一種基于基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型指導(dǎo)胞內(nèi)還原力調(diào)節(jié)的異丁醇合成菌株構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于合成生物學(xué)和生物能源技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及初始異了醇合成菌株構(gòu) 建，并通過(guò)基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型模擬預(yù)測(cè)還原代謝調(diào)節(jié)關(guān)鍵祀點(diǎn)，指導(dǎo)構(gòu)建異源依賴(lài) 于NADP的甘油-3-磯酸脫氨酶基因（gapN)，并通過(guò)不同強(qiáng)度的組成型啟動(dòng)子控制gapN的 表達(dá)水平調(diào)節(jié)胞內(nèi)還原力，構(gòu)建異了醇合成菌株的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著生物能源的興起，異了醇的生物合成最近獲得了重要的關(guān)注。異了醇具有能 量密度高，揮發(fā)性和腐蝕性小，辛燒值高等優(yōu)點(diǎn)，是理想的汽油替代品，也是最基本的化學(xué) 平臺(tái)物質(zhì)之一。目前采用合成生物學(xué)構(gòu)建異源化hlich途徑，W a-酬異戊酸為前體，禪合 分支氨基酸合成途徑，在大腸桿菌、枯草芽抱桿菌和谷氨酸椿狀桿菌等菌種中實(shí)現(xiàn)了異了 醇的合成。
[0003] 為了改造優(yōu)化異了醇合成菌株，代謝網(wǎng)絡(luò)模型模擬指導(dǎo)是至關(guān)重要的。有文獻(xiàn)報(bào) 道對(duì)異了醇合成菌株代謝網(wǎng)絡(luò)模型進(jìn)行了基元模式分析，在大腸桿菌中通過(guò)途徑分析發(fā) 現(xiàn)維持NADH代謝平衡是厭氧異了醇合成的關(guān)鍵因素（Trinh CT(2012化lucidating and reprogramming Escherichia coli metabolisms for obligate anaerobic n-butanol and isobutanol production. Appl. Microbiol. Biotechnol. 95 (4) : 1083-1094)，在枯草 芽抱桿菌中通過(guò)通量相關(guān)性分析則發(fā)現(xiàn)戊糖鱗酸途徑是提高NADPH促進(jìn)異下醇合成的重 要革Ev點(diǎn)（Li SS, Wen JP，Jia XQ(2011)Engineering Bacillus subtilis for isobutanol production，by heterologous Ehrlich pathway construction and the biosynthetic 2-ketoisovalerate precursor pathway overexpression. Appl Microbiol Biotechnol 91 (3):577-589)。值得注意的是，這種基元模式分析只能采用精簡(jiǎn)的代謝網(wǎng)絡(luò)模型（對(duì)大 腸桿菌研究了 79個(gè)代謝反應(yīng)，對(duì)枯草芽抱桿菌則研究了 131個(gè)反應(yīng)），未能全面考慮所有的 胞內(nèi)氧化還原代謝反應(yīng)（如，NADH和NADPH分別參與了 300和100多個(gè)反應(yīng)），這對(duì)還原力 代謝分析和靴點(diǎn)預(yù)測(cè)具有一定的片面性。因此，從還原力角度出發(fā)，采用更加全面的基因組 尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型，全局性地深入分析各種還原力調(diào)節(jié)方式對(duì)異了醇合成菌株整體代謝作 用規(guī)律，預(yù)測(cè)獲得最佳還原力調(diào)節(jié)祀點(diǎn)及其改造方式，是十分必要的。
[0004] 系統(tǒng)預(yù)測(cè)還原力調(diào)節(jié)祀點(diǎn)，需要綜合考慮還原力代謝反應(yīng)的輔因子置換、敲除和 過(guò)表達(dá)等調(diào)節(jié)方式對(duì)異了醇合成菌株胞內(nèi)代謝的作用規(guī)律。然而，目前還沒(méi)有報(bào)道同時(shí)完 成該=種還原力調(diào)節(jié)方式的模擬預(yù)測(cè)，通常單一地針對(duì)敲除或過(guò)表達(dá)或輔因子替換，進(jìn)行 模擬預(yù)測(cè)還原力調(diào)節(jié)祀點(diǎn)。而采用通量平衡分析（FBA)禪合代謝最小調(diào)節(jié)算法（M0MA)，為 嘗試模擬該=種還原力調(diào)節(jié)策略，預(yù)測(cè)異了醇合成還原力調(diào)節(jié)祀點(diǎn)提供了可能。進(jìn)一步對(duì) 預(yù)測(cè)祀點(diǎn)進(jìn)行改造，采用敲除、過(guò)表達(dá)或替換等簡(jiǎn)單方法通常不能夠達(dá)到最佳胞內(nèi)還原力 狀態(tài)，還有可能造成過(guò)度調(diào)節(jié)引起菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成能力下降。因此，為了充分調(diào)節(jié)還原 力代謝平衡，需要篩選和構(gòu)建適用于異了醇合成菌株的還原力調(diào)節(jié)代謝通路，同時(shí)為了達(dá) 到最佳還原力狀態(tài)，防止過(guò)度調(diào)節(jié)，采用人工基因表達(dá)調(diào)節(jié)元件對(duì)還原力調(diào)節(jié)代謝通路進(jìn) 行基因表達(dá)水平調(diào)節(jié)是十分重要的，其中人工組成型啟動(dòng)子庫(kù)是典型的基因表達(dá)水平調(diào)節(jié) 元件，為構(gòu)建還原力調(diào)節(jié)代謝通路提供了一種有力的工具。
[0005] 本發(fā)明首次從還原力代謝角度出發(fā)，采用基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型，模擬預(yù)測(cè)得 出異了醇合成菌株還原力代謝調(diào)節(jié)關(guān)鍵祀點(diǎn)一甘油醒-3-磯酸脫氨酶催化的代謝反應(yīng)，并 指導(dǎo)構(gòu)建來(lái)自Clostridium的NADP+-甘油-3-磯酸脫氨酶（gapN編碼）代謝通路（Martinez I, Zhu J, Lin H, Bennett GN, San KY(2008)Replacing Escherichia coli NAD-dependent glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)with a NADP-dependent enzyme from Clostridium acetobutylicum facilitates NADPH dependent pathways. Metab Eng 10 (6) : 352-359)，并通過(guò)不同強(qiáng)度的人工組成型啟動(dòng)子調(diào)節(jié)gapN的表達(dá)水平，最終獲得了 一株異了醇合成菌株。本發(fā)明所提供的基于模型模擬設(shè)計(jì)還原力調(diào)節(jié)方式還未見(jiàn)報(bào)道，其 結(jié)合合成生物學(xué)中人工調(diào)控元件的精確調(diào)控胞內(nèi)還原力的方法，對(duì)構(gòu)建大腸桿菌異了醇合 成菌株，具有迫切的現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對(duì)異了醇合成菌株的還原力平衡該一關(guān)鍵問(wèn)題，提供了一種采用異了醇 合成菌株基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型，模擬預(yù)測(cè)出甘油醒-3-磯酸脫氨酶催化的代謝反應(yīng)是 胞內(nèi)還原力調(diào)節(jié)關(guān)鍵祀點(diǎn)，理論指導(dǎo)構(gòu)建依賴(lài)于NADP+-甘油-3-磯酸脫氨酶代謝通路，并 通過(guò)不同強(qiáng)度的人工組成型啟動(dòng)子調(diào)節(jié)該代謝通路的表達(dá)水平，構(gòu)建異了醇合成菌株的方 法。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，采用了如下技術(shù)方案：
[000引一種基于基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型理性調(diào)節(jié)胞內(nèi)還原力的異了醇合成菌株構(gòu)建 方法，其步驟如下：
[0009] (1)在大腸桿菌MG1655基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型基礎(chǔ)上，根據(jù)初始異了醇合成菌 株LA02基因型，添加異了醇合成的代謝反應(yīng)和異了醇運(yùn)輸反應(yīng)，獲得的異了醇合成菌株基 因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型；
[0010] (2)根據(jù)初始異了醇合成菌株濕實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)設(shè)定異了醇合成菌株基因組尺度代謝網(wǎng) 絡(luò)模型的約束條件，聯(lián)合采用代謝通量平衡分析算法和最小代謝調(diào)節(jié)算法模擬預(yù)測(cè)得出甘 油醒-3-磯酸脫氨酶為最關(guān)鍵還原力調(diào)節(jié)祀點(diǎn)；
[0011] 做針對(duì)步驟似模擬預(yù)測(cè)的關(guān)鍵祀點(diǎn)，構(gòu)建和調(diào)節(jié)依賴(lài)于NADP的甘油醒-3-磯 酸脫氨酶代謝通路，從而調(diào)節(jié)異了醇合成菌株胞內(nèi)還原力狀態(tài)，構(gòu)建得到一株異了醇合成 兩株。
[0012] 具體方法為；
[001引 （1)將含有alsS、ilvC和ilvD基因的質(zhì)粒pACY化A09和含有kivd和7郵)基因 的質(zhì)粒pTRCLAlO導(dǎo)入大腸桿菌LA01中，獲得初始異了醇合成菌株LA02。
[0014] (2)采用代謝通量平衡分析算法模擬計(jì)算胞內(nèi)各個(gè)還原力的代謝反應(yīng)的初始代謝 通量，并依據(jù)各個(gè)還原力代謝反應(yīng)的初始代謝通量，采用最小代謝調(diào)節(jié)算法模擬預(yù)測(cè)每個(gè) 還原力代謝反應(yīng)的輔因子置換、敲除和過(guò)表達(dá)對(duì)菌株生長(zhǎng)和異了醇合成等代謝通量變化， 計(jì)算每個(gè)候選還原力代謝反應(yīng)的的表型系數(shù)，選取表型系數(shù)最大的還原力代謝反應(yīng)為最關(guān) 鍵還原力調(diào)節(jié)祀點(diǎn)。
[0015] (3)針對(duì)模擬預(yù)測(cè)出的甘油醒-3-磯酸脫氨酶催化的代謝反應(yīng)該一關(guān)鍵祀點(diǎn)，構(gòu) 建依賴(lài)于NADP的甘油醒-3-磯酸脫氨酶代謝通路，并采用人工啟動(dòng)子調(diào)節(jié)該通路表達(dá)水平 調(diào)節(jié)異了醇合成菌株胞內(nèi)還原力，從而調(diào)節(jié)異了醇合成菌株胞內(nèi)還原力，最終獲得一株高 效合成的異了醇合成菌株。
[0016] 人工啟動(dòng)子調(diào)節(jié)的依賴(lài)于NADP的甘油醒-3-磯酸脫氨酶代謝通路分別存在于質(zhì) 粒pTR化A13、pTR化A14、pTR化A15、pTR化A16和pTR化A17上；依賴(lài)于NADP的甘油醒-3-磯 酸脫氨酶代謝通路是由來(lái)自于Clostridium acetobut}di州m ATCC824的gapN基因編碼， gapN基因大小為1449bp，其序列為SEQ ID NO ;24 ;人工啟動(dòng)子分別為BBa_J23105、BBa_ 123106、883_扣3118、883_扣3102和883_扣3100，其序列分別為569 10^;25,569 10^; 26,沈Q ID NO ;27,沈Q ID NO ;28 和沈Q ID NO ;29。
[0017] 人工啟動(dòng)子調(diào)節(jié)的依賴(lài)于NADP的甘油醒-3-磯酸脫氨酶代謝通路具體步驟如 下：
[001 引 （1) W GeneBank 已報(bào)道中 Clostridium acetobutylicum ATCC824 的 gapN 基因 (NCBI-GeneID: 1119839)和組成型啟動(dòng)子序列為依據(jù)分別設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)引物BBa_J23105-F、 BBa_J23106-F、BBa_J23118-F、BBa_J23102-F、BBa_J23100-F 和 gapN-R，引物序列分別為為 沈Q ID NO ;30、沈Q ID NO ;31、沈QID NO ;32、沈Q ID NO ;33、沈Q ID NO ;：34 和沈Q ID NO ; 35,利用PCR獲得五個(gè)包含不同啟動(dòng)子控制的gapN基因
[0019] 似然后將步驟（1)中的獲得的片段分別用化nl和Sail,雙酶切連接到相同雙酶 切的pTR化A10質(zhì)粒上，獲得重組質(zhì)粒pTR化A13、pTR化A14、pTR化A15、pTR化A16和pTR化A17
[0020] (3)將重組質(zhì)粒pACY化A09分別與重組質(zhì)粒pTR化A13、pTR化A14、pTR化A15、 pTR化A16和pTR化A17,共同轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.coli LA01中巧.coli MG1655菌株pflB基因缺陷 型），獲得5株不同的胞內(nèi)還原力調(diào)節(jié)的異了醇合成菌株；
[0021] (4)對(duì)步驟（3)中構(gòu)建菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，獲得高效異了醇合成菌株，其產(chǎn)量最大 可達(dá)到8g/L W上。
[0022] 發(fā)酵方法為；30~37攝氏度條件下培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200~25化pm，當(dāng)細(xì)胞ODe。。增長(zhǎng)到 0. 6~0. 8時(shí)，加入0. 1~ImM的IPTG進(jìn)行異了醇誘導(dǎo)。
[002引培養(yǎng)基為；20~40g/L葡萄糖，5~lOg/L酵母浸粉，5~6g/L化2冊(cè)04 ? 12&0， 3 ~4g/L 皿2口04,0. 5 ~1.5g/L 化Cl，l ~2g/L 畑典1，0. 2 ~0. 6g/L M拆0"0. 01 ~0. 05g/ L CaCls和 1000 倍稀釋的 Trace mix A ;其中；Trace mix A 包含 2 ~4g/L H3BO3, 1 ~3g/ L MnCla ? 4&0, 0. 2 ~0. 8g/L ZnS04 ? 7&0, 0. 3 ~0. 5g/LNaMo04 ? 2&0, 0. 07 ~0. lOg/L CuS04 ? 5&0, and 49 ~60mg/L Co(N03)2 ? 6&0。
[0024] 下面根據(jù)具體載體圖和序列等對(duì)本發(fā)明詳細(xì)說(shuō)明：
[00巧](1)針對(duì)異了醇合成途徑，構(gòu)建了包括alsS、ilvC、ilvD、kivd和y化D的異了醇合 成途徑，獲得了初始大腸桿菌異了醇合成菌株，其具體步驟如下：
[0026] WpTRC99a為模板，設(shè)計(jì)引物