專利名稱：一種微量動(dòng)物細(xì)胞基因組dna模板制備液及相應(yīng)的dna模板制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種微量動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA模板制備液及相 應(yīng)的DNA模板制備方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有的動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA提取方法很多，包括酚氯仿抽提法等，提取過程由于 DNA純化需要洗滌等過程而繁瑣，而且由于DNA純化的得率問題，需要細(xì)胞初始樣本量較 多，因此一般需要抽取動(dòng)物血樣或采動(dòng)物組織樣，對(duì)動(dòng)物造成傷害較大。市場(chǎng)上現(xiàn)有的微量 動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒由于需要純化柱子而價(jià)格昂貴，且過程也相對(duì)繁瑣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供針對(duì)現(xiàn)有動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA提取存在的不足，提供一種微 量動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA模板制備液及相應(yīng)的DNA模板制備方法。一種微量動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA模板制備液，該制備液由A液和B液以1:3_10的 體積比混合制得，其中所述的A液為Tris、(NH4)2SO4, MgCl2的混合溶液，三種試劑終濃度 均為0. 1-2. OM ；所述的B液為Triton和β -琉基乙醇的混合溶液，二種試劑終濃度均為 0. 1-2. 0%。。相應(yīng)的DNA模板制備方法，依次包括如下步驟
(1)取上述微量動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA模板制備液，加入裝有微量動(dòng)物細(xì)胞的離心管或 PCR管中；
(2)將裝有所述DNA模板制備液和動(dòng)物細(xì)胞的離心管或PCR管95°C保溫5分鐘，16°C 保溫5分鐘；
(3)加入蛋白酶K溶液，該蛋白酶K終濃度為1.0-3.0mg/ml；
(4)55°C保溫2小時(shí)或以上，95°C保溫10分鐘，16°C保溫5分鐘；
(5)離心取上清，此上清液直接用作PCR的DNA模板。所述的DNA模板制備方法優(yōu)選依次包括如下步驟
(1)取上述微量動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA模板制備液8.8μ 1，加入裝有動(dòng)物細(xì)胞的離心管 或PCR管中；
(2)將裝有所述DNA模板制備液和動(dòng)物細(xì)胞的離心管或PCR管95°C保溫5分鐘，16°C 保溫5分鐘；
(3)加入濃度為10mg/ml蛋白酶K溶液1.2 μ 1，使該蛋白酶K終濃度為1.2mg/ml，得 到總反應(yīng)體積10 μ 1 ；
(4)55°C保溫2小時(shí)或以上，95°C保溫10分鐘，16°C保溫5分鐘；
(5)離心取上清，此上清液直接用作PCR的DNA模板。有益效果
3本發(fā)明微量動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA模板制備液成本較之現(xiàn)有的動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA提取 所需試劑成本大幅降低。本發(fā)明動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA模板制備過程簡(jiǎn)單，利用所配制的DNA 模板制備液直接將動(dòng)物細(xì)胞裂解，釋放的DNA無需進(jìn)行純化可直接用作常規(guī)PCR的DNA模 板，避免了常規(guī)方法提取基因組DNA的繁瑣過程。由于模板制備過程簡(jiǎn)單，本發(fā)明從微量動(dòng) 物細(xì)胞制備的基因組DNA模板完整，沒有耗損。本發(fā)明微量動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA的模板制 備液及相應(yīng)的DNA模板制備方法因所需初始動(dòng)物細(xì)胞數(shù)量較小，可用于動(dòng)物毛發(fā)毛囊、極 微量的動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞等基因組DNA模板的制備，使大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA模板制備成 為可能。由于動(dòng)物毛發(fā)等取樣簡(jiǎn)單，較之動(dòng)物血樣或組織樣等的取樣手段，對(duì)動(dòng)物的傷害更


圖1、實(shí)施例3利用本發(fā)明制備乳鴿微量羽髓細(xì)胞基因組DNA模板及乳鴿雌雄鑒別 結(jié)果圖，
M=Marker DL 2000。圖2、實(shí)施例4利用本發(fā)明制備牛毛囊細(xì)胞基因組DNA模板的PCR鑒定結(jié)果圖， M=Marker DL 2000。圖3、實(shí)施例5利用本發(fā)明制備豬單個(gè)卵母細(xì)胞周邊少量卵丘細(xì)胞基因組DNA模板 的PCR鑒定結(jié)果圖，
M =Marker DL 2000，泳道1、2 基因組DNA擴(kuò)增片段，泳道3、4 陰性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1微量動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA模板制備液的配制
A液Tris、(NH4)2SO4^MgCl2三種試劑溶于雙蒸水，使其終濃度均為0. IM ； B液=Triton和β -巰基乙醇用雙蒸水稀釋，使其終濃度均為0. 1% ； 以雙蒸水為溶劑，按常規(guī)方法分別配制A液和B液，然后以1:3的比例將Α、Β兩種液體 混合均勻，即得動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA模板制備液。實(shí)施例2微量動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA模板制備液的配制
A液Tris、(NH4)2SO4^MgCl2三種試劑溶于雙蒸水，使其終濃度均為2. OM ； B液=Triton和β -巰基乙醇用雙蒸水稀釋，使其終濃度均為2. 0% ； 以雙蒸水為溶劑，按常規(guī)方法分別配制A液和B液，然后以1 10的比例將A、B兩種液 體混合均勻，即得動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA模板制備液。實(shí)施例3利用乳鴿微量羽髓細(xì)胞制備基因組DNA模板及乳鴿雌雄鑒別 1. 1乳鴿羽髓細(xì)胞基因組DNA模板制備
撥取7天左右乳鴿新生腹側(cè)羽毛(含少量羽髓)1根，并取Img左右羽髓于PCR管中； PCR管中加入實(shí)施例1微量動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA模板制備液8. 8 μ 1 ； PCR管置PCR儀中95°C 5分鐘，16°C 5分鐘，55°C 2小時(shí)，95°C 10分鐘，16°C 5分鐘。 并在第一個(gè)16°C 5分鐘過種中暫停PCR儀，加入1.2 μ 1蛋白酶K (10mg/ml)； 離心取上清作PCR的DNA模板。1.2 PCR 擴(kuò)增
4反應(yīng)體系雙蒸水 6. 05 μ l、25mM Mg2+ 1. 0μ IUOXBuffer 1· Ομ l、5mM dNTP 0. 4μ 1、 5μΜ上、下游引物各0. 5μ l、Taq酶0. 05μ 1、DNA模板0. 5μ 1 ；上游引物為:SEQ ID NO. 1， 下游引物為=SEQ ID NO. 2。反應(yīng)條件94°C2 分鐘；94°C 30 秒，50 °C 30 秒，72 °C 40 秒，35 個(gè)循環(huán)。1.3 PCR產(chǎn)物條帶分型
EB染色，1%瓊脂糖凝膠5-lOV/cm電泳，成像系統(tǒng)條帶分型。雌性鴿為三條條帶，長(zhǎng)度 分別是628bp、420bp和358bp ；雄性鴿為二條條帶，長(zhǎng)度分別為628bp和358bp (見圖1)。實(shí)施例4利用牛毛囊細(xì)胞制備基因組DNA模板 1. 1種公牛毛囊細(xì)胞基因組DNA模板制備
撥取種公牛毛發(fā)1根，并取毛囊于PCR管中； PCR管中加入實(shí)施例2微量動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA模板制備液8. 8 μ 1 ； PCR管置PCR儀中95°C 5分鐘，16°C 5分鐘，55°C 2小時(shí)，95°C 10分鐘，16°C 5分鐘。 并在第一個(gè)16°C 5分鐘過種中暫停PCR儀，加入1.2 μ 1蛋白酶K (10 mg/ml)； 離心取上清作PCR的DNA模板。1.2 PCR 擴(kuò)增
反應(yīng)體系雙蒸水 6. 05 μ l、25mM Mg2+ 1. Ομ IUOXBuffer 1· 0μ l、5mM dNTP 0. 4μ 1、 5μΜ所述的上、下游引物各0. 5μ l、Taq酶0. 05μ 1、DNA模板0. 5μ 1 ；上游引物為SEQ ID NO. 3，下游引物為=SEQ ID NO. 4。反應(yīng)條件94°C2 分鐘；94°C 30 秒，56 °C 30 秒，72 °C 40 秒，35 個(gè)循環(huán)。1.3基因組DNA模板的PCR鑒定
EB染色，1%瓊脂糖凝膠5-lOV/cm電泳，成像系統(tǒng)鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶(見圖2)。實(shí)施例5利用豬單個(gè)卵母細(xì)胞周邊少量卵丘細(xì)胞制備基因組DNA模板 1. 1單個(gè)卵母細(xì)胞周邊的少量卵丘細(xì)胞基因組DNA模板制備
吸取單個(gè)卵母細(xì)胞(含少量卵丘細(xì)胞)，并吹入PCR管中(PBS盡量少)； PCR管中加入實(shí)施例2微量動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA模板制備液8. 8 μ 1 ； PCR管置PCR儀中95°C 5分鐘，16°C 5分鐘，55°C 2小時(shí)，95°C 10分鐘，16°C 5分鐘。 并在第一個(gè)16°C 5分鐘過種中暫停PCR儀，加入1.2 μ 1蛋白酶K (10mg/ml)； 離心取上清作PCR的DNA模板。1.2 PCR 擴(kuò)增
反應(yīng)體系雙蒸水 6. 05 μ l、25mM Mg2+ 1. 0μ IUOXBuffer 1· 0μ l、5mM dNTP 0. 4μ 1、 5μΜ所述的上、下游引物各0. 5μ l、Taq酶0. 05μ 1、DNA模板0. 5μ 1 ；上游引物為SEQ ID NO. 5，下游引物為=SEQ ID NO. 6。反應(yīng)條件94°C2 分鐘；94°C 30 秒，59 °C 30 秒，72 °C 30 秒，35 個(gè)循環(huán)。1.3基因組DNA模板的PCR鑒定
EB染色，1%瓊脂糖凝膠5-lOV/cm電泳，成像系統(tǒng)鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶(見圖3)。
權(quán)利要求
一種微量動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA模板制備液，其特征在于該制備液由A液和B液以1:3 10的體積比混合制得，其中所述的A液為Tris、(NH4)2SO4、MgCl2的混合溶液，三種試劑終濃度均為0.1 2.0M；所述的B液為Triton和β 琉基乙醇的混合溶液，二種試劑終濃度均為0.1 2.0%。
2.—種DNA模板制備方法，其特征在于依次包括如下步驟(1)取權(quán)利要求1所述的微量動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA模板制備液，加入裝有微量動(dòng)物細(xì) 胞的離心管或PCR管中；(2)將裝有所述DNA模板制備液和動(dòng)物細(xì)胞的離心管或PCR管于95°C保溫5分鐘， 16°C保溫5分鐘；(3)加入蛋白酶K溶液，使該蛋白酶K終濃度為1.0-3.0mg/ml；(4)55 °C保溫2小時(shí)或以上，95°C保溫10分鐘，16°C保溫5分鐘；(5)離心取上清，此上清液直接用作PCR的DNA模板。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA模板制備方法，依次包括如下步驟(1)取權(quán)利要求1所述的微量動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA模板制備液8.8 μ 1，加入裝有微量 動(dòng)物細(xì)胞的離心管或PCR管中；(2)將裝有所述DNA模板制備液和動(dòng)物細(xì)胞的離心管或PCR管于95°C保溫5分鐘， 16°C保溫5分鐘；(3)加入濃度為10mg/ml蛋白酶K溶液1.2 μ 1，使該蛋白酶K終濃度為1. 2mg/ml，得 到總反應(yīng)體積10 μ 1 ；(4)55°C保溫2小時(shí)或以上，95°C保溫10分鐘，16°C保溫5分鐘；(5)離心取上清，此上清液直接用作PCR的DNA模板。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，公開了一種微量動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA模板制備液及相應(yīng)的DNA模板制備方法。微量動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA模板制備液由A液和B液以1:3-10的體積比混合制得，A液為Tris、(NH4)2SO4、MgCl2的混合溶液，三種試劑終濃度分別為0.1-2.0M；所述的B液為Triton和β-琉基乙醇的混合溶液，二種試劑終濃度分別為0.1-2.0%。本發(fā)明微量動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA模板制備液成本較之現(xiàn)有的基因組DNA提取所需試劑的提取成本大幅降低；由于模板制備過程簡(jiǎn)單，所制備的基因組DNA模板完整，沒有耗損，可確保細(xì)胞基因組DNA模板制備的一次性成功。
文檔編號(hào)C12N15/10GK101948828SQ201010507070
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月14日
發(fā)明者夏銀, 王根林, 邢光東 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院