專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種檢測(cè)口蹄疫病毒基因組rna的單細(xì)胞實(shí)時(shí)熒光定量rt-pcr的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種檢測(cè)口蹄疫病毒基因組RNA的單細(xì)胞實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的方法，適用于在單細(xì)胞水平上研究口蹄疫病毒的復(fù)制，進(jìn)而分析病毒的急性感染與持續(xù)性感染的機(jī)理，探究在感染過(guò)程中病毒與宿主細(xì)胞的關(guān)系。
背景技術(shù)：
：口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus:FMDV)屬小RNA病毒科口蹄疫病毒屬，其所在的RNA病毒科在醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)上具有重要地位，該病毒主要引發(fā)偶蹄動(dòng)物發(fā)生口蹄疫?；蚪M由一條正義的RNA鏈組成，約含8500個(gè)核苷酸，其復(fù)制經(jīng)由一條互補(bǔ)的負(fù)鏈RNA作為模板。病毒感染其敏感細(xì)胞系(如倉(cāng)鼠腎細(xì)胞系BHK-21或豬腎細(xì)胞系IB-RS-2)，宿主細(xì)胞會(huì)發(fā)生致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE),表現(xiàn)為細(xì)胞變圓，內(nèi)細(xì)胞膜重排等。除急性感染外，口蹄疫病毒還能在動(dòng)物和細(xì)胞中建立持續(xù)性感染。基于口蹄疫病毒基因組的特點(diǎn)，現(xiàn)已建立了許多相關(guān)的檢測(cè)方法包括雜交實(shí)驗(yàn)(Verheyden,B,Lauwers,S,etal.QuantitativeRT-PCRELISAtodeterminetheamountandratioofpositive-andnegative-strandviralRNAsynthesisandtheeffectofguanidineinpoliovirusinfectedcells.J.Pharm.Biomed.Anal[J],2003,33:303-308.)、常規(guī)RT-PCR(Hofmann,MA，Thiir，B,etal.Rescueofinfectiousclassicalswinefeverandfoot-and-mouthdiseasevirusbyRNAtransfectionandvirusdetectionbyRT-PCRafterextendedstorageofsamplesinTrizol[J].J.Virol.Methods,2000,87:29-39.)以及近年建立的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(King,DP,Ferris,NP,etal.Detectionoffoot-and-mouthdiseasevirus:comparativediagnosticsensitivityoftwoindependentreal-timereversetranscriptionpolymerasechainreactionassays[J].J.VetDiagn.Invest"2006,18:93-97;Horsington,J,Zhang,Z.Analysisoffoot-and-mouthdiseasevimsreplicationusingstrand-specificquantitativeRT-PCR[J].J.Virol.Methods,2007,144:149-155.)。與其他的檢測(cè)方法相比，熒光定量RT-PCR技術(shù)優(yōu)勢(shì)明顯，如靈敏度高、速度快、特異性強(qiáng)，可減少交叉污染等。然而所有的這些檢測(cè)方法都是基于群體細(xì)胞的檢測(cè)(組織塊或細(xì)胞系)，所獲得是群體細(xì)胞中病毒復(fù)制的數(shù)據(jù)，只能反映群體細(xì)胞中的病毒量而不能獲悉單個(gè)細(xì)胞中病毒的感染及其復(fù)制情況。從上個(gè)世紀(jì)80年代末，生物學(xué)家們開(kāi)始探索單細(xì)胞PCR和單細(xì)胞RT-PCR的可行性。1988年，Jeffrey等從單個(gè)人體細(xì)胞中擴(kuò)增出了微衛(wèi)星DNA，標(biāo)志著單細(xì)胞PCR技術(shù)的建立(Jeffreys,AJ，Wilson,V，etal.Amplificationofhumanminisatellitesbythepolymerasechainreaction:towardsDNAfingerprintingofsinglecells[J].Nucleic.Acids.Res.，1988，16:10953-10971.)。近幾年熒光定量PCR技術(shù)又被成功的用于檢測(cè)單個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞中的基因以及研究胚胎發(fā)育細(xì)胞(Rice，JE,Sanchez,JA,etal.Real-timePCRwithmolecularbeaconsprovidesahighlyaccurateassayfordetectionofTay-Sachsallelesinsinglecells[J].Prenat.Diagn.,2002,22:1130-1134;Pierce,KE,Rice,JE,etal.Detectionofcysticfibrosisallelesfromsinglecellsusingmolecularbeaconsandanovelmethodofasymmetricreal-timePCR[J],Mol.Hum.Reprod.，2003,9:815-820)等。Wagatsuma等(Wagatsuma,A,Sadamoto,H，etal.DeterminationoftheexactcopynumbersofparticularmRNAsinasinglecellbyquantitativereal-timeRT-PCR[J].J.Exp.Biol"2005,208:2389-2398.)利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)單個(gè)蛇腦巨細(xì)胞中環(huán)AMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(英文名稱(chēng)CREB)的量，成功解決單細(xì)胞RT-PCR的兩大難題。首先，他們用激光切割術(shù)分離體細(xì)胞后用膜片鉗吸液術(shù)將細(xì)胞內(nèi)含物吸出，并成功地從單個(gè)細(xì)胞中提出mRNAs;其次，選用高靈敏度的熒光定量RT-PCR技術(shù)代替核酸雜交和競(jìng)爭(zhēng)性PCR進(jìn)行基因檢測(cè)，能夠檢測(cè)微量的目標(biāo)基因，特別適合于單細(xì)胞的定量分析。但是其分離單細(xì)胞技術(shù)存在一定的問(wèn)題，因?yàn)槟てQ技術(shù)不能保證完全能把細(xì)胞內(nèi)含物吸出而激光切割術(shù)也不能避免周?chē)渌蔷藜?xì)胞的污染。Parhar等(Parhar,IS,Ogawa,S,etal.Single-cellreal-timequantitativepolymerasechainreactionofimmunofluorescentlyidentifiedneuronsofgonadotropin陽(yáng)releasinghormonesubtypesincichlidfish[J].Endocrinology,2003,144:3297-3300)利用實(shí)時(shí)熒光定量方法同時(shí)檢測(cè)單個(gè)魚(yú)神經(jīng)元細(xì)胞中的促性腺激素釋放激素的三個(gè)亞型首先他們用連接在熒光顯微鏡上的顯微操縱儀分離單個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞，利用負(fù)壓將單個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)入裝有50nl細(xì)胞裂解液的1.5ml離心管中，凍入-8(TC;再將分離出來(lái)的單細(xì)胞樣品進(jìn)行蛋白消化和DnaseI酶解，用ISOGEN和RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA;最后將提取的細(xì)胞RNA分步進(jìn)行RT與PCR。用連接在顯微鏡上的顯微操縱儀分離細(xì)胞具有可監(jiān)控性、快速、易操作等優(yōu)點(diǎn)，可以完全監(jiān)控整個(gè)分離的過(guò)程，而其裂解細(xì)胞的過(guò)程確保無(wú)細(xì)胞蛋白和DNA污染，并且能完全釋放細(xì)胞RNA，使得后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增反應(yīng)有高純度的模板。該技術(shù)缺點(diǎn)也比較明顯，即裂解細(xì)胞歩驟較多并且從分離單細(xì)胞到進(jìn)行定量PCR反應(yīng)之間操作步驟繁瑣，會(huì)造成RNA的降解從而非真實(shí)地反應(yīng)原細(xì)胞目的基因的拷貝數(shù)。另外，兩步法(two-step)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR也在一定程度上增加了反應(yīng)時(shí)間和誤差幾率?？偠灾?，迄今單細(xì)胞熒光定量PCR技術(shù)還未被應(yīng)用于檢測(cè)感染細(xì)胞中的病毒的基因拷貝數(shù)，因此能否將之用于檢測(cè)感染細(xì)胞中攜帶的病毒量是我們所關(guān)注的科學(xué)問(wèn)題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供了一種檢測(cè)口蹄疫病毒基因組RNA的單細(xì)胞實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，包括了分離和裂解單細(xì)胞技術(shù)以及實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)，該方法能實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞水平上的病毒復(fù)制及其與宿主細(xì)胞關(guān)系的研究，為闡明病毒復(fù)制機(jī)制及探究病毒持續(xù)感染的成因等提供了一種新的技術(shù)手段。該方法還具有操作簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定性高、靈敏度高等特點(diǎn)，為研究病毒與宿主細(xì)胞關(guān)系提供了新的技術(shù)支持。另外，分離細(xì)胞和裂解細(xì)胞的技術(shù)具有廣泛適用性、能用于任何其他細(xì)胞(懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞)的分離與預(yù)處理，為在單細(xì)胞水平上進(jìn)行的各種研究奠定基礎(chǔ)。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施一種檢測(cè)口蹄疫病毒基因組RNA的單細(xì)胞實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的方法，其歩驟是A、單細(xì)胞的分離與裂解a、病毒感染用50100PFU滴度的口蹄疫病毒感染單層BHK-21細(xì)胞，1836h后，用胰酶將細(xì)胞消化，加入610倍于胰酶量的新鮮MEM生長(zhǎng)培養(yǎng)基滅活胰酶，充分分散細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至104106個(gè)/1111，最后，取lml細(xì)胞懸液于直徑6cm的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，進(jìn)行單細(xì)胞分離；b、分離單細(xì)胞分離單細(xì)胞需用到以下技術(shù)措施a)拉針器，b)磨針儀，c)顯微注射儀，d)細(xì)胞儲(chǔ)液，其特征是用拉針器和磨針儀制作精細(xì)的細(xì)胞挑針，通過(guò)與顯微注射儀連接的倒置顯微鏡可直接觀察到待分離的細(xì)胞并能隨時(shí)監(jiān)控整個(gè)分離挑取單細(xì)胞的過(guò)程，準(zhǔn)確快速地獲得所需的單細(xì)胞樣品(60min內(nèi)約可挑選分離3565個(gè)單細(xì)胞樣品)。具體實(shí)施步驟是首先將細(xì)胞挑針與顯微操縱儀的右導(dǎo)管相連，調(diào)節(jié)顯微注射儀的平衡(balance)旋鈕使提供的平衡壓減小(即表現(xiàn)為毛細(xì)管向內(nèi)吸液)，然后再將挑針前端伸入培養(yǎng)皿中至液面下，在顯微鏡下挑取單個(gè)細(xì)胞。挑起一個(gè)單細(xì)胞后，將帶有單細(xì)胞的挑針提起伸入PCR管液面下，增大平衡壓，將細(xì)胞送入PCR管內(nèi)的細(xì)胞儲(chǔ)液中。c、細(xì)胞裂解每30min60min處理一批單細(xì)胞樣品，以在裂解細(xì)胞前最大限度維持細(xì)胞原狀(60min內(nèi)約可挑選分離3565個(gè)單細(xì)胞樣品)。單細(xì)胞樣品于94T:98'C熱變性28min(可在水浴中變性也可在PCR儀中變性)后，迅速浸入液氮中，用蛋白酶K于53'C消化40或44或48或53或57或62或67或71或75min為避免病毒衣殼蛋白和細(xì)胞蛋白對(duì)逆轉(zhuǎn)錄的影響，蛋白酶解后立刻凍入液氮中直至進(jìn)行熒光定量RT-PCR反應(yīng)。B、熒光定量RT-PCR:熒光定量RT-PCR采用一步法擴(kuò)增(One-stepRT-PCR)，即在cDNA合成和擴(kuò)增之間不需要打開(kāi)管蓋一步完成，減少加樣誤差和交叉污染，特別是對(duì)單細(xì)胞樣品而言減少操作步驟無(wú)疑有利于精確定量。另外用已知濃度的體外轉(zhuǎn)錄RNA作為標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，使定量結(jié)果更準(zhǔn)確、直接，避免了用DNA為標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)逆轉(zhuǎn)錄效率不穩(wěn)定，而影響定量的準(zhǔn)確性。其具體步驟如下首先是一步法熒光定量反應(yīng)液(反應(yīng)總體積是50)il):2Xbuffer25^1,正義引物FP和反義引物RT各2pl(25(imol/L)，25pmol/L的熒光探針0.5nl，反轉(zhuǎn)錄和熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶lpl，RNA酶抑制劑(40U/pl)1^1，牛血清蛋白(10mg/ml)0.5^1，標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)的單細(xì)胞樣品均為5pl，無(wú)RNase的滅菌雙蒸水13pl組成。熒光探針5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM，3'端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。其次是反應(yīng)條件如下cDNA合成50°C30minPCR:95。C5min94°C30s，60°C90s}45cycles在每個(gè)循環(huán)第二步結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光檢測(cè)(即6(TC90s后采集熒光信號(hào))。對(duì)口蹄疫病毒的定量可通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值(Ct，ThresholdCycle)相比較以標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出待測(cè)樣品的起始拷貝數(shù)。第三是細(xì)胞總RNA的提取，將感染FMDV1836h后的BHK-21細(xì)胞離心收集起來(lái)，加入裂解液(Trizol，購(gòu)自Invi加gen)400pl充分混勻，室溫(20-25。C以下相同)靜置10min，加80pl氯仿，室溫靜置3min，于4。C12000g/min離心15min，上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)離心管中，力B200nl異丙醇，室溫沉淀10min，4'C12000g/min離心10min，棄上清，力卩l(xiāng)ml75X乙醇充分洗滌沉淀，于4。C7500g/min離心5min，棄上清，沉淀RNA并在室溫下自然干燥，加無(wú)RNase水10[il于6(TC10min溶解，置-7(TC保存。該RNA作為單細(xì)胞熒光定量PCR的陽(yáng)性對(duì)照。第四是取48個(gè)不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品，12個(gè)第三步所提的RNA作為陽(yáng)性對(duì)照，若干個(gè)單細(xì)胞樣品，24個(gè)陰性對(duì)照按照第一步所列出的配制反應(yīng)液，而后進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。采用單細(xì)胞實(shí)時(shí)熒光定量方法檢測(cè)，可以獲得有關(guān)病毒感染與復(fù)制的數(shù)據(jù)并解釋說(shuō)明其中一部分現(xiàn)象，例如在病毒感染過(guò)程中是否每個(gè)細(xì)胞都被感染上了(即檢測(cè)為陽(yáng)性的細(xì)胞)；在病毒感染過(guò)程中每個(gè)細(xì)胞中所攜帶的病毒量是否相同或差異顯著；細(xì)胞中攜帶的病毒量是否存在極限等等。這些直觀的數(shù)據(jù)進(jìn)一步揭示病毒與宿主細(xì)胞的關(guān)系以及病毒感染機(jī)制等。在本發(fā)明的一個(gè)具體方案中，配套使用拉針器與磨針儀制備分離單細(xì)胞所需的精細(xì)細(xì)胞挑針，所述的細(xì)胞挑針用拉針器和磨針儀制作的步驟是將無(wú)芯的外徑為1.0mm的玻璃管置于拉針器的中間部，溫度調(diào)至6064'C，使用一步法加熱(旋鈕調(diào)至"一步法"鍵)，打開(kāi)開(kāi)始鍵，由于重力作用，可使加熱的吸管拉長(zhǎng)變細(xì)成兩根吸管，即制成粗細(xì)胞吸管；粗細(xì)胞挑針經(jīng)磨針儀打磨至尖端部直徑略大于細(xì)胞直徑(20~100nm)，即制成分離單細(xì)胞所需的精細(xì)細(xì)胞挑針。在本發(fā)明的一個(gè)具體方案中，采用與顯微注射儀連接的顯微操縱儀半手動(dòng)進(jìn)行單細(xì)胞分離工作，整個(gè)分離過(guò)程都是在顯微鏡視野下觀測(cè)完成的，以避免分離單細(xì)胞不成功或分離出多于一個(gè)細(xì)胞等類(lèi)似情況的出現(xiàn)，準(zhǔn)確而快速地分離所需細(xì)胞，挑取出的單個(gè)細(xì)胞直接轉(zhuǎn)入裝有細(xì)胞儲(chǔ)液的PCR管中，半個(gè)小時(shí)內(nèi)完成單細(xì)胞的裂解。在本發(fā)明的一個(gè)具體方案中，細(xì)胞儲(chǔ)液選用0.9。/。NaCl(加入2U/ialRNase抑制劑)，0.9%NaCl(與水相比較)可增加細(xì)胞的滲透壓便于在熱變性的過(guò)程中細(xì)胞膜破裂完全，加入RNase抑制劑抑制RNase的活性，盡可能減少在分離和預(yù)處理過(guò)程中RNA的降解。在本發(fā)明的一個(gè)具體方案中，采用直接裂解法，熱變性使細(xì)胞膜破裂蛋白質(zhì)變性，再用蛋白酶消化除去蛋白對(duì)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的影響，避免加入任何的化學(xué)試劑(如裂解液、堿等)裂解細(xì)胞以增加反應(yīng)步驟和污染、降解RNA的機(jī)率。在本發(fā)明的一個(gè)具體方案中，采用94°C~98°C熱變性28min熱變性使宿主細(xì)胞膜破裂，釋放出其內(nèi)含物，隨后立即浸入液氮中降低RNA降解的可能性，最后選用蛋白酶K在53°。消化蛋白40或44或48或53或57或62或67或71或75min以避免病毒衣殼蛋白和細(xì)胞蛋白對(duì)逆轉(zhuǎn)錄的影響。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，采用一步法熒光定量RT-PCR，即在cDNA合成和擴(kuò)增之間不需要打開(kāi)管蓋使反應(yīng)一步完成，對(duì)于處理大量單細(xì)胞樣品而言，一歩法省時(shí)且易于操縱，更可減少加樣誤差和交叉污染；熒光定量反應(yīng)的引物序列分別為正義引物(FP)5，-GAACACATTCTTTACACCAGGAT-3'，反義引物(RT)5'-CATATCTTTGCCAATCAACATCAG-3'，擴(kuò)增子大小為121bp，熒光探針序列為5，F(xiàn)AM-ACAACCTACCGCCGAGCCAATTC-TAMRA-3，。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性RNA模板由含有插入目的片段的pGEM-Teasy(購(gòu)自PROMEGA公司)載體體外轉(zhuǎn)錄制備，轉(zhuǎn)錄后RNA于紫外分光光度計(jì)測(cè)A26o定量并10倍梯度稀釋。檢測(cè)所用的標(biāo)準(zhǔn)品制備過(guò)程如下PCR產(chǎn)物電泳后切下含有目的片段的凝膠，用Omega公司的凝膠回收試劑盒回收純化，與pGEM-Teasy載體4'C過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂平板培養(yǎng)，挑取白斑PCR鑒定陽(yáng)性后送博亞生物工程有限公司測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果將篩選的陽(yáng)性克隆菌接種到含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，用Omega公司的質(zhì)粒提取試劑盒制備質(zhì)粒DNA，Qiagen公司的純化試劑盒純化后，NcoI酶切后，并利用SP6啟動(dòng)子(根據(jù)測(cè)序結(jié)果)體外轉(zhuǎn)錄制備RNA模板，乙醇沉淀純化后于紫外分光光度計(jì)測(cè)A26o定量，并稀釋至梯度10^10i拷貝/1(^1，-7(TC保存，轉(zhuǎn)錄所用一切物品均需無(wú)RNA酶處理。在本發(fā)明的一個(gè)具體方案中，熒光定量反應(yīng)液由2Xbuffer溶液25pl，25nmol/LiH義(FP)、反義(RT)引物各2nl，25pmol/L熒光探針0.5^1,反轉(zhuǎn)錄和熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶lnl，RNA酶抑制劑lpl，牛血清蛋白(10mg/ml)0.5pl，無(wú)RNA酶的滅菌雙蒸水13pl組成。其中熒光探針5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM，3'端標(biāo)記以熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。在本發(fā)明提供的制作精細(xì)細(xì)胞挑針的方法中，針對(duì)顯微注射儀和BHK-21細(xì)胞的特點(diǎn)進(jìn)行了一系列的優(yōu)化，反復(fù)實(shí)驗(yàn)，以及與傳統(tǒng)的制作玻璃管的方法相比較，建立了一套制作精細(xì)細(xì)胞挑針的方法。具體如下外徑1.0mm的無(wú)芯管與顯微操縱儀相配套，采用半自動(dòng)的拉針器代替手動(dòng)拉制毛細(xì)管，選用6064'C的加熱溫度恰好能拉斷玻璃管又不至于使玻璃管前端部過(guò)短，制作出均勻細(xì)長(zhǎng)并有一定彎度的吸管，再經(jīng)磨針儀微微打磨成直徑略大于細(xì)胞直徑的精細(xì)細(xì)胞挑針。與傳統(tǒng)的酒精噴燈手動(dòng)拉制相比，拉針器半自動(dòng)制作能更快更均一地拉制品質(zhì)等同的毛細(xì)管，避免出現(xiàn)毛細(xì)管拉不斷，溫度不均一造成毛細(xì)管使用不便等情況。此外，拉針器還具有操作簡(jiǎn)便，易上手等特點(diǎn)，便于使用。在本發(fā)明提供的分離單細(xì)胞的方法中，基于現(xiàn)有的一些分離方法的比較和優(yōu)化，采用與顯微注射儀連接的顯微操縱儀半手動(dòng)分離單細(xì)胞，使用顯微注射儀平衡壓的功能，利用微毛細(xì)管內(nèi)的壓差吸入或排出液體從而實(shí)現(xiàn)分離單個(gè)細(xì)胞的目的。本發(fā)明提供的檢測(cè)口蹄疫病毒基因組RNA的單細(xì)胞熒光定量RT-PCR的方法是首次將單細(xì)胞熒光定量PCR技術(shù)與檢測(cè)病毒基因組RNA相結(jié)合，將在單細(xì)胞水平上研究病毒的復(fù)制及其與宿主細(xì)胞的關(guān)系變?yōu)榭赡埽瑸椴《净蚪M復(fù)制、轉(zhuǎn)錄的研究提供了一種新的手段，并進(jìn)一步完善了病毒學(xué)研究的方法。與現(xiàn)有一些單細(xì)胞分離處理技術(shù)和熒光定量PCR相比具有以下的優(yōu)點(diǎn)和效果1.與現(xiàn)有的一些分離單細(xì)胞的方法(流式細(xì)胞儀分選，膜片鉗技術(shù)等)相比，本發(fā)明中提供的顯微操縱儀分離法具有可視化操作、快速、高效、適用性廣等特點(diǎn)，分離后即轉(zhuǎn)入細(xì)胞儲(chǔ)液當(dāng)中進(jìn)行預(yù)處理，大大減少操作步驟，最大限度地維持細(xì)胞原狀(減少細(xì)胞核酸降解)使得定量結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠。2.與現(xiàn)有的一些細(xì)胞裂解法(堿裂解法、反復(fù)凍融法、加入裂解試劑法等)相比，本發(fā)明中提供的細(xì)胞裂解法具有操作步驟少而簡(jiǎn)單、無(wú)須加入額外試劑或需中和裂解等優(yōu)點(diǎn)，并且經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)裂解過(guò)程既不會(huì)造成RNA降解又能使細(xì)胞完全裂解致RNA釋放。3.與兩步法熒光定量RT-PCR相比，本實(shí)驗(yàn)采用的一步法擴(kuò)增，在處理大量重復(fù)樣品時(shí)易于操作，在cDNA合成和擴(kuò)增之間不需要打開(kāi)管蓋，因而有助于減少交叉污染、加樣誤差和小量樣品的損失，便于進(jìn)行單細(xì)胞水平的樣品檢測(cè)與定量。靈敏度高，最低可檢測(cè)至10copies，檢測(cè)范圍更可以達(dá)到九個(gè)數(shù)量級(jí)，是很多其他的定量方法所不能比擬的。圖l熒光定量RT-PCR反應(yīng)所獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，表明該定量檢測(cè)的范圍為101109，且線(xiàn)性非常好。線(xiàn)性方程為copynumber=10(—()，CT+11629)，其斜率為-3.497，112值為0.9999。圖2單細(xì)胞常規(guī)RT-PCR的凝膠電泳圖。(具體說(shuō)明見(jiàn)實(shí)例3)M，Marker,泳道14為一個(gè)單細(xì)胞樣品的不同稀釋度結(jié)果；泳道l:五分之一的細(xì)胞量；泳道2為五十分之一的細(xì)胞量；泳道3為五百分之一的細(xì)胞量；泳道4為五千分之一的細(xì)胞量，泳道5為陰性對(duì)照。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍，下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件和方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等主編，科學(xué)出版社，2002，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)；D丄.斯佩克特等主編，科學(xué)出版社，2001，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南；F.M.奧斯伯等主編，科學(xué)出版社，2005，精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南，或按照制造廠(chǎng)商建議的條件。實(shí)施例l單細(xì)胞熒光定量RT-PCR檢測(cè)急性感染細(xì)胞中口蹄疫病毒基因組RNA的拷貝數(shù)一、實(shí)驗(yàn)試劑與儀器A)試劑a)胰酶、MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(均購(gòu)自Invitrogen公司)b)細(xì)胞儲(chǔ)液每管含有5~10pl0.9%NaCl，分裝于PCR管中c)液氮d)蛋白酶K和RNase抑制劑(分別購(gòu)自Amesco和TAKARA公司)e)—步法反應(yīng)試劑盒(包括反轉(zhuǎn)錄酶和熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶以及buffer)、牛血清蛋白、RNase抑制劑、無(wú)RNase的水。前兩者購(gòu)自Invitrogen公司，后兩者購(gòu)自TAKARA公司。f)RT、FP引物，探針(Invitrogen公司合成)g)Trizol細(xì)胞裂解液(購(gòu)自Invitrogen公司)B)儀器a)顯微注射儀(購(gòu)自Narashige公司)b)熒光定量PCR儀(購(gòu)自Eppendorf公司)c)PCR儀(購(gòu)自Biometra公司)d)冷凍離心機(jī)(購(gòu)自Eppendorf公司)二、具體實(shí)施步驟如下A)單細(xì)胞的分離與裂解a)病毒感染用50100PFU(PFU:蝕斑形成單位)滴度的口蹄疫病毒感染單層BHK-21細(xì)胞，約18或20或24或26或29或32或34或36h后，用胰酶將細(xì)胞消化下來(lái)，加入IO倍于胰酶量的新鮮MEM生長(zhǎng)培養(yǎng)基滅活胰酶，調(diào)整細(xì)胞量至約104106個(gè)/1111。最后，取lml至直徑6cm的培養(yǎng)皿中(市售)，即可進(jìn)行單細(xì)胞分離。b)分離單細(xì)胞將精細(xì)細(xì)胞挑針與顯微操縱儀的右導(dǎo)管相連，調(diào)節(jié)顯微注射儀的平衡(balance)旋鈕使提供的平衡壓減小(即表現(xiàn)為毛細(xì)管向內(nèi)吸液)，再將挑針前端伸入培養(yǎng)皿中至液面下，用操作儀控制，在顯微鏡下挑取單個(gè)細(xì)胞。挑起一個(gè)單細(xì)胞后，將帶有單細(xì)胞的挑針提起伸入PCR管液面下，增大平衡壓，將細(xì)胞送入PCR管內(nèi)的細(xì)胞儲(chǔ)液中。c)細(xì)胞裂解每30或34或38或42或47或50或53或57或60min處理一批單細(xì)胞樣品，以在裂解細(xì)胞前最大限度維持細(xì)胞原狀。單細(xì)胞樣品于94'C98'C熱變性2或4或6或8min后，迅速浸入液氮中，用lpg的蛋白酶K(加入2U4aRNase抑制劑)于53。C消化40或45或49或54或58或63或68或72或75min以避免病毒衣殼蛋白和細(xì)胞蛋白對(duì)逆轉(zhuǎn)錄的影響，蛋白酶解后立刻凍入液氮中直至進(jìn)行熒光定量RT-PCR反應(yīng)。B)熒光定量RT-PCR首先是一步法熒光定量反應(yīng)液(反應(yīng)總體積是50nl):2Xbuffer25^1，正義引物FP和反義引物RT各2pl(25pmol/L)，25^imol/L的熒光探針0.5pl，反轉(zhuǎn)錄和熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶lpl,RNA酶抑制劑(40U爾l)lpl，牛血清蛋白(10mg/ml)0.5^1，標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)的單細(xì)胞樣品均為5pl，無(wú)RNase的滅菌雙蒸水13pl組成。熒光探針5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM，3'端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。其次是反應(yīng)條件如下cDNA合成50°C30minPCR:95。C5min94°C30s，60°C90s}45cycles在每個(gè)循環(huán)第二步結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光檢測(cè)(即60'C90s后采集熒光信號(hào))。對(duì)口蹄疫病毒的定量可通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值(Ct，ThresholdCycle)相比較，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出待測(cè)樣品的起始拷貝數(shù)。第三是細(xì)胞總RNA的提取將感染FMDV18或21或25或28或32或34或36h后的BHK-21細(xì)胞離心收集起來(lái)，加入裂解液(Trizol，購(gòu)自Invitrogen)400pl充分混勻，室溫靜置10min，加80pl氯仿，室溫靜置3min，于4。C12000g/min離心15min，上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)離心管，力B200(il異丙醇，室溫沉淀10min，4'C12000g/min離心10min，棄上清，力口lml75X乙醇充分洗滌沉淀，于4。C7500g/min離心5min，棄上清，沉淀RNA并在室溫下自然干燥，加無(wú)RNase水10^于6(TC10min溶解，即放入-70°C保存。將該RNA作為單細(xì)胞熒光定量PCR的陽(yáng)性對(duì)照。第四是取4個(gè)不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品，一個(gè)第三步所提的RNA作為陽(yáng)性對(duì)照，48個(gè)單細(xì)胞樣品，2個(gè)水作為陰性對(duì)照按照第一步所列出的配制反應(yīng)液，而后進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)果如下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>以上結(jié)果表明在口蹄疫病毒急性感染過(guò)程中，并不是每個(gè)細(xì)胞都被病毒感染(即檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性細(xì)胞)，細(xì)胞的陽(yáng)性率為83.33%，且細(xì)胞中的病毒RNA拷貝數(shù)差異較大(從十幾到幾十萬(wàn)拷貝數(shù)不等)。該實(shí)例很好的證實(shí)了單細(xì)胞熒光定量RT-PCR可以成功地應(yīng)用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)病毒量，且靈敏度可檢測(cè)1Ocopies。注熒光定量RT-PCR在10、10^/r有極好的線(xiàn)性關(guān)系，R2=0.9998，其檢測(cè)范圍可以達(dá)到九個(gè)數(shù)量級(jí)，靈敏度可檢測(cè)至10copies，且重復(fù)性很好。實(shí)施例2單細(xì)胞熒光定量RT-PCR檢測(cè)持續(xù)性感染細(xì)胞中口蹄疫病毒基因組RNA的拷貝數(shù)一、材料A)持續(xù)性感染口蹄疫病毒的BHK-21細(xì)胞的獲得用弱堿法建立持續(xù)性感染細(xì)胞(口蹄疫病毒持續(xù)性感染細(xì)胞系的快速選擇及其特性研究顧潮江，中國(guó)病毒學(xué)，第18巻第5期2003)。B)試劑與儀器a)胰酶、MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(均購(gòu)自Invitrogen公司)b)細(xì)胞儲(chǔ)液每管裝有510i^l0.9y。NaCl，分裝于PCR管中c)液氮d)蛋白酶K和RNase抑制劑(分別購(gòu)自Amesco和TAKARA公司)e)—步法反應(yīng)試劑盒(包括反轉(zhuǎn)錄酶和熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶以及buffer)、牛血清蛋白、RNase抑制劑、無(wú)RNase的水。前兩者購(gòu)自Invitrogen公司，后兩者購(gòu)自TAKARA公司。f)RT、FP引物，探針(Invitrogen公司合成)g)Trizol細(xì)胞裂解液(購(gòu)自Invitrogen公司)h)顯微注射儀(購(gòu)自Narashige公司)i)熒光定量PCR儀(購(gòu)自Eppendorf公司)j)PCR儀(購(gòu)自Biometra公司)k)冷凍離心機(jī)(購(gòu)自Eppendorf公司)二、實(shí)驗(yàn)方法及具體步驟A)單細(xì)胞的分離與裂解持感細(xì)胞傳代至第25代，加入胰酶消化3或4或5或6min，再加入610倍于胰酶量的新鮮MEM生長(zhǎng)培養(yǎng)基滅活胰酶，調(diào)整細(xì)胞濃度至約104106個(gè)/1111。取lml至直徑6cm的培養(yǎng)皿中，立刻進(jìn)行單細(xì)胞分離。將細(xì)胞挑針與顯微操縱儀的右導(dǎo)管相連，調(diào)節(jié)顯微注射儀的平衡(balance)旋鈕使平衡壓減小(即表現(xiàn)為毛細(xì)管向內(nèi)吸液)，再將挑針前端伸入培養(yǎng)皿中至液面下，用操作儀控制，在顯微鏡下進(jìn)行單細(xì)胞分離。挑起一個(gè)單細(xì)胞后，將挑針提起伸入PCR管液面中，增大平衡壓，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入PCR管內(nèi)的細(xì)胞儲(chǔ)液中。每30或32或37或41或45或49或52或56或60min處理一批單細(xì)胞樣品，以在裂解細(xì)胞前最大限度維持細(xì)胞原狀。單細(xì)胞樣品于94'C98'C熱變性2或4或6或8min后，迅速浸入液氮中，用lpg的蛋白酶K(加入2U爾1RNase抑制劑)于53'C消化40或44或48或53或57或62或67或71或75min以避免病毒衣殼蛋白和細(xì)胞蛋白對(duì)逆轉(zhuǎn)錄的影響，蛋白酶解后立刻凍入液氮中直至進(jìn)行后續(xù)熒光定量RT-PCR反應(yīng)。B)熒光定量RT-PCR首先是一步法熒光定量反應(yīng)液(反應(yīng)總體積是50pl):2Xbuffer25ul，正義引物FP和反義引物RT各2ul(25umol/L)，25umol/L的熒光探針0.5ul，反轉(zhuǎn)錄和熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶lul，RNA酶抑制劑(40U4d)1ul，牛血清蛋白(10mg/ml)0.5ul，標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)的單細(xì)胞樣品均為5ul，無(wú)RNase的滅菌雙蒸水13ul組成。熒光探針5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM,3'端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。其次是反應(yīng)條件如下cDNA合成50°C30minPCR:95°C5min94°C30s，60°C90s》45cycles在每個(gè)循環(huán)第二步結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光檢測(cè)(即60'C90s后采集熒光信號(hào))。對(duì)口蹄疫病毒的定量可通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值(Ct，ThresholdCycle)相比較，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出待測(cè)樣品的起始拷貝數(shù)。第三是細(xì)胞總RNA的提取將25代的持感細(xì)胞離心收集起來(lái)，加入裂解液(Trizol，購(gòu)自Invitrogen)400(xl充分混勻，室溫靜置10min，加80nl氯仿，室溫靜置3min，于4。C12000g/min離心15min,上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)離心管，力卩200pl異丙醇，室溫沉淀10min，4。C12000g/min離心10min，棄上清，力Blml75%乙醇充分洗滌沉淀，于4。C7500g/min離心5min,棄上清，沉淀RNA并在室溫下自然干燥，加無(wú)RNase水10pl于60。C10min溶解RNA，即放入-70。C保存。將此RNA作為單細(xì)胞熒光定量RT-PCR的陽(yáng)性對(duì)照。第四是取4個(gè)不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品，一個(gè)第三步所提的RNA作為陽(yáng)性對(duì)照，26個(gè)單細(xì)胞樣品，2個(gè)水作為陰性對(duì)照按照第一步所列出的配制反應(yīng)液，而后進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)果如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>以上數(shù)據(jù)表明持續(xù)感染細(xì)胞中所攜帶的病毒量大大低于急性感染細(xì)胞中的病毒量，這也許是病毒能與細(xì)胞共存的原因。該實(shí)例證明了單細(xì)胞熒光定量PCR技術(shù)可以被應(yīng)用于檢測(cè)少量目的片段，具備了很高的靈敏度，并且便于操作。注熒光定量RT-PCR在10、10k/r有極好的線(xiàn)性關(guān)系，R2=0.9999，其檢測(cè)范圍可以達(dá)到九個(gè)數(shù)量級(jí)，靈敏度可檢測(cè)至10copies,且重復(fù)性很好。其它實(shí)施步驟與實(shí)施例l相同。實(shí)施例3分離與裂解單細(xì)胞技術(shù)在單細(xì)胞RT-PCR中的應(yīng)用一、試劑與儀器a)胰酶、MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(均購(gòu)自Invitrogen公司)b)細(xì)胞儲(chǔ)液每管裝有510nl0.9n/。NaCl，分裝于PCR管中c)液氮d)蛋白酶K和RNase抑制劑(分別購(gòu)自Amesco和TAKARA公司)e)RT反應(yīng)液M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、5X緩沖液、dNTP、RNase抑制劑。前兩者購(gòu)自Promega公司，后兩者購(gòu)自TAKARA公司。f)PCR反應(yīng)液PremixTaq酶，無(wú)菌水。購(gòu)自TAKARA公司。g)RT、FP引物(Invitrogen公司合成)h)顯微注射儀(購(gòu)自Narashige公司)i)PCR儀(購(gòu)自Biometra公司)二、實(shí)驗(yàn)方法及具體步驟A)單細(xì)胞的分離與裂解將培養(yǎng)在T-25瓶中的BHK-21細(xì)胞消化下來(lái)，即加入胰酶消化3或4或5或6min，再加入610倍于胰酶量的新鮮MEM生長(zhǎng)培養(yǎng)基滅活胰酶，調(diào)整細(xì)胞濃度至約10"10MVml。最后，取lml至直徑6cm的培養(yǎng)皿中，立刻進(jìn)行單細(xì)胞分離。將細(xì)胞挑針與顯微操縱儀的右導(dǎo)管相連，調(diào)節(jié)顯微注射儀的平衡(balance)旋鈕使平衡壓減小(即表現(xiàn)為毛細(xì)管向內(nèi)吸液)，再將挑針前端伸入培養(yǎng)皿液面下，用操作儀控制，在顯微鏡下進(jìn)行單細(xì)胞分離。挑起一個(gè)單細(xì)胞后，將挑針提起伸入PCR管液面中，增大平衡壓，細(xì)胞轉(zhuǎn)入PCR管內(nèi)的細(xì)胞儲(chǔ)液中。每30或33或37或41或46或49或52或56或60min處理一批單細(xì)胞樣品，以在裂解細(xì)胞前最大限度維持細(xì)胞原狀。單細(xì)胞樣品于94'C98'C熱變性28min后，迅速浸入液氮中，用1嗎的蛋白酶K(加入2U/nlRNase抑制劑)于53T:消化40或44或48或53或57或62或67或71或75min以避免病毒衣殼蛋白和細(xì)胞蛋白對(duì)逆轉(zhuǎn)錄的影響，蛋白酶解后立刻凍入液氮中直至進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。B)常規(guī)RT-PCR將單細(xì)胞的分離與裂解技術(shù)應(yīng)用于常規(guī)RT-PCR，該反應(yīng)的耙基因?yàn)槌旨一蚋视腿?3-磷酸脫氫酶(英文簡(jiǎn)稱(chēng)GAPDH)的mRNA，引物序列為正義引物是5'-TGGCAAGTTCAAAGGCACA-3，，反義引物是5，-AGATCCACGACGGACACG-3，，擴(kuò)增子大小為576bp。反應(yīng)為兩步法，第一步是反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液包括5Xbuffer5^1，反義引物RTl[il(25拜ol/L)，反轉(zhuǎn)錄酶lpl，RNA酶抑制劑(40，)ljil，10mMdNTP1^1，待測(cè)的單細(xì)胞樣品為lnl，無(wú)RNase的滅菌雙蒸水15pl組成。反轉(zhuǎn)錄的條件如下42'C溫育反應(yīng)50min，98'C滅活反轉(zhuǎn)錄酶1530min。第二步是PCR，PCR的反應(yīng)體系為50W由2Xbuffer25W，正義引物FP和反義引物RT各lpl(25pmol/L)，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2pl，無(wú)菌水21pl組成。PCR條件如下95。C2min95°C40s，55°C30s^45cycles72。C2min_J72°ClOtnin將A)中分離裂解的單細(xì)胞樣品進(jìn)行10倍稀釋(從2xl0"至2x10—4)共四個(gè)樣品，將水作為陰性對(duì)照，進(jìn)行RT-PCR，反應(yīng)結(jié)果如附圖2。其它實(shí)施步驟與實(shí)施例l相同。以上結(jié)果表明單細(xì)胞RT-PCR反應(yīng)的靈敏度高達(dá)五百分之一的細(xì)胞量，也就是說(shuō)能完全應(yīng)用于檢測(cè)一個(gè)細(xì)胞基因組中的mRNA。同時(shí)，也證實(shí)了單細(xì)胞分離與裂解技術(shù)成功應(yīng)用于正常BHK-21細(xì)胞中mRNA的定性檢測(cè)。權(quán)利要求1、一種檢測(cè)口蹄疫病毒基因組RNA的單細(xì)胞實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，其步驟是A、單細(xì)胞的分離與裂解a、病毒感染用50～100PFU滴度的口蹄疫病毒感染單層BHK-21細(xì)胞，18～36h后，用胰酶將細(xì)胞消化，加入6～10倍于胰酶量的新鮮MEM生長(zhǎng)培養(yǎng)基滅活胰酶，分散細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至104～106個(gè)/ml，最后，取1ml細(xì)胞懸液于直徑6cm的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，進(jìn)行單細(xì)胞分離；b、分離單細(xì)胞分離單細(xì)胞采用a)拉針器，b)磨針儀，c)顯微注射儀，d)細(xì)胞儲(chǔ)液，用拉針器和磨針儀制作細(xì)胞挑針，通過(guò)與顯微注射儀連接的倒置顯微鏡直接觀察待分離的細(xì)胞并能隨時(shí)監(jiān)控整個(gè)分離挑取單細(xì)胞的過(guò)程，用細(xì)胞挑針挑起單細(xì)胞后，直接提起伸入PCR管液面下，完成將單細(xì)胞送入PCR管內(nèi)的細(xì)胞儲(chǔ)液全過(guò)程；c、細(xì)胞裂解每30～60min處理單細(xì)胞樣品，單細(xì)胞樣品于94℃～98℃熱變性2～8min后，浸入液氮中，用蛋白酶K于53℃酶解40-75min，隨后凍入液氮中直至進(jìn)行熒光定量RT-PCR反應(yīng)；B、熒光定量RT-PCR一步法熒光定量反應(yīng)液，反應(yīng)總體積是50μl，2×buffer25μl，正義引物FP和反義引物RT各2μl，25μmol/L的熒光探針0.5μl，反轉(zhuǎn)錄和熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶1μl，RNA酶抑制劑1μl，牛血清蛋白0.5μl，標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)的單細(xì)胞樣品5μl，無(wú)RNase的滅菌雙蒸水13μl組成，熒光探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA；反應(yīng)條件如下cDNA合成50℃30minPCR95℃5min細(xì)胞總RNA的提取，將感染口蹄疫病毒18～36h后的BHK-21細(xì)胞離心收集，加入裂解液400μl混勻，室溫靜置10min，加80μl氯仿，室溫靜置3min，于4℃12000g/min離心15min，上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)離心管內(nèi)，加200μl異丙醇，室溫沉淀10min，4℃12000g/min離心10min，棄上清，加1ml75％乙醇充分洗滌沉淀，于4℃7500g/min離心5min，棄上清，沉淀RNA并在室溫下自然干燥，加無(wú)RNase水10μl于60℃10min溶解，放入-70℃保存；取4～8個(gè)不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品，1～2個(gè)細(xì)胞總RNA作為陽(yáng)性對(duì)照，2～4個(gè)陰性對(duì)照按照前面所列出的配制反應(yīng)液，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)口蹄疫病毒基因組RNA的單細(xì)胞實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，其特征是所述的正義引物5'-GAACACATTCTTTACACCAGGAT-3，，反義引物5'-CATATCTTTGCCAATCAACATCAG-3'，擴(kuò)增子大小為121bp，熒光探針序列為5，F(xiàn)AM-ACAACCTACCGCCGAGCCAATTC-TAMRA-3，，探針的5'端標(biāo)記熒光發(fā)射基團(tuán)FAM，靠近3'端標(biāo)以熒光淬滅基團(tuán)TAMRA，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性RNA模板由己插入口蹄疫病毒基因組3D區(qū)121bp基因片段的pGEM-T載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ct，增殖后提取質(zhì)粒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄制備RNA，并于紫外分光光度計(jì)測(cè)A260值定量并10倍梯度稀釋。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)口蹄疫病毒基因組RNA的單細(xì)胞實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，其特征是所述的細(xì)胞挑針用拉針器和磨針儀制作的步驟是將無(wú)芯的外徑為1.0mm的玻璃管置于拉針器的中間部，溫度調(diào)至6064'C，使用一步法加熱，打開(kāi)開(kāi)始鍵，重力作用，使加熱的玻璃管拉長(zhǎng)成兩根均勻細(xì)長(zhǎng)吸管，即制成粗細(xì)胞挑針；粗細(xì)胞挑針經(jīng)磨針儀打磨呈彎度且尖端部直徑大于細(xì)胞直徑20100pm。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)口蹄疫病毒基因組RNA的單細(xì)胞實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法。該方法利用顯微注射儀分離感染口蹄疫病毒的單個(gè)細(xì)胞，裂解后即用熒光定量RT-PCR進(jìn)行定量分析。顯微注射儀的可視化操作能快速準(zhǔn)確地分離單個(gè)細(xì)胞，與高靈敏度的熒光定量RT-PCR相結(jié)合可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)病毒基因組RNA的量。該方法可用于在單細(xì)胞水平上研究病毒的復(fù)制及其與宿主細(xì)胞的關(guān)系，為病毒感染細(xì)胞生物學(xué)的深入研究提供一種新的方法。且分離與裂解細(xì)胞的技術(shù)具有廣泛適用性，可直接應(yīng)用于其它種類(lèi)病毒感染的細(xì)胞或正常細(xì)胞的分離預(yù)處理，使得本發(fā)明的方法也能用于其它RNA病毒基因組檢測(cè)和正常細(xì)胞基因組復(fù)制及轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制研究。文檔編號(hào)C12Q1/70GK101386893SQ20081019741公開(kāi)日2009年3月18日申請(qǐng)日期2008年10月28日優(yōu)先權(quán)日2008年10月28日發(fā)明者屈三甫,勇李,鄭從義,璇黃申請(qǐng)人:武漢大學(xué)