專利名稱：具有反式互補的基因組缺陷的呼吸道合胞病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疫苗接種領(lǐng)域，更具體地是涉及針對由肺病毒(例如呼吸道合胞病毒(RSV))引起的疾病的疫苗。本發(fā)明涉及攜帶RSV基因組的RSV病毒體，其中RSV基因組中的對于感染性所必需的基因已經(jīng)失活，而相應(yīng)的野生型基因產(chǎn)物對病毒體構(gòu)成反式互補。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)所述RSV病毒體的方法和它們在疫苗上的用途，以及涉及生產(chǎn)針對肺病毒進行疫苗接種的方法。
背景技術(shù)：
人呼吸道合胞病毒分類上屬于肺病毒(Pneumovirus)屬，副粘病毒科。它是嬰兒、老年人和免疫缺陷個體中急性下呼吸道疾病的主要病因。它也是青少年和成年人中上呼吸道疾病的重要病因。目前該領(lǐng)域中沒有有效的h-RSV疫苗。
RSV是RNA包膜病毒，其在表面表達(dá)兩個主要抗原附著蛋白G和融合蛋白F。兩個蛋白都顯示可激發(fā)保護性抗體。G是兩個已知h-RSV亞組A和B的決定簇。在這兩組中發(fā)現(xiàn)了抗原差異。G蛋白表現(xiàn)出高度變異，其在組A和組B中僅有53％的氨基酸同源性，并且在組A的G蛋白序列中表現(xiàn)多達(dá)20％的差異(Mufson 1988，Cane 1991)。
目前，使用以RSV富集的免疫球蛋白(Respigam)或合成的人源抗F單克隆抗體(Palivizumab)的被動式免疫處理，來用于處理和保護一些易患病的未滿月嬰兒(如早產(chǎn)嬰兒)免受RSV感染(Robinson 2000，Greenough 2000)。RSV病理有兩個主要方面由病毒自身引起的細(xì)胞傷害和由過度反應(yīng)的免疫系統(tǒng)引起的組織傷害。后者在疫苗設(shè)計中是高度復(fù)雜的因素。
RSV感染是季節(jié)性的，限于冬季并且在北半球高峰期是在年底左右。RSV可感染每一個兩歲之前小孩，很多病例被感染過兩次。較大的個體平均每隔一年被感染，這取決于環(huán)境；緊密接觸嬰兒和小孩的人具有50％的風(fēng)險。病毒通過緊密接觸以飛沫或污染表面進行傳播。RSV不能有效地通過氣溶膠傳播；病毒顆粒相對不穩(wěn)定。在初次感染期間，病毒從上呼吸道(URT)到下呼吸道(LRT)的體內(nèi)傳播主要通過吸入在URT上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的病毒顆粒而發(fā)生。不能排除以形成合胞體的方式進行傳播，并且這種傳播在LRT感染中可能起次要作用。
通常，RSV病理始于URT；侵入部位是鼻，少部分經(jīng)過眼而不是口。當(dāng)限于URT組織時，盡管在成人中有時是急性的，該疾病限于普通感冒。然而，當(dāng)病毒到達(dá)LRT時，在無保護的個體中會發(fā)生細(xì)支氣管炎和肺炎。在幼嬰中，這可危及生命，大約1/100需要住院和機械通氣，在這些幼嬰中超過1％會死亡。在老年人中，RSV誘發(fā)的LRT疾病是住院的主要因素；懷疑RSV導(dǎo)致25％的流感樣疾病。
對RSV的免疫應(yīng)答是復(fù)雜的。通常，接觸h-RSV可建立抗LRT疾病的保護性應(yīng)答。該應(yīng)答隨年齡增加而減弱，導(dǎo)致老年人群對RSV的更高敏感性。針對URT疾病的長效持久保護表明是不可行的；甚至在同一季節(jié)中再次感染很常見，這并不是由于病毒變異引起的?？筊SV感染的保護包括可預(yù)防LRT疾病的、針對血液中循環(huán)的病毒蛋白質(zhì)F和G的抗體。通過抗F和G的粘膜抗體可控制URT感染，但這些抗體的壽命有限。需要針對迄今尚未得到鑒定的病毒蛋白質(zhì)的CD8+T細(xì)胞，來清除受感染組織的病毒，但是看來它們的存活時間過短或不能從其儲備庫中高效募集。更可能的是，這可能是由G基因中編碼的RSV表達(dá)的因子引起的(Srikiatkhachom，1997a)。
RSV疾病的重要方面是病理學(xué)免疫增強作用。在有限的病例中，通過從過量吸引的粒細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子對感染組織的作用，細(xì)胞免疫應(yīng)答可加重RSV疾病。該反應(yīng)涉及宿主易患病的體質(zhì)，但也可能涉及出生后首次RSV感染的時機。不幸的是，用福爾馬林滅活RSV的早期免疫試驗顯示在這些接種情況中，免疫普遍加劇了對野生型(wt)病毒感染的病理(Kim 1969)。RSV中含有的因子是造成該現(xiàn)象的原因，且它顯然是由福爾馬林處理而釋放的。此后的40年中，逐漸表明病毒G蛋白是這些問題的主要介質(zhì)，但仍舊不清楚機理(Srikiatkhachorn 1997b)。無論如何，使用超出病毒體范圍的G蛋白進行接種(即在滅活病毒制劑中，作為沒有完全包被在膜中或肽結(jié)構(gòu)中的表達(dá)產(chǎn)物)，看起來在模型體系中可導(dǎo)致免疫增強。因此，盡管G蛋白在某種程度上有利于RSV免疫力，它的性質(zhì)也使疫苗設(shè)計變得復(fù)雜。
最初候選的活RSV疫苗包括冷傳代型或溫度敏感型突變體。前者通過在不斷降低的溫度中培養(yǎng)而被減毒，導(dǎo)致依賴于低溫進行生長，而后者突變體通過化學(xué)或放射誘發(fā)突變被制成依賴于特定的、通常是高溫進行復(fù)制。這些候選的活疫苗呈現(xiàn)出減毒不足或減毒過度(Crowe 1998)。
作為中和抗體的主要目標(biāo)，可從RSV-F或G蛋白衍生候選的亞單位疫苗。候選的亞單位疫苗PFP2(純化的F蛋白)對RSV血清反應(yīng)陽性病人是安全的，但不能提供針對LRT感染和相關(guān)病癥的完全保護(Gonzalez2000)。另一亞單位疫苗是由多肽組成的BBG2Na，其包含融合到鏈球菌G蛋白的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的h-RSV-G的氨基酸130-230(Power 1997)。BBG2Na在新生小鼠中誘導(dǎo)2型T輔助細(xì)胞的應(yīng)答，并不引發(fā)肺的免疫病理(Siegrist 1999)。但還沒有有關(guān)保護作用的數(shù)據(jù)。目前在動物模型中研究用于平衡體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答的新佐劑的用途(Plotnicky，2003)。
在動物模型中已經(jīng)研究了編碼RSV-F和G抗原作為候選疫苗的質(zhì)粒-DNA載體的用途。這些疫苗在嚙齒動物中誘導(dǎo)保護性應(yīng)答(Li，2000)，不過，在一種嚙齒動物中用野生型病毒攻擊后，發(fā)現(xiàn)RSV-F DNA候選疫苗的免疫小鼠可產(chǎn)生輕度增強的肺部炎性應(yīng)答(Bembridge 2000)。在人體中使用質(zhì)粒DNA疫苗的可行性還不得而知，并且在充分研究了并更重要地是接受該方法(特別是嬰兒)之前將至少花費15年。由表達(dá)RSV蛋白的活重組載體構(gòu)建基于載體輸送系統(tǒng)的候選疫苗。例如，表達(dá)RSV-F和G的重組牛痘病毒可在小鼠中提供保護，但在黑猩猩中缺乏該效果(Collins 1990)。問題是根據(jù)在人群和嬰兒的主目標(biāo)群中存在的(母體)抗痘病毒抗體，這些系統(tǒng)是否是安全(特別是牛痘病毒)和可行的。
一些候選疫苗是基于通過反求遺傳學(xué)產(chǎn)生的重組活RSV。研究的一個方向集中在通過將造成冷適應(yīng)和溫度敏感的單個或組合突變體導(dǎo)入重組病毒中，來減毒這些病毒。由于減毒過度或減毒不足，這些候選疫苗沒有一個是可用的。研究的另一方向集中在缺失一個或多個病毒非結(jié)構(gòu)基因?，F(xiàn)在僅有有限的關(guān)于這些病毒在模型系統(tǒng)中性質(zhì)的資料(Jin2003)。
對于研制RSV疫苗的可選擇的方法是使用牛RSV。只具有人F蛋白或具有人F和G蛋白的嵌合牛RSV，被用于評價其在黑猩猩中的效率。該候選疫苗的復(fù)制有限，其程度不能保護動物抵抗野生型h-RSV攻擊(Buchholtz 2000)。
因此，目前本領(lǐng)域中沒有有效可用的h-RSV疫苗。所有已在動物中測試過的RSV候選疫苗不能用于人。因此，在本領(lǐng)域中存在有效、安全的RSV疫苗的長期需求，而本發(fā)明的目的正是提供此類疫苗。
發(fā)明描述定義在本文及其權(quán)利要求中，動詞“包含(包括)”及其變化形式用于它的非限制性意義，來表示該詞后所納入的項目，但不排除沒有特別提到的項目。另外，不定冠詞“一個(種)”所涉及的要素不排除存在多于一個(種)要素的可能，除非上下文清楚地規(guī)定有且只有一個(種)要素。因此不定冠詞“一個(種)”通常指“至少一個(種)”。
本文所用的術(shù)語“病毒體”指在脂質(zhì)包膜中含有核衣殼蛋白、病毒基因組和復(fù)制酶復(fù)合物的病毒顆粒，其中所述的脂質(zhì)包膜含有病毒結(jié)構(gòu)糖蛋白。
術(shù)語“病毒感染性”、“感染性病毒”、“感染性病毒顆粒”或“感染性病毒體”指能侵入合適的宿主細(xì)胞并開始病毒復(fù)制循環(huán)的病毒、病毒顆粒或病毒體，不管它能否導(dǎo)致產(chǎn)生感染性的新病毒。
發(fā)明詳述本發(fā)明的第一個方面涉及肺病毒病毒體。該病毒體包括在編碼肺病毒感染性所必需的蛋白質(zhì)的基因中存在突變的病毒基因組，其中突變導(dǎo)致僅由病毒基因組產(chǎn)生的病毒缺乏感染性，并且病毒體包括病毒體感染性所必需的形式和量的所述蛋白質(zhì)。
肺病毒優(yōu)選是呼吸道合胞病毒(RSV)，更優(yōu)選是人或牛RSV。人RSV可以是亞組A或B病毒，優(yōu)選是臨床分離的、更優(yōu)選是體外未被過度傳代的分離株(如實施例中所述，優(yōu)選是傳代少于10、8、6或5次)。因此，任何RSV株或分離株可用于本發(fā)明的范圍中，從而可理解的是通過具體的人RSV分離株98-25147-X(稱為RSV分離株X)僅僅用于舉例說明本發(fā)明。更優(yōu)選的是病毒是最近的臨床分離株，從而規(guī)定“最近”指不到10、8、6、4、3或2天前進行第一次分離。可以理解的是，盡管病毒體中的核苷酸序列不必對應(yīng)于最近分離株的核苷酸序列，但優(yōu)選本發(fā)明的病毒體中的蛋白質(zhì)的氨基酸序列與最近臨床分離株中的蛋白質(zhì)序列相同。
病毒基因組在至少一個編碼肺病毒感染性所必需的蛋白質(zhì)的病毒基因中包括至少一個突變，其中病毒感染性如上所述。因此，肺病毒感染性所必需的蛋白質(zhì)是本發(fā)明的病毒體侵入合適宿主細(xì)胞并開始病毒復(fù)制循環(huán)能力所必需的蛋白質(zhì)，其中復(fù)制循環(huán)不必導(dǎo)致產(chǎn)生新的感染病毒。在本發(fā)明優(yōu)選的病毒體中，突變引起病毒體在體內(nèi)(即在合適的宿主機體)缺乏感染性，其中病毒體對于體外培養(yǎng)的合適宿主細(xì)胞仍是有感染性的。
在本發(fā)明優(yōu)選的病毒體中，編碼肺病毒感染性所必需的蛋白質(zhì)的突變基因是編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白的基因。本文中肺病毒的結(jié)構(gòu)蛋白被理解是在野生型感染性病毒的病毒體中存在的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的病毒體中被突變的、編碼結(jié)構(gòu)蛋白的基因優(yōu)選是編碼附著蛋白G和/或融合蛋白F的基因，其中最優(yōu)選是G蛋白。缺失和/或功能滅活編碼G蛋白的基因，適于幾個目的并可預(yù)防目前RSV候選疫苗的許多問題和并發(fā)癥。一個目的是疫苗安全性缺失G蛋白的RSV在其宿主中是高度減毒的(Karron1997，Schmidt 2002)，因為它不能有效地感染宿主。一個并發(fā)癥是G蛋白非常相關(guān)于引起不必要的免疫學(xué)應(yīng)答，包括加劇的免疫病理(Alwan1993，Srikiatkhachom 1997b)和在某些遺傳易感性條件下可能使得免疫系統(tǒng)偏向于易于發(fā)生過敏癥(和哮喘)狀態(tài)(Openshaw 2003，Peebles2003)?？赏ㄟ^缺失或失活G基因預(yù)防這種情況。包含在編碼G附著蛋白的基因中具有失活突變的病毒基因組、并包含病毒體感染性所需的形式和量的G附著蛋白的本發(fā)明肺病毒病毒體，稱為“ΔG+G”(肺)病毒或病毒體。類似地，在編碼G附著蛋白的基因中具有失活突變的、但沒有功能量的G蛋白作為反式互補的病毒體，稱為“ΔG”(肺)病毒或病毒體。
因此使用外部編碼的、感染所必需的蛋白質(zhì)，可瞬時和功能性重建本發(fā)明的肺病毒病毒體。外部編碼的、感染所必需的蛋白質(zhì)優(yōu)選是附著蛋白G/或融合蛋白F，其中最優(yōu)選是G蛋白。外部編碼的、感染所必需的蛋白質(zhì)優(yōu)選是與存在于病毒體中的基因組相同的病毒亞組(A或B)。外部編碼的、感染所必需的蛋白質(zhì)更優(yōu)選與存在于病毒體中的基因組是同源的，從而意味著在被失活之前，該蛋白質(zhì)具有與在病毒基因組中編碼的氨基酸序列相同的氨基酸序列?；蛘撸@可意味著外部編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列與存在于野生型病毒體中的序列相同，其中野生型病毒體與一個或多個內(nèi)部編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列同它們在本發(fā)明的病毒體中的對應(yīng)序列具有100％相同性。
在本發(fā)明的病毒體中，必需結(jié)構(gòu)蛋白基因中的突變是導(dǎo)致僅由該病毒基因組產(chǎn)生的病毒缺乏該蛋白質(zhì)或表達(dá)生物學(xué)失活的蛋白質(zhì)的突變。僅由病毒基因組產(chǎn)生的病毒被理解為在缺乏病毒基因組反式互補的任何編碼序列的情況下僅從病毒體中存在的病毒基因組產(chǎn)生的病毒。因此病毒體中存在的病毒基因組不能指導(dǎo)必需結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)。通過技術(shù)人員熟知的多種方法可實施該過程，包括如翻譯起始密碼子的失活、將終止子導(dǎo)入編碼的蛋白質(zhì)N末端附近、該基因的一個或多個移碼突變、該基因的一個或多個片段的缺失。優(yōu)選通過缺失編碼必需結(jié)構(gòu)蛋白的至少10、20、50、75、90或95％的序列，來失活該基因。然而，最優(yōu)選地是包含缺失編碼蛋白(全)序列的突變的病毒體。
本發(fā)明顯然包括存在多于一個突變的病毒體。具體地說，多于一個病毒蛋白質(zhì)編碼基因可包括所述蛋白功能的失活或變異的突變，或包括導(dǎo)致如上所述的病毒體缺乏該蛋白的突變。例如，本領(lǐng)域已知的冷傳代或熱敏感突變可聯(lián)合失活本發(fā)明中以上公開的必需結(jié)構(gòu)蛋白。
從感染的宿主機體清除肺病毒樣RSV，需要合適的細(xì)胞免疫，病毒沒有感染上皮細(xì)胞就不會產(chǎn)生有效的細(xì)胞免疫。然而，本發(fā)明突變型肺病毒缺乏體內(nèi)感染宿主細(xì)胞所必需的蛋白質(zhì)的遺傳信息。因此本發(fā)明公開用于生產(chǎn)突變型肺病毒的方法，其包括在(反式)互補缺乏感染所需的蛋白質(zhì)的細(xì)胞中復(fù)制突變型肺病毒。
因此在本發(fā)明另一方面中，涉及用于生產(chǎn)以上所述的突變型肺病毒病毒體的方法。該方法是用于生產(chǎn)肺病毒病毒體的方法，其中病毒體包含在編碼肺病毒(體內(nèi))感染性所必需蛋白的基因中具有突變的病毒基因組，該突變導(dǎo)致僅由病毒基因組產(chǎn)生的病毒缺乏感染性，以及病毒體包含病毒體感染性所需形式和量的所述蛋白質(zhì)。所述方法包括步驟(a)用包含具有以上所述突變的病毒基因組的肺病毒來感染第一宿主細(xì)胞培養(yǎng)物，其中宿主細(xì)胞包含可指導(dǎo)所述蛋白質(zhì)以病毒體感染性所需的形式和量在宿主細(xì)胞中瞬時性或組成型表達(dá)的表達(dá)載體；和(b)從感染的宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收病毒體。從感染的宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收病毒體包括從培養(yǎng)基回收或從細(xì)胞回收，或者二者都可。
第一宿主細(xì)胞是能復(fù)制肺病毒并且能或不能同時反式表達(dá)病毒體感染性所必需的蛋白質(zhì)的任何宿主細(xì)胞。用于該目的的適宜宿主細(xì)胞是例如非洲青猴腎細(xì)胞培養(yǎng)物(例如1990年EMEA許可的Vero，ECACC lot10-87，第134代)。
在本發(fā)明優(yōu)選的方法中，根據(jù)包括下列步驟的方法生產(chǎn)用于感染第一宿主細(xì)胞培養(yǎng)物的肺病毒(a)對第二宿主細(xì)胞提供可指導(dǎo)下列物質(zhì)在宿主細(xì)胞中表達(dá)的一個或多個表達(dá)載體(i)在編碼對肺病毒(體內(nèi))感染性是必需的蛋白質(zhì)的基因中具有突變的病毒基因組RNA，其中突變導(dǎo)致僅由該病毒基因組產(chǎn)生的病毒缺乏感染性；和(ii)肺病毒聚合酶復(fù)合物和任選地一種或多種另外的病毒蛋白質(zhì)；和(b)培養(yǎng)第二宿主細(xì)胞從而生產(chǎn)病毒體。在優(yōu)選的方法中，使用與第二宿主細(xì)胞相同或不同的宿主細(xì)胞，通過一種或多種另外的細(xì)胞感染步驟，擴增由第二宿主細(xì)胞產(chǎn)生的病毒體。
第二宿主細(xì)胞是能復(fù)制肺病毒并且能或不能同時反式表達(dá)病毒體感染性所必需的蛋白質(zhì)的任何宿主細(xì)胞。用于該目的的適宜宿主細(xì)胞是例如非洲青猴腎細(xì)胞培養(yǎng)物(例如1990年EMEA許可的Vero，ECACC lot10-87，第134代)。第二宿主細(xì)胞可以相同于或不同于第一宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的方法中，從在噬菌體DNA依賴性RNA聚合酶啟動子的控制下的病毒DNA拷貝轉(zhuǎn)錄病毒基因組RNA，從而對(第二)宿主細(xì)胞提供可在噬菌體DNA依賴性RNA聚合酶的宿主細(xì)胞中指導(dǎo)表達(dá)的表達(dá)載體。優(yōu)選地，噬菌體DNA依賴性RNA聚合酶是T7、T3或SP6聚合酶。
從第二宿主細(xì)胞的一個或多個表達(dá)載體表達(dá)的肺病毒聚合酶復(fù)合物至少包括從表達(dá)載體的對應(yīng)的基因或cDNA所表達(dá)的L、P、N蛋白。為了提高裸露病毒基因組RNA的病毒組裝和包裝效率，在第二宿主細(xì)胞任選地表達(dá)一種或多種另外的病毒蛋白質(zhì)。適于該目的的病毒蛋白質(zhì)優(yōu)選包括病毒基質(zhì)膜蛋白，其中特別優(yōu)選是M2-1蛋白。優(yōu)選從被導(dǎo)入宿主細(xì)胞并在其中表達(dá)的病毒分離株的病毒基因組衍生L、P、N、M2-1、G或F蛋白，但或者使用來自其它異種病毒或非病毒源的同源蛋白。
技術(shù)人員可理解的是用于在第一和/或第二宿主細(xì)胞中表達(dá)病毒基因組RNA、依賴DNA的RNA聚合酶、肺病毒聚合酶復(fù)合物和任選的更多的病毒蛋白質(zhì)以及必需結(jié)構(gòu)蛋白的各種表達(dá)載體和調(diào)控序列(例如啟動子)，是本領(lǐng)域中可得到的(參見Sambrook and Russell(2001)″Molecular CloningA Laboratory Manual(第三版)，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)。
對于RNA病毒的反求遺傳學(xué)，即重組RNA病毒(例如本發(fā)明的病毒體)的表達(dá)，將病毒基因組RNA的cDNA拷貝克隆入質(zhì)粒，并位于在一定條件下允許從DNA復(fù)制RNA的序列的控制下。通常，將用于噬菌體RNA聚合酶的啟動子序列位于RNA基因組的DNA拷貝的上游，同時將用于RNA聚合酶的適宜終止子位于基因組的下游。將自主剪切核酶序列位于終止子序列的上游，以允許通過適當(dāng)?shù)慕K止子核苷酸合成RNA。通常需要適當(dāng)?shù)慕K止子序列從合成的RNA來拯救病毒。對于非分段的負(fù)鏈RNA病毒，需要聚合酶復(fù)合物(用于副粘病毒的N、P和L蛋白)連同基因組RNA和反基因組RNA進行共表達(dá)，來獲得重組病毒(參見Neumann 2002和本文實施例中的實例)。
其它優(yōu)選的方法包括分離和/或純化本發(fā)明的病毒體，和/或?qū)⑦@些病毒體配制到藥物組合物中的更多步驟。對于有經(jīng)驗的病毒學(xué)家而言用于分離和/或純化病毒體的方法是眾所周知的。例如包括多種離心技術(shù)(如差速或密度離心)或?qū)游黾夹g(shù)的方法。用于將本發(fā)明的病毒體配制到藥物組合物中的方法至少包括將病毒體與如下定義的藥學(xué)上可接受的載體進行混和的步驟。
在另外的方面中，本發(fā)明涉及包含上述的或上述的方法中可獲得的病毒體的組合物，以及藥學(xué)上可接受的載體。優(yōu)選組合物是適于作為疫苗的藥物組合物，即組合物優(yōu)選是疫苗。
在另一方面中，本發(fā)明還提供包含根據(jù)本發(fā)明的作為活性成分的病毒體和藥學(xué)上可接受的載體的藥物制劑。也可將藥學(xué)上可接受的穩(wěn)定劑、滲透劑、緩沖劑、分散劑等等摻入藥物組合物中。優(yōu)選的形式取決于給藥和治療性應(yīng)用的計劃方式。藥物載體可以是適于將重建的病毒膜輸送到病人的任何親和性無毒物質(zhì)。通過水、緩沖鹽溶液、甘油、聚山梨醇酯20、Cremophor EL，以及辛酸/癸酸甘油酯的水性混合物，舉例說明適于鼻內(nèi)投藥的藥學(xué)上可接受的載體，并可對其緩沖處理以提供中性pH環(huán)境。
為了通過吸入給藥，使用合適的推進劑(如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合適的氣體)，以來自施壓器或霧化器的氣溶膠噴霧器的形式可便利地輸送本發(fā)明的藥物組合物，其中病毒體存在于如所述用于鼻內(nèi)投藥的載體中。至于施壓的氣溶膠，通過提供輸送可計量數(shù)量的閥來確定劑量單位。
用于制備鼻內(nèi)或吸入組合物的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并在多種資料來源中得到更具體地描述，包括，例如Remington′s PharmaceuticalScience(15th ed.，Mack Publishing，Easton，PA，1980)(出于所有目的，在此全部引用作為參考)。因此，可將病毒體作為活性成分配制到任何適于免疫接種的制劑中，來允許或促進免疫接種制劑有效地施用于個體，優(yōu)選是人或活家畜或農(nóng)畜(例如牛、豬、馬、山羊、綿羊)，其中該制劑還包括載體、佐劑、穩(wěn)定劑、溶解劑、防腐劑和本領(lǐng)域公知的賦形劑。
在另外的方面中，本發(fā)明通過對需要預(yù)防或治療的對象施用本發(fā)明上述的、或上述可得到的治療性或預(yù)防性有效量的病毒體(包含所述病毒體的藥物組合物)，涉及用于抗肺病毒感染的接種方法，或預(yù)防或治療肺病毒感染的方法。優(yōu)選地，通過鼻內(nèi)施用病毒體。
本發(fā)明同樣涉及本發(fā)明上述的、或上述可得到的、用于作為藥物的病毒體，優(yōu)選用于抗肺病毒感染的免疫接種藥物、或用于預(yù)防或治療肺病毒感染的藥物。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的病毒體在制備用于抗肺病毒疾病或感染的免疫接種的藥物中、或用于預(yù)防或治療抗肺病毒疾病或感染的藥物中的用途。藥物優(yōu)選是用于鼻內(nèi)給藥的制劑。
包含本發(fā)明用于免疫接種的病毒體的組合物優(yōu)選經(jīng)鼻內(nèi)施用于合適的宿主。在一個實施方案中，保護小牛免受b-RSV感染。還在另一實施方案中，保護人(優(yōu)選嬰兒和老年人或免疫缺陷的個體)免受h-RSV感染。制劑優(yōu)選包括適于以鼻內(nèi)滴劑或噴劑給藥的制劑，優(yōu)選是鼻噴劑。組合物中的ΔG+G肺病毒顆粒只感染上呼吸道上皮細(xì)胞一次，因為從最初感染的URT上皮細(xì)胞產(chǎn)生的第二代病毒體缺乏其從基因組被除去編碼序列的G附著蛋白。因此這些ΔG病毒體在宿主機體體內(nèi)是無感染性的。然而，最初的單循環(huán)感染使得產(chǎn)生適宜的細(xì)胞免疫——即能清除野生型病毒感染的應(yīng)答——以針對肺病毒(或特別是RSV)，而抗F的保護性抗體——即可預(yù)防下呼吸道感染的抗體——通過疫苗和無感染性子代被激發(fā)。如Palivimuzab處理的效力所示，抗F抗體可有效地限制RSV感染，其中Palivimuzab是抗F的人源單克隆抗體。這是本發(fā)明的重組肺病毒減毒型活疫苗的效力基礎(chǔ)。這些活病毒疫苗解決了許多與目前肺病毒候選疫苗有關(guān)的問題。在病毒體的天然環(huán)境中G蛋白的存在允許產(chǎn)生適宜的細(xì)胞免疫，卻又避免了分離的G蛋白不需要的免疫效應(yīng)，所述免疫效應(yīng)是分別造成對牲畜和人中b-RSV和h-RSV病原體的免疫增強的主要原因。
附圖描述

圖1PRSVXΔG的構(gòu)建圖。上方的線條代表具有所示基因的RSV分離株X基因組RNA。下方的盒子代表RT-PCR產(chǎn)物和用于構(gòu)建的寡核苷酸雙螺旋。盒子里的數(shù)字表示如表I所列的寡核苷酸數(shù)。指出了用于克隆而導(dǎo)入的限制性位點。以下顯示最終的克隆圖圓形物是質(zhì)粒，箭頭顯示克隆順序。
圖2顯示RSV分離株X和pRSVXΔG序列之間差異的對比。顯示了基因組方向?qū)Ρ鹊男蛄?。指明了pRSVXΔG僅僅不同于RSV分離株X的核苷酸。相同序列用圓點(.)表示，缺口用(-)表示。基因起始信號是單下劃線，基因終止信號是雙下劃線，并在圖注中指明了基因。盒子畫出了由導(dǎo)入的核苷酸突變引起的限制性酶識別位點。
圖3在RSV RT-PCR擴增產(chǎn)物，和a)Mlul、b)Xmal、c)SexA-1、d)SnaB-1的消化產(chǎn)物中序列標(biāo)記的鑒定圖。
圖4RSV分離株X和ΔG-RSV分離株X的生長曲線圖。用MOI＝0的病毒感染Vero細(xì)胞(實線)和Hep-2細(xì)胞(虛線)，并于37℃孵育。在所示的時點收集細(xì)胞，并測定對Vero細(xì)胞的CCID50滴度。
表I用于RT-PCR克隆RSV分離株X的引物。
表II.用于克隆輔助質(zhì)粒和克隆用于構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系的質(zhì)粒的引物。
表III.用于對來自RSV感染的Vero細(xì)胞RNA進行診斷性RT-PCR的引物。
表IV.以ΔG-RSV分離株X進行免疫以保護棉鼠(cotton rat)免受RSV感染和RSV誘導(dǎo)的病理的免疫試驗結(jié)果。
實施例通過非限制性實施例來舉例說明本發(fā)明，其中所述實施例僅僅用于舉例說明本發(fā)明的特定實施方案，不應(yīng)當(dāng)錯誤地作為限制本發(fā)明的廣泛范圍或任何方面。
實施例1病毒分離株、病毒分離、增殖和儲存重組h-RSV克隆的基礎(chǔ)是來自萊頓大學(xué)醫(yī)學(xué)中心診斷實驗室(theLeiden University Medical Centre diagnostic laboratory)的臨床RSV分離株。從病人上分離后，該病毒被命名為98-25147-X，其衍生于1998年12月21-24日期間的Hep-2細(xì)胞的診斷試驗。后來確定它屬于亞型A分離株，并稱作RSV分離株X。將該病毒在裝有DMEM(Gibco)、10％FCS、青霉素/鏈霉素/谷氨酸的T75瓶中以Hep-2細(xì)胞傳代4次，并隨后在裝有DMEM(Gibco)、10％FCS、青霉素/鏈霉素/谷氨酰胺的T75瓶中以Vero2細(xì)胞傳代5次。將得到的RSV分離株X作為工作上清液并在25或45％蔗糖中保存于-135℃。
實施例2編碼病毒基因組的RSV-X cDNA的構(gòu)建通過酚-胍異硫氰酸鹽(Trizol，Invitrogen)提取感染Vero細(xì)胞的RSV分離株X上清，獲得總RNA。使用Thermoscript(Invitrogen)反轉(zhuǎn)錄酶和隨機六聚物引物，通過反轉(zhuǎn)錄來制備cDNA。該cDNA可在使用了高保真Taq聚合酶(Invitrogen)和含有限制性酶識別位點的特異引物(表I和序列表)的PCR中作為模板。根據(jù)RSV-A2(Genbank登錄號M74568)和RSV-RSS2(Genbank登錄號U39662)公開的序列，來設(shè)計引物。
首先分別將PCR產(chǎn)物克隆入不同的載體以下列出引物對、載體、限制性酶識別位點以及得到的載體名RSV021/RSV047pCAP載體(Roche)，平端成為Mlu N1，pCAP3(SH/M/P區(qū))；RSV018/019pCAP載體，平端成為Mlu N1，pCAP2(G區(qū))；RSV016/RSV017PUC21，Mlu I/Bam HI，pUK5(M2-2/M2-1/F區(qū))；RSV024/RSV025aPUC21，Bam HI/Afl II，pUK1(NS2/NS1區(qū))；RSV022/RSV023PUC21，EcoR V，pUK4(N區(qū))；RSV014/RSV015PUC21，Kpn I/Mlu I，pUK2(L區(qū))。
對從兩個獨立cDNA模板衍生的至少兩個單獨克隆進行測序；在第三個克隆上對含有該兩個克隆差異的區(qū)域進行測序。如果需要，使用技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物技術(shù)修補克隆。得到覆蓋了用于克隆的引物結(jié)合位點的額外PCR產(chǎn)物，并進行測序。通過基因組RNA的聚腺苷酰作用確定5’基因組末端，隨后用含有下列引物的寡核苷酸進行RT-PCR
引物ALG018TTAAAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT，和NS1基因引物RSV 126AATTCTGCAGGCCCATCTCTAACCAAAGGAGT。
用Hind III/Pst I將該片段克隆入pUC21。通過RACE(cDNA末端的快速擴增法)聯(lián)合PCR法確定3’末端。裝配所有的序列來生產(chǎn)RSV-X共有序列(Seq ID No.1)。
使用BigDye末端試劑盒，通過PCR循環(huán)測序法確定所有的序列，并通過ABI Prism310遺傳分析儀進行分析。
實施例3ΔG-RSV分離株X全長質(zhì)粒的構(gòu)建通過連續(xù)連接PCR片段，來裝配橫跨整個RSV分離株X基因組的全長cDNA(圖1)。用于噬菌體T7聚合酶的啟動子位于“尾”端之前。為了產(chǎn)生正確的3’末端，將cDNA“前導(dǎo)”末端融合肝炎Δ病毒核酶(HDVR)并隨后融合T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄物終止子(參見圖1)。
首先，用T4DNA激酶使編碼RSV026/RSV027寡核苷酸和RSV028/029寡核苷酸的HDVR和T7終止子的兩組互補寡聚物進行磷酸化、雜交，并由Rsr II/Not I連接到克隆pUK1(含有基因NS1/NS2)中，從而生成質(zhì)粒pUK3。然后，將含有N的克隆pUK4的Xma I/Sex AI片段經(jīng)過Xma I/Sex AI酶切連接入質(zhì)粒pUK3。該質(zhì)粒(pUK6)含有N基因直到融合HDVR和T7終止子的3’前導(dǎo)序列的區(qū)域。
其次，用Xma I和已補平Hind III的位點，將質(zhì)粒pCAP3的Xma I/EcoRV片段插入質(zhì)粒pUK5，這生成質(zhì)粒pUK8。隨后，用BssH II和BsiW I消化pUK 8，并用Klenow聚合酶補平末端并進行再次連接。該質(zhì)粒含有基因M2-2、M2-1、F、SH、M以及P，并命名為pUK9。
為了合成用于RSV分離株X cDNA的低拷貝載體，用T4 DNA激酶將兩個互補寡聚物，即
RSV011AGCTTGCGGCCGCGTCGACCCGGGACGCGTCGATCGGGTACCAT，和RSV012CGATGGTACCCGATCGACGCGTCCCGGGTCGACGCGGCCGCA進行磷酸化、雜交并插入堿性磷酸酶處理過的和Cla I/Hind III消化過的質(zhì)粒ACYC 184(New England Biolabs)。得到的質(zhì)粒命名為pACYC184-MCS。隨后，插入含有T7啟動子和L基因的pUK2D的MluI-Knp I片段，該中間載體命名為pACYCl。然后，使用Xma I/Not I，將從N基因直到3’前導(dǎo)序列的區(qū)域(包括融合的HDVR和pUK6的T7終止子序列)加到pACYC1，這生成中間質(zhì)粒pACYC2。最后，將含有M2-2、M2-1、F、SH、M和P基因的pUK9的Xma I/Mlu I片段摻入pACYC2，生成包含缺失G基因的分離株X的RSV全基因組的質(zhì)粒pACYC3。后者質(zhì)粒的序列分析顯示在被修補的HDVR區(qū)中的缺失，并且所得質(zhì)粒命名為pRSVXΔG。
除了構(gòu)建體pRSVXΔG，還生成了構(gòu)建體pACYC24，其中通過反向PCR反向互補基因組RSV分離株X插入物。從該構(gòu)建體可合成反基因組RSV RNA。在pACYC24中，將T7啟動子位于3’前導(dǎo)序列之前，而將HDVR和T7終止子融合到5’尾序列。
將用于構(gòu)建pRSVXΔG的所有限制性酶識別位點定位在RSV基因間隔區(qū)，并且不改變編碼序列或影響轉(zhuǎn)錄信號(如圖2所示)。
實施例4輔助質(zhì)粒的構(gòu)建如下構(gòu)建表達(dá)幾個RSV蛋白的輔助質(zhì)粒。從實驗室分離株RSV-A2(ATCC#VR1302)可衍生所有需要的基因。在Hep-2細(xì)胞上空斑純化病毒，并隨后用于感染Vero細(xì)胞。通過酚-胍異硫氰酸鹽(Trizol，Invitrogen)從這些細(xì)胞提取總RNA，并用高保真Taq聚合酶(Invitrogen)和分別特異于RSV基因L、P、N和M2-1的引物組(參見表II)進行RT-PCR。隨后使用如表II所示的限制性酶識別位點，將PCR產(chǎn)物克隆入表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3、pcDNA6或pCI。使用BigDye終止子試劑盒(AppliedBiosystems)，通過PCR循環(huán)測序法確定克隆序列，并通過ABI Prism310遺傳分析儀進行分析。
實施例5構(gòu)建產(chǎn)生G蛋白的Vero細(xì)胞系使用以下幾種方法構(gòu)建產(chǎn)生RSV-G蛋白的細(xì)胞系在方法1中，使用如表II所示的引物在來自RSV-A2或RSV分離株X感染的Vero細(xì)胞的RNA上進行RT-PCR，將來自RSV-A2或RSV分離株X的G基因、或者來自RSV-A2的G基因(其中通過引物RSV033和RSV034的修飾，已經(jīng)失活內(nèi)部的翻譯起始密碼子)克隆入表達(dá)載體pcDNA3或pcDNA6(Invitrogen)。使用化學(xué)劑CaCl2、基于脂質(zhì)體的共沉淀法或電泳法(Ausubel 1989)，將質(zhì)粒導(dǎo)入Vero細(xì)胞?？墒褂眠m于分離穩(wěn)定細(xì)胞的兩種方法。在第一種方法中，轉(zhuǎn)染后72小時，使用含有選擇性培養(yǎng)基、用于pcDNA3的zeocin和用于pcDNA6的殺稻瘟菌素的不同稀釋度的新鮮培養(yǎng)基，以分開細(xì)胞。每3-4天對細(xì)胞補給選擇性培養(yǎng)基，直到鑒定到細(xì)胞灶。挑選單個克隆，并轉(zhuǎn)入96孔平板，或者以不同稀釋度進行種植以在96孔平板中得到單個細(xì)胞。通過免疫染色技術(shù)或使用了RSV G特異抗體的FACS，測試抗生素抗性克隆對RSV-G的表達(dá)。將表達(dá)G的克隆進行傳代，并稱其是表達(dá)G的穩(wěn)定細(xì)胞系。第二種方法包括在轉(zhuǎn)染72小時后使用RSV-G特異抗體進行FACS分選。將表達(dá)細(xì)胞的RSV-G以連續(xù)稀釋法種植，來在96孔板中得到單個細(xì)胞，并用選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)。在選擇性培養(yǎng)基上傳代單個細(xì)胞克隆，隨后再次測試RSV-G的表達(dá)，從而得到表達(dá)RSV-G的細(xì)胞系。
在方法2中，使用Flp-In系統(tǒng)(Invitrogen)以生產(chǎn)在染色體位置具有插入位點的靶基因的Vero細(xì)胞，其中所示的染色體位置允許靶基因不同水平的表達(dá)。將通過方法1從質(zhì)粒衍生的但具有G翻譯起始密碼子周邊序列的修飾(用引物RSV151導(dǎo)入表II)以允許高翻譯水平的RSV-G基因，使用系統(tǒng)-一般方法插入這些細(xì)胞系中的每一個，從而得到穩(wěn)定表達(dá)不同水平的G蛋白的Vero細(xì)胞系。
在方法3中，通過用含有來自方法1的G基因的表達(dá)質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染，或通過用牛痘病毒Ankara(MVA)(Sutter 1992)進行感染，或通過表達(dá)G蛋白的雞痘病毒(Spehner 1990)，使得Vero細(xì)胞瞬時表達(dá)G蛋白。
實施例6產(chǎn)生噬菌體T7聚合酶的細(xì)胞系的構(gòu)建使用引物ALG022和ALG023(表II)，從含有噬菌體T7聚合酶基因的噬菌體pPRT7(van Gennip 1997)中PCR擴增該基因。使用Hind III/XbaI，將PCR產(chǎn)物克隆入pcDNA6b載體中，從而生成質(zhì)粒pc6T7pol。根據(jù)制造商(Invitrogen)的建議，使用Lipofectamine 2000來轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞。轉(zhuǎn)染72小時后，分開細(xì)胞并在含有殺稻瘟菌素的新鮮培養(yǎng)基中生長。每3-4天對細(xì)胞供養(yǎng)新鮮培養(yǎng)基，并分開兩次以得到更大的培養(yǎng)體積。轉(zhuǎn)染20天后，使用Lipofectamine 2000通過報告質(zhì)粒pT7-IRES2-EGFP轉(zhuǎn)染殺稻瘟菌素抗性細(xì)胞。為了構(gòu)建質(zhì)粒pT7-IRES2-EGFP，通過由Hind III/BamH1在質(zhì)粒p-EGFP-N1(Clonetech)插入編碼T7啟動子序列(ALG32AGCTAATACGACTCACTATAGGGAGACGCGT和ALG33GATCACGCGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATT)的一組互補寡聚物來構(gòu)建第一質(zhì)粒pT7-EGFP。然后，通過由Xmal-Notl將質(zhì)粒pT7-EGFP的T7-EGFP片段克隆入質(zhì)粒p-IRES2-EGFP，構(gòu)建pT7-IRES2-EGFP。通過FACS分選表達(dá)EGFP的細(xì)胞，并以有限稀釋法進行培育，以得到單個細(xì)胞克隆。測試表達(dá)T7RNA聚合酶的單個克隆的穩(wěn)定性，并在大培養(yǎng)體積中生長并進行保存。
實施例7生產(chǎn)重組ΔG-RSV分離株X病毒的方法將Hep-2細(xì)胞在DMEM+10％FCS(胎牛血清)+青霉素/鏈霉素/谷氨酰胺中培養(yǎng)，而Vero細(xì)胞及其衍生物在M 199+5％ FCS+青霉素/鏈霉素/谷氨酰胺中培養(yǎng)。將細(xì)胞在10mm2的培養(yǎng)皿中于37℃培養(yǎng)直至80％平板密度。對于Vero和Hep-2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前用修飾過的Ankara-T7(MVA-T7)(Sutter 1992，Wyatt 1995)或雞痘-T7病毒(Britton 1996)以MOI＝3(感染復(fù)數(shù)＝3)感染細(xì)胞，并將其在32℃孵育60分鐘，以允許表達(dá)噬菌體T7聚合酶。用Optimem培養(yǎng)基(Optimem 1 with glutamax，Invitrogen)洗滌細(xì)胞(Hep-2、Vero或Vero-T7細(xì)胞)，隨后使用Optimem(總體積500μl)中的Lipofectamine2000(Invitrogen)，通過編碼RSV的N、P、L和M2.1基因的輔助質(zhì)粒和質(zhì)粒pRSVXΔG來轉(zhuǎn)染細(xì)胞。加入以下量的質(zhì)粒1.6μg pRSVXΔG、1.6μg pcDNA6-A2-N、1.2μg pcDNA3-P、0.4μg pcDNA6-A2-L、0.8μg pcDNA6-A2-M2.1。在32℃孵育3-4小時后，加入補充了2％FCS的500μl Optimem培養(yǎng)基，并將細(xì)胞在32℃孵育3天。然后刮取細(xì)胞，并將刮取的細(xì)胞混合物和含有拯救性病毒的培養(yǎng)基用于感染在DMEM+2％FCS+青霉素/鏈霉素/谷氨酰胺中生長的Vero或Hep-2細(xì)胞的新鮮培養(yǎng)物。后一過程重復(fù)4-5次，以得到高滴度的病毒上清。
通過從感染Vero細(xì)胞的ΔG-RSV分離株X中分離的RNA進行RT-PCR和通過單一限制性酶消化得到的產(chǎn)物，來確定ΔG-RSV分離株X病毒，其中將限制性酶的識別位點導(dǎo)入pRSVXΔG(圖2)。RSV分離株X作為對照。
為了鑒定RSV中的序列標(biāo)記，用RSV分離株X或ΔG-RSV分離株X以MOI＝0.1感染Vero細(xì)胞。感染72小時后，從培養(yǎng)上清分離RNA，并作為RT-PCR的模板。在重組ΔG-RSV分離株X病毒的插入序列標(biāo)記的兩側(cè)設(shè)計引物。在RT-PCR后，用合適的限制性酶消化得到的產(chǎn)物。得到下列消化產(chǎn)物(圖3)a)通過引物RSV065(GTCCATTGTTGGATTTAATC)和RSV093(CAAGATAAGAGTGTACAATACTGTC)進行PCR，并用Mlu-I進行消化，以產(chǎn)生RSV分離株X的937bp預(yù)期片段和ΔG-RSV分離株X的459和478bp片段；b)通過引物RSV105(GTTGGATTGAGAGACACTT)和RSV113(AGTATTAGGCAATGCTGC)進行PCR，并用Xma-I進行消化，以產(chǎn)生RSV分離株X的880bp預(yù)期片段和ΔG-RSV分離株X的656和224bp片段；c)通過引物RSV112(CCCAGTGAATTTATGATTAG)和RSV160(AATTGGATCCATGGACACAACCCACAATGA)進行PCR，并用Sex A-I進行消化，以產(chǎn)生RSV分離株X的694bp預(yù)期片段和ΔG-RSV分離株X的492和202bp片段；d)通過引物RSV098(TGGTAGTTCTCTTCTGGCTCG)和RSV114(ATCCCCAAGTCATTGTTCA)進行PCR，隨后用SnaB-I進行消化，以產(chǎn)生RSV分離株X的1820bp預(yù)期片段和ΔG-RSV分離株X的507和387bp片段。
與RSV分離株X相比，在Vero和Hep-2細(xì)胞上確定ΔG-RSV分離株X的生長特征。
表III.對來自RSV感染的Vero細(xì)胞的RNA進行診斷性RT-PCR的引物
實施例8生產(chǎn)重組ΔG+G-RSV分離株X病毒的方法將從轉(zhuǎn)染的Vero細(xì)胞衍生的ΔG-RSV分離株X病毒傳代幾次，以獲得至少105pfu/ml(每毫升空斑形成單位)的滴度。然后將不同MOI的病毒用于感染可生產(chǎn)RSV-G蛋白的Vero細(xì)胞系。從培養(yǎng)基和/或從細(xì)胞中收集得到的ΔG+G-RSV分離株X，并通過免疫檢測技術(shù)分析病毒體中G蛋白的存在情況。在Vero或Hep-2細(xì)胞上確定感染性滴度，并通過對提取自被ΔG+G-RSV分離株X病毒感染的細(xì)胞中的病毒RNA進行RT-PCR，來確定ΔG基因組的完整度。將病毒在25％或40％蔗糖中保存于-135℃。
實施例9以ΔG-RSV分離株X進行免疫以保護棉鼠動物模型免受RSV感染和RSV誘導(dǎo)的病理的方法在棉鼠(每組4-6只5-6周齡的棉鼠，雌雄都有)中進行保護試驗。在試驗初期，根據(jù)Prince(2001)的描述，動物顯示出對RSV感染敏感，并呈現(xiàn)出嚴(yán)重的疫苗介導(dǎo)的肺病理，這十分類似于人的情況。在鼻內(nèi)施用RSV后，肺病理的特點是支氣管/細(xì)支氣管的內(nèi)部和周邊的炎癥浸潤以及上皮細(xì)胞增生。通過用福爾馬林失活的RSV-A2進行肌肉免疫、隨后用RSV-A2進行鼻內(nèi)攻擊，可顯示更嚴(yán)重的病理。至于前述的病理，觀察血管周滲透和細(xì)支氣管周滲透以及肺泡炎，特征在于免疫介導(dǎo)的病理。這些觀察結(jié)果被用作所有免疫和攻擊試驗的“內(nèi)”對照。用RSV制劑進行鼻內(nèi)(兩個鼻孔)感染和免疫棉鼠。對棉鼠肺進行光學(xué)顯微鏡病理學(xué)檢查；使用具有可產(chǎn)生CCID50滴度的RSV特異ELISA的肺勻漿連續(xù)稀釋法和使用可產(chǎn)生pfu滴度的RSV特異抗體，在攻擊后或感染/免疫后的不同時間點檢測病毒對Vero細(xì)胞的滴度。用ΔG-RSV分離株X免疫兩次后，充分保護棉鼠避免肺的RSV分離株X引起的感染和病狀。在表IV中總結(jié)了幾個試驗的結(jié)果。
表IV
1病毒滴度，pfu/ml的對數(shù)值2每只動物所用的體積(μl)，每個鼻孔為該體積的一半3每克肺的病毒滴度的對數(shù)值，檢測限為102CCID50
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序列表<110>DE STAAT DER NEDERLANDEN，VERTEGENWOORDIGD DOOR DE MINISTER VANVOLKSGEZONDHEID，WELZIJN EN SPORT<120>具有反式互補的基因組缺陷的呼吸道合胞病毒<130>P210823 pct<160>33<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>15213<212>DNA<213>Human respiratory syncytial virus<400>1acgagaaaaa aagtgtcaaa aactaatatc tcgtagttta gttaatatac atataaacca 60attagatttg ggtttaaatt tattcctcct agatcaaaat gataatttta ggattagttc 120actagaagtt attaaaaatt atataattat taattttaaa taactataat tgaatacagt 180gttagtgtgt agccatggga atttttatta taagattttt gttcattatt cattatggaa 240gttgtataac aaactacctg tgattttaat cagtttttta agttcattgg ttgtcaagct 300gtttaacaat tcacttagat gaggatatgt agattctacc atatataaat gattatagtt 360taattctgtt gatctgaaat ttaaaacatg attgaaccac tttaagatgt tcatgtgctt 420atgatttata agtttattgc tgaaaacttc attacgtcca gctatagaat aagatagtat 480atctccacta acaacactct ttagtttaga caatgcagta ttaattcctt tttttgttat 540agggtaacaa agaaagggta tcaaactctt aatatttgca tcaatagact ctttatcagc 600cttcttaggc atgatgaaat ttttggttct tgatagtatc aatttagcat tttgtactac 660attaaatact gggaacacat ttgcaggacc tattgtaagg actaagtaaa cttcagatcc 720ctttaactta ctgcctaagc atacataagt ttttaatata gttatgttgt ctaatttgaa 780atcgatatca tcttgagcat gatattttac tattaacgta catttattaa ctgaagaaca 840gtacttgcat tttcttacat gcttgctcca ctctattata attttattcc agttgactgt 900tacaggcaat tcagcatcac agacaaaaag gctgataggt tcagcaaact ttatatgtaa 960ataagaccaa tgaatgttgt tggttgcatc tgtagcagga atggtcaaat tttcaccata1020atcaatgttg atatgtccat tgtacagcct taaaaactca attggtaaac tatgatcatt1080acaatctttc agacttctgt aaatatatct tatatcagga tgaagttcca ctactgtacg1140caataataaa ttccctgctc cttcacctat gaatgctata caattaggat ctttaatttt1200aaggtctttt aaaatatact ctatactaat tttacaacct gtagaactaa atacaaaatt1260gaatctatta atatgatgcc aaggaagcat gcaataaagt gatgtgctat tgtgtactaa1320
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<221>misc_feature<223>oligonucleotide<400>33aattaagctt accatggaca cgattaacat cgctaagaac g 4權(quán)利要求
1.一種包含病毒基因組的肺病毒的病毒體，其中所述的病毒基因組在編碼肺病毒感染性所必需的蛋白質(zhì)的基因中存在突變，其中該突變導(dǎo)致僅由該病毒基因組產(chǎn)生的病毒缺乏感染性，并且其中該病毒體包含病毒體感染性所需形式和量的所述蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的病毒體，其中肺病毒是呼吸道合胞病毒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中所述的病毒體，其中該基因編碼G附著蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的病毒體，其中突變導(dǎo)致僅由該病毒基因組產(chǎn)生的病毒缺乏所述蛋白質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的病毒體，其中突變包括缺失編碼所述蛋白質(zhì)的序列。
6.一種生產(chǎn)肺病毒的病毒體的方法，該病毒體包含在編碼肺病毒(體內(nèi))感染性所必需的蛋白質(zhì)的基因中存在突變的病毒基因組，其中該突變導(dǎo)致僅由該病毒基因組產(chǎn)生的病毒缺乏感染性，并且其中該病毒體包含病毒體感染性所需形式和量的所述蛋白質(zhì)，該方法包括步驟(a)用包含存在所述突變的病毒基因組的肺病毒感染第一宿主細(xì)胞培養(yǎng)物，其中宿主細(xì)胞包含可指導(dǎo)所述蛋白質(zhì)以病毒體感染性所需的形式和量在宿主細(xì)胞中表達(dá)的表達(dá)載體；和(b)從感染的宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收病毒體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6中所述的方法，其中生產(chǎn)用于感染第一宿主細(xì)胞培養(yǎng)物的肺病毒的方法包括步驟(a)給第二宿主細(xì)胞提供可指導(dǎo)下列物質(zhì)在宿主細(xì)胞中表達(dá)的一個或多個表達(dá)載體(i)在編碼肺病毒(體內(nèi))感染性所必需的蛋白質(zhì)的基因中具有突變的病毒基因組RNA，其中該突變導(dǎo)致僅由該病毒基因組產(chǎn)生的病毒缺乏感染性；(ii)肺病毒聚合酶復(fù)合物和任選地一種或多種另外的病毒蛋白質(zhì)；和(b)培養(yǎng)所述第二宿主細(xì)胞從而產(chǎn)生病毒體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7中所述的方法，其還包括使用與第二宿主細(xì)胞相同或不同的宿主細(xì)胞，通過一或個種另外的細(xì)胞感染步驟，擴增由第二宿主細(xì)胞產(chǎn)生的病毒體。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8中所述的方法，其中從在噬菌體DNA依賴性RNA聚合酶啟動子的控制下的病毒DNA拷貝轉(zhuǎn)錄所述病毒基因組RNA，并給所述宿主細(xì)胞提供在宿主細(xì)胞中指導(dǎo)噬菌體DNA依賴性RNA聚合酶表達(dá)的表達(dá)載體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9中所述的方法，其中噬菌體DNA依賴性RNA聚合酶是T7、T3或SP6聚合酶。
11.根據(jù)權(quán)利要求7-10中任一項所述的方法，其中肺病毒聚合酶復(fù)合物至少包含L、P、N蛋白。
12.根據(jù)權(quán)利要求7-11中任一項所述的方法，其中一種或多種另外的病毒蛋白質(zhì)是肺病毒基質(zhì)膜蛋白，優(yōu)選是M2-1蛋白。
13.根據(jù)權(quán)利要求6-12中任一項所述的方法，其中肺病毒是呼吸道合胞病毒。
14.根據(jù)權(quán)利要求6-13中任一項所述的方法，其中編碼感染性所必需的蛋白質(zhì)的基因是編碼G附著蛋白的基因。
15.一種組合物，其包含如權(quán)利要求1-5中任一項所述的病毒體或如權(quán)利要求6-14中任一項所述的方法中可得到的病毒體，以及藥學(xué)上可接受的載體。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的病毒體在制備用于預(yù)防或治療肺病毒感染的藥物中的用途。
17.根據(jù)權(quán)利要求16中所述的用途，該藥物是適于鼻內(nèi)施用的制劑。
18.一種用于預(yù)防或治療肺病毒感染的方法，包括步驟以預(yù)防或治療感染的有效量給對象施用包含如權(quán)利要求1-5中任一項所述的病毒體的組合物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18中所述的方法，其中所述組合物通過鼻內(nèi)施用。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含病毒基因組的肺病毒的病毒體，其中所述病毒基因組在編碼肺病毒感染性所必需的蛋白質(zhì)的基因中存在突變，其中該突變導(dǎo)致僅由該病毒基因組產(chǎn)生的病毒缺乏感染性，并且病毒體包含病毒體感染性所需形式和量的所述蛋白質(zhì)。本發(fā)明涉及生產(chǎn)肺病毒的病毒體的方法，和涉及在預(yù)防或治療肺病毒感染和疾病中使用該病毒體的方法。優(yōu)選的肺病毒病毒體是呼吸道合胞病毒的病毒體，優(yōu)選其中G附著蛋白基因被失活并反式互補。
文檔編號A61K35/76GK1922309SQ200480042063
公開日2007年2月28日 申請日期2004年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月24日
發(fā)明者威廉·盧伊特杰斯, 邁拉·努爾利·維佐約阿特莫佐 申請人:由衛(wèi)生福利和體育大臣代表的荷蘭王國