基因組被修飾的細胞的制作方法
【專利說明】
[0001] 本申請是2012年6月15日提交的申請?zhí)枮?01210201592. 4,發(fā)明名稱為"基因 組被修飾的細胞"申請的分案申請。
技術領域
[0002] 本發(fā)明涉及一種基因組被修飾的細胞，與其親代細胞相比，具有降低的或去除了 和糖鏈修飾相關的酶的活性，所述糖鏈中巖藻糖的1-位與N-糖苷連接糖鏈復合體還原末 端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通過α -鍵結合，以及采用該細胞產生抗體分子的過程。
【背景技術】
[0003] 在IgG類抗體的Fc區(qū)，存在兩個N-糖苷連接糖鏈結合位點。在血清IgG中， 通常在糖鏈結合位點上結合了一個具有多個分支的復合物型糖鏈，其中加入的唾液酸或 等分N-乙酰氨基葡萄糖很少。已知就半乳糖加入至復合物型糖鏈非還原末端上和巖 藻糖添加至還原末端的N-乙酰氨基葡萄糖上有一定的多樣性[Biochemistry(生物化 學），並，130(1997)]。
[0004] 這種糖鏈結構已認為可通過糖鏈基因來確定，也就是合成糖鏈的糖基轉移酶的基 因和水解糖鏈的糖酵解酶的基因。
[0005] N-糖苷連接糖鏈的合成如下所述。
[0006] 糖蛋白在內質網（以后稱為"ER"）腔中用糖鏈進行修飾。在N-糖苷連接糖鏈的 生物合成步驟中，相對大的糖鏈被轉移至在ER腔中延伸的多肽鏈上。在轉變過程中，糖鏈 首先連續(xù)加入到由大約20個α-異戊二烯單位組成的長鏈脂質載體的磷酸基團上，稱為 磷酸多萜醇（此后有時稱為〃P-Dol")。即，N-乙酰氨基葡萄糖被轉移至磷酸多萜醇形成 GlcNAc-P-P-Dol，然后轉移又一個 GlcNAc，從而形成 GlcNAc-GlcNAc-P-P-Dol。下一步，5 個 甘露糖（此后有時甘露糖被稱為"Man")被轉移，因此形成（Man)5-(GlcNAc) 2-P-P-Dol,然后 四個Man和三個葡萄糖（此后葡萄糖有時被稱為〃Glc〃）被轉移。因此，形成了糖鏈前體， (Glc) 3- (Man) 9- (GlcNAc) 2-P-P-Dol，稱為形成了核心寡糖。含有14個糖的糖鏈前體被作為 一個團體轉移至內質網腔中含有天冬酰胺-X-絲氨酸或天冬酰胺-X-蘇氨酸序列的多肽 上。在反應中，結合至核心寡糖上的磷酸多萜醇（P-P-Dol)被釋放，但通過焦磷酸酶的水解 作用再次成為磷酸多萜醇，并再進行循環(huán)。在糖鏈與多肽結合后立即開始糖鏈的加工。即， 三個Glc和一個或兩個Man在內質網上被刪除，已知α-1,2-葡萄糖苷酶I，α-1,3-葡萄 糖苷酶II和α-1，2-甘露糖苷酶與刪除作用有關。在內質網上被加工的糖蛋白被轉移至 尚爾基體上，被進彳丁不同的修飾。在尚爾基體的池（cis)部分，存在有關添加甘露糖憐酸的 N-乙酰氨基葡萄糖磷酸轉移酶，N-乙酰氨基葡萄糖1-磷酸二酯a -N-乙酰氨基葡萄糖苷 酶和α-甘露糖苷酶I，并將Man殘基還原至5。在高爾基體的中間部分，存在涉及在復合 物型N-糖苷連接糖鏈的外側第一個GlcNAc的添加的N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶I (GnTI)， 涉及刪除兩個Man的α -甘露糖苷酶II，涉及從外側添加第二個GlcNAc的N-乙酰氨基葡 萄糖轉移酶II (GnTII)和涉及巖藻糖添加至還原末端的N-乙酰氨基葡萄糖上的α 1，6-巖 藻糖基轉移酶。在高爾基體的trans部分，存在與半乳糖的添加有關的半乳糖轉移酶和與 唾液酸如N-乙酰神經氨酸的添加有關的唾液酸轉移酶或類似物。已知N-糖苷連接糖鏈是 通過這些不同酶的作用形成的。
[0007] 就抗體中的糖鏈而言，據報道巖藻糖向抗體N-糖苷連接糖鏈還原末端N-乙酰 氨基葡萄糖的添加修飾極大地改變了抗體的抗體依賴的細胞介導細胞毒活性（此后稱為 "ADCC活性"）（W000/61739)。這個報道表明糖鏈的結構在人抗體IgGl亞型的效應器功能 中發(fā)揮重要作用。
[0008] 通常，考慮用作藥物的大多數人源化抗體通過使用遺傳重組技術制備，使用動物 細胞，如中國倉鼠卵巢組織來源的CHO細胞作為宿主細胞產生。但如上所述，由于糖鏈結構 在抗體的效應器功能中發(fā)揮非常重要的作用，并在宿主細胞表達的糖蛋白的糖鏈結構中觀 察到一些差異，需要開發(fā)用于產生具有更高效應器功能的抗體的宿主細胞。
[0009] 也已經進行了修飾通過導入有關糖鏈修飾的酶基因產生的糖蛋白的糖鏈結構的 嘗試，作為其例子，已有報道1)可能產生一種蛋白，其中大量唾液酸通過將大鼠 β-半乳 糖苷-α -2, 6-唾液酸轉移酶導入CHO細胞中而被添加至糖鏈的非還原末端上[J. Biol. Chem.(生物化學雜志），261. 13848 (1989) ]，2)通過將人β -半乳糖苷-2- α -巖藻糖基轉 移酶轉移至小鼠 L細胞中，可能表達一種H抗原，其中巖藻糖（此后稱為"Fuc"）被添加 至糖鏈的非還原末端上（Fuc a l-2Gal β 1-) [Science (科學），252. 1668 (1991)]，和 3)通 過使用一種導入了 β-1，4-Ν-乙酰氨基葡萄糖轉移酶III (GnTIII)的CHO細胞產生一種 抗體，從而可能產生一種N-糖苷連接糖鏈的等分N-乙酰氨基葡萄糖添加比例很高的抗體 [Glycobiology(糖生物學），豆，813(1995) :TO 99/54342]。當通過使用導入了 GnTIII 的 CHO細胞表達抗體時，所述抗體顯示較親代細胞中表達的抗體高16倍的ADCC活性。然而， 由于已有報道GnTIII或β-1，4-Ν-乙酰氨基葡萄糖轉移酶V(GnTV)的過度表達顯示出對 CHO細胞的毒性，因此其不適合產生抗體藥物。
[0010] 對糖蛋白的生產例子也已有報道，其中產生的糖鏈結構可通過使用一種突變體作 為宿主細胞而改變，該突變體中有關糖鏈修飾的酶基因的活性被改變，作為其例子，已有報 道使用CHO細胞的一種突變體克隆產生了具有高甘露糖型（high mannose type)糖鏈結構 的抗體，該突變體克隆中4-N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶I(GnTI)被刪除[J. Immunol.(免疫 學雜志），13393 (1998)]。另外，已經報道了 一種抗體表達，其具有一種糖鏈結構，其中唾 液酸未被添加至糖鏈非的還原末端側，和通過使用CMP-唾液酸轉運子或UDP-半乳糖轉運 子缺陷克隆產生的未添加半乳糖的抗體表達例子，但沒有發(fā)現具有增強的效應器功能，適 合用作藥物的抗體[J. Immunol.(免疫學雜志），160, 3393 (1998) 1 0由于已經獲得的突變體 克隆是通過誘變劑處理導入隨機突變得到的克隆，它們不適合作為用于產生藥學制劑的克 隆。
[0011] 因此，為了修飾制備的糖蛋白的糖鏈結構，已經進行了許多在宿主細胞中控制有 關糖鏈修飾的酶活性的嘗試。但實際上，由于糖鏈修飾機制是多樣化和復雜的，不能說糖鏈 的生理作用已被完全闡明，因此目前的情況是要反復試驗和錯誤。特別的是已經逐漸地闡 明了抗體的效應器功能受糖鏈結構的影響很大，但能夠產生具有最合適的糖鏈結構修飾的 抗體分子的宿主細胞目前還沒有獲得。

【發(fā)明內容】

[0012] 本發(fā)明涉及下列的（1)至（43)。
[0013] (1) -種修飾基因組以使與糖鏈修飾相關的酶的活性比其親代細胞更低或消失的 細胞，所述糖鏈中巖藻糖的1位與N-糖苷連接的糖鏈復合體中還原端的N-乙酰氨基葡萄 糖的6位通過α-鍵連接。
[0014] (2)根據（1)的細胞，其中編碼糖鏈修飾相關酶的基因組基因被敲除，所述糖鏈 中巖藻糖的1位與N-糖苷連接的糖鏈復合體中還原端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通過 α -鍵連接。
[0015] (3)根據⑴或⑵的細胞，編碼糖鏈修飾相關酶的基因組上的所有等位基因被 敲除，所述糖鏈修飾中巖藻糖的1位與N-糖苷連接的糖鏈復合體中還原端的N-乙酰氨基 葡萄糖的6位通過α -鍵連接。
[0016] (4)根據⑴至⑶任一項中的細胞，與糖鏈修飾相關的酶是α 1，6-巖藻糖基轉 移酶，所述糖鏈中巖藻糖的1位與N-糖苷連接的糖鏈復合體中還原端的N-乙酰氨基葡萄 糖的6位通過α-鍵連接。
[0017] (5)根據（4)的細胞，α 1，6-巖藻糖基轉移酶是選自以下（a)至（d)的DNA編碼 的蛋白質：
[0018] (a)含有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列的DNA ;
[0019] (b)含有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的DNA ;
[0020] (c)在嚴格條件下，與包含SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列的DNA雜交，并具有 α 1，6-巖藻糖基轉移酶活性的DNA ;
[0021] (d)在嚴格條件下，與包含SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列的DNA雜交，并具有 α 1，6-巖藻糖基轉移酶活性的DNA。
[0022] (6)根據（4)的細胞，α 1，6-巖藻糖基轉移酶是選自以下（a)、（b)、（c)、（d)、（e) 和（f)的蛋白質：
[0023] (a)含有SEQ ID N0:4所示氨基酸序列的蛋白質；
[0024] (b)含有SEQ ID N0:5所示氨基酸序列的蛋白質；
[0025] (c)含有SEQ ID N0:4所示氨基酸序列中至少一個氨基酸被刪除、取代、插入、和/ 或添加的氨基酸序列，并具有α 1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；
[0026] (d)含有SEQ ID NO: 5所示氨基酸序列中至少一個氨基酸被刪除、取代、插入、和/ 或添加的氨基酸序列，并具有α 1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；
[0027] (e)含有與SEQ ID Ν0:4所示氨基酸序列具有80%或以上同源性的氨基酸序列， 并具有α 1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；
[0028] (f)含有與SEQ ID Ν0:5所示氨基酸序列具有80%或以上同源性的氨基酸序列， 并具有