血管內(nèi)皮細胞生長因子受體2(簡稱vEGFR2)，其是一種受體型酪氨酸激酶，它在Genebank蛋白數(shù)據(jù)庫中的登陸號為NP_002244，KDR具有血管內(nèi)皮細胞生長因子受體活性，在血管發(fā)育、血管增生和調(diào)節(jié)血管滲透性等方面具有重要功能。而非受體型酪氨酸激酶代表如Src、ABL、FAK等。
雖然磷酸化的酪氨酸僅占體內(nèi)磷酸化氨基酸的0.5％，但是一系列證據(jù)表明，酪氨酸磷酸化在許多細胞調(diào)節(jié)過程中起著重要作用。這些作用體現(xiàn)在T細胞和B細胞的活化、對外來刺激的反應、有絲分裂、細胞分化和形成、血管增生、神經(jīng)遞質(zhì)的轉(zhuǎn)導、細胞周期的生長控制、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、葡萄糖的攝取、腫瘤的產(chǎn)生以及細胞凋亡等過程。因此，酪氨酸激酶功能的紊亂可以導致許多疾病。正常情況下，細胞的酪氨酸激酶磷酸化作用是由酪氨酸激酶和酪氨酸磷酸酶拮抗調(diào)節(jié)來維持平衡的。但是，如基因突變、基因融合、自分泌和旁分泌循環(huán)等病理機制，會導致酪氨酸激酶的持續(xù)活化，從而阻斷了其對細胞分化、生長和凋亡等的調(diào)節(jié)功能，誘發(fā)腫瘤。鑒于酪氨酸激酶在腫瘤分子病原學上的重要作用，強效的酪氨酸激酶抑制劑可能在腫瘤的治療中有著重要意義。近年來，蛋白酪氨酸激酶廣泛地被作為抗腫瘤藥物篩選的靶標蛋白。
目前酪氨酸激酶的獲取方法有限，成本昂貴，一般采用下列方法1)從腫瘤細胞或組織中分離純化Wolfgang Webe等(The Journal of Biological Chemistry，1984，259(23)14631～14636)用免疫親和層析的方法，從大量表達EGFR的A431細胞(人陰道上皮癌細胞)中分離純化得到了內(nèi)皮細胞生長因子(EGF)受體。但這種方法成本極高、產(chǎn)量少。
2)采用昆蟲表達體系進行表達Greenfield等(The EMBO Journal，1988，7(1)139～146)將編碼EGFR的cDNA克隆入桿狀病毒載體pAc373，轉(zhuǎn)染SF9昆蟲細胞，表達出具有活性的EGFR。但是昆蟲表達系統(tǒng)表達存在成本高、產(chǎn)量低等缺點。
3)采用原核表達系統(tǒng)進行表達李林等(第二軍醫(yī)大學學報，2004，25(12)1353～1356)將EGFR-RTK的cDNA片段插入pQE30質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染大腸桿菌M15，IPTG誘導表達融合蛋白，表達的包涵體蛋白經(jīng)復性后親和層析法純化，ELISA方法測定蛋白具有生物學活性。雖然此法較傳統(tǒng)的昆蟲細胞表達系統(tǒng)簡便與經(jīng)濟，但是EGFR-RTK在大腸桿菌中絕大多數(shù)是以包涵體形式存在，后續(xù)的蛋白復性工藝收率較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明最主要的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種低成本、表達量高的重組酪氨酸激酶及其制備方法。
為此，本發(fā)明人首先篩選生長繁殖迅速、成本低的表達系統(tǒng)，其中畢赤酵母(Pichia pastoris)是一種優(yōu)良的表達系統(tǒng)，具有表達量高、穩(wěn)定性好、分泌量高、能進行多種翻譯后加工修飾、遺傳背景清楚、生長繁殖迅速、工藝簡單、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點。
然而由于酪氨酸激酶介導細胞信號轉(zhuǎn)導途徑，并調(diào)節(jié)細胞的生長、凋亡等多種功能。一般基因工程菌胞內(nèi)的表達重組蛋白積累在細胞質(zhì)中。如果按常規(guī)方法直接在畢赤酵母細胞質(zhì)中表達酪氨酸激酶，該激酶會影響酵母細胞的正常功能，對酵母細胞產(chǎn)生毒性甚至導致細胞死亡。故而目前尚未有在畢赤酵母中成功表達酪氨酸激酶的報道。為了避免對細胞產(chǎn)生毒害且免受蛋白酶降解，本發(fā)明人通過諸多試驗研究發(fā)現(xiàn)，將酪氨酸激酶定位至畢赤酵母的細胞器，如過氧化物酶體中進行表達可解決此問題。
為了使酪氨酸激酶定位在細胞器中表達，本發(fā)明在現(xiàn)有酪氨酸激酶蛋白的C端或N端加上可使蛋白定向輸送到畢赤酵母細胞器過氧化物酶體的定位信號(Peroxisomal Targeting Signal，PTS)。其中，所說的過氧化物酶體定位信號PTS可以是現(xiàn)有文獻報道的任何具有上述功能的肽，其通常是由若干個氨基酸組成的短肽，如加在C端的PTS1具有下列結(jié)構(gòu)通式絲氨酸/丙氨酸/半胱氨酸-賴氨酸/組氨酸/精氨酸-亮氨酸/甲硫氨酸(S/A/C-K/H/R-L/M)(見文獻Ann Rev Cell Biol，1993，9445-478)；加在N端的PTS2具有下列結(jié)構(gòu)通式精氨酸/賴氨酸-亮氨酸/異亮氨酸/纈氨酸-X5-組氨酸/谷氨酰胺-亮氨酸/丙氨酸R/K-L/I/V-X5-H/Q-L/A(見文獻J Biol Chem，1994，2697558-7563)，X5代表任意五個氨基酸。其中，上述符號“/”代表“或”的意思。
因此，本發(fā)明在畢赤酵母細胞器中表達的重組酪氨酸激酶，其具有下列結(jié)構(gòu)通式PTS2-酪氨酸激酶，或酪氨酸激酶-PTS1，其中，PTS1和PTS2代表可使激酶蛋白定向輸送到畢赤酵母過氧化物酶體的定位信號，PTS1是具有下列結(jié)構(gòu)式S/A/C-K/H/R-L/M的氨基酸序列的三肽；PTS2是具有下列結(jié)構(gòu)式R/K-L/I/V-X5-H/Q-L/A的氨基酸序列的九肽，其中X5代表任意五個氨基酸。
本發(fā)明所說的酪氨酸激酶可以是任何能使不同底物的酪氨酸殘基磷酸化的酶，包括受體型酪氨酸激酶EGFR、PDGFR、FGFR和KDR等，以及非受體型酪氨酸激酶Src、ABL及FAK等。
在本發(fā)明一較佳例中，所述酪氨酸激酶為KDR(氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示)，所述PTS1的氨基酸序列為SKL(絲氨酸-賴氨酸-亮氨酸)，構(gòu)成的該重組酪氨酸激酶的氨基酸序列即為SEQ ID No.2所示的KDR的氨基酸序列末端再加上SKL，具體參見序列表中SEQ ID No.7所示氨基酸序列中的第261-629位氨基酸序列。
本發(fā)明的另一較佳例中，所述酪氨酸激酶為非受體型酪氨酸激酶Src(氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.16所示)，所述PTS2的氨基酸序列為RLNNLATQL(精氨酸-亮氨酸-天冬酰胺-天冬酰胺-亮氨酸-丙氨酸-蘇氨酸-谷氨酰胺-亮氨酸)，構(gòu)成的該重組酪氨酸激酶的氨基酸序列即為SEQ IDNo.16所示的Src的氨基酸序列前面再加上RLNNLATQL，具體參見序列表中SEQ ID No.19所示氨基酸序列中全部或第3-547位氨基酸序列，其中，第1-2位是優(yōu)選pPIC3.5K質(zhì)粒作為表達載體時，為了保證正確地開始翻譯目的基因，而添加的包含有起始密碼子ATG的Kozak序列ATGGCT對應的氨基酸序列。
因此，顯然上述兩較佳例的重組酪氨酸激酶還可以是將所述氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有相同酶活性的，由這些序列如序列表中SEQ ID No.7所示的第261-629位氨基酸序列或SEQ IDNo.19所示的第3-547位氨基酸序列衍生的蛋白質(zhì)，比如在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸，如與載體編碼的氨基酸融合、不影響序列的修飾形式上的差異等情況。
本發(fā)明的另一目的是提供上述在畢赤酵母細胞器中表達的重組酪氨酸激酶的cDNA。
顯然，該cDNA是由一種編碼酪氨酸激酶的任何核苷酸序列加上編碼上述過氧化物酶體定位信號PTS的核苷酸序列構(gòu)成。
已公開的編碼一種酪氨酸激酶KDR的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNo.1所示。然而，所述酪氨酸激酶為人源的，而畢赤酵母翻譯系統(tǒng)與動物細胞翻譯系統(tǒng)存在著差異，其氨基酸密碼子的使用頻率不同。當畢赤酵母表達外源蛋白質(zhì)時，如果外源基因轉(zhuǎn)錄的mRNA中密碼子的分配情況與畢赤酵母相似，則細胞能正常進行蛋白質(zhì)翻譯，蛋白在翻譯過程中出現(xiàn)錯誤的頻率較少。反之如果mRNA帶有較多的稀有密碼子，畢赤酵母內(nèi)識別稀有密碼子的tRNA量不能滿足翻譯過程中的需要，會使外源蛋白在翻譯水平上出現(xiàn)移碼突變、翻譯水平下降等障礙，從而影響基因的表達。因此為提高表達水平，更佳地，本發(fā)明優(yōu)選針對畢赤酵母密碼子偏愛性的酪氨酸激酶蛋白的基因序列，如序列表中SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
以過氧化物酶體定位信號PTS1的氨基酸序列為SKL時為例，編碼SKL的堿基序列為TCCAAGTTG，故上述重組酪氨酸激酶一較佳例——重組KDR的cDNA可以是SEQ ID No.1所示的核苷酸序列末端加上TCCAAGTTG，即為序列表中SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；或者是SEQ ID No.3所示的核苷酸序列末端加上TCCAAGTTG，即為序列表中SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；也可以是其它任何能編碼由序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)所對應的堿基序列的末端加上TCCAAGTTG。
而已公開的編碼另一種酪氨酸激酶Src的核苷酸序列如序列表中SEQID No.15所示(GeneBank登陸號為NM_005417)。
以過氧化物酶體定位信號PTS2的氨基酸序列為RLNNLATQL時為例，編碼RLNNLATQL的堿基序列為AGATTGAACAACTTGGCTACTCAATTG，故上述另一較佳例——重組Src的cDNA可以是SEQ ID No.15所示的核苷酸序列前端加上AGATTGAACAACTTGGCTACTCAATTG，即為序列表中SEQID No.17所示的核苷酸序列中的7-1641位核苷酸序列，SEQ ID No.17所示的核苷酸序列中第1-6位堿基是使用pPIC3.5K質(zhì)粒作為表達載體時，為保證正確地開始翻譯目的基因而加入的包含有起始密碼子ATG的Kozak序列ATGGCT；本發(fā)明重組Src的cDNA也可以是其它任何能編碼由序列表中SEQ ID No.16所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)所對應的堿基序列的前端加上AGATTGAACAACTTGGCTACTCAATTG。
更佳地，本發(fā)明將酪氨酸激酶和標記蛋白融合表達，這樣做的技術(shù)優(yōu)勢在于可以通過對標記蛋白的測定來間接檢測激酶的表達量，便于在菌種篩選、發(fā)酵和純化過程中實時監(jiān)測酪氨酸激酶的活性和產(chǎn)量。
因此，本發(fā)明的再一目的是提供一種上述重組酪氨酸激酶的衍生融合蛋白，其為標記蛋白與酪氨酸激酶的融合蛋白。
本發(fā)明優(yōu)選的標記蛋白為熒光蛋白。因為熒光蛋白無論在原核或真核細胞中表達，當用一定波長激發(fā)時，都能產(chǎn)生一種很亮的熒光(生理科學進展，2002，33(4)，364～366)。此外，熒光蛋白還具有低毒性、不干擾正常的細胞活動等優(yōu)點。
將酪氨酸激酶和熒光蛋白融合表達，可以通過熒光顯微鏡、熒光酶標儀或流式細胞儀等快速檢測熒光強度來間接檢測激酶的表達量，并可在菌種篩選、發(fā)酵和純化過程中通過熒光強度檢測實時監(jiān)測酪氨酸激酶的活性和產(chǎn)量。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員知曉，熒光蛋白包括綠色、黃色、紅色熒光蛋白等，這些不同顏色的熒光蛋白均可用于本發(fā)明。
為了便于從純化的融合蛋白中得到重組酪氨酸激酶單體，本發(fā)明在熒光蛋白和酪氨酸激酶之間引入了凝血酶(thrombin)酶切位點(氨基酸序列LVPRGS)，這樣可以用凝血酶從融合蛋白中酶切得到酪氨酸激酶。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員知曉，為了便于從純化的融合蛋白中得到重組酪氨酸激酶單體，除了在熒光蛋白和酪氨酸激酶之間引入了凝血酶酶切位點外，其他酶切位點還有腸激酶位點(氨基酸序列DDDDK)，Xa因子位點(氨基酸序列IEGR)，HRV 3C位點(氨基酸序列LEVLFQGP)等，這些酶切位點均可用于本發(fā)明。
在本發(fā)明一較佳實施例中，所述的衍生融合蛋白中含有的標記蛋白選用綠色熒光蛋白(GFP)，GFP是來源于水母(Aequorea victoria)的一條由238個氨基酸組成的多肽鏈(其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.10所示，核苷酸序列如SEQ ID No.9所示)；所述酶切位點選用凝血酶酶切位點；該衍生融合蛋白具有序列表中SEQ ID No.7所示的第15-629位氨基酸序列，其中第15～252位為GFP的氨基酸序列，第253-254位為核酸酶EcoRI位點，第255-260位為凝血酶酶切位點的氨基酸序列，第261-629位為重組酪氨酸激酶KDR的氨基酸序列；編碼該衍生融合蛋白的cDNA核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.6所示的第43-1887位核苷酸序列。
更佳地，為了簡化純化工藝，降低生產(chǎn)成本，本發(fā)明在熒光蛋白和酪氨酸激酶融合蛋白的N端加了便于親和純化的純化標記蛋白或肽，如多聚組氨酸(His-tag)序列(6-10個組氨酸)，這樣可以通過鎳離子親和層析或其它方法純化激酶。當然，除了多聚組氨酸序列，其他現(xiàn)有便于純化的純化標記蛋白或肽均可用于本發(fā)明，例如GST Tag、S Tag、T7 Tag、CBD Tag等(見pET system manual，www.novagen.com)。
上述包括多聚組氨酸序列的衍生融合蛋白具有序列表中SEQ ID No.7所示的全部或第3-629位氨基酸序列，其中，第1-2位為包含有起始密碼子ATG的Kozak序列ATGGCT編碼的2個氨基酸，第3-12位為His-tag(10個組氨酸組成)；編碼該衍生融合蛋白的cDNA核苷酸序列如序列表中SEQ IDNo.6的全部或第7-1887位堿基序列所示，相應地，SEQ ID No.6中的第1-6位為包含有起始密碼子ATG的Kozak序列ATGGCT。
本發(fā)明所說的“Kozak序列”是指在使用pPIC3.5K質(zhì)粒作為表達載體時，為了保證正確地開始翻譯目的基因，通常需要在目的基因前端加入一段包含有ATG的Kozak序列(Multi-Copy Pichia Expression Kit，Version E，Invitrogen)。其中ATG相當于隨后目的基因的起始密碼子，ATG后面的三個核苷酸可以是G開頭的任何三個核苷酸。在本發(fā)明的兩個較佳實施例中添加的ATGGCT即為一段合適的Kozak序列，當然如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知曉，ATG后面的三個核苷酸可以不僅限于GCT。
當然，本發(fā)明也可以將酪氨酸激酶單和上述純化標記蛋白或肽融合表達。在本發(fā)明的一較佳例中，采用GST-tag作為純化標記(其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.21所示，核苷酸序列如SEQ ID No.20所示)，并在酪氨酸激酶Src和純化標記之間引入了腸激酶(EK)酶切位點(氨基酸序列DDDDK)，這樣可以用腸激酶從融合蛋白中酶切得到酪氨酸激酶。本例中的衍生融合蛋白具有序列表中SEQ ID No.19所示的全部或第3-777位氨基酸序列，其中，第1-547或3-547位為重組酪氨酸激酶Src的氨基酸序列，第548-552位為EK酶切位點的氨基酸序列，第553-554位為EcoRI位點，第555-777位為GST-tag；編碼該衍生融合蛋白的cDNA核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.18的全部或第7-2331位堿基序列所示。
本發(fā)明的再一目的是提供一種含有上述目的蛋白基因序列的重組表達載體。
該重組表達載體可以包括下列核苷酸序列之一1)上述重組酪氨酸激酶，如重組KDR的cDNA核苷酸序列，例如序列表中SEQ ID No.4、SEQ ID No.5所示的堿基序列以及其他編碼由序列表SEQID No.7所示的氨基酸序列中第261-629位氨基酸組成的蛋白質(zhì)所對應的堿基序列；或是重組Src的cDNA核苷酸序列，例如序列表中SEQ ID No.17所示的全部或第7-1641位堿基序列以及其他編碼由序列表SEQ ID No.19所示的全部或第3-547位氨基酸組成的蛋白質(zhì)所對應的堿基序列；2)上述熒光蛋白和酪氨酸激酶的融合蛋白(如GFP-KDR)的cDNA核苷酸序列，如序列表中SEQ ID No.6所示的第43-1887位堿基序列；3)上述含有多聚組氨酸的衍生融合蛋白的cDNA核苷酸序列，如序列表中SEQ ID No.6所示的全部或7-1887位堿基序列；或是含有GST-tag的衍生融合蛋白的cDNA核苷酸序列，如序列表中SEQ ID No.18所示的全部或第7-2331位堿基序列。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，重組表達載體可以是能方便地進行重組DNA操作并能導致目的蛋白序列表達的任何載體。載體的選擇一般取決于載體與待引入載體的宿主細胞之間的相容性。載體可以是自主復制性載體，即作為一種染色體外實體存在的載體，其復制不依賴于染色體的復制。載體可含有保證自主復制的任何元件。另外，載體也可以是這樣一種載體，當引入宿主細胞后，可以整合到基因組中并與所整合的染色體一起復制。
本發(fā)明的表達載體優(yōu)選的含有一種或多種使轉(zhuǎn)化細胞能得到方便篩選的選擇性標記。選擇性標記是一種基因，其產(chǎn)物提供抗生素抗性、殺生物劑或病毒抗性、重金屬抗性等。如提供抗生素抗性的氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性的標記。適當?shù)谋磉_載體的選擇取決于待表達的目的蛋白及所選表達宿主細胞。本發(fā)明的表達宿主細胞為畢赤酵母，故選用的表達載體為適用于畢赤酵母的現(xiàn)有任何載體，包括但不限于pPIC衍生質(zhì)粒pPIC3.5K、pPIC9K，或它們的衍生物。
本發(fā)明的又一目的是提供含有本發(fā)明的目的基因和重組表達載體的宿主細胞，其用于目標酪氨酸激酶的重組生產(chǎn)。將含有本發(fā)明的目的基因的重組表達載體引入宿主細胞中，使載體作為染色體整合體保持于其中。術(shù)語“宿主細胞”還包括由于復制期間發(fā)生突變而與親代細胞不同的親代細胞的任何子代。
本發(fā)明中所用的宿主細胞是真核表達宿主——畢赤酵母細胞，所述的畢赤酵母包括但不限于現(xiàn)有的GS115、KM71菌株等。
本發(fā)明的另一目的是提供上述重組酪氨酸激酶的制備方法。
本發(fā)明制備方法的關(guān)鍵在于將酪氨酸激酶定位至畢赤酵母細胞器過氧化物酶體中進行表達，其包括在編碼酪氨酸激酶的任何基因序列上連接使蛋白定向輸送到畢赤酵母細胞器過氧化物酶體的定位信號PTS(如PTS1或PTS2)的基因序列，從而構(gòu)成在畢赤酵母細胞器中表達的重組酪氨酸激酶的cDNA核苷酸序列，接著制備含有該cDNA核苷酸序列的重組表達載體，將所述重組表達載體轉(zhuǎn)化真核表達宿主畢赤酵母，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，將培養(yǎng)物分離純化的步驟。
所述的表達載體如上述的pPIC衍生質(zhì)粒，真核表達宿主為畢赤酵母GS115、KM71菌株等。制備重組表達載體和轉(zhuǎn)化體可采用現(xiàn)有基因工程技術(shù)。如制備上述含有多聚組氨酸、表達GFP-KDR衍生融合蛋白(His-GFP-KDR)的重組載體時，可分別在KDR基因的兩端引入EcoRI和NotI酶切位點，GFP基因兩端引入PstI和EcoRI酶切位點，His-tag基因兩端引入XbaI-SnaBI和PstI酶切位點；分別將His-tag與GFP以PstI酶切位點相連，將均經(jīng)EcoRI/NotI酶切處理后的pPIC3.5K與KDR連接，再將上述兩者經(jīng)SnaBI/EcoRI酶切處理后連接，得到最終表達載體pPIC3.5K-plus。又如制備上述含有GST-tag、表達Src衍生融合蛋白(GST-Src)的重組表達載體時，可分別在Src基因的兩端引入SnaBI和EcoRI酶切位點，GST-tag基因兩端引入EcoRI和AvrII酶切位點；將均經(jīng)SnaBI/EcoRI酶切處理后的pPIC3.5K與Src連接得質(zhì)粒Src-pPIC3.5K，再將均經(jīng)EcoRI/AvrII酶切處理后的Src-pPIC3.5K與GST-tag連接，得到最終表達載體Src-GST-pPIC3.5K。而向畢赤酵母細胞中引入重組表達載體的方法可以是原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電穿孔法、PEG法以及LiCl法等。培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體及將培養(yǎng)物分離純化的方法也均可采用現(xiàn)有技術(shù)(參見J.薩母布魯克等編的《分子克隆實驗指南》)。
本發(fā)明的效果在于本發(fā)明將酪氨酸激酶定位在過氧化物酶體這一畢赤酵母的細胞器中，減少了激酶對宿主畢赤酵母菌株的毒害，首次實現(xiàn)了酪氨酸激酶在酵母中的大量表達制備。本發(fā)明還通過優(yōu)化酪氨酸激酶cDNA的密碼子，使其適合在畢赤酵母中表達。同時將酪氨酸激酶基因和熒光蛋白融合表達，以便于激酶的監(jiān)測。最后本發(fā)明在融合蛋白的N端或C端加了便于親和純化的氨基酸序列，可以簡化純化工藝，減少純化的成本。同時畢赤酵母表達的酪氨酸激酶不會形成包涵體，要比大腸桿菌表達具有更好的優(yōu)勢。通過以上技術(shù)的應用，本發(fā)明實現(xiàn)了高生物活性的酪氨酸激酶在畢赤酵母中低成本、大量制備。


圖1為現(xiàn)有酪氨酸激酶KDR基因序列(上行)、本發(fā)明針對畢赤酵母密碼子偏愛性而優(yōu)化的KDR基因序列(中行，其中與原基因序列相同的堿基未列出)以及它們編碼的KDR氨基酸序列(下行)。
圖2為帶有His-tag、GFP和KDR基因的重組表達載體構(gòu)建示意圖。
圖3為PCR擴增GFP和KDR圖譜，其中control為對照。
圖4為PCR驗證重組表達載體質(zhì)粒pPIC3.5K-plus的圖譜。
圖5為Ni柱親和純化本發(fā)明衍生融合蛋白His-GFP-KDR結(jié)果。
圖6為帶有Src和GST-tag基因的重組表達載體構(gòu)建示意圖。
圖7為GST-Agarose親和層析柱親和純化本發(fā)明衍生融合蛋白GST-Src結(jié)果。
具體實施例方式
下面用實施例來進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。
下列實施例中的材料與方法為所采用的分子克隆技術(shù)參見J.薩母布魯克等編的《分子克隆實驗指南》。
所使用的工具酶均購自TaKaRa生物公司(大連，中國)，具體的反應條件和使用的方法均參考商品說明書。
下面的商品化質(zhì)粒和大腸桿菌株用于基因克隆pBlueScript(+)和pUC19購自天根生化科技(北京)有限公司；pDEST15購自Invitrogen公司；pPIC3.5K、大腸桿菌Top10、畢赤酵母GS115、KM71菌株購自Invitrogen。
λ-DNA HindIII Marker(Takala，大連寶生物公司)，Ni親和層析柱(Ni Sepharose 6 Fast Flow，GE公司)，GST-Agarose親和層析柱(Amersham Pharmacia Biotech公司)。
實施例1 重組酪氨酸激酶KDR的制備及活性試驗實施例1.1 帶有His-tag序列的重組質(zhì)粒的制備His-tag基因序列由63個堿基組成，見序列表SEQ ID NO8，該序列由商業(yè)化合成[生工生物工程(上海)有限公司]。該序列的5’端含XbaI-SnaBI酶切位點(5’端第4-15位堿基)以及包含有起始密碼子的Kozak序列ATGGCT(5’端第19-24位堿基)，3’端含PstI酶切位點(3’端第4-9位堿基)。
該序列經(jīng)限制性內(nèi)切酶XbaI和PstI酶切，用T4連接酶連接，克隆入經(jīng)XbaI和PstI酶切的商用pBlueScript(+)的XbaI和PstI位點處，獲得帶有His-tag序列的重組質(zhì)粒His-pBlueScript(+)。
實施例1.2 帶有His-tag序列和綠色熒光蛋白GFP基因序列的重組質(zhì)粒的制備GFP基因序列由717個堿基(序列表SEQ ID NO9)組成，設(shè)計合成了PCR引物P1和P2，其中P1引入了DNA酶切位點PstI，P2引入了DNA酶切位點EcoRI。
P15’-AAACTGCAGATGTCTAAAGGTGAAGAATTATTC-3’PstI (SEQ ID NO11)P25’-CCGGAATTCTTTGTACAATTCATCCATAC-3’EcoRI (SEQ ID NO12)利用上述引物對P1和P2，以含有該GFP基因的pUC19重組質(zhì)粒為模板(參考Microbiology，1997，143303-311)，通過如下PCR反應擴增得到一個732bp的DNA片段以總體積50ul進行PCR反應，95℃變性7分鐘，按94℃變性1分鐘，46℃退火1分鐘，72℃延伸1.5分鐘循環(huán)反應5次，然后再94℃變性1分鐘，52℃退火1分鐘，72℃延伸1.5分鐘循環(huán)反應25次，最后再72℃延伸10分鐘。瓊脂糖凝膠電泳回收所得PCR反應片段(見圖3所示)，經(jīng)限制性內(nèi)切酶PstI和EcoRI酶切，用T4連接酶連接，克隆入經(jīng)PstI和EcoRI酶切的實施例1.1的His-pBlueScript(+)的PstI和EcoRI位點處，獲得帶有His-tag序列和GFP序列的重組質(zhì)粒His-GFP-pBlueScript(+)。
實施例1.3 KDR基因序列的優(yōu)化制備及過氧化物酶體的定位信號的引入KDR基因序列由1098個堿基組成，在不改變氨基酸的前提下，對KDR基因的密碼子進行優(yōu)化。KDR氨基酸序列如SEQ ID NO2所示；原核苷酸序列如SEQ ID NO1所示、優(yōu)化后的序列如SEQ ID NO3所示，兩組核苷酸序列對比參見圖1。優(yōu)化后的序列由公司[生工生物工程(上海)有限公司]商業(yè)化全合成，并克隆在商用pBlueScript(+)載體上。
以pBlueScript(+)載體上優(yōu)化的KDR基因為模板，設(shè)計合成了PCR引物P3和P4，其中P3引入了DNA酶切位點EcoRI以及凝血酶酶切位點(雙波浪線表示，對應的氨基酸序列為LVPRGS)，P4引入了DNA酶切位點AvrII-NotI及過氧化物酶體的定位信號SKL(雙下劃線標記)。
P35’-CCGGAATTCCTGGTCCCCAGAGGCTCTATGGACCCTGATGAGTTG-3’EcoRI(SEQ ID NO13)P45’-CATTAGCGGCCGCCCTAGGCTACTA GTCCTGCTGAGCGTT-3’ AvrII-NotI(SEQ ID NO14)利用上述引物對P3和P4，以含有該KDR基因的pBlueScript(+)載體為模板，通過如下PCR反應擴增得到一個1159bp的DNA片段以總體積50ul進行PCR反應，95℃變性7分鐘，按94℃變性1分鐘，60℃退火1分鐘，72℃延伸1.5分鐘循環(huán)反應30次，最后再72℃延伸10分鐘。瓊脂糖凝膠電泳回收所得PCR反應片段(見圖3)。
實施例1.4 帶有KDR序列的重組質(zhì)粒的構(gòu)建將實施例1.3所得PCR反應片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI酶切，用T4連接酶連接，克隆入經(jīng)EcoRI和NotI酶切的商用pPIC3.5K的EcoRI和NotI位點處，獲得帶有KDR序列的重組質(zhì)粒KDR-pPIC3.5K。
實施例1.5 含有His-tag片段以及GFP-KDR片段的表達載體的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶XbaI和EcoRI酶切實施例1.2中所得的重組質(zhì)粒His-GFP-pBlueScript(+)，以及瓊脂糖凝膠電泳回收His-GFP片段，用T4連接酶連接，克隆入經(jīng)XbaI和EcoRI酶切的實施例1.4所得的KDR-pPIC3.5K的XbaI和EcoRI位點處，獲得最終目的表達載體pPIC3.5K-plus(如圖2)。轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10后篩選重組子，用引物對P1和P4進行PCR，鑒定重組質(zhì)粒中插入片段的大小和方向。陽性克隆的PCR驗證大小應為2kb左右，得到6個陽性克隆(見圖4中的3-4、6-9泳道)，取8號菌經(jīng)DNA測序儀(儀器型號3730)測定該片段序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO6所示，氨基酸序列如SEQ ID NO7所示，表明擴增序列與既定目標序列完全相符。其中，除去His-tag后的GFP-KDR融合蛋白(含凝血酶酶切位點)的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO6所示序列的第43-1887位，氨基酸序列如SEQID NO7所示序列的第15-629位；而除去GFP及凝血酶酶切位點的本發(fā)明重組酪氨酸激酶KDR的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO4所示，即SEQ IDNO6所示序列的第781-1887位，氨基酸序列如SEQ ID NO7所示序列的第261-629位。
實施例1.6 含有KDR序列的重組宿主菌的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶SacI將實施例1.5中所得的重組質(zhì)粒pPIC3.5K-plus線性化，電轉(zhuǎn)化入畢赤酵母宿主菌GS115感受態(tài)細胞，用組氨酸缺陷型MGY平板(Invitrogen公司)篩選陽性克隆，將陽性克隆轉(zhuǎn)涂不同濃度的G418平板，濃度分別為1、2、3、4mg/ml，篩選高拷貝重組菌株。將平板上長出的菌株進行搖瓶表達，每隔24小時取樣，用流式細胞儀檢測熒光強度以判斷各菌株的表達情況，結(jié)果表明1號菌(命名為Pichia KDR No.1)在24小時時熒光強度幾何平均值為1618.31，是各菌株中表達量最高的。
實施例1.7 產(chǎn)生GFP-KDR的基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)及GFP-KDR的分離純化1.基因工程菌(畢赤酵母)的發(fā)酵培養(yǎng)將實施例1.6中所得的基因工程菌Pichia KDR No.1菌株接種于BSM培養(yǎng)基中(參考Sreekrishna K，Kropp KE(1996)Pichia pastoris.InWolf K，eds.，Non-Conventional Yeast in BiotechnologyA Handbook.BerlinSpringer-Verlag，pp.203-253)，28℃振蕩培養(yǎng)30小時，再以10％的接種量接種于新鮮的同種培養(yǎng)基中，于28℃繼續(xù)培養(yǎng)60小時左右。
2.GFP-KDR的分離、純化按上述條件培養(yǎng)工程菌過程中，每隔6小時取樣用流式細胞儀檢測熒光強度。當熒光強度出現(xiàn)下降時，停止發(fā)酵培養(yǎng)。經(jīng)測定，酪氨酸激酶融合蛋白的最大表達量為260mg/L。
將發(fā)酵液3000g離心30分鐘，棄上清保留菌體。用玻璃珠破壁，Ni親和層析柱分離純化，以50mM磷酸鹽溶液(含250mM咪唑)進行洗脫。洗脫曲線見圖5。樣品上樣至Ni柱之后，先用含20mM咪唑的平衡，再用250mM咪唑洗脫，250mM咪唑洗脫峰即為目標蛋白峰，之后再用1M的咪唑洗脫則沒有蛋白洗下。
將純化的GFP-KDR激酶用酪氨酸激酶分析試劑盒(NO.PTK101，Sigma公司)測定活性，結(jié)果如下

其中的陽性及陰性對照均為試劑盒提供。以上結(jié)果說明純化后的酪氨酸激酶KDR具有高的活性。
為了進一步評價純化的重組KDR的生物活性，采用商用KDR特異性抑制劑進行KDR抑制實驗。結(jié)果表明當抑制劑PTK789、SU11248、SU5416的濃度為10-5mol/L時，三者對KDR的抑制率分別為78.6％、60.4％、77.2％，均高于50％，這進一步說明本發(fā)明純化的重組酪氨酸激酶KDR具有良好的生物活性。
實施例2 重組酪氨酸激酶Src的制備及活性測定實施例2.1 Src基因序列的制備及過氧化物酶體的定位信號的引入Src基因序列由1608個堿基(序列表SEQ ID NO15)組成，設(shè)計合成了PCR引物P5和P6，其中P5引入了DNA酶切位點SnaBI以及過氧化物酶體的定位信號RLNNLATQL(雙下劃線標記)，SnaBI酶切位點與定位信號之間引入包含有起始密碼子的Kozak序列ATGGCT，在P6引入了DNA酶切位點EcoRI以及腸激酶酶切位點(雙波浪線表示，對應的氨基酸序列為DDDDK)。
P55’-CTGTACGTAATGGCT SnaBIATGGGTAGCAACAAGAGC-3’ (SEQ ID NO22)P65’-CGAGAATTCCTTGTCGTCGTCATCGAGGTTCTCCCCGGGCTGGTA-3’ EcoRI(SEQ ID NO23)利用上述引物對P5和P6，以含有該Src基因的質(zhì)粒pBA3CS(BMCBiochemistry，2002，332)為模板，通過如下PCR反應擴增得到一個1674bp的DNA片段以總體積50ul進行PCR反應，95℃變性7分鐘，按94℃變性1分鐘，65℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘循環(huán)反應30次，最后再72℃延伸10分鐘。瓊脂糖凝膠電泳回收所得PCR反應片段。
實施例2.2 帶有GST-tag序列的重組質(zhì)粒的制備GST-tag基因序列由669個堿基組成，見序列表SEQ ID NO20，設(shè)計合成了PCR引物P7和P8，從商業(yè)化質(zhì)粒pDEST15(Invitrogen公司)上擴增得到GST-tag基因序列，其中P7引入了DNA酶切位點EcoRI，P8引入了DNA酶切位點AvrII。
P75’-CCGGAATTCTCCCCTATACTAGGTTATTGG-3’EcoRI (SEQ ID NO24)P85’-CAACCTAGGCTACTAACGCGGAACCAGATCCGATTT-3’AvrII (SEQ ID NO25)利用上述引物對P7和P8，以含有該GST-tag基因的pDEST15載體為模板，通過如下PCR反應擴增得到一個693bp的DNA片段以總體積50ul進行PCR反應，95℃變性7分鐘，按94℃變性1分鐘，54℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘循環(huán)反應30次，最后再72℃延伸10分鐘。瓊脂糖凝膠電泳回收所得PCR反應片段，經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI和AvrII酶切，用T4連接酶連接，克隆入經(jīng)EcoRI和AvrII酶切的商用pPIC3.5K的EcoRI和AvrII位點處，獲得帶有GST-tag序列的重組質(zhì)粒GST-pPIC3.5K。
實施例2.3 含有GST-tag片段以及Src片段的表達載體的構(gòu)建將實施例2.1所得PCR反應片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶SnaBI和EcoRI酶切，用T4連接酶連接，克隆入經(jīng)SnaBI和EcoRI酶切的實施例2.2的GST-pPIC3.5K的SnaBI和EcoRI位點處，獲得帶有Src序列的最終目的表達載體Src-GST-pPIC3.5K。轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10后篩選重組子，用引物對P5和P8進行PCR，鑒定重組質(zhì)粒中插入片段的大小和方向。陽性克隆的PCR驗證大小應為2355bp，得到8個陽性克隆，取1號菌經(jīng)DNA測序儀(儀器型號3730)測定該片段序列，其10-2346位核苷酸序列如SEQ ID NO18所示，氨基酸序列如SEQ ID NO19所示，表明擴增序列與既定目標序列完全相符。其中，除去GST-tag及腸激酶酶切位點后的Src重組蛋白單體的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO18所示序列的第1-1641位(第1-6位為包含啟動密碼子的Kozak序列)，氨基酸序列如SEQ ID NO19所示序列的第1-547位(相應地第1-2位為Kozak序列編碼的兩個氨基酸)。
實施例2.4 含有Src序列的重組宿主菌的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶SacI將實施例2.3中所得的重組質(zhì)粒Src-GST-pPIC3.5K線性化，電轉(zhuǎn)化入畢赤酵母宿主菌KM71感受態(tài)細胞，用組氨酸缺陷型MGY平板(Invitrogen公司)篩選陽性克隆，將陽性克隆轉(zhuǎn)涂不同濃度的G418平板，濃度分別為1、2、3、4mg/ml，篩選高拷貝重組菌株。將平板上長出的菌株進行搖瓶表達，每隔24小時取樣，玻璃珠破壁之后，用酪氨酸激酶分析試劑盒(NO.PTK101，Sigma公司)測定活性以判斷各菌株的表達情況，結(jié)果表明5號菌(命名為Pichia Src No.5)在24小時時酶活是各菌株中最高的。
實施例2.5 產(chǎn)生Src的基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)及Src的分離純化1.基因工程菌(畢赤酵母)的發(fā)酵培養(yǎng)將實施例2.4中所得的基因工程菌Pichia Src No.5菌株接種于BSM培養(yǎng)基中(方法參考實施例1.7)，28℃振蕩培養(yǎng)30小時，再以10％的接種量接種于新鮮的同種培養(yǎng)基中，于28℃繼續(xù)培養(yǎng)60小時左右。
2.Src的分離、純化按上述條件培養(yǎng)工程菌過程中，每隔6小時取樣用酪氨酸激酶分析試劑盒(NO.PTK101，Sigma公司)測定活性。當活性出現(xiàn)下降時，停止發(fā)酵培養(yǎng)。
將發(fā)酵液3000g離心30分鐘，棄上清保留菌體。用玻璃珠破壁，GST-Agarose親和層析柱(Amersham Pharmacia Biotech)分離純化，以50mM磷酸鹽溶液(含50mmol/L Tris，0.15mol/L NaCl，2.5mmol/L CaCl2，pH7.5)進行洗脫，收集目的蛋白。洗脫曲線見圖7。
將純化的Src激酶用酪氨酸激酶分析試劑盒(NO.PTK101，Sigma公司)測定活性，結(jié)果如下

其中的陽性及陰性對照均為試劑盒提供。以上結(jié)果說明純化后的酪氨酸激酶Src具有高的活性。
序列表<110>華東理工大學；中國科學院上海藥物研究所<120>在畢赤酵母細胞器中表達的重組酪氨酸激酶及其基因、衍生融合蛋白和制備方法<130>061709C<160>25<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1098<212>DNA<213>人(human)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1098)<400>1atg gat cca gat gaa ctc cca ttg gat gaa cat tgt gaa cga ctg cct 48Met Asp Pro Asp Glu Leu Pro Leu Asp Glu His Cys Glu Arg Leu Pro1 5 10 15tat gat gcc agc aaa tgg gaa ttc ccc aga gac cgg ctg aag cta ggt 96Tyr Asp Ala Ser Lys Trp Glu Phe Pro Arg Asp Arg Leu Lys Leu Gly20 25 30aag cct ctt ggc cgt ggt gcc ttt ggc caa gtg att gaa gca gat gcc144Lys Pro Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Gln Val Ile Glu Ala Asp Ala35 40 45ttt gga att gac aag aca gca act tgc agg aca gta gca gtc aaa atg192Phe Gly Ile Asp Lys Thr Ala Thr Cys Arg Thr Val Ala Val Lys Met50 55 60ttg aaa gaa gga gca aca cac agt gag cat cga gct ctc atg tct gaa240Leu Lys Glu Gly Ala Thr His Ser Glu His Arg Ala Leu Met Ser Glu65 70 75 80ctc aag atc ctc att cat att ggt cac cat ctc aat gtg gtc aac ctt288Leu Lys Ile Leu Ile His Ile Gly His His Leu Asn Val Val Asn Leu85 90 95cta ggt gcc tgt acc aag cca gga ggg cca ctc atg gtg att gtg gaa336Leu Gly Ala Cys Thr Lys Pro Gly Gly Pro Leu Met Val Ile Val Glu100 105 110
ttc tgc aaa ttt gga aac ctg tcc act tac ctg agg agc aag aga aat384Phe Cys Lys Phe Gly Asn Leu Ser Thr Tyr Leu Arg Ser Lys Arg Asn115 120 125gaa ttt gtc ccc tac aag acc aaa ggg gca cga ttc cgt caa ggg aaa432Glu Phe Val Pro Tyr Lys Thr Lys Gly Ala Arg Phe Arg Gln Gly Lys130 135 140gac tac gtt gga gca atc cct gtg gat ctg aaa cgg cgc ttg gac agc480Asp Tyr Val Gly Ala Ile Pro Val Asp Leu Lys Arg Arg Leu Asp Ser145 150 155 160atc acc agt agc cag agc tca gcc agc tct gga ttt gtg gag gag aag528Ile Thr Ser Ser Gln Ser Ser Ala Ser Ser Gly Phe Val Glu Glu Lys165 170 175tcc ctc agt gat gta gaa gaa gag gaa gct cct gaa gat ctg tat aag576Ser Leu Ser Asp Val Glu Glu Glu Glu Ala Pro Glu Asp Leu Tyr Lys180 185 190gac ttc ctg acc ttg gag cat ctc atc tgt tac agc ttc caa gtg gct624Asp Phe Leu Thr Leu Glu His Leu Ile Cys Tyr Ser Phe Gln Val Ala195 200 205aag ggc atg gag ttc ttg gca tcg cga aag tgt atc cac agg gac ctg672Lys Gly Met Glu Phe Leu Ala Ser Arg Lys Cys Ile His Arg Asp Leu210 215 220gcg gca cga aat atc ctc tta tcg gag aag aac gtg gtt aaa atc tgt720Ala Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu Lys Asn Val Val Lys Ile Cys225 230 235 240gac ttt ggc ttg gcc cgg gat att tat aaa gat cca gat tat gtc aga768Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asp Pro Asp Tyr Val Arg245 250 255aaa gga gat gct cgc ctc cct ttg aaa tgg atg gcc cca gaa aca att816Lys Gly Asp Ala Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met Ala Pro Glu Thr Ile260 265 270ttt gac aga gtg tac aca atc cag agt gac gtc tgg tct ttt ggt gtt864Phe Asp Arg Val Tyr Thr Ile Gln Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val275 280 285ttg ctg tgg gaa ata ttt tcc tta ggt gct tct cca tat cct ggg gta912Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Ala Ser Pro Tyr Pro Gly Val290 295 300aag att gat gaa gaa ttt tgt agg cga ttg aaa gaa gga act aga atg960Lys Ile Asp Glu Glu Phe Cys Arg Arg Leu Lys Glu Gly Thr Arg Met305 310 315 320agg gcc cct gat tat act aca cca gaa atg tac cag acc atg ctg gac 1008Arg Ala Pro Asp Tyr Thr Thr Pro Glu Met Tyr Gln Thr Met Leu Asp325 330 335tgc tgg cac ggg gag ccc agt cag aga ccc acg ttt tca gag ttg gtg 1056
Cys Trp His Gly Glu Pro Ser Gln Arg Pro Thr Phe Ser Glu Leu Val340 345 350gaa cat ttg gga aat ctc ttg caa gct aat gct cag cag gat1098Glu His Leu Gly Asn Leu Leu Gln Ala Asn Ala Gln Gln Asp355 360 365<210>2<211>366<212>PRT<213>人(human)<400>2Met Asp Pro Asp Glu Leu Pro Leu Asp Glu His Cys Glu Arg Leu Pro1 5 10 15Tyr Asp Ala Ser Lys Trp Glu Phe Pro Arg Asp Arg Leu Lys Leu Gly20 25 30Lys Pro Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Gln Val Ile Glu Ala Asp Ala35 40 45Phe Gly Ile Asp Lys Thr Ala Thr Cys Arg Thr Val Ala Val Lys Met50 55 60Leu Lys Glu Gly Ala Thr His Ser Glu His Arg Ala Leu Met Ser Glu65 70 75 80Leu Lys Ile Leu Ile His Ile Gly His His Leu Asn Val Val Asn Leu85 90 95Leu Gly Ala Cys Thr Lys Pro Gly Gly Pro Leu Met Val Ile Val Glu100 105 110Phe Cys Lys Phe Gly Asn Leu Ser Thr Tyr Leu Arg Ser Lys Arg Asn115 120 125Glu Phe Val Pro Tyr Lys Thr Lys Gly Ala Arg Phe Arg Gln Gly Lys130 135 140Asp Tyr Val Gly Ala Ile Pro Val Asp Leu Lys Arg Arg Leu Asp Ser145 150 155 160Ile Thr Ser Ser Gln Ser Ser Ala Ser Ser Gly Phe Val Glu Glu Lys165 170 175Ser Leu Ser Asp Val Glu Glu Glu Glu Ala Pro Glu Asp Leu Tyr Lys180 185 190Asp Phe Leu Thr Leu Glu His Leu Ile Cys Tyr Ser Phe Gln Val Ala195 200 205Lys Gly Met Glu Phe Leu Ala Ser Arg Lys Cys Ile His Arg Asp Leu210 215 220Ala Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu Lys Asn Val Val Lys Ile Cys225 230 235 240
Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asp Pro Asp Tyr Val Arg245 250 255Lys Gly Asp Ala Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met Ala Pro Glu Thr Ile260 265 270Phe Asp Arg Val Tyr Thr Ile Gln Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val275 280 285Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Ala Ser Pro Tyr Pro Gly Val290 295 300Lys Ile Asp Glu Glu Phe Cys Arg Arg Leu Lys Glu Gly Thr Arg Met305 310 315 320Arg Ala Pro Asp Tyr Thr Thr Pro Glu Met Tyr Gln Thr Met Leu Asp325 330 335Cys Trp His Gly Glu Pro Ser Gln Arg Pro Thr Phe Ser Glu Leu Val340 345 350Glu His Leu Gly Asn Leu Leu Gln Ala Asn Ala Gln Gln Asp355 360 365<210>3<211>1098<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<223>針對畢赤酵母密碼子偏愛性優(yōu)化的酪氨酸激酶KDR的核苷酸序列<400>3atggaccctg atgagttgcc attggatgaa cactgcgagc gtttgcctta cgacgcctct 60aagtgggagt tccctagaga tagattgaag ttgggaaagc cacttggtag aggagccttt120ggtcaagtca ttgaggctga cgccttcgga atcgacaaga ccgctacctg ccgtaccgtt180gctgtcaaaa tgttgaaaga gggagctacc cactctgaac atagagcctt gatgtccgag240ttgaagatcc ttatccacat tggtcatcac ttgaatgttg tcaacttgtt gggtgcttgt300actaagccag gtggaccatt gatggtcatt gtcgagtttt gcaagtttgg taacctttcc360acctacctta gatccaagcg taacgagttc gtcccataca agactaaggg tgctagattc420cgtcaaggaa aggactatgt tggtgctatc ccagttgatt tgaagcgtag attggattct480atcacttctt ctcaatcctc cgcttcttcc ggattcgttg aggagaagtc tctttctgat540gtcgaggaag aggaagcccc agaggacctt tacaaagact ttcttacttt ggaacacttg600atctgttact ccttccaggt cgccaaaggt atggagtttc ttgcctctag aaagtgcatc660catcgtgacc ttgctgctcg taacatcttg ttgtctgaaa agaatgtcgt caagatctgc720gacttcggac ttgctcgtga catctacaag gacccagact acgttagaaa gggagacgcc780agattgcctt tgaagtggat ggctccagaa actatcttcg atagagtcta caccatccag840tccgatgtct ggtcctttgg agttcttttg tgggagatct tctctcttgg agcctctcct900taccctggag ttaagattga tgaagagttc tgtagacgtt tgaaggaagg aactagaatg960
cgtgctcctg actacactac tcctgagatg tatcagacca tgcttgactg ttggcatgga1020gaaccatctc aacgtccaac tttctccgag cttgttgagc accttggaaa ccttcttcaa1080gctaacgctc agcaggac 1098<210>4<211>1107<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<223>含畢赤酵母過氧化物酶體定位信號SKL且密碼子優(yōu)化的酪氨酸激酶KDR的核苷酸序列<220>
<221>transit_peptide<222>(1099)..(1107)<400>4atggaccctg atgagttgcc attggatgaa cactgcgagc gtttgcctta cgacgcctct 60aagtgggagt tccctagaga tagattgaag ttgggaaagc cacttggtag aggagccttt120ggtcaagtca ttgaggctga cgccttcgga atcgacaaga ccgctacctg ccgtaccgtt180gctgtcaaaa tgttgaaaga gggagctacc cactctgaac atagagcctt gatgtccgag240ttgaagatcc ttatccacat tggtcatcac ttgaatgttg tcaacttgtt gggtgcttgt300actaagccag gtggaccatt gatggtcatt gtcgagtttt gcaagtttgg taacctttcc360acctacctta gatccaagcg taacgagttc gtcccataca agactaaggg tgctagattc420cgtcaaggaa aggactatgt tggtgctatc ccagttgatt tgaagcgtag attggattct480atcacttctt ctcaatcctc cgcttcttcc ggattcgttg aggagaagtc tctttctgat540gtcgaggaag aggaagcccc agaggacctt tacaaagact ttcttacttt ggaacacttg600atctgttact ccttccaggt cgccaaaggt atggagtttc ttgcctctag aaagtgcatc660catcgtgacc ttgctgctcg taacatcttg ttgtctgaaa agaatgtcgt caagatctgc720gacttcggac ttgctcgtga catctacaag gacccagact acgttagaaa gggagacgcc780agattgcctt tgaagtggat ggctccagaa actatcttcg atagagtcta caccatccag840tccgatgtct ggtcctttgg agttcttttg tgggagatct tctctcttgg agcctctcct900taccctggag ttaagattga tgaagagttc tgtagacgtt tgaaggaagg aactagaatg960cgtgctcctg actacactac tcctgagatg tatcagacca tgcttgactg ttggcatgga 1020gaaccatctc aacgtccaac tttctccgag cttgttgagc accttggaaa ccttcttcaa 1080gctaacgctc agcaggactc caagttg 1107<210>5<211>1107<212>DNA
<213>人工序列(Artificial)<220>
<223>含畢赤酵母過氧化物酶體定位信號SKL的酪氨酸激酶KDR的核苷酸序列<220>
<221>transit_peptide<222>(1099)..(1107)<400>5atggatccag atgaactccc attggatgaa cattgtgaac gactgcctta tgatgccagc 60aaatgggaat tccccagaga ccggctgaag ctaggtaagc ctcttggccg tggtgccttt120ggccaagtga ttgaagcaga tgcctttgga attgacaaga cagcaacttg caggacagta180gcagtcaaaa tgttgaaaga aggagcaaca cacagtgagc atcgagctct catgtctgaa240ctcaagatcc tcattcatat tggtcaccat ctcaatgtgg tcaaccttct aggtgcctgt300accaagccag gagggccact catggtgatt gtggaattct gcaaatttgg aaacctgtcc360acttacctga ggagcaagag aaatgaattt gtcccctaca agaccaaagg ggcacgattc420cgtcaaggga aagactacgt tggagcaatc cctgtggatc tgaaacggcg cttggacagc480atcaccagta gccagagctc agccagctct ggatttgtgg aggagaagtc cctcagtgat540gtagaagaag aggaagctcc tgaagatctg tataaggact tcctgacctt ggagcatctc600atctgttaca gcttccaagt ggctaagggc atggagttct tggcatcgcg aaagtgtatc660cacagggacc tggcggcacg aaatatcctc ttatcggaga agaacgtggt taaaatctgt720gactttggct tggcccggga tatttataaa gatccagatt atgtcagaaa aggagatgct780cgcctccctt tgaaatggat ggccccagaa acaatttttg acagagtgta cacaatccag840agtgacgtct ggtcttttgg tgttttgctg tgggaaatat tttccttagg tgcttctcca900tatcctgggg taaagattga tgaagaattt tgtaggcgat tgaaagaagg aactagaatg960agggcccctg attatactac accagaaatg taccagacca tgctggactg ctggcacggg 1020gagcccagtc agagacccac gttttcagag ttggtggaac atttgggaaa tctcttgcaa 1080gctaatgctc agcaggattc caagttg 1107<210>6<211>1887<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<223>含His-tag、GFP、凝血酶酶切位點、KDR、SKL的融合蛋白的核苷酸序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(1887)
<400>6atg gct cat cac cac cat cat cat cat cat cat cat ctg cag atg tct48Met Ala His His His His His His His His His His Leu Gln Met Ser1 5 10 15aaa ggt gaa gaa tta ttc act ggt gtt gtc cca att ttg gtt gaa tta96Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu20 25 30gat ggt gat gtt aat ggt cac aaa ttt tct gtc tcc ggt gaa ggt gaa144Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu35 40 45ggt gat gct act tac ggt aaa ttg acc tta aaa ttt att tgt act act192Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr50 55 60ggt aaa ttg cca gtt cca tgg cca acc tta gtc act act ttc ggt tat240Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe Gly Tyr65 70 75 80ggt gtt caa tgt ttt gct aga tac cca gat cat atg aaa caa cat gac288Gly Val Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp85 90 95ttt ttc aag tct gcc atg cca gaa ggt tat gtt caa gaa aga act att336Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile100 105 110ttt ttc aaa gat gac ggt aac tac aag acc aga gct gaa gtc aag ttt384Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe115 120 125gaa ggt gat acc tta gtt aat aga atc gaa tta aaa ggt att gat ttt432Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe130 135 140aaa gaa gat ggt aac att tta ggt cac aaa ttg gaa tac aac tat aac480Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn145 150 155 160tct cac aat gtt tac atc atg gct gac aaa caa aag aat ggt atc aaa528Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys165 170 175gtt aac ttc aaa att aga cac aac att gaa gat ggt tct gtt caa tta576Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu180 185 190gct gac cat tat caa caa aat act cca att ggt gat ggt cca gtc ttg624Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu195 200 205tta cca gac aac cat tac tta tcc act caa tct gcc tta tcc aaa gat672Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp210 215 220
cca aac gaa aag aga gac cac atg gtc ttg tta gaa ttt gtt act gct720Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala225 230 235 240gct ggt att acc cat ggt atg gat gaa ttg tac aaa gaa ttc ctg gtc768Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Glu Phe Leu Val245 250 255ccc aga ggc tct atg gac cct gat gag ttg cca ttg gat gaa cac tgc816Pro Arg Gly Ser Met Asp Pro Asp Glu Leu Pro Leu Asp Glu His Cys260 265 270gag cgt ttg cct tac gac gcc tct aag tgg gag ttc cct aga gat aga864Glu Arg Leu Pro Tyr Asp Ala Ser Lys Trp Glu Phe Pro Arg Asp Arg275 280 285ttg aag ttg gga aag cca ctt ggt aga gga gcc ttt ggt caa gtc att912Leu Lys Leu Gly Lys Pro Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Gln Val Ile290 295 300gag gct gac gcc ttc gga atc gac aag acc gct acc tgc cgt acc gtt960Glu Ala Asp Ala Phe Gly Ile Asp Lys Thr Ala Thr Cys Arg Thr Val305 310 315 320gct gtc aaa atg ttg aaa gag gga gct acc cac tct gaa cat aga gcc 1008Ala Val Lys Met Leu Lys Glu Gly Ala Thr His Ser Glu His Arg Ala325 330 335ttg atg tcc gag ttg aag atc ctt atc cac att ggt cat cac ttg aat 1056Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Leu Ile His Ile Gly His His Leu Asn340 345 350gtt gtc aac ttg ttg ggt gct tgt act aag cca ggt gga cca ttg atg 1104Val Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Lys Pro Gly Gly Pro Leu Met355 360 365gtc att gtc gag ttt tgc aag ttt ggt aac ctt tcc acc tac ctt aga 1152Val Ile Val Glu Phe Cys Lys Phe Gly Asn Leu Ser Thr Tyr Leu Arg370 375 380tcc aag cgt aac gag ttc gtc cca tac aag act aag ggt gct aga ttc 1200Ser Lys Arg Asn Glu Phe Val Pro Tyr Lys Thr Lys Gly Ala Arg Phe385 390 395 400cgt caa gga aag gac tat gtt ggt gct atc cca gtt gat ttg aag cgt 1248Arg Gln Gly Lys Asp Tyr Val Gly Ala Ile Pro Val Asp Leu Lys Arg405 410 415aga ttg gat tct atc act tct tct caa tcc tcc gct tct tcc gga ttc 1296Arg Leu Asp Ser Ile Thr Ser Ser Gln Ser Ser Ala Ser Ser Gly Phe420 425 430gtt gag gag aag tct ctt tct gat gtc gag gaa gag gaa gcc cca gag 1344Val Glu Glu Lys Ser Leu Ser Asp Val Glu Glu Glu Glu Ala Pro Glu435 440 445
gac ctt tac aaa gac ttt ctt act ttg gaa cac ttg atc tgt tac tcc1392Asp Leu Tyr Lys Asp Phe Leu Thr Leu Glu His Leu Ile Cys Tyr Ser450 455 460ttc cag gtc gcc aaa ggt atg gag ttt ctt gcc tct aga aag tgc atc1440Phe Gln Val Ala Lys Gly Met Glu Phe Leu Ala Ser Arg Lys Cys Ile465 470 475 480cat cgt gac ctt gct gct cgt aac atc ttg ttg tct gaa aag aat gtc1488His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu Lys Asn Val485 490 495gtc aag atc tgc gac ttc gga ctt gct cgt gac atc tac aag gac cca1536Val Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asp Pro500 505 510gac tac gtt aga aag gga gac gcc aga ttg cct ttg aag tgg atg gct1584Asp Tyr Val Arg Lys Gly Asp Ala Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met Ala515 520 525cca gaa act atc ttc gat aga gtc tac acc atc cag tcc gat gtc tgg1632Pro Glu Thr Ile Phe Asp Arg Val Tyr Thr Ile Gln Ser Asp Val Trp530 535 540tcc ttt gga gtt ctt ttg tgg gag agc ttc tct ctt gga gcc tct cct1680Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Ala Ser Pro545 550 555 560tac cct gga gtt aag att gat gaa gag ttc tgt aga cgt ttg aag gaa1728Tyr Pro Gly Val Lys Ile Asp Glu Glu Phe Cys Arg Arg Leu Lys Glu565 570 575gga act aga atg cgt gct cct gac tac act act cct gag atg tat cag1776Gly Thr Arg Met Arg Ala Pro Asp Tyr Thr Thr Pro Glu Met Tyr Gln580 585 590acc atg ctt gac tgt tgg cat gga gaa cca tct caa cgt cca act ttc1824Thr Met Leu Asp Cys Trp His Gly Glu Pro Ser Gln Arg Pro Thr Phe595 600 605tcc gag ctt gtt gag cac ctt gga aac ctt ctt caa gct aac gct cag1872Ser Glu Leu Val Glu His Leu Gly Asn Leu Leu Gln Ala Asr Ala Gln610 615 620cag gac tcc aag ttg1887Gln Asp Ser Lys Leu625<210>7<211>629<212>PRT<213>人工序列(Artificial)
<220>
<223>Synthetic Construct<400>7Met Ala His His His His His His His His His His Leu Gln Met Ser1 5 10 15Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu20 25 30Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu35 40 45Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr50 55 60Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe Gly Tyr65 70 75 80Gly Val Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp85 90 95Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile100 105 110Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe115 120 125Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe130 135 140Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn145 150 155 160Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys165 170 175Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu180 185 190Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu195 200 205Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp210 215 220Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala225 230 235 240Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Glu Phe Leu Val245 250 255Pro Arg Gly Ser Met Asp Pro Asp Glu Leu Pro Leu Asp Glu His Cys260 265 270Glu Arg Leu Pro Tyr Asp Ala Ser Lys Trp Glu Phe Pro Arg Asp Arg275 280 285Leu Lys Leu Gly Lys Pro Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Gln Val Ile290 295 300
Glu Ala Asp Ala Phe Gly Ile Asp Lys Thr Ala Thr Cys Arg Thr Val305 310 315 320Ala Val Lys Met Leu Lys Glu Gly Ala Thr His Ser Glu His Arg Ala325 330 335Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Leu Ile His Ile Gly His His Leu Asn340 345 350Val Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Lys Pro Gly Gly Pro Leu Met355 360 365Val Ile Val Glu Phe Cys Lys Phe Gly Asn Leu Ser Thr Tyr Leu Arg370 375 380Ser Lys Arg Asn Glu Phe Val Pro Tyr Lys Thr Lys Gly Ala Arg Phe385 390 395 400Arg Gln Gly Lys Asp Tyr Val Gly Ala Ile Pro Val Asp Leu Lys Arg405 410 415Arg Leu Asp Ser Ile Thr Ser Ser Gln Ser Ser Ala Ser Ser Gly Phe420 425 430Val Glu Glu Lys Ser Leu Ser Asp Val Glu Glu Glu Glu Ala Pro Glu435 440 445Asp Leu Tyr Lys Asp Phe Leu Thr Leu Glu His Leu Ile Cys Tyr Ser450 455 460Phe Gln Val Ala Lys Gly Met Glu Phe Leu Ala Ser Arg Lys Cys Ile465 470 475 480His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu Lys Asn Val485 490 495Val Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asp Pro500 505 510Asp Tyr Val Arg Lys Gly Asp Ala Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met Ala515 520 525Pro Glu Thr Ile Phe Asp Arg Val Tyr Thr Ile Gln Ser Asp Val Trp530 535 540Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Ala Ser Pro545 550 555 560Tyr Pro Gly Val Lys Ile Asp Glu Glu Phe Cys Arg Arg Leu Lys Glu565 570 575Gly Thr Arg Met Arg Ala Pro Asp Tyr Thr Thr Pro Glu Met Tyr Gln580 585 590Thr Met Leu Asp Cys Trp His Gly Glu Pro Ser Gln Arg Pro Thr Phe595 600 605Ser Glu Leu Val Glu His Leu Gly Asn Leu Leu Gln Ala Asn Ala Gln610 615 620Gln Asp Ser Lys Leu625
<210>8<211>63<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<223>編碼His-tag的核苷酸序列<400>8gactctagat acgtaaccat ggctcatcac caccatcatc atcatcatca tcatctgcag60tag 63<210>9<211>717<212>DNA<213>水母(Aequorea victoria)<220>
<221>CDS<222>(1)..(717)<400>9atg tct aaa ggt gaa gaa tta ttc act ggt gtt gtc cca att ttg gtt 48Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val1 5 10 15gaa tta gat ggt gat gtt aat ggt cac aaa ttt tct gtc tcc ggt gaa 96Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu20 25 30ggt gaa ggt gat gct act tac ggt aaa ttg acc tta aaa ttt att tgt144Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys35 40 45act act ggt aaa ttg cca gtt cca tgg cca acc tta gtc act act ttc192Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe50 55 60ggt tat ggt gtt caa tgt ttt gct aga tac cea gat cat atg aaa caa240Gly Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln65 70 75 80cat gac ttt ttc aag tct gcc atg cca gaa ggt tat gtt caa gaa aga288His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg85 90 95act att ttt ttc aaa gat gac ggt aac tac aag acc aga gct gaa gtc336Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val
100 105 110aag ttt gaa ggt gat acc tta gtt aat aga atc gaa tta aaa ggt att384Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile115 120 125gat ttt aaa gaa gat ggt aac att tta ggt cac aaa ttg gaa tac aac432Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn130 135 140tat aac tct cac aat gtt tac atc atg gct gac aaa caa aag aat ggt480Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly145 150 155 160atc aaa gtt aac ttc aaa att aga cac aac att gaa gat ggt tct gtt528Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val165 170 175caa tta gct gac cat tat caa caa aat act cca att ggt gat ggt cca576Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro180 185 190gtc ttg tta cca gac aac cat tac tta tcc act caa tct gcc tta tcc624Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser195 200 205aaa gat cca aac gaa aag aga gac cac atg gtc ttg tta gaa ttt gtt672Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val210 215 220act gct gct ggt att acc cat ggt atg gat gaa ttg tac aaa taa717Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys225 230 235<210>10<211>238<212>PRT<213>水母(Aequorea victoria)<400>10Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val1 5 10 15Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu20 25 30Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys35 40 45Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe50 55 60Gly Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln65 70 75 80
His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg85 90 95Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val100 105 110Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile115 120 125Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn130 135 140Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly145 150 155 160Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val165 170 175Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro180 185 190Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser195 200 205Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val210 215 220Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys225 230 235<210>11<211>33<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<223>引物P1<400>11aaactgcaga tgtctaaagg tgaagaatta ttc 33<210>12<211>29<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<223>引物P2<400>12
ccggaattct ttgtacaatt catccatac 29<210>13<211>45<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<223>引物P3<400>13ccggaattcc tggtccccag aggctctatg gaccctgatg agttg 45<210>14<211>49<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<223>引物P4<400>14cattagcggc cgccctaggc tactacaact tggagtcctg ctgagcgtt 49<210>15<211>1608<212>DNA<213>人(human)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1608)<400>15atg ggt agc aac aag agc aag ccc aag gat gcc agc cag cgg cgc cgc48Met Gly Ser Asn Lys Ser Lys Pro Lys Asp Ala Ser Gln Arg Arg Arg1 5 10 15agc ctg gag ccc gcc gag aac gtg cac ggc gct ggc ggg ggc gct ttc96Ser Leu Glu Pro Ala Glu Asn Val His Gly Ala Gly Gly Gly Ala Phe20 25 30
ccc gcc tcg cag acc ccc agc aag cca gcc tcg gcc gac ggc cac cgc144Pro Ala Ser Gln Thr Pro Ser Lys Pro Ala Ser Ala Asp Gly His Arg35 40 45ggc ccc agc gcg gcc ttc gcc ccc gcg gcc gcc gag ccc aag ctg ttc192Gly Pro Ser Ala Ala Phe Ala Pro Ala Ala Ala Glu Pro Lys Leu Phe50 55 60gga ggc ttc aac tcc tcg gac acc gtc acc tcc ccg cag agg gcg ggc240Gly Gly Phe Asn Ser Ser Asp Thr Val Thr Ser Pro Gln Arg Ala Gly65 70 75 80ccg ctg gcc ggt gga gtg acc acc ttt gtg gcc ctc tat gac tat gag288Pro Leu Ala Gly Gly Val Thr Thr Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Glu85 90 95tct agg acg gag aca gac ctg tcc ttc aag aaa ggc gag cgg ctc cag336Ser Arg Thr Glu Thr Asp Leu Ser Phe Lys Lys Gly Glu Arg Leu Gln100 105 110att gtc aac aac aca gag gga gac tgg tgg ctg gcc cac tcg ctc agc384Ile Val Asn Asn Thr Glu Gly Asp Trp Trp Leu Ala His Ser Leu Ser115 120 125aca gga cag aca ggc tac atc ccc agc aac tac gtg gcg ccc tcc gac432Thr Gly Gln Thr Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Ser Asp130 135 140tcc atc cag gct gag gag tgg tat ttt ggc aag atc acc aga cgg gag480Ser Ile Gln Ala Glu Glu Trp Tyr Phe Gly Lys Ile Thr Arg Arg Glu145 150 155 160tca gag cgg tta ctg ctc aat gca gag aac ccg aga ggg acc ttc ctc528Ser Glu Arg Leu Leu Leu Asn Ala Glu Asn Pro Arg Gly Thr Phe Leu165 170 175gtg cga gaa agt gag acc acg aaa ggt gcc tac tgc ctc tca gtg tct576Val Arg Glu Ser Glu Thr Thr Lys Gly Ala Tyr Cys Leu Ser Val Ser180 185 190gac ttc gac aac gcc aag ggc ctc aac gtg aag cac tac aag atc cgc624Asp Phe Asp Asn Ala Lys Gly Leu Asn Val Lys His Tyr Lys Ile Arg195 200 205aag ctg gac agc ggc ggc ttc tac atc acc tcc cgc acc cag ttc aac672Lys Leu Asp Ser Gly Gly Phe Tyr Ile Thr Ser Arg Thr Gln Phe Asn210 215 220agc ctg cag cag ctg gtg gcc tac tac tcc aaa cac gcc gat ggc ctg720Ser Leu Gln Gln Leu Val Ala Tyr Tyr Ser Lys His Ala Asp Gly Leu225 230 235 240tgc cac cgc ctc acc acc gtg tgc ccc acg tcc aag ccg cag act cag768Cys His Arg Leu Thr Thr Val Cys Pro Thr Ser Lys Pro Gln Thr Gln245 250 255
ggc ctg gcc aag gat gcc tgg gag atc cct cgg gag tcg ctg cgg ctg 816Gly Leu Ala Lys Asp Ala Trp Glu Ile Pro Arg Glu Ser Leu Arg Leu260 265 270gag gtc aag ctg ggc cag ggc tgc ttt ggc gag gtg tgg atg ggg acc 864Glu Val Lys Leu Gly Gln Gly Cys Phe Gly Glu Val Trp Met Gly Thr275 280 285tgg aac ggt acc acc agg gtg gcc atc aaa acc ctg aag cct ggc acg 912Trp Asn Gly Thr Thr Arg Val Ala Ile Lys Thr Leu Lys Pro Gly Thr290 295 300atg tct cca gag gcc ttc ctg cag gag gcc cag gtc atg aag aag ctg 960Met Ser Pro Glu Ala Phe Leu Gln Glu Ala Gln Val Met Lys Lys Leu305 310 315 320agg cat gag aag ctg gtg cag ttg tat gct gtg gtt tca gag gag ccc1008Arg His Glu Lys Leu Val Gln Leu Tyr Ala Val Val Ser Glu Glu Pro325 330 335att tac atc gtc acg gag tac atg agc aag ggg agt ttg ctg gac ttt1056Ile Tyr Ile Val Thr Glu Tyr Met Ser Lys Gly Ser Leu Leu Asp Phe340 345 350ctc aag ggg gag aca ggc aag tac ctg cgg ctg cct cag ctg gtg gac1104Leu Lys Gly Glu Thr Gly Lys Tyr Leu Arg Leu Pro Gln Leu Val Asp355 360 365atg gct gct cag atc gcc tca ggc atg gcg tac gtg gag cgg atg aac1152Met Ala Ala Gln Ile Ala Ser Gly Met Ala Tyr Val Glu Arg Met Asn370 375 380tac gtc cac cgg gac ctt cgt gca gcc aac atc ctg gtg gga gag aac1200Tyr Val His Arg Asp Leu Arg Ala Ala Asn Ile Leu Val Gly Glu Asn385 390 395 400ctg gtg tgc aaa gtg gcc gac ttt ggg ctg gct cgg ctc att gaa gac1248Leu Val Cys Lys Val Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Leu Ile Glu Asp405 410 415aat gag tac acg gcg cgg caa ggt gcc aaa ttc ccc atc aag tgg acg1296Asn Glu Tyr Thr Ala Arg Gln Gly Ala Lys Phe Pro Ile Lys Trp Thr420 425 430gct cca gaa gct gcc ctc tat ggc cgc ttc acc atc aag tcg gac gtg1344Ala Pro Glu Ala Ala Leu Tyr Gly Arg Phe Thr Ile Lys Ser Asp Val435 440 445tgg tcc ttc ggg atc ctg ctg act gag ctc acc aca aag gga cgg gtg1392Trp Ser Phe Gly Ile Leu Leu Thr Glu Leu Thr Thr Lys Gly Arg Val450 455 460ccc tac cct ggg atg gtg aac cgc gag gtg ctg gac cag gtg gag cgg1440Pro Tyr Pro Gly Met Val Asn Arg Glu Val Leu Asp Gln Val Glu Arg465 470 475 480
ggc tac cgg atg ccc tgc ccg ccg gag tgt ccc gag tcc ctg cac gac1488Gly Tyr Arg Met Pro Cys Pro Pro Glu Cys Pro Glu Ser Leu His Asp485 490 495ctc atg tgc cag tgc tgg cgg aag gag cct gag gag cgg ccc acc ttc1536Leu Met Cys Gln Cys Trp Arg Lys Glu Pro Glu Glu Arg Pro Thr Phe500 505 510gag tac ctg cag gcc ttc ctg gag gac tac ttc acg tcc acc gag ccc1584Glu Tyr Leu Gln Ala Phe Leu Glu Asp Tyr Phe Thr Ser Thr Glu Pro515 520 525cag tac cag ccc ggg gag aac ctc1608Gln Tyr Gln Pro Gly Glu Asn Leu530 535<210>16<211>536<212>PRT<213>人(human)<400>16Met Gly Ser Asn Lys Ser Lys Pro Lys Asp Ala Ser Gln Arg Arg Arg1 5 10 15Ser Leu Glu Pro Ala Glu Asn Val His Gly Ala Gly Gly Gly Ala Phe20 25 30Pro Ala Ser Gln Thr Pro Ser Lys Pro Ala Ser Ala Asp Gly His Arg35 40 45Gly Pro Ser Ala Ala Phe Ala Pro Ala Ala Ala Glu Pro Lys Leu Phe50 55 60Gly Gly Phe Asn Ser Ser Asp Thr Val Thr Ser Pro Gln Arg Ala Gly65 70 75 80Pro Leu Ala Gly Gly Val Thr Thr Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Glu85 90 95Ser Arg Thr Glu Thr Asp Leu Ser Phe Lys Lys Gly Glu Arg Leu Gln100 105 110Ile Val Asn Asn Thr Glu Gly Asp Trp Trp Leu Ala His Ser Leu Ser115 120 125Thr Gly Gln Thr Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Ser Asp130 135 140Ser Ile Gln Ala Glu Glu Trp Tyr Phe Gly Lys Ile Thr Arg Arg Glu145 150 155 160Ser Glu Arg Leu Leu Leu Asn Ala Glu Asn Pro Arg Gly Thr Phe Leu165 170 175
Val Arg Glu Ser Glu Thr Thr Lys Gly Ala Tyr Cys Leu Ser Val Ser180 185 190Asp Phe Asp Asn Ala Lys Gly Leu Asn Val Lys His Tyr Lys Ile Arg195 200 205Lys Leu Asp Ser Gly Gly Phe Tyr Ile Thr Ser Arg Thr Gln Phe Asn210 215 220Ser Leu Gln Gln Leu Val Ala Tyr Tyr Ser Lys His Ala Asp Gly Leu225 230 235 240Cys His Arg Leu Thr Thr Val Cys Pro Thr Ser Lys Pro Gln Thr Gln245 250 255Gly Leu Ala Lys Asp Ala Trp Glu Ile Pro Arg Glu Ser Leu Arg Leu260 265 270Glu Val Lys Leu Gly Gln Gly Cys Phe Gly Glu Val Trp Met Gly Thr275 280 285Trp Asn Gly Thr Thr Arg Val Ala Ile Lys Thr Leu Lys Pro Gly Thr290 295 300Met Ser Pro Glu Ala Phe Leu Gln Glu Ala Gln Val Met Lys Lys Leu305 310 315 320Arg His Glu Lys Leu Val Gln Leu Tyr Ala Val Val Ser Glu Glu Pro325 330 335Ile Tyr Ile Val Thr Glu Tyr Met Ser Lys Gly Ser Leu Leu Asp Phe340 345 350Leu Lys Gly Glu Thr Gly Lys Tyr Leu Arg Leu Pro Gln Leu Val Asp355 360 365Met Ala Ala Gln Ile Ala Ser Gly Met Ala Tyr Val Glu Arg Met Asn370 375 380Tyr Val His Arg Asp Leu Arg Ala Ala Asn Ile Leu Val Gly Glu Asn385 390 395 400Leu Val Cys Lys Val Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Leu Ile Glu Asp405 410 415Asn Glu Tyr Thr Ala Arg Gln Gly Ala Lys Phe Pro Ile Lys Trp Thr420 425 430Ala Pro Glu Ala Ala Leu Tyr Gly Arg Phe Thr Ile Lys Ser Asp Val435 440 445Trp Ser Phe Gly Ile Leu Leu Thr Glu Leu Thr Thr Lys Gly Arg Val450 455 460Pro Tyr Pro Gly Met Val Asn Arg Glu Val Leu Asp Gln Val Glu Arg465 470 475 480Gly Tyr Arg Met Pro Cys Pro Pro Glu Cys Pro Glu Ser Leu His Asp485 490 495Leu Met Cys Gln Cys Trp Arg Lys Glu Pro Glu Glu Arg Pro Thr Phe500 505 510
Glu Tyr Leu Gln Ala Phe Leu Glu Asp Tyr Phe Thr Ser Thr Glu Pro515 520 525Gln Tyr Gln Pro Gly Glu Asn Leu530 535<210>17<211>1641<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<223>含畢赤酵母過氧化物酶體定位信號RLNNLATQL的酪氨酸激酶Src的核苷酸序列<220>
<221>transit_peptide<222>(7)..(33)<400>17atggctagat tgaacaactt ggctactcaa ttgatgggta gcaacaagag caagcccaag 60gatgccagcc agcggcgccg cagcctggag cccgccgaga acgtgcacgg cgctggcggg120ggcgctttcc ccgcctcgca gacccccagc aagccagcct cggccgacgg ccaccgcggc180cccagcgcgg ccttcgcccc cgcggccgcc gagcccaagc tgttcggagg cttcaactcc240tcggacaccg tcacctcccc gcagagggcg ggcccgctgg ccggtggagt gaccaccttt300gtggccctct atgactatga gtctaggacg gagacagacc tgtccttcaa gaaaggcgag360cggctccaga ttgtcaacaa cacagaggga gactggtggc tggcccactc gctcagcaca420ggacagacag gctacatccc cagcaactac gtggcgccct ccgactccat ccaggctgag480gagtggtatt ttggcaagat caccagacgg gagtcagagc ggttactgct caatgcagag540aacccgagag ggaccttcct cgtgcgagaa agtgagacca cgaaaggtgc ctactgcctc600tcagtgtctg acttcgacaa cgccaagggc ctcaacgtga agcactacaa gatccgcaag660ctggacagcg gcggcttcta catcacctcc cgcacccagt tcaacagcct gcagcagctg720gtggcctact actccaaaca cgccgatggc ctgtgccacc gcctcaccac cgtgtgcccc780acgtccaagc cgcagactca gggcctggcc aaggatgcct gggagatccc tcgggagtcg840ctgcggctgg aggtcaagct gggccagggc tgctttggcg aggtgtggat ggggacctgg900aacggtacca ccagggtggc catcaaaacc ctgaagcctg gcacgatgtc tccagaggcc960ttcctgcagg aggcccaggt catgaagaag ctgaggcatg agaagctggt gcagttgtat 1020gctgtggttt cagaggagcc catttacatc gtcacggagt acatgagcaa ggggagtttg 1080ctggactttc tcaaggggga gacaggcaag tacctgcggc tgcctcagct ggtggacatg 1140gctgctcaga tcgcctcagg catggcgtac gtggagcgga tgaactacgt ccaccgggac 1200cttcgtgcag ccaacatcct ggtgggagag aacctggtgt gcaaagtggc cgactttggg 1260ctggctcggc tcattgaaga caatgagtac acggcgcggc aaggtgccaa attccccatc 1320aagtggacgg ctccagaagc tgccctctat ggccgcttca ccatcaagtc ggacgtgtgg 1380
tccttcggga tcctgctgac tgagctcacc acaaagggac gggtgcccta ccctgggatg1440gtgaaccgcg aggtgctgga ccaggtggag cggggctacc ggatgccctg cccgccggag1500tgtcccgagt ccctgcacga cctcatgtgc cagtgctggc ggaaggagcc tgaggagcgg1560cccaccttcg agtacctgca ggccttcctg gaggactact tcacgtccac cgagccccag1620taccagcccg gggagaacct c 1641<210>18<211>2337<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<223>含RLNNLATQL、Src、腸激酶酶切位點、GST-tag的融合蛋白的核苷酸序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(2337)<400>18atg gct aga ttg aac aac ttg gct act caa ttg atg ggt agc aac aag 48Met Ala Arg Leu Asn Asn Leu Ala Thr Gln Leu Met Gly Ser Asn Lys1 5 10 15agc aag ccc aag gat gcc agc cag cgg cgc cgc agc ctg gag ccc gcc 96Ser Lys Pro Lys Asp Ala Ser Gln Arg Arg Arg Ser Leu Glu Pro Ala20 25 30gag aac gtg cac ggc gct ggc ggg ggc gct ttc ccc gcc tcg cag acc144Glu Asn Val His Gly Ala Gly Gly Gly Ala Phe Pro Ala Ser Gln Thr35 40 45ccc agc aag cca gcc tcg gcc gac ggc cac cgc ggc ccc agc gcg gcc192Pro Ser Lys Pro Ala Ser Ala Asp Gly His Arg Gly Pro Ser Ala Ala50 55 60ttc gcc ccc gcg gcc gcc gag ccc aag ctg ttc gga ggc ttc aac tcc240Phe Ala Pro Ala Ala Ala Glu Pro Lys Leu Phe Gly Gly Phe Asn Ser65 70 75 80tcg gac acc gtc acc tcc ccg cag agg gcg ggc ccg ctg gcc ggt gga288Ser Asp Thr Val Thr Ser Pro Gln Arg Ala Gly Pro Leu Ala Gly Gly85 90 95gtg acc acc ttt gtg gcc ctc tat gac tat gag tct agg acg gag aca336Val Thr Thr Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Glu Ser Arg Thr Glu Thr100 105 110gac ctg tcc ttc aag aaa ggc gag cgg ctc cag att gtc aac aac aca384Asp Leu Ser Phe Lys Lys Gly Glu Arg Leu Gln Ile Val Asn Asn Thr115 120 125
gag gga gac tgg tgg ctg gcc cac tcg ctc agc aca gga cag aca ggc432Glu Gly Asp Trp Trp Leu Ala His Ser Leu Ser Thr Gly Gln Thr Gly130 135 140tac atc ccc agc aac tac gtg gcg ccc tcc gac tcc atc cag gct gag480Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Ser Asp Ser Ile Gln Ala Glu145 150 155 160gag tgg tat ttt ggc aag atc acc aga cgg gag tca gag cgg tta ctg528Glu Trp Tyr Phe Gly Lys Ile Thr Arg Arg Glu Ser Glu Arg Leu Leu165 170 175ctc aat gca gag aac ccg aga ggg acc ttc ctc gtg cga gaa agt gag576Leu Asn Ala Glu Asn Pro Arg Gly Thr Phe Leu Val Arg Glu Ser Glu180 185 190acc acg aaa ggt gcc tac tgc ctc tca gtg tct gac ttc gac aac gcc624Thr Thr Lys Gly Ala Tyr Cys Leu Ser Val Ser Asp Phe Asp Asn Ala195 200 205aag ggc ctc aac gtg aag cac tac aag atc cgc aag ctg gac agc ggc672Lys Gly Leu Asn Val Lys His Tyr Lys Ile Arg Lys Leu Asp Ser Gly210 215 220ggc ttc tac atc acc tcc cgc acc cag ttc aac agc ctg cag cag ctg720Gly Phe Tyr Ile Thr Ser Arg Thr Gln Phe Asn Ser Leu Gln Gln Leu225 230 235 240gtg gcc tac tac tcc aaa cac gcc gat ggc ctg tgc cac cgc ctc acc768Val Ala Tyr Tyr Ser Lys His Ala Asp Gly Leu Cys His Arg Leu Thr245 250 255acc gtg tgc ccc acg tcc aag ccg cag act cag ggc ctg gcc aag gat816Thr Val Cys Pro Thr Ser Lys Pro Gln Thr Gln Gly Leu Ala Lys Asp260 265 270gcc tgg gag atc cct cgg gag tcg ctg cgg ctg gag gtc aag ctg ggc864Ala Trp Glu Ile Pro Arg Glu Ser Leu Arg Leu Glu Val Lys Leu Gly275 280 285cag ggc tgc ttt ggc gag gtg tgg atg ggg acc tgg aac ggt acc acc912Gln Gly Cys Phe Gly Glu Val Trp Met Gly Thr Trp Asn Gly Thr Thr290 295 300agg gtg gcc atc aaa acc ctg aag cct ggc acg atg tct cca gag gcc960Arg Val Ala Ile Lys Thr Leu Lys Pro Gly Thr Met Ser Pro Glu Ala305 310 315 320ttc ctg cag gag gcc cag gtc atg aag aag ctg agg cat gag aag ctg 1008Phe Leu Gln Glu Ala Gln Val Met Lys Lys Leu Arg His Glu Lys Leu325 330 335gtg cag ttg tat gct gtg gtt tca gag gag ccc att tac atc gtc acg 1056Val Gln Leu Tyr Ala Val Val Ser Glu Glu Pro Ile Tyr Ile Val Thr340 345 350
gag tac atg agc aag ggg agt ttg ctg gac ttt ctc aag ggg gag aca1104Glu Tyr Met Ser Lys Gly Ser Leu Leu Asp Phe Leu Lys Gly Glu Thr355 360 365ggc aag tac ctg cgg ctg cct cag ctg gtg gac atg gct gct cag atc1152Gly Lys Tyr Leu Arg Leu Pro Gln Leu Val Asp Met Ala Ala Gln Ile370 375 380gcc tca ggc atg gcg tac gtg gag cgg atg aac tac gtc cac cgg gac1200Ala Ser Gly Met Ala Tyr Val Glu Arg Met Asn Tyr Val His Arg Asp385 390 395 400ctt cgt gca gcc aac atc ctg gtg gga gag aac ctg gtg tgc aaa gtg1248Leu Arg Ala Ala Asn Ile Leu Val Gly Glu Asn Leu Val Cys Lys Val405 410 415gcc gac ttt ggg ctg gct cgg ctc att gaa gac aat gag tac acg gcg1296Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Leu Ile Glu Asp Asn Glu Tyr Thr Ala420 425 430cgg caa ggt gcc aaa ttc ccc atc aag tgg acg gct cca gaa gct gcc1344Arg Gln Gly Ala Lys Phe Pro Ile Lys Trp Thr Ala Pro Glu Ala Ala435 440 445ctc tat ggc cgc ttc acc atc aag tcg gac gtg tgg tcc ttc ggg atc1392Leu Tyr Gly Arg Phe Thr Ile Lys Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Ile450 455 460ctg ctg act gag ctc acc aca aag gga cgg gtg ccc tac cct ggg atg1440Leu Leu Thr Glu Leu Thr Thr Lys Gly Arg Val Pro Tyr Pro Gly Met465 470 475 480gtg aac cgc gag gtg ctg gac cag gtg gag cgg ggc tac cgg atg ccc1488Val Asn Arg Glu Val Leu Asp Gln Val Glu Arg Gly Tyr Arg Met Pro485 490 495tgc ccg ccg gag tgt ccc gag tcc ctg cac gac ctc atg tgc cag tgc1536Cys Pro Pro Glu Cys Pro Glu Ser Leu His Asp Leu Met Cys Gln Cys500 505 510tgg cgg aag gag cct gag gag cgg ccc acc ttc gag tac ctg cag gcc1584Trp Arg Lys Glu Pro Glu Glu Arg Pro Thr Phe Glu Tyr Leu Gln Ala515 520 525ttc ctg gag gac tac ttc acg tcc acc gag ccc cag tac cag ccc ggg1632Phe Leu Glu Asp Tyr Phe Thr Ser Thr Glu Pro Gln Tyr Gln Pro Gly530 535 540gag aac ctc gat gac gac gac aag gaa ttc tcc cct ata cta ggt tat1680Glu Asn Leu Asp Asp Asp Asp Lys Glu Phe Ser Pro Ile Leu Gly Tyr545 550 555 560tgg aaa att aag ggc ctt gtg caa ccc act cga ctt ctt ttg gaa tat1728Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr565 570 575
ctt gaa gaa aaa tat gaa gag cat ttg tat gag cgc gat gaa ggt gat1776Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp580 585 590aaa tgg cga aac aaa aag ttt gaa ttg ggt ttg gag ttt ccc aat ctt1824Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu595 600 605cct tat tat att gat ggt gat gtt aaa tta aca cag tct atg gcc atc1872Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile610 615 620ata cgt tat ata gct gac aag cac aac atg ttg ggt ggt tgt cca aaa1920Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys625 630 635 640gag cgt gca gag att tca atg ctt gaa gga gcg gtt ttg gat att aga1968Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg645 650 655tac ggt gtt tcg aga att gca tat agt aaa gac ttt gaa act ctc aaa2016Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys660 665 670gtt gat ttt ctt agc aag cta cct gaa atg ctg aaa atg ttc gaa gat2064Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp675 680 685cgt tta tgt cat aaa aca tat tta aat ggt gat cat gta acc cat cct2112Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn Gly Asp His Val Thr His Pro690 695 700gac ttc atg ttg tat gac gct ctt gat gtt gtt tta tac atg gac cca2160Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp Val Val Leu Tyr Met Asp Pro705 710 715 720atg tgc ctg gat gcg ttc cca aaa tta gtt tgt ttt aaa aaa cgt att2208Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile725 730 735gaa gct atc cca caa att gat aag tac ttg aaa tcc agc aag tat ata2256Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile740 745 750gca tgg cct ttg cag ggc tgg caa gcc acg ttt ggt ggt ggc gac cat2304Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala Thr Phe Gly Gly Gly Asp His755 760 765cct cca aaa tcg gat ctg gtt ccg cgt tag tag2337Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg770 775<210>19<211>777
<212>PRT<213>人工序列(Artificial)<220>
<223>Synthetic Construct<400>19Met Ala Arg Leu Asn Asn Leu Ala Thr Gln Leu Met Gly Ser Asn Lys1 5 10 15Ser Lys Pro Lys Asp Ala Ser Gln Arg Arg Arg Ser Leu Glu Pro Ala20 25 30Glu Asn Val His Gly Ala Gly Gly Gly Ala Phe Pro Ala Ser Gln Thr35 40 45Pro Ser Lys Pro Ala Ser Ala Asp Gly His Arg Gly Pro Ser Ala Ala50 55 60Phe Ala Pro Ala Ala Ala Glu Pro Lys Leu Phe Gly Gly Phe Asn Ser65 70 75 80Ser Asp Thr Val Thr Ser Pro Gln Arg Ala Gly Pro Leu Ala Gly Gly85 90 95Val Thr Thr Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Glu Ser Arg Thr Glu Thr100 105 110Asp Leu Ser Phe Lys Lys Gly Glu Arg Leu Gln Ile Val Asn Asn Thr115 120 125Glu Gly Asp Trp Trp Leu Ala His Ser Leu Ser Thr Gly Gln Thr Gly130 135 140Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Ser Asp Ser Ile Gln Ala Glu145 150 155 160Glu Trp Tyr Phe Gly Lys Ile Thr Arg Arg Glu Ser Glu Arg Leu Leu165 170 175Leu Asn Ala Glu Asn Pro Arg Gly Thr Phe Leu Val Arg Glu Ser Glu180 185 190Thr Thr Lys Gly Ala Tyr Cys Leu Ser Val Ser Asp Phe Asp Asn Ala195 200 205Lys Gly Leu Asn Val Lys His Tyr Lys Ile Arg Lys Leu Asp Ser Gly210 215 220Gly Phe Tyr Ile Thr Ser Arg Thr Gln Phe Asn Ser Leu Gln Gln Leu225 230 235 240Val Ala Tyr Tyr Ser Lys His Ala Asp Gly Leu Cys His Arg Leu Thr245 250 255Thr Val Cys Pro Thr Ser Lys Pro Gln Thr Gln Gly Leu Ala Lys Asp260 265 270Ala Trp Glu Ile Pro Arg Glu Ser Leu Arg Leu Glu Val Lys Leu Gly275 280 285
Gln Gly Cys Phe Gly Glu Val Trp Met Gly Thr Trp Asn Gly Thr Thr290 295 300Arg Val Ala Ile Lys Thr Leu Lys Pro Gly Thr Met Ser Pro Glu Ala305 310 315 320Phe Leu Gln Glu Ala Gln Val Met Lys Lys Leu Arg His Glu Lys Leu325 330 335Val Gln Leu Tyr Ala Val Val Ser Glu Glu Pro Ile Tyr Ile Val Thr340 345 350Glu Tyr Met Ser Lys Gly Ser Leu Leu Asp Phe Leu Lys Gly Glu Thr355 360 365Gly Lys Tyr Leu Arg Leu Pro Gln Leu Val Asp Met Ala Ala Gln Ile370 375 380Ala Ser Gly Met Ala Tyr Val Glu Arg Met Asn Tyr Val His Arg Asp385 390 395 400Leu Arg Ala Ala Asn Ile Leu Val Gly Glu Asn Leu Val Cys Lys Val405 410 415Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Leu Ile Glu Asp Asn Glu Tyr Thr Ala420 425 430Arg Gln Gly Ala Lys Phe Pro Ile Lys Trp Thr Ala Pro Glu Ala Ala435 440 445Leu Tyr Gly Arg Phe Thr Ile Lys Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Ile450 455 460Leu Leu Thr Glu Leu Thr Thr Lys Gly Arg Val Pro Tyr Pro Gly Met465 470 475 480Val Asn Arg Glu Val Leu Asp Gln Val Glu Arg Gly Tyr Arg Met Pro485 490 495Cys Pro Pro Glu Cys Pro Glu Ser Leu His Asp Leu Met Cys Gln Cys500 505 510Trp Arg Lys Glu Pro Glu Glu Arg Pro Thr Phe Glu Tyr Leu Gln Ala515 520 525Phe Leu Glu Asp Tyr Phe Thr Ser Thr Glu Pro Gln Tyr Gln Pro Gly530 535 540Glu Asn Leu Asp Asp Asp Asp Lys Glu Phe Ser Pro Ile Leu Gly Tyr545 550 555 560Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr565 570 575Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp580 585 590Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu595 600 605Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile610 615 620
Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys625 630 635 640Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg645 650 655Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys660 665 670Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp675 680 685Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn Gly Asp His Val Thr His Pro690 695 700Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp Val Val Leu Tyr Met Asp Pro705 710 715 720Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile725 730 735Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile740 745 750Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala Thr Phe Gly Gly Gly Asp His755 760 765Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg770 775<210>20<211>669<212>DNA<213>人(human)<220>
<221>CDS<222>(1)..(669)<400>20tcc cct ata cta ggt tat tgg aaa att aag ggc ctt gtg caa ccc act48Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro Thr1 5 10 15cga ctt ctt ttg gaa tat ctt gaa gaa aaa tat gaa gag cat ttg tat96Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu Tyr20 25 30gag cgc gat gaa ggt gat aaa tgg cga aac aaa aag ttt gaa ttg ggt144Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu Gly35 40 45ttg gag ttt ccc aat ctt cct tat tat att gat ggt gat gtt aaa tta192Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys Leu50 55 60
aca cag tct atg gcc atc ata cgt tat ata gct gac aag cac aac atg240Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn Met65 70 75 80ttg ggt ggt tgt cca aaa gag cgt gca gag att tca atg ctt gaa gga288Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu Gly85 90 95gcg gtt ttg gat att aga tac ggt gtt tcg aga att gca tat agt aaa336Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser Lys100 105 110gac ttt gaa act ctc aaa gtt gat ttt ctt agc aag cta cct gaa atg384Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met115 120 125ctg aaa atg ttc gaa gat cgt tta tgt cat aaa aca tat tta aat ggt432Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn Gly130 135 140gat cat gta acc cat cct gac ttc atg ttg tat gac gct ctt gat gtt480Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp Val145 150 155 160gtt tta tac atg gac cca atg tgc ctg gat gcg ttc cca aaa tta gtt528Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val165 170 175tgt ttt aaa aaa cgt att gaa gct atc cca caa att gat aag tac ttg576Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr Leu180 185 190aaa tcc agc aag tat ata gca tgg cct ttg cag ggc tgg caa gcc acg624Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala Thr195 200 205ttt ggt ggt ggc gac cat cct cca aaa tcg gat ctg gtt ccg cgt669Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg210 215 220<210>21<211>223<212>PRT<213>人(human)<400>21Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro Thr1 5 10 15Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu Tyr20 25 30
Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu Gly35 40 45Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys Leu50 55 60Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn Met65 70 75 80Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu Gly85 90 95Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser Lys100 105 110Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met115 120 125Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn Gly130 135 140Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp Val145 150 155 160Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val165 170 175Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr Leu180 185 190Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala Thr195 200 205Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg210 215 220<210>22<211>60<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<223>引物P5<400>22ctgtacgtaa tggctagatt gaacaacttg gctactcaat tgatgggtag caacaagagc60<210>23<211>45<212>DNA<213>人工序列(Artificial)
<220>
<223>引物P6<400>23cgagaattcc ttgtcgtcgt catcgaggtt ctccccgggc tggta 45<210>24<211>30<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<223>引物P7<400>24ccggaattct cccctatact aggttattgg 30<210>25<211>36<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<223>引物P8<400>25caacctaggc tactaacgcg gaaccagatc cgattt3權(quán)利要求
1.一種在畢赤酵母(Pichia pastoris)細胞器中表達的重組酪氨酸激酶，其具有下列結(jié)構(gòu)通式PTS2-酪氨酸激酶，或酪氨酸激酶-PTS1，其中，PTS1和PTS2代表可使激酶蛋白定向輸送到畢赤酵母過氧化物酶體的定位信號，PTS1具有下列結(jié)構(gòu)式S/A/C-K/H/R-L/M的氨基酸序列的三肽；PTS2是具有下列結(jié)構(gòu)式R/K-L/I/V-X5-H/Q-L/A的氨基酸序列的九肽，其中X5代表任意5個氨基酸。
2.如權(quán)利要求1所述的重組酪氨酸激酶，其特征在于所述酪氨酸激酶選自受體型酪氨酸激酶EGFR、PDGFR、FGFR和KDR，以及非受體型酪氨酸激酶Src、ABL和FAK。
3.如權(quán)利要求2所述的重組酪氨酸激酶，其特征在于PTS1的氨基酸序列為SKL，該酪氨酸激酶為KDR，該重組酪氨酸激酶的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.7中第261-629位氨基酸序列所示。
4.如權(quán)利要求3所述的重組酪氨酸激酶的cDNA，其是下列核苷酸序列之一1)其具有序列表中SEQ ID No.4所示的堿基序列；2)其具有序列表中SEQ ID No.5所示的堿基序列；3)編碼由序列表中SEQ ID No.7所示的氨基酸序列中第261-629位氨基酸組成的蛋白質(zhì)。
5.如權(quán)利要求2所述的重組酪氨酸激酶，其特征在于PTS2的氨基酸序列為RLNNLATQL，該酪氨酸激酶為非受體型酪氨酸激酶Src，該重組酪氨酸激酶的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.19的全部或第3-547位氨基酸序列所示。
6.如權(quán)利要求5所述的重組酪氨酸激酶的cDNA，其是下列核苷酸序列之一1)其具有序列表中SEQ ID No.17所示的全部或第7-1641位的堿基序列；2)編碼由序列表中SEQ ID No.19所示的全部或第3-547位氨基酸組成的蛋白質(zhì)。
7.一種如權(quán)利要求1～3和5任一項所述的重組酪氨酸激酶的衍生融合蛋白，其為標記蛋白與酪氨酸激酶的融合蛋白。
8.如權(quán)利要求7所述的衍生融合蛋白，其特征在于所述的標記蛋白選自綠色、黃色和紅色熒光蛋白。
9.如權(quán)利要求7所述的衍生融合蛋白，其特征在于標記蛋白與酪氨酸激酶之間含有蛋白酶酶切位點，所述蛋白酶酶切位點選自凝血酶位點、腸激酶位點、Xa因子位點和HRV 3C位點。
10.如權(quán)利要求9所述的衍生融合蛋白，其特征在于該標記蛋白為綠色熒光蛋白、該酶切位點為凝血酶位點，該衍生融合蛋白具有序列表中SEQ IDNo.7所示的第15-629位氨基酸序列，編碼該衍生融合蛋白的cDNA核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.6中的第43-1887位核苷酸序列所示。
11.如權(quán)利要求7所述的衍生融合蛋白，其特征在于該融合蛋白還包括純化標簽蛋白或肽，該純化標簽蛋白或肽選自His-tag、GST Tag、S Tag、T7Tag和CBD Tag。
12.如權(quán)利要求11所述的衍生融合蛋白，其特征在于該純化標簽蛋白或肽為His-tag，所述的衍生融合蛋白具有序列表中SEQ ID No.7所示的全部或第3-629位氨基酸序列，編碼該衍生融合蛋白的cDNA核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.6的全部或第7-1887位堿基序列所示。
13.一種如權(quán)利要求1～2和5所述的重組酪氨酸激酶的衍生融合蛋白，其為純化標簽蛋白或肽與酪氨酸激酶的融合蛋白。
14.如權(quán)利要求13所述的衍生融合蛋白，其特征在于所述的純化標簽蛋白或肽選自His-tag、GST Tag、S Tag、T7 Tag和CBD Tag。
15.如權(quán)利要求13所述的衍生融合蛋白，其特征在于純化標簽蛋白或肽與酪氨酸激酶之間含有蛋白酶酶切位點，所述蛋白酶酶切位點選自凝血酶位點、腸激酶位點、Xa因子位點和HRV 3C位點。
16.如權(quán)利要求15所述的衍生融合蛋白，其特征在于該純化標簽蛋白或肽為GST-tag、該酶切位點為腸激酶位點，該衍生融合蛋白具有序列表中SEQ ID No.19所示的全部或第3-777位氨基酸序列，編碼該衍生融合蛋白的cDNA核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.18的全部或第7-2331位堿基序列所示。
17.一種重組表達載體，其包括下列核苷酸序列之一1)如權(quán)利要求4所述的重組酪氨酸激酶的cDNA核苷酸序列；2)如權(quán)利要求6所述的重組酪氨酸激酶的cDNA核苷酸序列；3)如權(quán)利要求10所述的衍生融合蛋白的cDNA核苷酸序列；4)如權(quán)利要求12所述的衍生融合蛋白的cDNA核苷酸序列；5)如權(quán)利要求16所述的衍生融合蛋白的cDNA核苷酸序列。
18.如權(quán)利要求17所述的重組表達載體，其特征在于該重組表達載體中的表達載體選用適于畢赤酵母的pPIC衍生質(zhì)粒pPIC3.5K、pPIC9K，或它們的衍生物。
19.一種含有權(quán)利要求17或18所述的重組表達載體的真核表達宿主，其為畢赤酵母(Pichia pastoris)。
20.如權(quán)利要求19所述的真核表達宿主，其特征在于所述的畢赤酵母為畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115或KM71菌株。
21.一種如權(quán)利要求1～3及5任一項所述的重組酪氨酸激酶的制備方法，其包括下列步驟在酪氨酸激酶基因的C端或N端連接上可使激酶蛋白定向輸送到畢赤酵母過氧化物酶體的定位信號PTS1或PTS2的核苷酸序列，構(gòu)成編碼在畢赤酵母細胞器過氧化物酶體中表達的重組酪氨酸激酶的cDNA，將該cDNA克隆至表達載體構(gòu)建重組表達載體，再將所述重組表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞畢赤酵母(Pichia pastoris)，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，然后將培養(yǎng)物分離純化。
22.如權(quán)利要求21所述的制備方法，其特征在于所述表達載體選用適于畢赤酵母的pPIC衍生質(zhì)粒pPIC3.5K、pPIC9K，或它們的衍生物；構(gòu)成的重組表達載體如權(quán)利要求18所述。
23.如權(quán)利要求23所述的制備方法，其特征在于所述轉(zhuǎn)化體如權(quán)利要求20所述。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種在畢赤酵母細胞器中表達制備酪氨酸激酶的方法及制備的重組酪氨酸激酶，其具有下列結(jié)構(gòu)通式PTS2－酪氨酸激酶，或酪氨酸激酶－PTS1，其中，PTS1和PTS2代表可使激酶蛋白定向輸送到畢赤酵母過氧化物酶體的定位信號，PTS1是具有下列結(jié)構(gòu)式S/A/C－K/H/R－L/M的氨基酸序列；PTS2是具有下列結(jié)構(gòu)式R/K－L/I/V－X
文檔編號C07K19/00GK1920015SQ200610030908
公開日2007年2月28日 申請日期2006年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月7日
發(fā)明者周祥山, 張元興, 王雅, 倪振華, 丁健, 林莉萍 申請人:華東理工大學, 中國科學院上海藥物研究所