專利名稱：基因組被修飾的細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生抗體組合物的過程，其特征是使用本發(fā)明的細(xì)胞。
抗體組合物是一種含有Fc區(qū)具有N-糖苷連接糖鏈復(fù)合體的抗體分子的組合物。
抗體是一種四聚體，其中兩條多肽鏈，重鏈(此后稱為“H鏈”)和輕鏈(此后稱為“L鏈”)中的兩個(gè)分子分別是相連的。每個(gè)H鏈N-末端的大約四分之一和L鏈N-末端的大約四分之一(每個(gè)都超過100個(gè)氨基酸)稱為V區(qū)，該區(qū)富有多樣性，并直接與抗原的結(jié)合有關(guān)。V區(qū)以外部分的較大部分稱為C區(qū)。根據(jù)C區(qū)的同源性，抗體分子分為IgG，IgM，IgA，IgD和IgE幾型。
同樣，根據(jù)C區(qū)的同源性IgG型也進(jìn)一步分為IgG1至IgG4亞型。
H鏈從其N-末端側(cè)分為四個(gè)免疫球蛋白區(qū)VH，CH1，CH2和CH3，和在CH1和CH2之間將CH1和CH2分開的高度可變的多肽區(qū)，稱為鉸鏈區(qū)。含有鉸鏈區(qū)后的CH2和CH3的結(jié)構(gòu)單位稱為Fc區(qū)，N-糖苷連接糖鏈結(jié)合在上面，該區(qū)也是Fc受體，補(bǔ)體和類似物結(jié)合的區(qū)域(免疫學(xué)圖冊(cè)，原版，Nankodo，2000年2月10日發(fā)行，第五版；抗體技術(shù)手冊(cè)(Kotai KogakuNyumon)，Chijin Shokan，1994年1月25日，第一版)。
根據(jù)與蛋白質(zhì)部分的結(jié)合形式，糖蛋白，如抗體的糖鏈粗略地分為兩種類型，即與天冬酰胺(N-糖苷連接的糖鏈)結(jié)合的糖鏈和與其他氨基酸，如絲氨酸、蘇氨酸(O-糖苷連接糖鏈)結(jié)合的糖鏈。N-糖苷連接糖鏈有一個(gè)基本的共同核心結(jié)構(gòu)，由下面的結(jié)構(gòu)式(I)表示[生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法23-研究糖蛋白糖鏈的方法(Gakujutsu Shuppan中心)，Reiko Takahashi主編(1989)]
在結(jié)構(gòu)式(I)中，與天冬酰胺結(jié)合的糖鏈末端稱為還原末端，相反的一側(cè)稱為非還原末端。
N-糖苷連接糖鏈可以是任何N-糖苷連接糖鏈，只要它含有結(jié)構(gòu)式(I)的核心結(jié)構(gòu)。例子包括高甘露糖型，其中甘露糖與核心結(jié)構(gòu)的非還原末端單獨(dú)結(jié)合；復(fù)合物型，其中核心結(jié)構(gòu)的非還原末端側(cè)至少有一個(gè)半乳糖-N-乙酰氨基葡萄糖(此后稱為“Gal-GlcNAc”)，Gal-GlcNAc的非還原末端側(cè)具有一種唾液酸，等分N-乙酰氨基葡萄糖或類似的結(jié)構(gòu)；雜交型，其中核心結(jié)構(gòu)的非還原末端側(cè)含有高甘露糖型和復(fù)合物型的兩種分支；等等。
因?yàn)榭贵w分子中的Fc區(qū)具有N-糖苷連接糖鏈獨(dú)立結(jié)合的部位，兩條糖鏈結(jié)合一個(gè)抗體分子。因?yàn)榕c抗體分子結(jié)合的N-糖苷連接糖鏈包括含有結(jié)構(gòu)式(I)所示核心結(jié)構(gòu)的任何糖鏈，與抗體結(jié)合的兩條N-糖苷連接糖鏈可能有許多糖鏈的組合。
因此，在本發(fā)明中，使用本發(fā)明的細(xì)胞制備的本發(fā)明的抗體組合物，含有相同糖鏈結(jié)構(gòu)或不同糖鏈結(jié)構(gòu)的抗體，只要從該組合物可獲得本發(fā)明的效應(yīng)。本發(fā)明的抗體組合物優(yōu)選下面的一種抗體組合物，其中在與抗體組合物中與Fc區(qū)結(jié)合的N-糖苷連接糖鏈總復(fù)合體中，巖藻糖不與糖鏈還原末端中N-乙酰氨基葡萄糖結(jié)合的糖鏈比例較基因組未被修飾的親代細(xì)胞所產(chǎn)生的抗體組合物高。
而且，在本發(fā)明中，通過使用非人動(dòng)物或植物或其后代制備的抗體組合物含有具有相同糖鏈結(jié)構(gòu)或不同糖鏈結(jié)構(gòu)的抗體，只要從該組合物可獲得本發(fā)明的效應(yīng)，其特征在于所述動(dòng)物或植物或其后代中，基因組被修飾以便其α1，6-巖藻糖修飾酶的活性更加降低或被消除。
本發(fā)明的抗體組合物優(yōu)選下面一種抗體組合物，其中在與抗體組合物中Fc區(qū)結(jié)合的N-糖苷連接糖鏈總復(fù)合體中，巖藻糖不與糖鏈還原末端中N-乙酰氨基葡萄糖結(jié)合的糖鏈比例較通過使用基因組未被修飾的非人動(dòng)物或植物或其后代(此后稱為“親代個(gè)體”)所產(chǎn)生的抗體組合物高。
基因組被修飾以便其α1，6-巖藻糖修飾酶的活性更加降低或被消除的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物或植物或其后代可使用胚胎干細(xì)胞，受精卵或植物細(xì)胞來制備。
在本發(fā)明中，在與抗體組合物中包含的Fc區(qū)結(jié)合的N-糖苷連接糖鏈總復(fù)合體中，巖藻糖不與糖鏈還原末端中N-乙酰氨基葡萄糖結(jié)合的糖鏈比例是其中巖藻糖不與糖鏈還原末端中N-乙酰氨基葡萄糖結(jié)合的糖鏈數(shù)量和與抗體組合物中包含的Fc區(qū)結(jié)合的N-糖苷連接糖鏈復(fù)合體總數(shù)量的比例。
其中巖藻糖不與N-糖苷連接糖鏈復(fù)合體還原末端中N-乙酰氨基葡萄糖結(jié)合的糖鏈?zhǔn)窃贜-糖苷連接糖鏈復(fù)合體中，巖藻糖不與還原末端中N-乙酰氨基葡萄糖通過α-鍵結(jié)合的糖鏈。特別地是，其中巖藻糖的1-位不與N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵結(jié)合的N-糖苷連接糖鏈復(fù)合體。
在與本發(fā)明抗體組合物中包含的Fc區(qū)結(jié)合的N-糖苷連接糖鏈總復(fù)合體中，巖藻糖不與糖鏈還原末端中的N-乙酰氨基葡萄糖結(jié)合的糖鏈比例優(yōu)選20％或更多，更優(yōu)選30％或更多，仍然更優(yōu)選40％或更多，最優(yōu)選50％或更多，甚至最優(yōu)選100％。
較親代細(xì)胞或親代個(gè)體產(chǎn)生的抗體組合物有較高ADCC活性的抗體組合物包括，在與抗體組合物中Fc區(qū)結(jié)合的N-糖苷連接糖鏈總復(fù)合體中，巖藻糖不與糖鏈還原末端中N-乙酰氨基葡萄糖結(jié)合的糖鏈比例較親代細(xì)胞或親代個(gè)體所產(chǎn)生的抗體組合物高。例子包括一種抗體組合物，其活性至少為2倍，優(yōu)選至少3倍，更優(yōu)選至少5倍，進(jìn)一步優(yōu)選10倍或更高。最優(yōu)選的抗體組合物是其中連接到抗體組合物中Fc區(qū)的所有N-糖苷連接糖鏈復(fù)合體是其中巖藻糖不與糖鏈還原末端中N-乙酰氨基葡萄糖結(jié)合的糖鏈。
糖鏈中巖藻糖不與糖鏈還原末端中N-乙酰氨基葡萄糖結(jié)合的糖鏈比例為100％的抗體組合物或所有N-糖苷連接糖鏈復(fù)合體都連接到抗體組合物中Fc區(qū)的是巖藻糖的1-位不與還原末端中N-乙酰氨基葡萄糖的6-位結(jié)合的糖鏈，其中的巖藻糖通過下面的第5項(xiàng)所述糖鏈分析方法不能檢測(cè)到。
本發(fā)明獲得的抗體組合物中，在與Fc區(qū)結(jié)合的N-糖苷連接糖鏈總復(fù)合體中，其中巖藻糖不與糖鏈還原末端中N-乙酰氨基葡萄糖結(jié)合的糖鏈比例較親代細(xì)胞或親代個(gè)體所產(chǎn)生的抗體組合物高，本發(fā)明中獲得的抗體組合物的ADCC活性較含有親代細(xì)胞或親代個(gè)體產(chǎn)生的抗體分子的抗體組合物高。
ADCC活性是一種細(xì)胞毒活性，與活體內(nèi)腫瘤細(xì)胞上存在的細(xì)胞表面抗原結(jié)合的抗體可通過存在于抗體Fc區(qū)和效應(yīng)細(xì)胞表面上存在的Fc受體活化效應(yīng)細(xì)胞，因此可干擾腫瘤細(xì)胞等[單克隆抗體原理和應(yīng)用，Wiley-Liss，Inc.，2.1章(1955)]。效應(yīng)細(xì)胞包括殺傷細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞，活化的巨噬細(xì)胞等。
其中巖藻糖不與組合物中包含的糖鏈還原末端中N-乙酰氨基葡萄糖結(jié)合的糖鏈比例的測(cè)定可采用已知的方法如肼解作用，酶消化或類似方法從抗體分子中釋放糖鏈，其特征在于所述的組合物含有具有Fc區(qū)中N-糖苷連接糖鏈復(fù)合體的抗體分子[Biochemical Experimentation Methods23-Method for Studying Glycoprotein Sugar Chain(生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，研究榶蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)的方法23)(Japan Scientific Societies Press(日本科學(xué)學(xué)會(huì)出版))，Reiko Takahashi編著(1989)]從抗體分子中釋放糖鏈來測(cè)定，對(duì)于釋放的糖鏈進(jìn)行熒光標(biāo)記或者放射性標(biāo)記，然后通過層析方法分離標(biāo)記的糖鏈?？蛇x擇的，釋放的糖鏈也可以用HPAED-PAD方法分析來確定，[J Liq Chromatogr.，6，1577(1983)]。
同樣，本發(fā)明的抗體優(yōu)選可識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原的抗體，識(shí)別變態(tài)反應(yīng)或炎癥相關(guān)抗原的抗體，識(shí)別心血管疾病相關(guān)抗原的抗體或識(shí)別下面所舉例的病毒或細(xì)菌感染相關(guān)抗原的抗體，優(yōu)選屬于IgG類型。
識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原的抗體包括抗-GD2抗體[Anticancer Res.(抗癌研究)，13，331-336(1993)]，抗-GD3抗體[Cancer Immunol.Immunother.，36，260-266(1993)]，抗-GM2抗體[Cancer Res.(癌癥研究)，54，1511-1516(1994)]，抗-HER2抗體[Proc.Natl.Acad.Sci.(美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào))USA，89，4285-4289(1992)]，抗-CD52抗體[Proc.Natl.Acad.Sci.(美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào))USA，89，4285-4289(1992)]，抗-MAGE抗體[British J.Cancer(癌癥)，83，493-497(2000)]，抗-HM1.24抗體[Molecular Immunol.(分子免疫學(xué))，36，387-395(1999)]，抗-甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(PTHrP)抗體[Cancer(癌癥)，88，2909-2911(2000)]，抗堿性成纖維生長(zhǎng)因子抗體和抗-FGF8抗體[Proc.Nail.Acad，Sci.USA，86，9911-9915(1989)]，抗堿性成纖維生長(zhǎng)因子受體抗體和抗-FGF8受體抗體[J.Biol.Chem.(生物化學(xué)雜志)，265，16455-16463(1990)]，抗胰島素樣生長(zhǎng)因子抗體[J.Neurosci.Res.，40，647-659(1995)]，抗胰島素樣生長(zhǎng)因子受體抗體[J.Neurosci.Res.，40，647-659(1995)]，抗-PMSA抗體[J.Urology(泌尿?qū)W研究)，160.2396-2401(1998)]，抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子抗體[Cancer Res.(癌癥研究)，57，4593-4599(1997)]，抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體抗體[OncoGene(基因)，19，2138-2146(2000)]，抗-CA125抗體，抗-17-1A抗體，抗整合素αvβ3抗體，抗-CD33抗體，抗-CD22抗體，抗-HLA抗體，抗-HLA-DR抗體，抗-CD20抗體，抗-CD19抗體，抗-EGF受體抗體[Immunology Today(今日免疫學(xué))，21(8)，403-410(2000)]，抗-CD10抗體[American Journal of Clinical Pathology(美國(guó)臨床病理雜志)，113，374-382(2000)]等。
識(shí)別變態(tài)反應(yīng)或炎癥相關(guān)抗原的抗體包括抗白介素6抗體[Immunol.Rev.(免疫學(xué)研究)，127，5-24(1992)]，抗白介素6受體抗體[MolecularImmunol.(分子免疫學(xué))，31，371-381(1994)]，抗白介素5抗體[Immunol.Rev(免疫學(xué)研究).，127，5-24(1992)]，抗白介素5受體抗體和抗白介素4抗體[Cytokine(細(xì)胞因子)，3，562-567(1991)]，抗白介素4抗體[J.Immunol.Meth.(免疫學(xué)方法雜志)，217，41-50(1991)]，抗腫瘤壞死因子抗體[Hybridoma，13，183-190(1994)]，抗腫瘤壞死因子受體抗體[Molecular PharmacoL，58，237-245(2000)]，抗-CCR4抗體[Nature(自然)，400，776-780(1999)]，抗化學(xué)趨化因子抗體[J.Immuno.Meth.(免疫學(xué)方法雜志)，174，249-257(1994)]，抗化學(xué)趨化因子受體抗體[J.Exp.Med.(實(shí)驗(yàn)方法雜志)，186，1373-1381(1997)]，抗-IgE抗體，抗-CD23抗體，抗-CD 11a抗體[Immunology Today(今日免疫學(xué))，21(8)，403-410(2000)]，抗-CRTH2抗體[J.Immuno.(免疫學(xué)雜志)，162，1278-1286(1999)]，抗-CCR8抗體(WO99/25734)，抗-CCR3抗體(US6207155)等等。
識(shí)別心血管疾病相關(guān)抗原的抗體包括抗-GpIIb/IIIa抗體[J.Immunol.(免疫學(xué)雜志)，152，2968-2976(1994)]，抗血小板衍生生長(zhǎng)因子抗體[Science(科學(xué))，253，1129-1132(1991)]，抗血小板衍生生長(zhǎng)因子受體抗體[J.Biol.Chem.(生物化學(xué)雜志)，272，17400-17404(1997)]，抗凝血因子抗體[Circulation(循環(huán))，101，1158-1164(2000)]等等。
識(shí)別自體免疫性疾病相關(guān)抗原的抗體包括抗自體DNA抗體[Immunol.Letters，72，61-68(2000)]等等。
識(shí)別病毒或細(xì)菌感染相關(guān)抗原的抗體包括抗gp120抗體[Structure(結(jié)構(gòu))，8，385-395(2000)]，抗-CD4抗體[J.Rheumatology(風(fēng)濕病學(xué)雜志)，25，2065-2076(1998)]，抗-CCR4抗體，抗-Vero toxin抗體[J.Clin.Microbiol，37，396-399(1999)]，自身免疫性疾病的抗體(銀屑病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克隆氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、全身性紅斑狼瘡、腦脊髓多發(fā)性硬化，等)，抗-CD11a抗體、抗-ICAM3抗體、抗-CD80抗體、抗-CD2抗體、抗-CD3抗體、抗-CD4抗體、抗-整合素α4β7抗體、抗-GD40L抗體、抗-IL-2抗體[Immunology Today(今日免疫學(xué))，21(8)，403-410(2000)]，等等。
抗體分子可以任何抗體分子，只要它含有抗體的Fc區(qū)。例子包括抗體，抗體片段，含有Fc區(qū)的融合蛋白，等等。
抗體是作為外源抗原刺激在活體中引起的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)，具有與抗原特異結(jié)合的活性。例子包括由用抗原免疫的動(dòng)物的脾細(xì)胞制備的雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體；遺傳重組技術(shù)制備的抗體，也就是通過將插入了抗體基因的抗體表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中獲得的抗體；等等。具體的例子包括由雜交瘤產(chǎn)生的抗體，人源化抗體，人抗體等等。
雜交瘤是用來自抗原免疫的非人哺乳動(dòng)物的B細(xì)胞和來自鼠或類似來源的骨髓瘤細(xì)胞之間細(xì)胞融合獲得的一種細(xì)胞，可產(chǎn)生具有所需抗原特異性的單克隆抗體。
人源化抗體包括人嵌合抗體，人CDR移植抗體等。
人嵌合抗體是包括非人抗體的重鏈可變區(qū)(以下稱為“HV”或者“VH”，可變鏈和重鏈分別為“V區(qū)域”和“H鏈”)和非人抗體輕鏈的可變區(qū)(以下稱為“LV”或者“VL”)，人抗體重鏈恒定區(qū)(在此后也稱作為“CH”)和人抗體輕鏈恒定區(qū)(在此后也稱作為“CL”)的抗體。對(duì)于非人動(dòng)物，任何動(dòng)物例如小鼠，大鼠，倉(cāng)鼠，兔等都可以使用，只要可以從中制備雜交瘤。
通過從產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤中制備編碼VH和VL的cDNA，把它們插入用于宿主細(xì)胞的表達(dá)載體中，宿主細(xì)胞具有編碼人抗體CH和人抗體CL的基因，構(gòu)建表達(dá)人嵌合抗體的載體，然后把載體導(dǎo)入用于表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，產(chǎn)生人嵌合抗體。
對(duì)于人嵌合抗體的CH，可以應(yīng)用任何CH，只要其屬于人的免疫球蛋白(以下稱為“hIg”)。那些屬于hIgG的類別是優(yōu)選的，也可以使用任何屬于hIgG類的亞類，如hIgG1，hIgG2，hIgG3和hIgG4。同樣地，對(duì)于人嵌合抗體的CL，可以使用任何CL，只要其屬于hIg類，并且也可以使用那些屬于κ或者λ類的CL。
人CDR-移植抗體是其中非人動(dòng)物抗體的VH和VL的CDR的氨基酸序列移植到人抗體的VH和VL的合適位置的抗體。
人CDR-移植抗體可通過構(gòu)建編碼V區(qū)域的cDNA制備，其中來源于非人動(dòng)物的抗體VH和VL的CDR移植到人抗體的VH和VL的CDR區(qū)域，將它們插入到用于宿主細(xì)胞的表達(dá)載體中，該宿主細(xì)胞含有編碼人抗體CH和人抗體CL的基因，由此構(gòu)建了用于人-CDR移植抗體的表達(dá)的載體，然后將表達(dá)載體導(dǎo)入到宿主細(xì)胞來表達(dá)人CDR-移植抗體。
對(duì)于人CDR-移植抗體的CH，可以使用任何CH，只要它屬于hIg類，但hIgG是優(yōu)選的，任何屬于hIgG類的亞類，如hIgG1，hIgG2，hIgG3和hIgG4也可以使用。同樣地，對(duì)于人CDR-移植抗體的CL，可以應(yīng)用任何CL，只要其屬于hIg類，并且也可以使用那些屬于κ或者λ類的CL。
人抗體起初是人體中自然存在的抗體，但是也包括從人抗體噬菌體庫(kù)，產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因植物中得到的抗體。產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因植物是以基因工程，細(xì)胞過程和發(fā)育工程技術(shù)的最新進(jìn)展為基礎(chǔ)制備的。
通過分離人外周血淋巴細(xì)胞，用EB病毒等感染使其永生化，把它克隆獲得能夠產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞，培養(yǎng)該淋巴細(xì)胞，從培養(yǎng)基中分離和純化抗體而獲得人體中存在的抗體。
人抗體噬菌體庫(kù)是一種文庫(kù)，其中通過把從人B細(xì)胞中制備的編碼抗體的基因插入噬菌體基因，抗體片段如Fab(抗原結(jié)合片段)，單鏈抗體等表達(dá)于噬菌體的表面。表達(dá)具有所需要的抗原結(jié)合活性的抗體片段的噬菌體，可以使用它結(jié)合于固定化抗原的底物的活性，作為標(biāo)記從文庫(kù)中回收?？贵w片段可以進(jìn)一步通過重組DNA技術(shù)轉(zhuǎn)化為包括兩個(gè)全長(zhǎng)H鏈和全長(zhǎng)L鏈的人抗體分子。
產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物是人抗體被導(dǎo)入細(xì)胞中的非人動(dòng)物。特別是產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可通過將人抗體基因?qū)胄∈蟮呐咛ジ杉?xì)胞中，將胚胎干細(xì)胞移植進(jìn)其他小鼠的早期胚胎中，然后使其發(fā)育來制備。通過將人嵌合抗體基因?qū)胧芫阎?，并進(jìn)行發(fā)育，也可以制備轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物。就從產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物中制備人抗體而言，通過使用通常在非人哺乳動(dòng)物進(jìn)行的雜交瘤制備方法獲得產(chǎn)生人抗體的雜交瘤，然后進(jìn)行培養(yǎng)，可產(chǎn)生人抗體并在培養(yǎng)基中積累。
轉(zhuǎn)基因的非人動(dòng)物包括牛、綿羊、山羊、豬、馬、小鼠、大鼠、家禽、猴、兔等。
在本發(fā)明中也優(yōu)選抗體是可識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原的抗體，識(shí)別變態(tài)反應(yīng)或炎癥相關(guān)抗原的抗體，識(shí)別心血管疾病相關(guān)抗原的抗體，識(shí)別自體免疫疾病相關(guān)抗原的抗體或識(shí)別病毒或細(xì)菌感染相關(guān)抗原的抗體，優(yōu)選屬于IgG型的人抗體。
抗體片段是含有部分抗體Fc區(qū)的片段。Fc區(qū)是位于抗體H鏈C末端的區(qū)域，包括天然類型和突變類。IgG型Fc區(qū)的部分根據(jù)Kabat等人EU指數(shù)的編號(hào)，是從C末端226位點(diǎn)的Cys到C末端，或從C末端230位點(diǎn)的Pro到C末端[Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991)]。例子包括抗體，抗體片段，含有Fc區(qū)的融合蛋白，和類似物?？贵w片段包括H鏈單體，H鏈二聚體和類似物。
含有Fc區(qū)部分的融合蛋白是一種蛋白質(zhì)，其中由抗體或抗體片段的Fc區(qū)的抗體與蛋白質(zhì)，如酶或細(xì)胞因子融合的一種蛋白質(zhì)(此后稱為“Fc融合蛋白”)。
本發(fā)明在下面詳細(xì)解釋。
1.制備本發(fā)明的細(xì)胞 本發(fā)明的細(xì)胞通過下列的技術(shù)制備。
(1)含有靶向編碼酶基因組成的基因破壞技術(shù) 本發(fā)明的細(xì)胞通過使用靶向編碼1，6-巖藻糖修飾酶的基因的基因破壞技術(shù)進(jìn)行制備，通過。有關(guān)糖鏈修飾作用的酶包括α1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，α-L-巖藻糖苷酶等，其中在N-糖苷連接糖鏈復(fù)合體中，巖藻糖的1-位與還原末端中N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵結(jié)合。
基因破壞法可以是任何方法，只要它包括破壞靶酶基因在內(nèi)。例子包括同源重組法，RNA-DNA寡聚核苷酸(RDO)法，采用逆轉(zhuǎn)錄病毒的方法，使用轉(zhuǎn)座子的方法等。這些方法具體描述如下。
(a)通過同源重組制備本發(fā)明的抗體產(chǎn)生細(xì)胞 本發(fā)明細(xì)胞可通過靶向編碼α1，6-巖藻糖修飾酶基因的同源重組技術(shù)，在修飾染色體上的目的基因制備。
染色體上的目的基因可采用在鼠胚操作，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港實(shí)驗(yàn)室印刷)(1994)(此后稱為“鼠胚操作，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”)中所述的方法進(jìn)行修飾；基因靶向，實(shí)踐方法，IRL Press at Oxford University Press(1993)；Biomanual Series8，基因靶向，采用ES細(xì)胞制備突變鼠，Yodo-sha(1995)(此后稱為“采用ES細(xì)胞制備突變鼠”)；或類似方法，如下。
制備編碼α1，6-巖藻糖修飾酶的cDNA。
根據(jù)獲得的cDNA，制備編碼α1，6-巖藻糖修飾酶的基因組DNA。
根據(jù)基因組DNA的核苷酸序列，為要被修飾的目的基因的同源重組體制備目的載體(例如，α1，6-巖藻糖修飾酶的結(jié)構(gòu)基因，或啟動(dòng)子基因)。
本發(fā)明的宿主細(xì)胞的產(chǎn)生可通過將制備的目的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，并選擇一種細(xì)胞，其中在目的基因和目的載體之間發(fā)生了同源重組。
如宿主細(xì)胞一樣，可使用任何細(xì)胞如酵母，動(dòng)物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞或植物細(xì)胞，只要它具有編碼α1，6-巖藻糖修飾酶的目的基因。例子包括在下面第3項(xiàng)中所述的細(xì)胞。
獲得編碼α1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的cDNA或基因組DNA的方法包括如下所述的方法。
cDNA的制備方法 從各種宿主細(xì)胞中制備總RNA或mRNA。
從制備的總RNA或mRNA制備cDNA文庫(kù)。
以α1，6-巖藻糖修飾酶為基礎(chǔ)產(chǎn)生簡(jiǎn)并引物，例如采用制備的cDNA文庫(kù)作為模板，通過PCR獲得編碼α1，6-巖藻糖修飾酶的人氨基酸序列和基因片段。
可通過使用已獲得的基因片段作為探針，篩選cDNA文庫(kù)，獲得編碼α1，6-巖藻糖修飾酶的cDNA。
如各種細(xì)胞的mRNA一樣，可使用市售產(chǎn)品(如，由Clontech制造)或可如下從多種宿主細(xì)胞中制備。從各種宿主細(xì)胞中制備總RNA的方法包括硫氰酸胍-三氟醋酸銫法[酶學(xué)方法，154，3(1987)]，酸性硫氰酸胍苯酚氯仿(AGPC)法[Analytical Biochemistry(生物化學(xué))，162，156(1987)；Experimental Medicine(Jikken Igaku)，9，1937(1991)]和類似方法。
而且，從總RNA中制備mRNA為poly(A)+RNA的方法包括寡(dT)-固化纖維素柱法(分子克隆，第二版)和類似方法。
另外，使用如Fast Track mRNA分離試劑盒(Invitrogen制造)，QuickPrep mRNA純化試劑盒(Pharmacia制造)或類似的試劑盒制備mRNA。
從制備的人或非人動(dòng)物組織或細(xì)胞mRNA制備cDNA文庫(kù)。制備cDNA文庫(kù)的方法包括在分子克隆，第二版；現(xiàn)代分子生物學(xué)方法，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版(1989)；和類似文章中所述的方法，或使用市售試劑盒如進(jìn)行cDNA合成和質(zhì)?？寺〉腟uperscript質(zhì)粒系統(tǒng)(LifeTechnologies制造)，ZAP-cDNA合成試劑盒(STRATAGENE(基因)制造)和類似試劑盒的方法。
如為制備cDNA文庫(kù)的克隆載體，可使用任何載體如噬菌體載體，質(zhì)粒載體或類似物，只要它可在大腸桿菌K12中自主復(fù)制。例子包括ZAP Express[STRATAGENE(基因)制造，Strategies，5，58(1992)]，pBluescript II SK(+)[Nucleic Acids Research(核酸研究)，17，9494(1989)]，Lambda ZAP II(STRATAGENE(基因)制造)，λgt10和λgt11[DNA克隆，實(shí)踐方法，1，49(1985)]，λTriplEx(Clontech制造)，λExCell(Pharmacia制造)，pcD2[Mol.Cell.Biol，3，280(1983)]，pUC18[Gene(基因)，33，103(1985)]和類似物。
任何微生物可用作制備cDNA文庫(kù)的宿主微生物，優(yōu)選大腸桿菌。例子包括大腸桿菌XL1-Blue MRJF′[STRATAGENE(基因)制造，Strategies，5，81(1992)]，大腸桿菌C600[Genetics(遺傳學(xué))，39，440(\954)]，大腸桿菌Y1088[Science(科學(xué))，222.778(1983)]，大腸桿菌Y1090[Science(科學(xué))，222.778(1983)]，大腸桿菌NM522[J.Mol.Biol，166，1(1983)]，大腸桿菌K802[J.Mol Biol.，16，118(1966)]，大腸桿菌JM105[Gem，38，275(1985)]和類似物。
CDNA文庫(kù)可用在隨后的分析中，以便獲得全長(zhǎng)cDNA，通過降低infull長(zhǎng)cDNA的比例盡可能有效，通過使用Sugano等人開發(fā)的寡帽法制備的cDNA文庫(kù)[Gene(基因)，138，171(1994)；Gene(基因)，200，149(1997)；蛋白，核酸，蛋白，41，603(1996)；實(shí)驗(yàn)藥物(Jikken Igaku)，11，2491(1993)；cDNA克隆(Yodo-sha)(1996)；制備基因文庫(kù)的方法(Yodo-sha)(1994)]可用在下面的分析中。
以α1，6-巖藻糖修飾酶的氨基酸序列為基礎(chǔ)，制備推定編碼氨基酸序列的核苷酸序列的5’末端和3’末端核苷酸序列特異的簡(jiǎn)并引物，DNA使用制備的cDNA文庫(kù)作為模板，通過PCR擴(kuò)增[PCR方法，AcademicPress(1990)]，獲得編碼α1，6-巖藻糖修飾酶的基因片段。
通常通過用于分析核苷酸的方法，如Sanger等人的雙脫氧法[Proc.Nail.Acad.Sci.USA，74，5463(1977)]，核苷酸序列分析儀如ABEPRISM377 DNA測(cè)序儀(PE Biosystems制造)或類似方法，已獲得的基因片段能夠被證實(shí)是編碼α1，6-巖藻糖修飾酶的DNA。
編碼α1，6-巖藻糖修飾酶的DNA可通過進(jìn)行菌落雜交或噬斑雜交來獲得(分子克隆，第二版)，使用基因片段作為DNA探針，在包含在人或非人動(dòng)物組織或細(xì)胞中的mRNA獲得合成的cDNA或cDNA文庫(kù)。
編碼α1，6-巖藻糖修飾酶的DNA也可通過進(jìn)行PCR篩選而獲得，使用從包含在人或非人動(dòng)物組織或細(xì)胞中的mRNA合成的cDNA或cDNA文庫(kù)作為模板，使用的引物可用來獲得編碼α1，6-巖藻糖修飾酶的基因片段。
已獲得的編碼α1，6-巖藻糖修飾酶的DNA的核苷酸序列從其末端進(jìn)行分析，通過通常用于分析核苷酸的方法進(jìn)行測(cè)定，如Sanger等人的雙脫氧法[Proc.Nail.Acad，Sci.USA，74，5463(1977)]，核苷酸序列分析儀如ABIPRISM 377 DNA測(cè)序儀(PE Biosystems制造)或類似方法。
編碼α1，6-巖藻糖修飾酶的基因也可從數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因確定，以確定的cDNA的核苷酸序列為基礎(chǔ)，使用同源檢索程序如BLAST通過搜索核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)如GenBank，EMBL，DDBJ等。
編碼α1，6-巖藻糖修飾酶的基因核苷酸序列含有SEQ ID NO1或2所示的核苷酸序列。
編碼α1，6-巖藻糖修飾酶的cDNA也可通過化學(xué)合成獲得，以確定的DNA的核苷酸序列為基礎(chǔ)，使用一種DNA合成儀，如Perkin Elmer制造的392型DNA合成儀，或使用亞磷酰胺方法化學(xué)合成得到。
作為制備編碼α1，6-巖藻糖修飾酶的基因組DNA的方法例子，下面所述的方法舉例說明。
基因組DNA的制備方法 制備基因組DNA的方法包括已知的方法，其描述見分子克隆，第二版；現(xiàn)代分子生物學(xué)方法；和類似文獻(xiàn)。另外，編碼α1，6-巖藻糖修飾酶的基因組DNA也可采用試劑盒，如來進(jìn)行基因組DNA文庫(kù)篩選系統(tǒng)(Genome Systems制造)，通用GenomeWalkerTM試劑盒(CLONTECH制造)或類似物。
編碼α1，6-巖藻糖修飾酶的基因組DNA的核苷酸序列含有SEQ IDNO3所示的核苷酸序列。
在目的基因的同源重組中使用的目的載體可根據(jù)下面所述的方法進(jìn)行制備，如基因靶向，實(shí)踐方法，IRL Press at Oxford University Press(1993)；Biomanual Series 8，基因靶向，采用ES細(xì)胞制備突變小鼠，Yodo-sha(1995)；或類似文獻(xiàn)。目的載體可使用替換型和插入型。
為了將目的載體導(dǎo)入各種宿主細(xì)胞，可使用在下面第3項(xiàng)中所述的適合多種宿主細(xì)胞的導(dǎo)入重組載體的方法。
有效選擇同源重組體的方法包括如正選擇，啟動(dòng)子選擇，負(fù)選擇或polyA選擇，其描述見基因靶向，實(shí)踐方法，ERL Press at OxfordUniversity Press(1993)；Biomanual Series 8，基因靶向，采用ES細(xì)胞制備突變小鼠，Yodo-sha(1995)；或類似文獻(xiàn)。從選擇出的克隆中選擇目的同源重組體的方法包括基因組DNA的Southern雜交法(分子克隆，第二版)，PCR[PCR方法，Academic Press(1990)]，和類似方法。
同源重組體的獲得能夠以有關(guān)糖鏈修飾的酶的活性變化為基礎(chǔ)，其中巖藻糖的1-位與N-乙酰氨基葡萄糖的6-位在N-糖苷連接糖鏈的還原末端通過α-鍵結(jié)合。下面的方法作為選擇轉(zhuǎn)化體的方法的例子，描述如下。
選擇轉(zhuǎn)化體的方法 選擇其中α1，6-巖藻糖修飾酶的活性降低或被消除的細(xì)胞的方法包括生物化學(xué)方法或遺傳工程技術(shù)，其描述見新生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)從書3-糖類I，糖蛋白(Tokyo Kagaku Dojin)，日本生物化學(xué)協(xié)會(huì)主編(1988)；細(xì)胞工程增刊，實(shí)驗(yàn)方法從書，糖類生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，糖蛋白，糖脂和蛋白多糖(ShujuN-sha)，Naoyuki Taniguchi，Akemi Suzuki，KiyoshiFurukawa和Kazuyuki Sugawara主編(1996)；分子克隆，第二版；現(xiàn)代分子生物學(xué)方法；和類似文獻(xiàn)。生物化學(xué)方法包括的方法中，酶活性通過使用一種酶特異性底物和類似物進(jìn)行測(cè)定。遺傳工程技術(shù)包括Northern分析，RT-PCR和類似的測(cè)量編碼酶的基因的mRNA量的方法。
確定植物凝集素抗性細(xì)胞的方法包括確定GDP-巖藻糖合成酶，α1，6-巖藻糖修飾酶或GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶表達(dá)的方法，在直接添加植物凝集素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞的方法。特別是細(xì)胞中α1，6-巖藻糖修飾酶之一的α1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶mRNA表達(dá)量。其中α1，6-巖藻糖修飾酶活性降低的細(xì)胞對(duì)植物凝集素是有抗性的。
而且，以α1，6-巖藻糖修飾劑活性降低引起的形態(tài)學(xué)變化為基礎(chǔ)選擇細(xì)胞的方法，包括以制備的抗體分子的糖鏈結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)選擇轉(zhuǎn)化體的方法，使用細(xì)胞膜糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)選擇轉(zhuǎn)化體的方法，和類似方法。使用產(chǎn)生抗體分子的糖鏈結(jié)構(gòu)選擇轉(zhuǎn)化體的方法包括在下面第5項(xiàng)中所述的方法。使用細(xì)胞膜糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)選擇轉(zhuǎn)化體的方法包括選擇對(duì)可識(shí)別糖鏈結(jié)構(gòu)的植物凝集素有抗性的克隆，其中巖藻糖的1-位與N-糖苷連接糖鏈復(fù)合體還原末端中的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵結(jié)合。例子包括使用植物凝集素的方法，其描述見Somatic Cell.Mol.Gene(基因)t.，12，51(1986)。
作為凝集素，可以使用任何凝集素，只要它是可以識(shí)別巖藻糖的1位通過α鍵結(jié)合于N-糖苷鍵合的復(fù)合糖鏈還原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖鏈的凝集素。例子包括小扁豆凝集素LCA(來源于Lens culinaris的扁豆凝集素)，豌豆凝集素PSA(來源于Pisum sativum的豌豆凝集素)，一種蠶豆凝集素VFA(來源于Vicia faba的凝集素)，陳皮木耳凝集素AAL(來源于Aleuria aurantia的凝集素)等等。
特別的是本發(fā)明的宿主細(xì)胞的選擇可通過培養(yǎng)細(xì)胞1天至2周，優(yōu)選3天至1周，在含有濃度為幾十μg/ml至10mg/ml，優(yōu)選0.5至2.0mg/ml的植物凝集素組成的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，傳代存活的細(xì)胞或挑選出的克隆，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，隨后繼續(xù)在含有植物凝集素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
(b)通過RDO法制備本發(fā)明的細(xì)胞 本發(fā)明細(xì)胞的制備可通過RDO法，靶向編碼α1，6-巖藻糖修飾酶的基因，例如如下進(jìn)行。
制備編碼α1，6-巖藻糖修飾酶的cDNA或基因組DNA。
測(cè)定制備的cDNA或基因組DNA的核苷酸序列。
以確定的DNA序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)和合成含有目的基因的一部分翻譯區(qū)，一部分非翻譯區(qū)或一部分內(nèi)含子的適當(dāng)長(zhǎng)度的RDO構(gòu)建物。
本發(fā)明細(xì)胞的獲得可通過將合成的RDO導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，然后選擇轉(zhuǎn)化體，在轉(zhuǎn)化體中，靶酶，也就是α1，6-巖藻糖修飾酶中發(fā)生了突變。
作為宿主細(xì)胞，可以使用任何細(xì)胞如酵母，動(dòng)物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞或植物細(xì)胞，只要它含有編碼α1，6-巖藻糖修飾酶的基因。例子包括在下面第3項(xiàng)中所述的宿主細(xì)胞。
將RDO導(dǎo)入多種宿主細(xì)胞中的方法包括在下面第3項(xiàng)中所描述的導(dǎo)入多種宿主細(xì)胞所適合的重組載體。
制備編碼α1，6-巖藻糖修飾酶的cDNA的方法包括在1(1)項(xiàng)中所描述的“cDNA的制備方法”和類似方法。
制備編碼α1，6-巖藻糖修飾酶的基因組DNA的方法包括在1(1)(a)中所描述的“基因組DNA的制備方法”和類似方法。
DNA的核苷酸序列的測(cè)定可通過用合適的限制性酶消化，將DNA片段克隆進(jìn)質(zhì)粒如pBluescript SK(-)(StrataGene(基因)制造)中，將克隆進(jìn)行反應(yīng)，該反應(yīng)通常用作分析核苷酸序列的方法，如Sanger等人的雙脫氧法[Proc.Natl.Acad Sci.USA，74，5463(1977)]或類似方法，然后通過自動(dòng)核苷酸序列分析儀，如A.L.F.DNA測(cè)序儀(Pharmacia制造)或類似方法來分析克隆。
RDO可通過常規(guī)的方法或采用DNA合成儀來制備。
選擇其中通過將RDO導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，在靶酶，編碼α1，6-巖藻糖修飾酶的基因中有突變發(fā)生的細(xì)胞的方法，包括直接檢測(cè)染色體基因中突變的方法，其描述見分子克隆，第二版，現(xiàn)代分子生物學(xué)方法和類似方法。
而且，也可使用在1(1)(a)中所描述的以α1，6-巖藻糖修飾酶活性變化為基礎(chǔ)的“選擇轉(zhuǎn)化體的方法”。
RDO構(gòu)建物可以按照Science(科學(xué))，273 1386(1996)，NatureMedicine(天然藥物)，4，285(1998)，Hepatology(肝臟病學(xué))，25，1462(1997)，Gene Therapy(基因治療)，5，1960(1999)，；J Mol.Med.(分子藥物雜志).，75，829(1997)，Proc.Natl.Acad.Sci.(美國(guó)科學(xué)院院報(bào))USA，96，8774(1999)，Proc.Natl.Acad.Sci.(美國(guó)科學(xué)院院報(bào))USA，96，8768(1999)，Nuc.Acids Res(核酸研究).，27，1323(1999)，Invest.Dematol.，111，1172(1998)，Nature Biotech.(自然生物技術(shù))，16，1343(1998)；Nature Biotech.(自然生物技術(shù))，18，43(2000)；Nature Biotech.(自然生物技術(shù))，18，555(2000)等中描述的方法設(shè)計(jì)。
(c)通過使用轉(zhuǎn)座子的方法制備本發(fā)明的細(xì)胞 本發(fā)明的細(xì)胞可使用一種轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)誘導(dǎo)突變進(jìn)行制備，其描述見Nature Genet.(自然遺傳學(xué))，25，35(2000)或類似文獻(xiàn)，然后以α1，6-巖藻糖修飾酶的活性，或制備的抗體分子或細(xì)胞膜糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)選擇突變體。
轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)是通過在染色體中隨機(jī)插入外源基因誘發(fā)突變的系統(tǒng)，其中插入在轉(zhuǎn)座子之間的外源基因一般用作誘發(fā)突變的載體，并且同時(shí)向細(xì)胞中導(dǎo)入用于在染色體中隨機(jī)插入基因的轉(zhuǎn)位酶表達(dá)載體。
可以使用任何轉(zhuǎn)位酶，只要其適合于使用的轉(zhuǎn)座子的序列。
作為外源基因，可以使用任何基因，只要它可以在宿主細(xì)胞的DNA中誘發(fā)突變。
作為細(xì)胞，可使用任何細(xì)胞如酵母，動(dòng)物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞或植物細(xì)胞，只要它含有編碼靶α1，6-巖藻糖修飾酶的基因。例子包括在下列第3項(xiàng)中所描述的宿主細(xì)胞。
為了將編碼抗體分子的基因?qū)胱鳛樗拗骷?xì)胞的本發(fā)明的細(xì)胞中，可使用下面第3項(xiàng)中所描述的導(dǎo)入多種宿主細(xì)胞適合的重組載體的方法。
以α1，6-巖藻糖修飾酶活性為基礎(chǔ)，選擇突變體的方法包括在1(1)(a)中所描述的以α1，6-巖藻糖修飾酶活性變化為基礎(chǔ)的“選擇轉(zhuǎn)化體的方法”。
(d)通過反義方法或核糖核酸酶法制備本發(fā)明的細(xì)胞 本發(fā)明的細(xì)胞通過反義法或核糖核酸酶法來制備，方法的描述見Cell Technology，12，239(1993)；BIO/TECHNOLOGY，17，1097(1999)；Hum.Mol Genet.，5，1083(1995)；Cell Technology，13，255(1994)；Proc.Nail Acad.Sci.USA，96，1886(1999)；或類似文獻(xiàn)，如以下面的方式通過靶向編碼α1，6-巖藻糖修飾酶的基因。
制備目的基因的cDNA或基因組DNA。
測(cè)定制備的cDNA或基因組DNA的核苷酸序列。
以確定的DNA序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)含有目的基因的一部分翻譯區(qū)，一部分非翻譯區(qū)或一部分內(nèi)含子的適當(dāng)長(zhǎng)度的反義基因或核糖核酸酶構(gòu)建物。
為了在細(xì)胞中表達(dá)反義基因或核糖核酸酶，通過將制備的DNA的片段或全長(zhǎng)插入至合適表達(dá)載體啟動(dòng)子的下游制備重組載體。
通過將重組載體導(dǎo)入適合表達(dá)載體的宿主細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)化體。
本發(fā)明的細(xì)胞能夠通過以目的基因編碼的蛋白質(zhì)的活性為基礎(chǔ)，選擇轉(zhuǎn)化體而獲得。本發(fā)明的細(xì)胞也能夠通過以細(xì)胞膜糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)或制備抗體分子的糖鏈結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，選擇轉(zhuǎn)化體而獲得。
作為用于產(chǎn)生本發(fā)明細(xì)胞的宿主細(xì)胞，可使用任何細(xì)胞，如酵母，動(dòng)物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞或植物細(xì)胞，只要它含有目的基因。例子包括在下面第3項(xiàng)中所描述的宿主細(xì)胞。
作為表達(dá)載體，使用可在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制，或可被整合進(jìn)染色體中的載體，它含有的啟動(dòng)子處被傳遞了設(shè)計(jì)的反義基因或核糖核酸酶。例子包括在下面第3項(xiàng)中所描述的表達(dá)載體。
作為將基因?qū)攵喾N宿主細(xì)胞中的方法，可使用在下面第3項(xiàng)中所描述的導(dǎo)入多種宿主細(xì)胞適合的重組載體的方法。
獲得目的基因cDNA或基因組DNA的方法包括在1(1)(a)中“cDNA的制備方法”和“基因組DNA的制備方法”中所描述的方法。
以目的基因編碼的蛋白質(zhì)的活性為基礎(chǔ)，選擇方法包括在1(1)(a)項(xiàng)中“選擇轉(zhuǎn)化體的方法”中所描述的方法。
而且，以目的基因編碼的蛋白質(zhì)的活性降低所引起的形態(tài)學(xué)變化為基礎(chǔ)，選擇細(xì)胞的方法包括以制備的抗體分子的糖鏈結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)選擇轉(zhuǎn)化體的方法，以細(xì)胞膜糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)選擇轉(zhuǎn)化體的方法，和類似方法。以制備的抗體分子的糖鏈結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)選擇轉(zhuǎn)化體的方法包括下面第5項(xiàng)中所描述的方法。以細(xì)胞膜糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)選擇轉(zhuǎn)化體的方法包括上述選擇對(duì)可識(shí)別糖鏈結(jié)構(gòu)的植物凝集素有抗性的菌株的方法，該糖鏈結(jié)構(gòu)中巖藻糖的1-位與N-糖苷連接糖鏈復(fù)合體還原末端中的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵結(jié)合。例子包括使用植物凝集素的方法，其描述見Somatic Cell.Mol.Gene(基因)t.，2，51(1986)。
而且，本發(fā)明的細(xì)胞可不使用表達(dá)載體而獲得，通過直接將反義寡聚核苷酸或核糖核酸酶導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，它們是以目的基因的核苷酸序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的。
反義寡聚核苷酸或核糖核酸酶可通過通常的方法或使用DNA合成儀來制備。特別地是，其制備可用具有連續(xù)5至150個(gè)堿基，優(yōu)選5至60個(gè)堿基，更優(yōu)選10至40個(gè)堿基相應(yīng)序列的寡聚核苷酸的序列信息為基礎(chǔ)，在目的基因cDNA和基因組DNA的核苷酸序列中，通過合成寡聚核苷酸來進(jìn)行，該寡聚核苷酸對(duì)應(yīng)于與寡聚核苷酸互補(bǔ)的序列(反義寡聚核苷酸)或含有寡聚核苷酸序列的核糖核酸酶。
寡聚核苷酸包括寡聚RNA和寡聚核苷酸的衍生物(此后稱為“寡聚核苷酸衍生物”)。
寡聚核苷酸衍生物包括其中寡聚核苷酸中的磷酸二酯鍵被轉(zhuǎn)換為硫代磷酸鍵的寡聚核苷酸衍生物，其中寡聚核苷酸中的磷酸二酯鍵被轉(zhuǎn)變?yōu)镹3′-P5′phosphoamidate鍵的寡聚核苷酸衍生物，其中寡聚核苷酸中的核糖和磷酸二酯鍵被轉(zhuǎn)變?yōu)殡?核酸鍵的寡聚核苷酸衍生物，其中寡聚核苷酸中的尿嘧啶被C-5 propynyluracil替換的寡聚核苷酸衍生物，其中寡聚核苷酸中的尿嘧啶被C-5噻唑尿嘧啶替換的寡聚核苷酸衍生物，其中寡聚核苷酸中的胞嘧啶被C-5 propynylcytosine替換的寡聚核苷酸衍生物，其中寡聚核苷酸中的胞嘧啶被吩嗪修飾的胞嘧啶替換的寡聚核苷酸衍生物，其中寡聚核苷酸中的核糖被2′-O-丙基核糖替換的寡聚核苷酸衍生物，其中寡聚核苷酸中的核糖被2′-甲氧乙氧基核糖替換的寡聚核苷酸衍生物[Cell Technology(Saibo Kogakn)，16，1463(1997)]。
(e)通過RNAi法制備本發(fā)明的細(xì)胞 本發(fā)明細(xì)胞可通過RNAi(RNA干涉)法靶向編碼本發(fā)明蛋白的基因而制備，例如如下。RNAi法是指雙鏈RNA被導(dǎo)入細(xì)胞中，存在于細(xì)胞中與RNA序列同源的mRNA被分解和破壞，抑制基因表達(dá)的方法。
制備目的基因的cDNA。
測(cè)定制備的cDNA的核苷酸序列。
以確定的DNA序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)由目的基因的一部分翻譯區(qū)或非翻譯區(qū)組成的適當(dāng)長(zhǎng)度的RNAi基因構(gòu)建物。
為了在細(xì)胞中表達(dá)RNAi基因，通過將制備的DNA的全長(zhǎng)或片段插入至合適表達(dá)載體啟動(dòng)子的下游制備重組載體。
通過將重組載體導(dǎo)入適合表達(dá)載體的宿主細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)化體。
本發(fā)明的細(xì)胞可以目的基因編碼的蛋白質(zhì)的活性或制備的抗體分子或細(xì)胞膜糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，通過選擇轉(zhuǎn)化體而獲得。
作為宿主細(xì)胞，可使用任何細(xì)胞，如酵母，動(dòng)物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞或植物細(xì)胞，只要它含有編碼制備的抗體分子為目標(biāo)的基因。例子包括在下面第3項(xiàng)中所描述的宿主細(xì)胞。
作為表達(dá)載體，使用可在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制，或可被整合進(jìn)染色體中的載體，它含有的啟動(dòng)子處被轉(zhuǎn)入了設(shè)計(jì)的RNAi基因。例子包括在下面第3項(xiàng)中所描述的表達(dá)載體。
作為將基因?qū)攵喾N宿主細(xì)胞中的方法，可使用下面第3項(xiàng)中所描述的導(dǎo)入多種宿主細(xì)胞適合的重組載體的方法。
以目的基因編碼的蛋白質(zhì)的活性為基礎(chǔ)選擇轉(zhuǎn)化體的方法或以細(xì)胞膜糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)選擇轉(zhuǎn)化體的方法包括在1(1)(a)項(xiàng)中所描述的方法。以制備的抗體分子糖鏈結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)選擇轉(zhuǎn)化體的方法包括在下面第5項(xiàng)中所描述的方法。
制備目的基因編碼蛋白質(zhì)的cDNA的方法包括在1(1)(a)項(xiàng)中“cDNA的制備方法”中所描述的方法和類似方法。
而且，本發(fā)明的細(xì)胞可不使用表達(dá)載體而獲得，可通過直接導(dǎo)入以目的基因的核苷酸序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的RNAi基因。
可通過常規(guī)方法或使用DNA合成儀制備RNAi基因。
RNAi基因構(gòu)建物的設(shè)計(jì)可根據(jù)下面所描述的方法，見Nature(自然)，391，806(1998)；Proc.Natl.Acad.Sci.(美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào))USA，95，15502(1998)；Nature(自然)，395，854(1998)；Proc.Natl.Acad.Sci.(美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào))USA，96，5049(1999)；Cell(細(xì)胞)，95，1017(1998)；Proc.Natl.Acad.Sci.(美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào))USA，96，1451(1999)；Proc.Natl.Acad.Sci.(美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào))USA，95，13959(1998)；Nature(自然)Cell Biol，2，70(2000)；和類似文獻(xiàn)。
在本發(fā)明的RNAi法中使用的RNA包括與編碼有關(guān)糖鏈修飾的酶蛋白的DNA對(duì)應(yīng)的RNA，所述的糖鏈中巖藻糖的1-位與N-糖苷連接糖鏈復(fù)合體還原末端中的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵結(jié)合，并優(yōu)選與編碼α1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA對(duì)應(yīng)的RNA，該酶作為有關(guān)糖鏈修飾的酶蛋白，所述的糖鏈中巖藻糖的1-位與N-糖苷連接糖鏈復(fù)合體還原末端中的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵結(jié)合。
作為本發(fā)明的RNAi法中使用的RNA，可使用任何RNA，只要它是由RNA及其互補(bǔ)RNA組成的雙鏈RNA，能夠降低a1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶mRNA的量。關(guān)于RNA的長(zhǎng)度，此RNA是優(yōu)選1至30，更優(yōu)選5至29，仍更優(yōu)選10至29和最優(yōu)選15至29個(gè)的連續(xù)RNA。
(2)通過導(dǎo)入顯性失活突變體的方法制備本發(fā)明的細(xì)胞 本發(fā)明的細(xì)胞可通過使用導(dǎo)入蛋白質(zhì)的顯性失活突變體的方法靶向α1，6-巖藻糖修飾酶而制備。
作為顯性失活突變體，例子為涉及細(xì)胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體的蛋白質(zhì)。
已知細(xì)胞內(nèi)糖核苷酸的轉(zhuǎn)運(yùn)子在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體的膜上是以二聚體的形式起作用的[J.Biol.Chem.(生物化學(xué)雜志)，275，17718(2000)]。也有報(bào)道，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)糖核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)子的突變體在細(xì)胞內(nèi)強(qiáng)制表達(dá)時(shí)，用野生型轉(zhuǎn)運(yùn)子形成雜二聚體，形成的雜二聚體具有抑制野生型同型二聚體的活性[J.Biol.Chem.(生物化學(xué)雜志)，275，17718(2000)]。因此，制備細(xì)胞內(nèi)糖核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)子的突變體，并導(dǎo)入細(xì)胞中以便作為顯性失活突變體起作用。可采用位點(diǎn)定向誘變法來制備突變體，其描述見分子克隆，第二版，現(xiàn)代分子生物學(xué)方法和類似文獻(xiàn)。
本發(fā)明細(xì)胞可采用根據(jù)下面文獻(xiàn)中所描述的方法在上面制備的α1，6-巖藻糖修飾酶的顯性失活突變體基因來制備，見分子克隆，第二版，現(xiàn)代分子生物學(xué)方法，操作鼠胚，或類似文獻(xiàn)，例如如下。
制備α1，6-巖藻糖修飾酶的顯性失活突變體基因。
以制備的顯性失活突變體基因的全長(zhǎng)DNA為基礎(chǔ)，如果需要，制備含有部分編碼蛋白質(zhì)的適當(dāng)長(zhǎng)度的DNA片段。
通過將DNA片段或全長(zhǎng)DNA插入至合適表達(dá)載體的啟動(dòng)子下游制備重組載體。
通過將重組載體導(dǎo)入適合表達(dá)載體的宿主細(xì)胞中獲得轉(zhuǎn)化體。
本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以α1，6-巖藻糖修飾酶的活性或制備抗體分子或細(xì)胞膜糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)選擇轉(zhuǎn)化體而制備。
作為宿主細(xì)胞，可使用任何細(xì)胞，如酵母，動(dòng)物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞或植物細(xì)胞，只要它含有編碼靶蛋白的基因。例子包括在下面第3項(xiàng)中描述的宿主細(xì)胞。
作為表達(dá)載體，使用可在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制，或可被整合進(jìn)染色體中的載體，它含有的啟動(dòng)子處編碼目的顯性失活突變體的DNA的轉(zhuǎn)錄可受影響。例子包括在下面第3項(xiàng)中所描述的表達(dá)載體。
作為將基因?qū)攵喾N宿主細(xì)胞中的方法，可使用在下面第3項(xiàng)中所描述的導(dǎo)入多種宿主細(xì)胞適合的重組載體的方法。
以靶蛋白質(zhì)的活性為基礎(chǔ)選擇突變體的方法或以細(xì)胞膜糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)選擇突變體的方法包括上面1(1)項(xiàng)中所描述的方法。以制備的抗體分子的糖鏈結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)選擇突變體的方法包括在下面第4項(xiàng)中所描述的方法。
(3)將突變導(dǎo)入酶中的方法 本發(fā)明細(xì)胞的制備可通過將突變導(dǎo)入編碼α1，6-巖藻糖修飾酶的基因中，然后選擇其中在酶中發(fā)生突變的目的克隆。
有關(guān)糖鏈修飾的酶包括α1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，α-L-巖藻糖苷酶和類似物，所述的糖鏈中巖藻糖的1-位與N-糖苷連接糖鏈復(fù)合體還原末端中的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵結(jié)合。
方法包括1)一種方法，其中所需的克隆選自用誘變劑處理親代細(xì)胞系誘導(dǎo)突變產(chǎn)生的突變體或以α1，6-巖藻糖修飾酶的活性為基礎(chǔ)自發(fā)產(chǎn)生的突變體，2)一種方法，其中所需的克隆選自用誘變劑處理親代細(xì)胞系誘導(dǎo)突變產(chǎn)生的突變體或以制備的抗體分子的糖鏈結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)自發(fā)產(chǎn)生的突變體和3)一種方法，其中所需的克隆選自用誘變劑處理親代細(xì)胞系誘導(dǎo)突變產(chǎn)生的突變體或以細(xì)胞膜糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)自發(fā)產(chǎn)生的突變體。
作為誘導(dǎo)突變的處理，可以使用任何處理方法，只要它可誘導(dǎo)親代細(xì)胞系中的DNA點(diǎn)突變，刪除或移碼突變。例子包括用乙基亞硝基脲，亞硝基胍，苯并芘或吖啶顏料處理，并用放射線處理。多種烷化劑和致癌劑也可用作誘變劑。使誘變劑作用于細(xì)胞的方法包括在組織培養(yǎng)技術(shù)，第三版(Asakura Shoten)，日本組織培養(yǎng)協(xié)會(huì)主編(1996)，Nature(自然)Genet.，24，314(2000)和類似文獻(xiàn)中描述的方法。
自發(fā)產(chǎn)生的突變體包括在普通的細(xì)胞培養(yǎng)條件下不應(yīng)用特殊的突變誘導(dǎo)處理，通過連續(xù)傳代培養(yǎng)自發(fā)形成的突變體。
以α1，6-巖藻糖修飾酶的活性為基礎(chǔ)選擇目的克隆的方法，以制備的抗體分子的糖鏈結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)選擇目的糖鏈的方法和以細(xì)胞膜糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)選擇目的克隆的方法包括在1(1)(a)項(xiàng)中所描述的以α1，6-巖藻糖修飾酶活性變化為基礎(chǔ)的“選擇轉(zhuǎn)化體的方法”。
(4)抑制GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)錄或翻譯的方法 本發(fā)明宿主細(xì)胞可通過靶向編碼α1，6-巖藻糖修飾酶的基因和采用反義RNA/DNA技術(shù)抑制目的基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯[BioScience(科學(xué))and Industry，50，322(1992)；Chemistry(Kagaku)，46，681(1991)；Biotechnology，9，358(1992)；Trends in Biotechnology，10，87(1992)，Trends in Biotechnology，10，152(1992)，Cell Technology，16，1463(1997)]，三-herix技術(shù)[Trends in Biotechnology，10，132(1992)]或類似方法來制備。
2.制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物或植物或其子代 本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物或植物或其子代是其基因組基因被修飾的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物或植物或其子代，修飾的方式是有關(guān)抗體分子糖鏈修飾的酶活性可被控制，可根據(jù)第1項(xiàng)中所描述的方法從胚胎干細(xì)胞，受精卵細(xì)胞或植物細(xì)胞，通過靶向編碼α1，6-巖藻糖修飾酶的基因而制備。
有關(guān)糖鏈修飾的酶包括α1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，α-L-巖藻糖苷酶和類似物，所述的糖鏈中巖藻糖的1-位與N-糖苷連接糖鏈復(fù)合體還原末端中的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵結(jié)合。
特殊的方法如下所述。
在轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物中，本發(fā)明的胚胎干細(xì)胞的制備可通過將在第1項(xiàng)中所描述的方法應(yīng)用于所需的非人動(dòng)物如牛、綿羊、山羊、豬、馬、小鼠、大鼠、家禽、猴、兔或類似動(dòng)物的胚胎干細(xì)胞，其中α1，6-巖藻糖修飾酶的活性可被控制。
特別地是，突變的克隆可通過使用一種已知的同源重組技術(shù)被制備，其中編碼α1，6-巖藻糖修飾酶的基因被滅活或用任何序列取代[如，Nature(自然)，326，6110，295(1987)；Cell(細(xì)胞)，51.，3，503(1987)；或類似文獻(xiàn)]。使用制備的突變克隆，含有胚胎干細(xì)胞克隆和正常細(xì)胞的嵌合個(gè)體的制備可通過注射嵌合體進(jìn)入動(dòng)物受精卵囊胚的方法或通過嵌合體聚集法。嵌合個(gè)體與正常個(gè)體雜交，以便獲得轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中在整個(gè)機(jī)體細(xì)胞中α1，6-巖藻糖修飾酶的活性是降低的。
根據(jù)在基因靶向，實(shí)踐方法，IRL Press at Oxford University Press(1993)；Biomanual叢書8，基因靶向，使用ES細(xì)胞制備突變小鼠，Yodo-sha(1995)或類似文獻(xiàn)中所描述的方法為目的基因的同源重組制備靶載體。靶載體可用替代型，插入型和基因捕獲型中的任何一種。
作為將靶載體導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞中的方法，可使用任何方法，只要它可將DNA導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞中。例子包括電穿孔[Cytotechnology(電穿孔)，3，133(1990)]，磷酸鈣法(日本已公布的未審查專利申請(qǐng)227075/90號(hào))，脂染法[Proc.Nail Acad Sci.USA，84，7413(1987)]，注射法[操作鼠胚，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)]，使用基因槍的方法(基因槍)(日本專利2606856號(hào)，日本專利2517813號(hào))，DEAE-葡聚糖法[Biomanual叢書4-基因傳遞和表達(dá)分析(Yodo-sha)，Takashi Yokota和Kenichi Arai主編(1994)]，病毒載體法[操作鼠胚，第二版]和類似方法。
有效選擇同源重組體的方法包括以下的方法，如正選擇，啟動(dòng)子選擇，負(fù)選擇或polyA選擇，其描述見基因靶向，實(shí)踐方法，IRL Press atOxford University Press(1993)，或類似文獻(xiàn)。特別是在含有hprt基因的靶載體的情況下，它可被導(dǎo)入hprt基因缺陷的胚胎干細(xì)胞中，胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)在含有氨基蝶呤，次黃嘌呤和胸腺嘧啶的培養(yǎng)基中，通過選擇含有氨基蝶呤抗性克隆的同源重組體進(jìn)行可選擇hprt基因同源重組體的正選擇。在含有新霉素抗性基因的靶載體的情況下，導(dǎo)入載體的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)在含有G418的培養(yǎng)基中，通過選擇含有新霉素抗性基因的同源重組體進(jìn)行正選擇。在含有DT基因的靶載體情況下，培養(yǎng)導(dǎo)入載體的胚胎干細(xì)胞，通過選擇生長(zhǎng)克隆進(jìn)行無DT基因同源重組體的負(fù)選擇(因?yàn)镈T基因表達(dá)，同時(shí)被整合在染色體中，被隨機(jī)而不是同源重組導(dǎo)入染色體中的重組體由于DT的毒性而不能生長(zhǎng))。在已選擇的克隆中選擇目的同源重組體的方法包括基因組DNA的Southern雜交(分子克隆，第二版)，PCR[PCR方法，Academic Press(1990)]和類似方法。
當(dāng)胚胎干細(xì)胞采用嵌合體聚集法被導(dǎo)入受精卵中時(shí)，通常優(yōu)選使用在8細(xì)胞期之前的發(fā)育期的受精卵。當(dāng)胚胎干細(xì)胞使用注射嵌合體法被導(dǎo)入受精卵中時(shí)，通常優(yōu)選使用8細(xì)胞期至囊胚期之間的發(fā)育期的受精卵。
當(dāng)受精卵被移植進(jìn)雌性小鼠中時(shí)，優(yōu)選人工移植或種植從假孕雌性小鼠中獲得的受精卵，其受精是通過與被結(jié)扎的雄性非人哺乳動(dòng)物交配所誘發(fā)的。盡管假孕的雌性小鼠可通過自然的交配獲得，但在應(yīng)用促黃體激素釋放激素(此后稱為“LHRH”)或其類似物后，被誘發(fā)受精的假孕雌性小鼠可通過與雄性小鼠交配而獲得。LHRH的類似物包括[3，5-Dil-Tyr5]-LHRH，[Gln8]-LHRH，[D-Ala6]-LHRH，des-Gly1O-[D-His(Bzl)6]-LHRH乙胺和類似物。
本發(fā)明的受精卵細(xì)胞的制備也可通過將第1項(xiàng)中所描述的方法用于目的非人動(dòng)物如牛、綿羊、山羊、豬、馬、小鼠、大鼠、家禽、猴、兔或類似動(dòng)物的受精卵，所述受精卵中α1，6-巖藻糖修飾酶的活性是降低的。
其中α1，6-巖藻糖修飾酶活性降低的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的制備可通過將制備的受精卵細(xì)胞移植至假孕雌性的輸卵管或子宮中，使用在操作鼠胚，第二版或類似文獻(xiàn)中所描述的胚胎移植法，然后動(dòng)物分娩。
在轉(zhuǎn)基因植物中，其中α1，6-巖藻糖修飾酶活性降低的本發(fā)明胼胝體的制備可通過將第1項(xiàng)中所描述的方法應(yīng)用于目的植物的胼胝體或細(xì)胞中。
其中α1，6-巖藻糖修飾酶活性降低的轉(zhuǎn)基因植物的制備可根據(jù)已知的方法，通過使用由生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素組成的培養(yǎng)基培養(yǎng)制備的胼胝體，使其再分化[Tissue Culture，20(1994)；Tissue Culture，21(1995)；Trends in Biotechnology，15，45(1997)]。
3.產(chǎn)生抗體組合物的方法 抗體組合物的獲得可通過使用在下面文獻(xiàn)中所描述的方法將其在宿主細(xì)胞中表達(dá)，見分子克隆，第二版，現(xiàn)代分子生物學(xué)方法，抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Cold Spring Harbor Laboratory，1988(此后稱為“抗體”)；單克隆抗體原理和實(shí)踐，第三版，Acad.Press，1993(此后有時(shí)稱為“單克隆抗體”)；和抗體工程，實(shí)踐方法，IRL Press at Oxford UniversityPress(此后有時(shí)稱為“抗體工程”)，例如如下。
制備抗體分子的cDNA。
以制備的抗體分子的全長(zhǎng)cDNA為基礎(chǔ)，如果需要，制備含有部分編碼蛋白質(zhì)的組成的適當(dāng)長(zhǎng)度的DNA片段。
通過將DNA片段或全長(zhǎng)cDNA插入至適當(dāng)表達(dá)載體啟動(dòng)子的下游制備重組載體。
產(chǎn)生抗體分子的轉(zhuǎn)化體可通過將重組載體導(dǎo)入適合表達(dá)載體的宿主細(xì)胞中而獲得。
作為宿主細(xì)胞，可以使用任何酵母、動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞或類似物，只要它表達(dá)目的基因。
涉及與抗體分子的Fc區(qū)結(jié)合的N-糖苷連接糖鏈修飾的酶通過遺傳工程技術(shù)被導(dǎo)入的細(xì)胞如酵母、動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞或類似物也可用作宿主細(xì)胞。
用于產(chǎn)生抗體組合物的宿主細(xì)胞包括在上面1中所制備的本發(fā)明細(xì)胞。
作為表達(dá)載體，使用可在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制，或可被整合進(jìn)染色體中的載體，它含有的啟動(dòng)子處可傳遞編碼目的抗體分子的DNA。
根據(jù)在1(1)(a)中“cDNA的制備方法”中所描述的方法，使用，例如目的抗體分子特異的探針引物從人或非人組織或細(xì)胞中制備cDNA。
當(dāng)酵母用作宿主細(xì)胞，表達(dá)載體包括YEP 13(ATCC 37115)，YEp24(ATCC 37051)，YcpS50(ATCC 37419)等。
可使用任何啟動(dòng)子，只要它可在酵母中發(fā)揮作用。例子包括糖酵解途徑的基因如己糖激酶基因的啟動(dòng)子，PHO5啟動(dòng)子，PGK啟動(dòng)子，GAP啟動(dòng)子，ADH啟動(dòng)子，gal 1啟動(dòng)子，gal 10啟動(dòng)子，熱休克蛋白啟動(dòng)子，MFα1啟動(dòng)子，CUP 1啟動(dòng)子等。
宿主細(xì)胞包括屬于下列的種屬，如酵母屬，裂殖酵母屬，克魯維酵母屬，絲孢酵母屬，Schwanniomyces屬和類似種屬，如釀酒酵母，非洲粟酒彭貝裂殖酵母，乳酸克魯維酵母，芽毛孢子菌和Schwanniomycesalluvins。
作為導(dǎo)入重組載體的方法，可使用任何方法，只要它可將DNA導(dǎo)入酵母中。例子包括電穿孔[Methods in Enzymology，194，182(1990)]，原生質(zhì)球法[Proc.Natl.Acad.Sci.(美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào))USA，84，1929(1978)]，醋酸鋰法[J.Bacterial，153，163(1983)]，在Proc.Natl.Acad.Sci.(美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào))USA，75，1929(1978)中描述的方法和類似方法。
當(dāng)動(dòng)物細(xì)胞用作宿主細(xì)胞時(shí)，表達(dá)載體包括pcDNAI，pcDMS(從Funakoshi獲得)，pAGE107[日本已公布未實(shí)審的專利申請(qǐng)22979/91號(hào)；Cytotechnology(電穿孔)，3，133(1990)]，pAS3-3(日本已公布未實(shí)審的專利申請(qǐng)227075/90號(hào))，pCDMS[Nature(自然)，329，840(1987)]，pcDNAI/Amp(Invitrogen制造)，pREP4(Invitrogen制造)，pAGE 103[J.Biochemistry(生物化學(xué))，101，1307(1987)]，pAGE210和類似物。
可使用任何啟動(dòng)子，只要它能在動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮作用。例子包括巨細(xì)胞病毒(CMV)基因的IE(極早期)啟動(dòng)子，SV40的早期啟動(dòng)子，逆轉(zhuǎn)錄病毒的啟動(dòng)子，金屬硫蛋白的啟動(dòng)子，熱休克啟動(dòng)子，SRα啟動(dòng)子等。人CMVIE基因的增強(qiáng)子可與啟動(dòng)子一起使用。
宿主細(xì)胞包括人的細(xì)胞如Namalwa細(xì)胞，猴細(xì)胞如COS細(xì)胞，中國(guó)倉(cāng)鼠細(xì)胞如CHO細(xì)胞或HBT5637(日本已公布未實(shí)審的專利申請(qǐng)No.299/88)，大鼠骨髓瘤細(xì)胞，小鼠骨髓瘤細(xì)胞，來自敘利亞倉(cāng)鼠腎的細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞，受精卵細(xì)胞和類似細(xì)胞。
作為導(dǎo)入重組載體的方法，可使用任何方法，只要它可將DNA導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞中。例子包括電穿孔[Cytotechnology(電穿孔)，3，133(1990)]，磷酸鈣法(日本已公布未實(shí)審的專利申請(qǐng)No.227075/90)，脂染法[Proc.Natl.Acad Sci.USA，84，7413(1987)]，注射法[操作鼠胚，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)]，采用基因槍的方法(基因槍)(日本專利2606856號(hào)，日本專利2517813號(hào))，DEAE-葡聚糖法[Biomanita從書4-基因傳遞和表達(dá)分析(Yodo-sha)，Takashi Yokota和Kenichi Arai主編(1994)]，病毒載體法(操作鼠胚，第二版)和類似物。
當(dāng)昆蟲細(xì)胞用作宿主，蛋白質(zhì)可通過在現(xiàn)代分子生物學(xué)方法，桿狀病毒表達(dá)載體，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，W.H.Freeman and Company，New York(1992)，Bio/Technology，6，47(1988)或類似文獻(xiàn)中所描述的方法進(jìn)行表達(dá)， 蛋白質(zhì)可通過在昆蟲培養(yǎng)的上清液中獲得重組病毒，然后用重組病毒感染昆蟲細(xì)胞來表達(dá)。
在此方法中使用的基因?qū)胼d體包括pVL1392，pVL1393，pBlueBacIII(所有都由Invitrogen制造)和類似物。
桿狀病毒包括加州苜蓿夜蛾核多角體病毒，可被甘藍(lán)夜蛾家族的昆蟲感染。
昆蟲細(xì)胞包括草地貪夜蛾Sf9和Sf21的卵母細(xì)胞[現(xiàn)代分子生物學(xué)方法，桿狀病毒表達(dá)載體，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，W.H.Freeman and Company，New York(1992)]，粉紋夜蛾High 5的卵母細(xì)胞(Invitrogen制造)和類似細(xì)胞。
為制備重組病毒將重組基因?qū)胼d體和桿狀病毒共同導(dǎo)入的方法包括磷酸鈣法(日本已公布未實(shí)審的專利申請(qǐng)227075/90號(hào))，脂染法[Proc.Natl.Acad.Sci.(美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào))USA，84，7413(1987)]和類似方法。
當(dāng)植物細(xì)胞用作宿主細(xì)胞時(shí)，表達(dá)載體包括Ti質(zhì)粒，煙草花葉病毒載體和類似載體。
作為啟動(dòng)子，可使用任何啟動(dòng)子，只要它能在植物細(xì)胞中發(fā)揮作用。例子包括花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子，大米肌動(dòng)蛋白1啟動(dòng)子和類似啟動(dòng)子。
宿主細(xì)胞包括煙草、馬鈴薯、胡蘿卜、大豆、油菜、苜蓿、大米、小麥、大麥和類似的植物細(xì)胞。
作為導(dǎo)入重組載體的方法，可使用任何方法，只要它可將DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞中。例子包括使用土壤桿菌(日本已公布未實(shí)審的專利申請(qǐng)140885/84號(hào)，日本已公布未實(shí)審的專利申請(qǐng)70080/85號(hào)，WO 94/00977)的方法，電穿孔(日本已公布未實(shí)審的專利申請(qǐng)251887/85號(hào))，使用基因槍(基因槍)的方法(日本專利2606856號(hào)，日本專利2517813號(hào))和類似方法。
作為表達(dá)抗體基因的方法，F(xiàn)c區(qū)與其他蛋白的融合蛋白等的分泌產(chǎn)生，表達(dá)除了直接表達(dá)以外，可根據(jù)在分子克隆，第二版或其他文獻(xiàn)中描述的方法進(jìn)行。
當(dāng)基因由酵母，動(dòng)物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞或植物細(xì)胞表達(dá)時(shí)，細(xì)胞中被導(dǎo)入了涉及糖鏈合成的基因，可獲得通過被導(dǎo)入基因加入了糖或糖鏈的抗體分子。
抗體組合物的獲得，可通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)已獲得的轉(zhuǎn)化體，以在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累抗體分子，然后從得到的培養(yǎng)基中回收。采用培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體的方法可根據(jù)通常用于培養(yǎng)宿主細(xì)胞的方法進(jìn)行。
作為碳源?？墒褂媚切┍簧矬w吸收的碳源。例子包括碳水化合物如葡萄糖、果糖、蔗糖，含有它們的糖蜜、淀粉和淀粉水解物；有機(jī)酸如乙酸和丙酸；醇類如乙醇和丙醇；和類似物。
氮源包括氨；無機(jī)酸或有機(jī)酸的銨鹽如氯化銨、硫酸銨、醋酸銨和磷酸銨；其他含氮的化合物；蛋白胨；肉膏；酵母提取物；玉米漿；酪蛋白水解物；大豆粕(soybean meal)；大豆粕水解物；多種發(fā)酵細(xì)胞及其水解物；和類似物。
無機(jī)物包括磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸銅、碳酸鈣和類似物。
通常在需氧的條件如振搖培養(yǎng)或水下?lián)Q氣攪拌培養(yǎng)系統(tǒng)中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)的溫度優(yōu)選15至40℃，培養(yǎng)時(shí)間通常在16小時(shí)至7天。在培養(yǎng)中，pH維持在3.0至9.0。用無機(jī)酸或有機(jī)酸，堿溶液，尿素，碳酸鈣，氨或類似物調(diào)整pH。
如果需要，在培養(yǎng)中可加入抗生素如氨芐青霉素或四環(huán)素至培養(yǎng)基。
當(dāng)用通過使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子作為啟動(dòng)子獲得的重組載體轉(zhuǎn)化的微生物被培養(yǎng)時(shí)，如果需要可向培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物。例如，當(dāng)用通過lac啟動(dòng)子獲得的重組載體轉(zhuǎn)化的微生物被培養(yǎng)時(shí)，可向培養(yǎng)基中加入異丙基-β-D-硫基半乳糖吡喃糖苷，當(dāng)用通過trp啟動(dòng)子獲得的重組載體轉(zhuǎn)化的微生物被培養(yǎng)時(shí)，可向培養(yǎng)基中加入吲哚丙烯酸。
當(dāng)使用動(dòng)物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞獲得的轉(zhuǎn)化體被培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基包括通常使用的RPMI 1640培養(yǎng)基[美國(guó)醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)月刊，199，519(1967)]，Eagle′s MEM培養(yǎng)基[科學(xué)，122，501(1952)]，Dulbecco′s modified MEM培養(yǎng)基[病毒學(xué)，8，396(1959)]，199培養(yǎng)基[生物醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)進(jìn)展，73，1(1950)]和Whitten培養(yǎng)基[發(fā)育工程實(shí)驗(yàn)手冊(cè)-制備轉(zhuǎn)基因小鼠(KodaN-sha)，M.Katsuki主編(1987)]，添加小牛血清等的培養(yǎng)基和類似物。
培養(yǎng)通常在pH 6至8，30至40℃，5％CO2下進(jìn)行1至7天。
如果需要，可在培養(yǎng)中加入抗生素如卡那霉素或青霉素。
培養(yǎng)使用昆蟲細(xì)胞作為宿主獲得的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基包括通常使用的TNM-FH培養(yǎng)基(Pharmingen制造)，Sf-900 II SFM培養(yǎng)基(LifeTechnologies制造)，ExCell 400和ExCell 405(都由JRH BioScience(科學(xué))s制造)，Grace昆蟲培養(yǎng)基[Nature(自然)，195，788(1962)]和類似培養(yǎng)基。
培養(yǎng)通常在中性pH 6至7，25至30℃進(jìn)行1至5天。
另外，如果需要，在培養(yǎng)過程中可向培養(yǎng)基中加入抗生素如慶大霉素。
使用植物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞獲得的轉(zhuǎn)化體可作為細(xì)胞培養(yǎng)，或在將其分化成為植物細(xì)胞或器官之后培養(yǎng)。培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基包括通常使用的Murashige和Skoog(MS)培養(yǎng)基和White培養(yǎng)基，加入植物激素如生長(zhǎng)素，細(xì)胞因子等的培養(yǎng)基，和類似培養(yǎng)基。
培養(yǎng)通常在pH 5至9，20至40℃進(jìn)行3至60天。
如果需要，在培養(yǎng)中可向培養(yǎng)基中加入抗生素如卡那霉素或潮霉素。
因此，抗體組合物的產(chǎn)生可通過培養(yǎng)來自酵母，動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化體，根據(jù)通常的培養(yǎng)方法，從而產(chǎn)生和積累抗體組合物，然后從培養(yǎng)基中回收抗體組合物，其中轉(zhuǎn)化體含有的重組載體中被插入了編碼抗體分子的DNA。
產(chǎn)生抗體組合物的方法包括在宿主細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)方法，從宿主細(xì)胞的細(xì)胞外分泌方法，在宿主細(xì)胞膜外膜上產(chǎn)生的方法。可根據(jù)所使用的宿主細(xì)胞或產(chǎn)生的抗體組合物結(jié)構(gòu)的改變來選擇方法。
當(dāng)本發(fā)明的抗體組合物在宿主細(xì)胞中或宿主細(xì)胞膜外膜上產(chǎn)生時(shí)，根據(jù)Paulson等人的方法[J.Biol.Chem.(生物化學(xué)雜志)，264，17619(1989)]，Lowe等人的方法[Proc.Natl.Acad Sci.USA，86，8227(1989)，Gene(基因)s Develop.，4，1288(1990)]，在日本已公布未實(shí)審的專利申請(qǐng)336963/93號(hào)和日本已公布未實(shí)審的專利申請(qǐng)823021/94號(hào)中描述的方法和類似方法，它可被主動(dòng)分泌至細(xì)胞外。
也就是，通過使用基因重組技術(shù)，在表達(dá)載體中插入一個(gè)編碼抗體分子的DNA和編碼適合表達(dá)抗體分子的信號(hào)肽的DNA進(jìn)入，將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，然后表達(dá)抗體分子，目的抗體分子可從宿主細(xì)胞中主動(dòng)地被分泌至細(xì)胞外。
根據(jù)在日本已公布未實(shí)審的專利申請(qǐng)227075/90號(hào)中描述的方法也可通過使用一種基因擴(kuò)增系統(tǒng)，使用二氫葉酸還原酶基因增加其產(chǎn)量。
另外，抗體組合物也可通過使用導(dǎo)入了基因的動(dòng)物個(gè)體(轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物)或植物個(gè)體(轉(zhuǎn)基因植物)來產(chǎn)生，其構(gòu)建是通過被導(dǎo)入了基因的動(dòng)物或植物細(xì)胞的再分化。
當(dāng)轉(zhuǎn)化體是動(dòng)物個(gè)體或植物個(gè)體，抗體組合物的產(chǎn)生可根據(jù)一種通常的方法通過飼養(yǎng)或培養(yǎng)該個(gè)體產(chǎn)生和積累抗體組合物，然后從動(dòng)物或植物個(gè)體中回收抗體組合物。
通過使用動(dòng)物個(gè)體產(chǎn)生抗體組合物的方法包括一種目的抗體組合物在根據(jù)一種已知方法導(dǎo)入基因而構(gòu)建的動(dòng)物中產(chǎn)生的方法[American Journal of Clinical Nutrition，63，627S(1996)；Bio/Technology，9，830(1991)]。
在動(dòng)物個(gè)體的情況下，抗體組合物的產(chǎn)生可通過飼養(yǎng)轉(zhuǎn)基因的非人動(dòng)物，該動(dòng)物被導(dǎo)入了編碼抗體分子的DNA，因而在動(dòng)物中產(chǎn)生和積累抗體組合物，然后從動(dòng)物中回收抗體組合物。動(dòng)物中產(chǎn)生和積累組合物的位置包括乳汁(日本已公布未實(shí)審的專利申請(qǐng)309192/88號(hào))和動(dòng)物的卵。作為在此情況下使用的啟動(dòng)子，可使用任何啟動(dòng)子，只要它可在動(dòng)物中發(fā)揮作用。優(yōu)選的例子包括乳腺細(xì)胞特異性啟動(dòng)子如酪蛋白啟動(dòng)子，β酪蛋白啟動(dòng)子，β乳球蛋白啟動(dòng)子，乳清酸性蛋白啟動(dòng)子和類似啟動(dòng)子。
通過使用植物個(gè)體產(chǎn)生抗體組合物的方法包括一種方法，其中抗體組合物的產(chǎn)生是通過培養(yǎng)一種轉(zhuǎn)基因植物，該植物通過已知的方法被導(dǎo)入了編碼抗體分子的DNA[Tissue Culture，20(1994)；TissueCulture，21(1995)；Trends in Biotechnology，15，45(1997)]，以在植物中產(chǎn)生和積累抗體組合物，然后從植物中回收抗體組合物。
關(guān)于通過轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的抗體組合物的純化而言，該轉(zhuǎn)化體中被導(dǎo)入了編碼抗體分子的基因，例如當(dāng)抗體組合物在細(xì)胞內(nèi)以溶解狀態(tài)表達(dá)時(shí)，培養(yǎng)后的細(xì)胞離心回收，懸浮在水緩沖液中，然后用超聲波振蕩器，F(xiàn)rench press，Manton Gaulin勻漿器，dynomill或類似方法破壞獲得無細(xì)胞提取物。從通過離心無細(xì)胞提取物獲得的上清液中可獲得抗體組合物的純化產(chǎn)物，通過使用通常的酶分離純化技術(shù)如溶劑提??；鹽析和硫酸銨脫鹽等；用有機(jī)溶劑沉淀；使用樹脂如二乙氨乙基(DEAE)-瓊脂糖凝膠或DIAION HPA-75(Mitsubishi Chemical制造)的陰離子交換色譜；使用樹脂如S-Sepharose FF(Pharmacia制造)的陽離子交換樹脂；使用樹脂如丁基-瓊脂糖凝膠，苯基-瓊脂糖凝膠的疏水色譜；使用分子篩的凝膠過濾；親和色譜；色譜聚焦；電泳如等電點(diǎn)聚焦；和類似單獨(dú)使用或聯(lián)合使用的方法。
當(dāng)抗體組合物也通過形成不溶體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，以相同的方式回收細(xì)胞，破壞和離心，抗體組合物的不溶體作為沉淀部分被回收?；厥盏目贵w不溶體采用蛋白質(zhì)變性劑溶解。通過稀釋或透析溶解的溶液，將抗體組合物制成正常的三維結(jié)構(gòu)，然后通過相同的分離純化方法獲得抗體組合物的純化產(chǎn)物。
當(dāng)抗體組合物被分泌至細(xì)胞外時(shí)，抗體組合物或其衍生物從培養(yǎng)上清液中回收。即，通過如離心的技術(shù)處理培養(yǎng)基獲得可溶的部分，從可溶的部分中通過相同的分離純化方法獲得抗體組合物的純化制劑。
因此得到的抗體組合物包括抗體，抗體片段，由抗體Fc區(qū)組成的融合蛋白，和類似物。
作為獲得抗體組合物的例子，產(chǎn)生人源化抗體組合物和Fc融合蛋白的方法在下面詳述，但其他的抗體組合物也可用類似于該法的方式獲得。
A.制備人源化抗體組合物 (1)構(gòu)建人源化抗體表達(dá)的載體 人源化抗體表達(dá)的載體是插入了編碼人抗體H鏈和L鏈C區(qū)基因的動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，其構(gòu)建可通過將編碼人抗體每條CH和CL的基因克隆進(jìn)動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體中。
人抗體的C區(qū)可以是任何人抗體的CH和CL。例子包括人抗體H鏈中屬于IgGl亞型的C區(qū)(此后稱為″hCγl″)，人抗體L鏈中屬于k型的C區(qū)(此后稱為″hCκ″)，和類似物。
作為編碼人抗體CH和CL的基因，可使用由外顯子和內(nèi)含子組成的染色體DNA，也可使用cDNA。
作為動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體，可使用任何載體，只要編碼人抗體C區(qū)的基因可被插入其中并在其中表達(dá)。例子包括pAGE 107[Cytotechnology(電穿孔)，3，133(1990)]，pAGE103[J.Biocfiem.，101，1307(1987)]，pHSG274[Gene(基因)，27，223(1984)]，pKCR[Proc.Natl.Acad.Sci.(美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào))USA，78，1527(1981)，pSGl βd2-4[Cytotechnology(電穿孔)，4，173(1990)]等。在動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體中的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子含有SV40早期啟動(dòng)子和增強(qiáng)子[J.Biochem.(生物化學(xué)雜質(zhì))，101，1307(1987)]，莫羅尼鼠白血病病毒LTR啟動(dòng)子[Biochem.Biophys.Res.Comnun.，149，960(1987)]，免疫球蛋白H鏈啟動(dòng)子[Cell(細(xì)胞)，41，479(1985)]和增強(qiáng)子[Cell(細(xì)胞)，33，717(1983)]和類似物。
已構(gòu)建的人源化抗體表達(dá)載體可用來在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)人嵌合抗體和人CDR-移植抗體。
(2)編碼非人動(dòng)物抗體V區(qū)cDNA的制備方法 編碼非人動(dòng)物抗體如鼠抗體VH和VL的cDNA可以下列的方式獲得。
cDNA從產(chǎn)生目的鼠抗體的雜交瘤細(xì)胞中提取的mRNA合成。已合成的cDNA被克隆進(jìn)載體如噬菌體或質(zhì)粒中以獲得cDNA文庫(kù)。每個(gè)含有編碼VH的cDNA的重組噬菌體或重組質(zhì)粒和含有編碼VL的cDNA的重組噬菌體或重組質(zhì)粒從文庫(kù)中分離，使用現(xiàn)有鼠抗體的C區(qū)部分或V區(qū)部分作為探針。測(cè)定在重組噬菌體或重組質(zhì)粒上目的鼠抗體VH和VL的全部核苷酸序列，從核苷酸序列推算出VH和VL的全長(zhǎng)按計(jì)算序列。
作為非人動(dòng)物，可使用任何動(dòng)物如小鼠，大鼠，倉(cāng)鼠或兔，只要可從中產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞。
從雜交瘤細(xì)胞中制備總RNA的方法包括硫氰酸胍-三氟醋酸銫法[Methods in Enzymology，154，3(1987)]和類似方法，從總RNA中制備mRNA的方法包括寡聚(dT)-固定纖維素柱法[分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]和類似方法。另外，從雜交瘤細(xì)胞中制備mRNA的試劑盒的實(shí)施例包括Fast TrackmRNA分離試劑盒(Invitrogen制造)，Quick Prep mRNA純化試劑盒(Pharmacia制造)和類似物。
合成cDNA和制備cDNA文庫(kù)的方法包括常規(guī)的方法[分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)，現(xiàn)代分子生物學(xué)方法，增刊1-34]，使用市售試劑盒的方法，試劑盒如SuperscriptTM，cDNA合成和質(zhì)?？寺〉馁|(zhì)粒系統(tǒng)(GEBCO BRL制造)或ZAP-cDNA合成試劑盒(Stratagene制造)，和類似物。
在制備cDNA文庫(kù)過程中，插入了從雜交瘤細(xì)胞中提取的mRNA作為模板合成的cDNA的載體可以是任何載體，只要可插入cDNA。實(shí)施例包括ZAP Express[Strategies，5，58(1992)]，pBluescript II SK(+)[Nucleic Acids Research，17，9494(1989)]，XzapII(Stratagene制造)，λgt10和λgt11[DNA 克隆，實(shí)踐方法，I，49(1985)]，LambdaBlueMid(Clontech制造)，λExCell，pT7T3 18U(Pharmacia制造)，pcD2[Mol.Cell.Biol.，3，280(1983)]，pUCIS/Gene，33，103(1985)]和類似物。
作為被導(dǎo)入了從噬菌體或質(zhì)粒載體構(gòu)建的cDNA文庫(kù)的大腸桿菌，可使用任何大腸桿菌，只要可被導(dǎo)入，表達(dá)和保留cDNA文庫(kù)。實(shí)施例包括XL 1-Blue MRF[Strategies，5，81(1992)]，C600[Genetics，39，440(1954)]，Y1088和Y1090[Science，222，778(1983)]，NM522[J.Mol，Biol.，166，1(1983)]，K802[J.Mol.Biol.，16，118(1966)]，JM105[Gene，38，275(1985)]和類似物。
作為從cDNA文庫(kù)中選擇編碼非人動(dòng)物抗體H鏈和L鏈V區(qū)的cDNA克隆的方法，可使用采用同位素或熒光標(biāo)記探針的菌落雜交或噬斑雜交[分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]。編碼VH和VL的cDNA可通過制備引物，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)而制備[此后稱為“PCR”；分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989)；現(xiàn)代分子生物學(xué)方法，增刊1-34]使用從mRNA或cDNA文庫(kù)中合成的cDNA作為模板。
cDNA核苷酸序列的測(cè)定可通過用適當(dāng)?shù)南拗菩悦赶堰x擇的cDNA，將DNA片段克隆進(jìn)如pBluescript SK(-)(Stratagene制造)的質(zhì)粒中，進(jìn)行通常使用的核苷酸序列分析方法如Sanger等人的雙脫氧法[Proc.Nat/.Acad.Sci.USA，74，5463(1977)]或類似方法的反應(yīng)，然后使用自動(dòng)核苷酸序列分析儀如A.L.F.DNA測(cè)序儀(Pharmacia制造)或類似儀器分析克隆。
不管已獲得的cDNA是否編碼含有分泌信號(hào)的抗體VH和VL全長(zhǎng)氨基酸序列，序列可通過從已測(cè)定的核苷酸序列推導(dǎo)VH和VL的全長(zhǎng)核苷酸序列，并將其與已知抗體VH和VL的全長(zhǎng)氨基酸序列比較而證實(shí)[Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Dep.Healthand Human Services(1991)]。
(3)來源于非人動(dòng)物的抗體的V區(qū)的氨基酸序列分析 關(guān)于包括分泌信號(hào)序列的抗體的H鏈和L鏈的V區(qū)的全長(zhǎng)氨基酸序列，分泌信號(hào)序列和N-端氨基酸序列的長(zhǎng)度可以推導(dǎo)出來，通過把它們與已知抗體的H鏈和L鏈的V區(qū)的全長(zhǎng)氨基酸序列[Sequences ofproteins of Immunological Interest，US Dep.Health and Human Services(具有免疫學(xué)重要性的蛋白質(zhì)的序列，美國(guó)，健康與人類服務(wù)進(jìn)展)(1991)]加以比較，可以發(fā)現(xiàn)它們所屬的亞群。另外，可以通過把它們與已知抗體的H鏈和L鏈的V區(qū)的氨基酸序列[Sequences of proteins ofImmunological Interest，US Dep.Health and Human Services(具有免疫學(xué)重要性的蛋白質(zhì)的序列，美國(guó)，健康與人類服務(wù)進(jìn)展)(1991)]加以比較，也可發(fā)現(xiàn)H鏈和L鏈的V區(qū)的每個(gè)CDR的氨基酸序列。
(4)表達(dá)人嵌合抗體的載體的構(gòu)建 表達(dá)人嵌合抗體的載體的構(gòu)建，如條目3(1)中描述的，通過在人源化抗體表達(dá)的載體中，把編碼來源于非人動(dòng)物的抗體的H鏈和L鏈的V區(qū)的cDNA克隆進(jìn)入編碼人抗體的H鏈和L鏈的C區(qū)的基因的上游。例如，表達(dá)人嵌合抗體的載體可以通過把編碼來源于人類動(dòng)物的抗體的H鏈和L鏈的V區(qū)的每個(gè)cDNA，與合成的DNA加以連接構(gòu)建，此處合成的DNA包括來源于非人動(dòng)物的抗體的H鏈和L鏈的V區(qū)的3’-末端核苷酸序列，人抗體的H鏈和L鏈的C區(qū)的5’-末端核苷酸序列，并且在兩個(gè)末端都有合適的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，和把它們克隆到載體中含有的編碼人抗體的H鏈和L鏈的C區(qū)的基因的上游，此載體是如條目3(1)所描述構(gòu)建的適合表達(dá)的人源化抗體的表達(dá)載體。
(5)編碼人CDR-移植抗體V區(qū)的cDNA的構(gòu)建 編碼人CDR-移植抗體H鏈和L鏈的V區(qū)的cDNA可以如以下獲得。首先，選擇用于移植來源于非人動(dòng)物的抗體的H鏈和L鏈的V區(qū)的CDR的人抗體的H鏈和L鏈的V區(qū)的框架(以下稱為“FR”)的氨基酸。作為人抗體H鏈和L鏈V區(qū)FR的氨基酸序列，任何氨基酸都可以使用，只要它們來源于人抗體。例子包括數(shù)據(jù)庫(kù)，例如蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中登記的人抗體H鏈和L鏈V區(qū)FR的氨基酸序列，通常人抗體H鏈和L鏈V區(qū)FR的每個(gè)亞群的氨基酸序列[Sequences of proteins of Immunological Interest，US Dep.Health and Human Services(具有免疫學(xué)重要性的蛋白質(zhì)的序列，美國(guó)，健康與人類服務(wù)進(jìn)展)(1991)]等。為了制備有效活性的人CDR-移植抗體，優(yōu)選的選擇與來源于非人動(dòng)物的目的抗體的H鏈和L鏈的V區(qū)的氨基酸序列同源性盡可能高的氨基酸序列(至少60％或更多)。
然后，來源于非人動(dòng)物的目的抗體的H鏈和L鏈的V區(qū)的CDR氨基酸序列，移植到選擇的人抗體的H鏈和L鏈的V區(qū)的FR氨基酸序列，設(shè)計(jì)人CDR-移植抗體H鏈和L鏈V區(qū)的氨基酸序列?？紤]抗體基因核苷酸序列中發(fā)現(xiàn)的密碼子選擇的頻率，把設(shè)計(jì)的氨基酸序列轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA序列[Sequences of proteins of Immunological Interest，US Dep.Health andHuman Services(具有免疫學(xué)重要性的蛋白質(zhì)的序列，美國(guó)，健康與人類服務(wù)進(jìn)展)(1991)]，設(shè)計(jì)編碼人CDR-移植抗體H鏈和L鏈V區(qū)氨基酸序列的DNA序列。以設(shè)計(jì)的DNA序列為基礎(chǔ)，合成幾種長(zhǎng)度約100個(gè)堿基的合成DNA，使用它們進(jìn)行PCR。在此情況下，考慮到PCR的反應(yīng)效率和可以合成的DNA的長(zhǎng)度，每種H鏈和L鏈優(yōu)選設(shè)計(jì)4到6種合成DNA。
而且，通過把合適的限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)導(dǎo)入存在于合成DNA的兩個(gè)末端的5’-端，合成DNA可以容易的克隆進(jìn)入在條目3(1)中構(gòu)建的，用于人源化抗體表達(dá)的載體中。PCR后，擴(kuò)增的產(chǎn)物克隆進(jìn)入質(zhì)粒例如pBluescript SK(-)(Stratagene生產(chǎn))或相似的質(zhì)粒，通過條目3(2)中的方法確定核苷酸序列，獲得含有編碼需要的人CDR-移植抗體的H鏈和L鏈的V區(qū)的氨基酸序列的DNA序列的質(zhì)粒。
(6)人CDR移植抗體V區(qū)氨基酸序列的修飾 已知當(dāng)通過僅將非人動(dòng)物抗體VH和VL中的CDR簡(jiǎn)單地移植至人抗體VH和VL中FR中產(chǎn)生人CDR移植抗體時(shí)，其抗原結(jié)合活性低于原始的非人動(dòng)物抗體的結(jié)合活性[BIO/TECHNOLOGY，9，266(1991)]。就其原因，考慮Fr而不是CDR的幾個(gè)氨基酸殘基直接或間接與原始非人動(dòng)物抗體VH和VL中的抗原結(jié)合活性有關(guān)，它們可改變?yōu)槿丝贵wVH和VL中的不同F(xiàn)R氨基酸殘基。為了解決這個(gè)問題，在人CDR移植抗體中，在人抗體VH和VL的FR氨基酸序列中，與結(jié)合抗原直接相關(guān)的氨基酸殘基，或通過與CDR中的氨基酸殘基相互作用或通過保持抗體的三維結(jié)構(gòu)與結(jié)合抗原間接有關(guān)的氨基酸殘基，被鑒定并修飾為可在原始非人動(dòng)物抗體中發(fā)現(xiàn)的一種氨基酸序列，以增加已被降低的抗原結(jié)合活性[BIO/TECHNOLOGY，9，266(1991)]。
在人CDR移植抗體的產(chǎn)生中，最重要的是如何有效鑒別FR中與抗原結(jié)合活性有關(guān)的氨基酸殘基，這樣構(gòu)建抗體的三維結(jié)構(gòu)，并通過X-射線晶體學(xué)[J.Mol Biol，112，535(1977)]，計(jì)算機(jī)建模[ProteinEngineering，7，1501(1994)]或類似方法來分析。盡管抗體的三維結(jié)構(gòu)信息已經(jīng)用于產(chǎn)生人CDR移植抗體的產(chǎn)生，用于產(chǎn)生可用于產(chǎn)生所有抗體的人CDR移植抗體的方法現(xiàn)在還沒有建立。因此，現(xiàn)在需要進(jìn)行多種嘗試，例如產(chǎn)生每個(gè)抗體的幾種修飾抗體，闡明每個(gè)修飾抗體和其抗體結(jié)合活性之間的關(guān)系。
為了根據(jù)如3(5)所述的PCR進(jìn)行修飾，已選擇的人抗體VH和VL的FR氨基酸序列的修飾可使用多種合成DNA來完成。就通過PCR獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物而言，根據(jù)3(2)中所述的方法測(cè)定核苷酸序列以證實(shí)是否已經(jīng)進(jìn)行了目標(biāo)修飾。
(7)構(gòu)建用于人CDR-移植抗體表達(dá)的載體 通過把編碼條目3(5)和(6)中構(gòu)建的人CDR-移植抗體H鏈和L鏈的V區(qū)的cDNA克隆進(jìn)入編碼條目3(1)中描述的用于人源化抗體表達(dá)的載體中的人抗體的H鏈和L鏈的C區(qū)基因的上游，構(gòu)建用于人CDR-移植抗體表達(dá)的載體。例如，通過在條目3(5)和(6)中進(jìn)行PCR構(gòu)建H鏈和L鏈的V區(qū)時(shí)，把合適的限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列導(dǎo)入所用的合成的DNA片段兩個(gè)末端的5’-末端中，這樣人CDR-移植抗體H鏈和L鏈的V區(qū)cDNA可以克隆進(jìn)入如條目3(1)中描述的用于人源化抗體表達(dá)的載體中編碼人抗體的H鏈和L鏈的C區(qū)的基因的上游，以這樣的方式它們可以以合適的方式表達(dá)，因此構(gòu)建了人CDR移植抗體的表達(dá)載體。
(8)穩(wěn)定產(chǎn)生人源化抗體 通過把條目3(4)或(7)中描述的表達(dá)人源化抗體的載體導(dǎo)入合適的動(dòng)物細(xì)胞，能獲得穩(wěn)定產(chǎn)生人嵌合抗體和人CDR-移植抗體(在下文中兩者都稱為“人源化抗體”)的轉(zhuǎn)化體。
把表達(dá)人源化抗體的載體導(dǎo)入細(xì)胞的方法包括電穿孔[日本公開的審查的專利申請(qǐng)257891/90號(hào)，Cytotechnology(電穿孔)，3，133(1990)]等。
作為表達(dá)人源化抗體的載體導(dǎo)入的動(dòng)物細(xì)胞，可以使用任何細(xì)胞，只要是可以產(chǎn)生人源化抗體的動(dòng)物細(xì)胞。
例子包括小鼠骨髓瘤細(xì)胞，例如NS0細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞，例如CHO/dhfr-細(xì)胞和CHO/DG44細(xì)胞；大鼠骨髓瘤細(xì)胞，例如YB2/0細(xì)胞和IR983F細(xì)胞；來源于敘利亞倉(cāng)鼠腎的BHK細(xì)胞；人骨髓瘤細(xì)胞例如Namalwa細(xì)胞等。優(yōu)選中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO/DG44細(xì)胞、大鼠骨髓瘤細(xì)胞YB2/0細(xì)胞和在1項(xiàng)中所描述的細(xì)胞。
導(dǎo)入表達(dá)人源化抗體的載體后，根據(jù)日本公開的審查的專利申請(qǐng)?zhí)?57891/90中公開的方法，使用用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的含有例如G418硫酸鹽(以下稱為“G418”，由SIGMA制備)的培養(yǎng)基，選擇能夠穩(wěn)定產(chǎn)生人源化抗體的轉(zhuǎn)化體。作為動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，可以提及的是RPMI 1640培養(yǎng)基(Nissui Pharmaceutical生產(chǎn))，GIT培養(yǎng)基(NihonPharmaceutical生產(chǎn))，EX-CELL 302培養(yǎng)基(JRH生產(chǎn))，IMDM培養(yǎng)基(GIBCO BRL生產(chǎn))，Hybridoma-SFM培養(yǎng)基(GIBCO BRL生產(chǎn))，往這些培養(yǎng)基中加入多種添加劑例如胎牛血清(以下稱為“FCS”)獲得的培養(yǎng)基等。通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得的轉(zhuǎn)化體，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累人源化抗體。培養(yǎng)基中人源化抗體的產(chǎn)生和抗原結(jié)合活性可以用例如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)[以下稱為“ELISA”，AntibodiesA LaboratoryManual(實(shí)驗(yàn)手冊(cè))，Cold Spring Harbor Laboratory，第14章(1998)，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，Academic Press(美國(guó)學(xué)術(shù)出版社)Limited(1996)]等方法測(cè)定。而且，根據(jù)日本公開的審查的專利申請(qǐng)257891/90號(hào)中公開的方法，使用DHFR基因擴(kuò)增系統(tǒng)，可以使通過轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生人源化抗體的產(chǎn)量增加。， 使用蛋白A柱[AntibodiesA Laboratory Manual(抗體實(shí)驗(yàn)手冊(cè))Cold Spring Harbor Laboratory(冷泉港實(shí)驗(yàn)室)，第8章(1988)，Monoclonal Antibodies Principles and Practice(單克隆抗體原理于實(shí)踐)，Academic Press(美國(guó)學(xué)術(shù)出版社)Limited(1996)]，從轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基上清中純化人源化抗體。另外，也可以使用一般用于純化蛋白質(zhì)的純化方法。例如，通過凝膠過濾，離子交換層析，超濾相結(jié)合進(jìn)行提純。能夠分別測(cè)定純化的人源化抗體的H鏈，L鏈和整體抗體分子的分子量，例如，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳[以下稱為“SDS-PAGE”，Nature(自然)，227，680(1970)]，Western blotting[Antibodies ALaboratory Manual(抗體實(shí)驗(yàn)手冊(cè))，第12章(1988)，MonoclonalAntibodies(單克隆抗體)]等。
B.制備Fc融合蛋白 (1)構(gòu)建Fc融合蛋白的表達(dá)載體 Fc融合蛋白的表達(dá)載體是一種被插入了編碼人抗體的Fc區(qū)和要被融合的蛋白質(zhì)的基因的動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，它的構(gòu)建可通過將編碼人抗體的Fc區(qū)和要被融合的蛋白質(zhì)的每個(gè)基因克隆進(jìn)動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體中。
人抗體的Fc區(qū)包括那些除了含有CH2和CH3區(qū)的區(qū)域以外，含有鉸鏈區(qū)的一部分和/或CH1的區(qū)域。也可以是任何Fc區(qū)，只要CH2或CH3的至少一個(gè)氨基酸被刪除，取代，添加或插入，實(shí)質(zhì)上具有與Fcγ受體的結(jié)合活性。
作為編碼人抗體的Fc區(qū)和要被融合的蛋白的基因，可使用由外顯子和內(nèi)含子組成的染色體DNA，也可使用cDNA。連接基因和Fc區(qū)的方法包括使用每個(gè)基因序列作為模板的PCR(分子克隆)，CurrentProtocols in Molecular.Biology(現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法)，增刊1-34)。
作為動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體，可使用任何載體，只要編碼人抗體C區(qū)的基因被插入其中和在其中表達(dá)。例子包括pAGE107[Cytotechnology(電穿孔)，3，133(1990)]，pAGElOS[J.Biochem.(生物化學(xué)雜質(zhì))，101，1307(1987)]，pHSG274[Gene(基因)，27，223(1984)]，pKCR[Proc.Natl.Acad.Sci.(美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào))USA，78，1527(1981)，pSG1 p d2-4[Cytotechnology(電穿孔)，4，173(1990)]和類似物。動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體中的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子含有SV40早期啟動(dòng)子和增強(qiáng)子[J.Biochem.(生物化學(xué)雜質(zhì))，101，1307(1987)]，莫洛尼小鼠白血病病毒LTR啟動(dòng)子[Biochem.Biophys.Res.Commun.，149，960(1987)]，免疫球蛋白H鏈啟動(dòng)子[Cell(細(xì)胞)，41，479(1985)]和增強(qiáng)子[Cell(細(xì)胞)，33，717(1983)]，和類似物。
(2)制備編碼人抗體Fc區(qū)和要被融合的蛋白的DNA 編碼人抗體Fc區(qū)和要被融合蛋白的DNA可以下面的方式獲得。
從表達(dá)要與Fc融合的目的蛋白的細(xì)胞或組織提取的mRNA合成cDNA。已合成的cDNA被克隆進(jìn)載體中如噬菌體或質(zhì)粒以獲得cDNA文庫(kù)。含有編碼目的蛋白的cDNA的重組噬菌體或重組質(zhì)粒通過使用目的蛋白部分基因序列作為探針從文庫(kù)中分離。測(cè)定重組噬菌體或重組質(zhì)粒上目的抗體的全長(zhǎng)核苷酸序列，從核苷酸序列推導(dǎo)出全長(zhǎng)氨基酸序列。
作為非人動(dòng)物，可使用任何動(dòng)物如小鼠，大鼠，倉(cāng)鼠或兔，只要可從其中取出細(xì)胞或組織。
從細(xì)胞或組織制備總RNA的方法包括硫氰酸胍-三氟醋酸銫法[Methods in Enzymology，154，3(1987)]和類似方法，從總RNA制備mRNA的方法包括寡聚(dT)-固定纖維素柱法(分子克隆，第二版)和類似方法。另外，從細(xì)胞或組織制備mRNA的試劑盒包括Fast TrackmRNA分離試劑盒(Invitrogen制造)，Quick Prep mRNA純化試劑盒(Pharmacia制造)和類似方法。
合成cDNA和制備cDNA文庫(kù)的方法包括常規(guī)方法(分子克隆)，Current Protocols in Molecular.Biology(現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法)，增刊1-34)；使用市售試劑盒如SuperscriptTM，cDNA合成和質(zhì)?？寺〉馁|(zhì)粒系統(tǒng)(GIBCO BRL制造)或ZAP-cDNA合成試劑盒(StrataGene(基因)制造)的方法；和類似方法。
在制備cDNA文庫(kù)過程中，被插入了cDNA的載體可以是任何載體，只要可插入cDNA，該cDNA是使用從細(xì)胞或組織提取的mRNA作為模板合成的。例子包括ZAP Express[Strategies，5，58(1992)]，pBluescript II SK(+)[Nucleic Acids Research(核酸研究)，17，9494(1989)]，XzapII(StrataGene(基因)制造)，λgt10和λgt11[DNA克隆，實(shí)踐方法，I，49(1985)]，Lambda BlueMid(Clontech制造)，AExCell(細(xì)胞)，pT7T3 18U(Pharmacia制造)，pcD2[Mol.Cell Biol，3，280(1983)]，pUC18[Gene(基因)，33，103(1985)]和類似物。
作為被導(dǎo)入了從噬菌體或質(zhì)粒載體構(gòu)建的cDNA文庫(kù)的大腸桿菌，可使用任何大腸桿菌，只要可導(dǎo)入，表達(dá)和保持cDNA文庫(kù)。例子包括XL1-Blue MRF′[Strategies，5，81(1992)]，C600[Genetics(遺傳學(xué))，39，440(1954)]，Y1088和Y1090[Science(科學(xué))，222，778(1983)]，NM522[J.Mol.Biol.，166，1(1983)]，K802[J.Mol.Biol.，16，118(1966)]，JM105[Gene(基因)，38，275(1985)]和類似物。
作為從cDNA文庫(kù)中選擇編碼目的蛋白的cDNA克隆的方法，可使用采用同位素或熒光標(biāo)記的探針的菌落雜交或噬斑雜交(分子克隆，第二版)。編碼目的蛋白的cDNA也可根據(jù)PCR，通過制備引物，使用從mRNA或cDNA文庫(kù)中合成的cDNA作為模板而制備。
將目的蛋白與人抗體Fc區(qū)融合的方法包括PCR。例如，在編碼目的蛋白的基因序列的5’末端和3’末端設(shè)計(jì)合成的寡聚DNA(引物)，進(jìn)行PCR以制備PCR產(chǎn)物。以同樣的方法，為編碼要融合的人抗體Fc區(qū)的基因序列設(shè)計(jì)引物以制備PCR產(chǎn)物。在此時(shí)，以下列的方式設(shè)計(jì)引物，在要被融合的蛋白的PCR產(chǎn)物3’末端和Fc區(qū)PCR產(chǎn)物的5’末端之間存在有相同的限制性酶位點(diǎn)或相同的基因序列。當(dāng)需要修飾連接位點(diǎn)周圍的氨基酸時(shí)，通過使用被導(dǎo)入突變的引物導(dǎo)入突變。進(jìn)一步通過使用兩種已獲得的PCR片段進(jìn)行PCR以連接基因。它們也可在用相同的限制性酶處理后通過連接反應(yīng)被連接。
DNA的核苷酸序列的確定可通過使用適當(dāng)?shù)南拗菩悦赶蒙鲜龅姆椒ㄟB接的基因序列，將DNA片段克隆進(jìn)質(zhì)粒中如pBluescriptSK(-)(StrataGene(基因)制造)，使用通常使用的核苷酸序列分析方法如Sanger等人的雙脫氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.(美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào))USA，74，5463(1977)]或自動(dòng)核苷酸序列分析儀如A.L.F.DNA測(cè)序儀(Pharmacia制造)進(jìn)行分析。
不管已獲得的cDNA是否編碼含有分泌信號(hào)的Fc融合蛋白的全長(zhǎng)氨基酸序列，序列可通過從已測(cè)定的核苷酸序列推導(dǎo)Fc融合蛋白的全長(zhǎng)核苷酸序列，并將其與目的氨基酸序列比較而證實(shí)。
(3)穩(wěn)定產(chǎn)生Fc融合蛋白 能夠穩(wěn)定產(chǎn)生Fc融合蛋白的轉(zhuǎn)化體通過將在(1)中所描述的Fc融合蛋白表達(dá)載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)膭?dòng)物細(xì)胞中而獲得。
將Fc融合蛋白表達(dá)載體導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞中的方法包括電穿孔[日本已公布未實(shí)審的專利申請(qǐng)257891/90號(hào)，Cytotechnology(電穿孔)，3，133(1990)]和類似方法。
作為被導(dǎo)入Fc融合蛋白表達(dá)載體的動(dòng)物細(xì)胞，可使用任何細(xì)胞，只要它是可產(chǎn)生Fc融合蛋白的動(dòng)物細(xì)胞。
優(yōu)選的例子包括小鼠骨髓瘤細(xì)胞如NS0細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞如CHO/dhfr-細(xì)胞和CHO/DG44細(xì)胞，大鼠骨髓瘤細(xì)胞如YB2/0細(xì)胞和IR983F細(xì)胞，來自敘利亞倉(cāng)鼠腎的BHK細(xì)胞，人骨髓瘤細(xì)胞如Namalwa細(xì)胞，和類似細(xì)胞，優(yōu)選中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO/DG44細(xì)胞，大鼠骨髓瘤YB2/0細(xì)胞和在1項(xiàng)中所描述的本發(fā)明方法中使用的宿主細(xì)胞。
在導(dǎo)入Fc融合蛋白表達(dá)載體后，根據(jù)日本已公布未實(shí)審的專利申請(qǐng)257891/90號(hào)中所描述的方法通過使用含有如G418和類似試劑的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基，選擇能夠穩(wěn)定產(chǎn)生Fc融合蛋白表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體的選擇。培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基包括RPMI 1640培養(yǎng)基(NissuiPharmaceutical制造)，GIT培養(yǎng)基(Nihon Pharmaceutical制造)，EX-CELL302培養(yǎng)基(JRH制造)，IMDM培養(yǎng)基(GEBCO BRL制造)，Hybridoma-SFM培養(yǎng)基(GIBCO BRL制造)。通過向這些培養(yǎng)基中加入多種添加物如胎牛血清獲得的培養(yǎng)基，和類似培養(yǎng)基?？赏ㄟ^在培養(yǎng)基中培養(yǎng)已獲得的轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生和積累Fc融合蛋白質(zhì)。在培養(yǎng)上清液中Fc融合蛋白的產(chǎn)生量和抗原結(jié)合活性可通過如ELISA的方法來測(cè)量。也可采用dhfr基因擴(kuò)增系統(tǒng)根據(jù)在日本已公布未實(shí)審的專利申請(qǐng)257891/90號(hào)中描述的方法增加轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的Fc融合蛋白的量。
可采用蛋白A柱從轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)上清液中純化Fc融合蛋白(抗體，第8章；單克隆抗體)。另外，也可使用通常用作蛋白純化的純化方法。例如，可通過聯(lián)合使用凝膠過濾，離子交換色譜和超濾來進(jìn)行純化。作為整個(gè)純化的Fc融合蛋白分子，分子量通過SDS-PAGE[Nature(自然)，227，680(1970)]，Western blotting[抗體，第12章，(1988)，單克隆抗體]或類似方法來測(cè)定。
因此，采用動(dòng)物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞產(chǎn)生抗體組合物的方法已經(jīng)被描述，但如上所述，抗體組合物也可通過酵母，昆蟲細(xì)胞，植物細(xì)胞，動(dòng)物個(gè)體或植物個(gè)體通過相同的方法在動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生。
當(dāng)細(xì)胞天生具有表達(dá)抗體分子的能力，目的抗體組合物的產(chǎn)生可采用在1項(xiàng)中所描述的方法通過制備產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞，然后從得到的培養(yǎng)基中純化抗體組合物。
4.抗體組合物的活性評(píng)價(jià) 作為純化抗體組合物的量、純化抗體與抗原結(jié)合的活性和純化抗體組合物的效應(yīng)器功能的測(cè)量方法，可以使用單克隆抗體、抗體工程學(xué)等文獻(xiàn)中描述的已知方法。
例如，當(dāng)抗體組合物是人源化抗體時(shí)，其與抗原的結(jié)合活性和與抗原陽性的培養(yǎng)克隆的結(jié)合活性可以通過如ELISA和免疫熒光法的方法檢測(cè)[Cancer Immunol.Immunother.，36，373(1993)]。對(duì)抗原陽性培養(yǎng)克隆的細(xì)胞毒活性可以通過測(cè)量補(bǔ)體-依賴的細(xì)胞毒活性(此后稱為″CDC活性″)、ADCC活性[Cancer Immunol.Immunother.，36，373(1993)]等來評(píng)價(jià)。
此外，抗體組合物在人中的安全性和療效可以通過使用相對(duì)接近于人的適當(dāng)動(dòng)物種屬模型如Macaca fascicularis來評(píng)價(jià)。
5.抗體組合物中糖鏈的分析 在各種細(xì)胞中表達(dá)的抗體分子的糖鏈結(jié)構(gòu)可以根據(jù)糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)的一般分析進(jìn)行分析。例如，結(jié)合于IgG分子的糖鏈包括中性糖鏈例如半乳糖，甘露糖或巖藻糖，氨基糖例如N-乙酰氨基葡萄糖，酸性糖例如唾液酸，可以通過例如使用糖組合物分析糖鏈結(jié)構(gòu)，二維糖鏈圖譜等方法分析。
(1)中性糖和氨基糖成分的分析 抗體組合物的糖鏈可以通過把糖鏈用酸例如三氟乙酸酸解，釋放出中性糖和氨基糖，測(cè)定組合物比率來分析。
例子包括使用由Dionex生產(chǎn)的糖組合物分析儀(BioLC)的方法。BioLC是一種用HPAEC-PAD(高效陰離子交換色譜法脈沖電流測(cè)定)[J Liq.Chromatogr.(液相色譜雜志)，6，1577(1983)]分析糖組合物的儀器。
組合物的比率也可以用使用2-氨基吡啶的熒光標(biāo)記法分析。具體的，把酸解過的樣品用2-氨基吡啶化的熒光標(biāo)記，然后HPLC分析組合物，組合物的比率可以根據(jù)已知方法[Agric.Biol Chem.(農(nóng)業(yè)生物化學(xué))，55(1)，283-284(1991)]計(jì)算， (2)糖鏈結(jié)構(gòu)的分析 抗體分子的糖鏈結(jié)構(gòu)可以用二維糖鏈圖譜法分析[Anal Biochem.(農(nóng)業(yè)生物化學(xué))，171，73(1988)，Biochemical Experimentation Methods23-Methods for.Studying Glycoprotein Sugar Chains(生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法23-研究糖蛋白糖鏈的方法)(Japan Scientific Societies Press(日本科學(xué)學(xué)會(huì)出版))由Reiko Takahashi編輯(1989)]。二維糖鏈圖譜法是通過，例如，分別用反相色譜法得到的糖鏈的滯留時(shí)間或洗脫位置作為X軸，正相色譜法得到的糖鏈的滯留時(shí)間或洗脫位置作為y軸，把它們與已知糖鏈的結(jié)果相比較，從而推導(dǎo)糖鏈結(jié)構(gòu)的方法。
具體的，把抗體肼解，糖鏈從抗體釋放出來，釋放的糖鏈用2-氨基吡啶(以下稱為“PA”)熒光標(biāo)記[J.Biocbcni.，95，197(1984)]，然后糖鏈通過凝膠過濾，和反相色譜，從過量PA-處理試劑中分離出來。然后，分離的糖鏈的每個(gè)峰經(jīng)正相色譜法分離。通過把得到的結(jié)果標(biāo)繪在二維糖鏈圖譜上，把它們與糖鏈標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)(由Takara Slluzo繪制)或文獻(xiàn)[AnalBiochem.，171，73(1988)]比較推導(dǎo)出糖鏈結(jié)構(gòu)。
通過二維糖鏈圖譜方法推導(dǎo)出的結(jié)構(gòu)可以進(jìn)一步用質(zhì)譜法，例如每個(gè)糖鏈的MALDI-TOF-MS確證。
6.本發(fā)明中獲得的抗體組合物的應(yīng)用 本發(fā)明中獲得的抗體組合物具有高ADCC活性。具有高ADCC活性的抗體可用于預(yù)防和治療各種疾病，包括癌癥、炎癥性疾病、免疫疾病如自體免疫疾病、變態(tài)反應(yīng)等，心血管疾病和各種由如病毒和感染引起的疾病。
在癌癥即惡性腫瘤情況下，癌癥細(xì)胞增長(zhǎng)。一般的抗腫瘤藥抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。相反，具有高ADCC活性的抗體可經(jīng)其細(xì)胞殺傷作用損害癌細(xì)胞而治療癌癥，因此是比一般的抗腫瘤藥更有效的治療劑。目前，在癌癥治療藥中，抗體藥物單獨(dú)的抗腫瘤效果是不夠的，因此已進(jìn)行與化療的聯(lián)合治療[Science(科學(xué))，280，1197(1998)]。如果發(fā)現(xiàn)單獨(dú)用本發(fā)明的抗體組合物有較高的抗腫瘤效果，那么對(duì)化療的依賴性將下降，副作用將減少。
在免疫疾病如炎癥性疾病、自體免疫疾病和變態(tài)反應(yīng)中，疾病的體內(nèi)反應(yīng)是由免疫細(xì)胞釋放的介質(zhì)分子引起的，因此可以通過采用具有高ADCC活性的抗體清除免疫細(xì)胞來抑制變態(tài)反應(yīng)。
心血管疾病包括動(dòng)脈硬化等。目前，動(dòng)脈硬化采用氣囊導(dǎo)管治療，但采用具有高ADCC活性的抗體可以通過抑制氣囊導(dǎo)管治療后再狹窄中的動(dòng)脈細(xì)胞生長(zhǎng)來預(yù)防和治療心血管疾病。
通過采用具有高ADCC活性的抗體抑制被病毒或細(xì)菌感染的細(xì)胞的增殖可以預(yù)防和治療包括病毒和細(xì)菌感染的各種疾病。
識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原的抗體、識(shí)別變態(tài)反應(yīng)或炎癥相關(guān)抗原的抗體、識(shí)別心血管疾病相關(guān)抗原的抗體，和識(shí)別病毒或細(xì)菌感染相關(guān)抗原的抗體在下面舉例說明。
識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原的抗體包括抗GD2抗體[Anticancer Res.(抗癌研究)，13，331-336(1993)]、抗GD3抗體[Cancer Immunol.Immunother.，36，260-266(1993)]、抗GM2抗體[Cancer Res.(癌癥研究)，54，1511-1516(1994)]、抗HER2抗體[Proc.Natl.Acad Sci.USA，89，4285-4289(1992)]、抗CD52抗體[Proc.Natl.Acad.Sci.(美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào))USA，89，4285-4289(1992)]、抗MAGE抗體[British J.Cancer(癌癥)，83，493-497(2000)]、抗HM1.24抗體[Molecular Immunol.(分子免疫學(xué))，36，387-395(1999)]、抗甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(PTHrP)抗體[Cancer(癌癥)，88，2909-2911(2000)]、抗FGF8抗體(Proc.Natl.Acad.Sci.(美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào))USA，86，9911-9915(1989)、抗堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子抗體和抗FGF8受體抗體(J.Biol.Chem，265，16455-16463(1990))、抗堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體抗體和抗胰島素樣生長(zhǎng)因子抗體[J.Neurosci.Res.，40，647-659(1995)]、抗胰島素樣生長(zhǎng)因子受體抗體[J.Neurosci.Res.，40，647-659(1995)]、抗PMSA抗體[J.Urology(泌尿?qū)W研究)，160，2396-2401(1998)]、抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子抗體[Cancer Res.(癌癥研究)，57，4593-4599(1997)]、抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體抗體[OncoGene，19，2138-2146(2000)]、抗CA125抗體、抗17-1A抗體、抗整合素av β3抗體、抗CD33抗體、抗CD22抗體、抗HLA抗體、抗HLA-DR抗體、抗CD20抗體、抗CD19抗體、抗EGF受體抗體(Immunology Today(今日免疫學(xué))，21(8)，403-410(2000))、抗CD10抗體[American Journal of Clinical Pathology(美國(guó)臨床病理雜志)，113，374-382(2000)]，等。
識(shí)別變態(tài)反應(yīng)或炎癥相關(guān)抗原的抗體包括抗白介素6抗體[Immunol.Rev.(免疫學(xué)研究)，127，5-24(1992)]、抗白介素6受體抗體[Molecular Immunol.(分子免疫學(xué))，31，371-381(1994)]、抗白介素5抗體[Immunol.Rev(免疫學(xué)研究).，127，5-24(1992)]、抗白介素5受體抗體和抗白介素4抗體[Cytokine(細(xì)胞因子)，3，562-567(1991)]、抗白介素4受體抗體[J.Immunol.(免疫學(xué)雜志)Meth.，217，41-50(1998)]、抗腫瘤壞死因子抗體[Hybridoma，13，183-190(1994)]、抗腫瘤壞死因子受體抗體[Molecular Pharmacol，58，237-245(2000)]、抗CCR4抗體[Nature(自然)，400，776-780(1999)]、抗細(xì)胞因子抗體[J.Immuno.Meth，174，249-257(1994)]、抗細(xì)胞因子受體抗體[J.Exp.Med.(實(shí)驗(yàn)方法雜志)，186，1373-1381(1997)]、抗IgE抗體、抗CD23抗體、抗CD11a抗體[Immunology Today(今日免疫學(xué))，21(8).，403-410(2000)]、抗CRTH2抗體(J Immunol.，162，1278-1286(1999))、抗CCR8抗體(WO99/25734)、抗CCR3抗體(US6207155)，等。
識(shí)別心血管病相關(guān)抗原的抗體包括抗GpIIb/IIIa抗體[J.Immunol.，152.2968-2976(1994)]、抗血小板衍生的生長(zhǎng)因子抗體[Science(科學(xué))，253，1129-1132(1991)]、抗血小板衍生的生長(zhǎng)因子受體抗體[J.Biol.Chem.(生物化學(xué)雜志)，272，17400-17404(1997)]和抗凝血因子抗體[Circulation(循環(huán))，101，1158-1164(2000)]，等。
識(shí)別自體免疫疾病相關(guān)抗原的抗體包括抗自體-DNA抗體[Immunol.Letters，72，61-68(2000)]，等。
識(shí)別病毒或細(xì)菌感染相關(guān)抗原的抗體包括抗gp120抗體[Structure(結(jié)構(gòu))，8，385-395(2000)]、抗CD4抗體[J.Rheumatology(風(fēng)濕病學(xué)雜志)，25，2065-2076(1998)]、抗CCR4抗體、抗Vero毒素抗體[J.Clin.Microbiol，37，396-399(1999)]、抗自體免疫疾病(牛皮癬、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腦脊髓多發(fā)性硬化，等)抗體、抗CD11a抗體、抗ICAM3抗體、抗CD80抗體、抗CD2抗體、抗CD3抗體、抗CD4抗體、抗整合素α4β7抗體、抗GD40L抗體、抗IL-2抗體[Immunology Today(今日免疫學(xué))，21(8)，403-410(2000)]，等。
這些抗體可從公共組織獲得，如ATCC(The American Type CultureCollection)、The Institute of Physical and Chemical Research的RIKEN基因庫(kù)，和National Institute of BioScience and Human Technology，Agency of Industrial Science and Technology，或獲取自所有的試劑銷售公司如Dainippon Pharmaceutical，R & D SYSTEMS，PharMingen，Cosmo Bio和Funakoshi。
本發(fā)明的抗體組合物可以作為單獨(dú)的治療試劑給藥。通常，優(yōu)選的是抗體組合物與至少一種藥學(xué)可接受的載體混合，把它作為藥學(xué)配方，用制備藥學(xué)的技術(shù)領(lǐng)域中已知的合適方法制備。
優(yōu)選的是選擇治療中最有效的給藥途徑。例子包括口服、非腸道給藥，例如口腔的、氣管的、直腸的、皮下的、肌肉的、靜脈內(nèi)的施用。在抗體制備中，靜脈內(nèi)施用是優(yōu)選的。
劑形包括噴霧、膠囊、片劑、顆粒、糖漿、乳劑、栓劑、注射劑、軟膏劑、粘膏劑等。
合適于口服的藥學(xué)制劑的例子包括乳劑、糖漿、膠囊、片劑、粉末、顆粒等等。
液體制劑，例如乳劑和糖漿，可以用如添加劑、水；糖例如蔗糖、山梨醇和果糖；二元醇例如聚乙二醇和丙二醇；油例如芝麻油、橄欖油和豆油；防腐劑例如p-對(duì)羥基苯甲酸酯；香料例如草莓香料和薄荷等制備。
膠、片劑、粉末、顆粒等可以用添加劑，賦形劑例如乳糖、葡萄糖、蔗糖和甘露醇；分解劑例如淀粉和精氨酸鈉；潤(rùn)滑劑例如硬脂酸鎂和滑石；粘合劑例如聚乙烯醇、羥丙纖維素和明膠，表面活性劑例如脂肪酸酯，可塑劑例如丙三醇制備。
適合非腸道給藥的藥學(xué)制劑包括注射劑、栓劑、噴霧劑等等。
注射劑可以使用載體例如鹽溶液、葡萄糖溶液或它們的混合物等等。粉末注射劑可以用常規(guī)方法制備的冷凍干燥的抗體組合物，往其中加入氯化鈉制備。
栓劑可以使用載體，例如可可脂、氫化脂或羧酸制備。
噴霧也可以使用這樣的抗體組合物或使用不刺激患者口腔或氣管粘膜，并且通過把它分散成細(xì)顆粒而促進(jìn)抗體組合物吸收的載體制備。
載體包括乳糖、甘油等。根據(jù)抗體組合物和載體的性質(zhì)，可以制備藥學(xué)制劑例如噴霧劑和干粉。另外，作為口服制劑的添加劑例子的成分也可以添加到非腸道的制劑中。
雖然臨床劑量或施用頻率根據(jù)目的治療效果、施用方法、治療周期、年齡、體重等等不同，但是一般是10微克/千克到20微克/千克/天/人。
而且，作為檢驗(yàn)抗體組合物對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤作用的方法，體外檢驗(yàn)包括CDC活性檢測(cè)方法、ADCC活性檢測(cè)方法等；體內(nèi)檢驗(yàn)包括在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物例如小鼠中使用腫瘤系統(tǒng)的抗腫瘤實(shí)驗(yàn)等。
CDC活性和ADCC活性測(cè)定和抗腫瘤實(shí)驗(yàn)可以根據(jù)cancerImmunology Immunotherapy，36，373(1993)；Cancer Research，54，1511(1944)等中描述的方法進(jìn)行。
本發(fā)明將根據(jù)實(shí)驗(yàn)例詳細(xì)描述如下；然而，實(shí)驗(yàn)僅僅是本發(fā)明的簡(jiǎn)單說明，本發(fā)明的范圍不受此限制。
附圖簡(jiǎn)要說明


圖1顯示由大鼠骨髓瘤YB2/0細(xì)胞衍生的克隆KM2760#58-35-16和克隆1-15產(chǎn)生的抗CCR4嵌合抗體對(duì)CCR4/EL-4細(xì)胞的ADCC活性?？v坐標(biāo)和橫坐標(biāo)分別顯示細(xì)胞毒活性和抗體濃度，″n″和″A″分別表示由克隆KM2760#58-35-16產(chǎn)生的抗CCR4嵌合抗體KM2760-1的活性和由克隆1-15產(chǎn)生的抗CCR4嵌合抗體KM2760-2的活性。
圖2顯示從導(dǎo)入mfFUTS-6和pAGE249的克隆產(chǎn)生的抗體中制備的PA處理糖鏈的洗脫方式，通過其反相HPLC分析獲得。圖2A和圖2B分別顯示從導(dǎo)入mfFUT8-6的克隆產(chǎn)生的抗體中制備的PA處理糖鏈的洗脫方式，和從導(dǎo)入pAGE249的克隆產(chǎn)生的抗體中制備的PA處理糖鏈的洗脫方式?？v坐標(biāo)和橫坐標(biāo)分別顯示相對(duì)熒光強(qiáng)度和洗脫時(shí)間。
圖3顯示采用RT-PCR在每個(gè)宿主克隆中測(cè)定的FUT8和β-肌動(dòng)蛋白轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物水平的照片。用能夠產(chǎn)生KM2760-1的克隆KM2760#58-35-16、能夠產(chǎn)生KM2760-2的克隆1-15和親代大鼠骨髓瘤YB2/0細(xì)胞制備的cDNAs作為模板，用FUT8特異的引物對(duì)(SEQ IDNO13和14)或β-肌動(dòng)蛋白特異的引物對(duì)(SEQ ID NOs11和12)進(jìn)行PCR，并通過對(duì)反應(yīng)溶液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳給出所得的結(jié)果。
圖4顯示質(zhì)粒ploxPPuro的構(gòu)造。
圖5顯示質(zhì)粒pKOFUT8gE2-1的構(gòu)造。
圖6顯示質(zhì)粒pKOFUT8gE2-2的構(gòu)造。
圖7顯示質(zhì)粒pscFUT8gE2-3的構(gòu)造。
圖8顯示質(zhì)粒pKOFUT8gE2-3的構(gòu)造。
圖9顯示質(zhì)粒pKOFUT8gE2-4的構(gòu)造。

圖10顯示質(zhì)粒pKOFUT8gE2-5的構(gòu)造。

圖11顯示質(zhì)粒pKOFUT8Puro的構(gòu)造。

圖12顯示作為α1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因斷裂的CHO克隆的克隆IstΔFUT8 2-46-1和克隆2-46-H10的基因組Southern分析照片。

圖13顯示作為α1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因斷裂的CHO克隆的克隆IstΔFUT8 2-46和克隆IstΔFUT8 2-46-H10的基因組Southern分析照片。

圖14顯示純化自FUT8等位基因斷裂克隆的抗CCR4嵌合抗體的ADCC活性?？v坐標(biāo)和橫坐標(biāo)分別顯示細(xì)胞毒活性和抗體濃度?！濉搴汀濉觥宸謩e表示從產(chǎn)生抗CCR4嵌合抗體的CHO細(xì)胞克隆5-03衍生的純化抗體的活性和從克隆Ist.FUT8 2-46-1衍生的純化抗體的活性。

圖15顯示質(zhì)粒Pkofut8Neo的構(gòu)造。

圖16顯示克隆基因組Southern分析照片，克隆中CHO/DG44細(xì)胞FUT8等位基因的拷貝之一是斷裂的。

圖17顯示克隆基因組Southern分析照片，克隆中CHO/DG44細(xì)胞的兩個(gè)PUTS等位基因都是斷裂的。

圖18顯示克隆基因組Southern分析照片，克隆中耐藥基因從CHO/DG44細(xì)胞的兩個(gè)PUTS等位基因中去除。

圖19顯示質(zhì)粒pBS-2B8L的構(gòu)造。
圖20顯示質(zhì)粒pBS-2B8H和質(zhì)粒pBS-28B8Hm的構(gòu)造。
圖21顯示質(zhì)粒pKANTEX2B8P的構(gòu)造。
圖22顯示從FUT8基因雙敲除的CHP/DG44克隆中純化的抗CD20嵌合抗體對(duì)人B淋巴細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞系Raji細(xì)胞的ADCC活性?？v坐標(biāo)和橫坐標(biāo)分別顯示細(xì)胞毒活性和抗體濃度。
圖23顯示質(zhì)粒CHfFUT8-pCR2.1的構(gòu)造。
本發(fā)明的實(shí)施方式 實(shí)施例1 產(chǎn)生穩(wěn)定生產(chǎn)抗CCR4嵌合抗體的細(xì)胞 采用WO 01/64754中描述的抗CCR4嵌合抗體的串聯(lián)式表達(dá)載體pKANTEX2160以如下方式制備，能夠穩(wěn)定生產(chǎn)抗CCR4嵌合抗體的細(xì)胞。
(1)用大鼠骨髓瘤YB2/0細(xì)胞制備生產(chǎn)抗體的細(xì)胞 通過電穿孔將10μg抗CCR4嵌合抗體表達(dá)載體pKANTEX2160導(dǎo)入4×106大鼠骨髓瘤YB2/0細(xì)胞(ATCC CRL 1662)[Cytotechnology(電穿孔)，3，133(1990)]后，將細(xì)胞懸浮在40mlHybridoma-SFM-FBS(5)[Hybridoma-SFM培養(yǎng)基(由Invitrogen生產(chǎn))添加了5％FBS(由PAA Laboratories生產(chǎn))]中，并以200μl/孔分配進(jìn)96孔培養(yǎng)板(由Sumitomo Bakelite生產(chǎn))。在5％CO2孵箱中37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，添加G418至1mg/ml濃度，隨后培養(yǎng)1至2周。通過集落形成觀察到顯示G418耐受的轉(zhuǎn)化株生長(zhǎng)，從該孔中回收培養(yǎng)上清物，通過實(shí)施例2的(2)項(xiàng)中描述的ELISA測(cè)定上清物中抗CCR4嵌合抗體的抗原結(jié)合活性。
對(duì)于培養(yǎng)上清物中觀察到產(chǎn)生抗CCR4嵌合抗體的孔中的轉(zhuǎn)化株，為了增加用DHFR基因擴(kuò)增系統(tǒng)生產(chǎn)抗體的量，將它們每一個(gè)懸浮在添加了1mg/ml G418和50nM DHFR抑制劑MTX(由SIGMA生產(chǎn))的Hybridoma-SFM-FBS(5)培養(yǎng)基中以得到1-2×105細(xì)胞/ml的密度，該懸浮液以1ml分配進(jìn)24孔平板(由Greiner生產(chǎn))的孔中。在5％CO2孵箱中37℃培養(yǎng)1至2周后，誘導(dǎo)了顯示50nM MTX耐受的轉(zhuǎn)化株。觀察到轉(zhuǎn)化株生長(zhǎng)的孔中培養(yǎng)上清物內(nèi)抗CCR4嵌合抗體的抗原結(jié)合活性通過實(shí)施例2的(2)項(xiàng)中描述的ELISA測(cè)定。
對(duì)于培養(yǎng)上清物中觀察到產(chǎn)生抗CCR4嵌合抗體的孔中的轉(zhuǎn)化株，通過相同的方法提高M(jìn)TX濃度，最終獲得能夠在添加了200nM MTX的Hybridoma-SFM-FBS(5)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并能夠高度生產(chǎn)抗CCR4嵌合抗體的轉(zhuǎn)化株。將獲得的轉(zhuǎn)化株通過限制稀釋兩次制成單細(xì)胞(克隆)，且將獲得的克隆稱為克隆KM2760#58-35-16。在此情況下，采用WO00/61739中描述的α1，6-墨角藻糖基轉(zhuǎn)移酶(此后稱為″FUT8″)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的測(cè)定方法，選擇生產(chǎn)相對(duì)小量轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的克隆，并被用作適當(dāng)?shù)目寺　?br> (2)用CHO/DG44細(xì)胞制備生產(chǎn)抗體的細(xì)胞 通過電穿孔將4μg抗CCR4嵌合抗體表達(dá)載體pKANTEX2160導(dǎo)入1.6×106CHO/DG44細(xì)胞[Cytotechnology(電穿孔)，3，133(1990)]后，將細(xì)胞懸浮在10ml IMDM-dFBS(10)-HT(1)[IMDM培養(yǎng)基(由Invitrogen生產(chǎn))添加了10％dFBS(由Invitrogen生產(chǎn))和1×濃度的HT添加物(由Invitrogen生產(chǎn))]中，并以100μl/孔分配進(jìn)96孔培養(yǎng)板(由Iwaki Glass生產(chǎn))。在5％CO2孵箱中37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，培養(yǎng)基改變?yōu)镮MDM-dFBS(10)(添加10％透析FBS的IMDM培養(yǎng)基)，隨后培養(yǎng)1至2周。從觀察到形成了顯示不依賴HT的轉(zhuǎn)化株生長(zhǎng)的孔中回收培養(yǎng)上清物，通過實(shí)施例2的(2)項(xiàng)中描述的ELISA測(cè)定上清物中抗CCR4嵌合抗體產(chǎn)生的量。
對(duì)于培養(yǎng)上清物中觀察到產(chǎn)生抗CCR4嵌合抗體的孔中的轉(zhuǎn)化株，為了增加用DHFR基因擴(kuò)增系統(tǒng)生產(chǎn)抗體的量，將它們每一個(gè)懸浮在添加了50nM MTX的IMDM-dFBS(10)培養(yǎng)基中以得到1-2×105細(xì)胞/ml的密度，該懸浮液以0.5ml分配進(jìn)24孔平板(由Iwaki Glass生產(chǎn))的孔中。在5％CO2孵箱中37℃培養(yǎng)1至2周后，誘導(dǎo)了顯示50nM MTX耐受的轉(zhuǎn)化株。對(duì)于觀察到生長(zhǎng)的孔中的轉(zhuǎn)化株，MTX濃度通過相同的方法提高到200nM，最終獲得能夠在添加了200nM MTX的IMDM-dFBS(10)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并能夠大量生產(chǎn)抗CCR4嵌合抗體的轉(zhuǎn)化體。獲得的轉(zhuǎn)化株被叫做克隆5-03。
實(shí)施例2 FUT8基因表達(dá)減少的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞產(chǎn)生的抗體組合物與其親代細(xì)胞產(chǎn)生的抗體組合物的比較 比較基因組被修飾的細(xì)胞產(chǎn)生的抗體組合物和其親代細(xì)胞產(chǎn)生的抗體組合物間的ADCC活性，所述修飾降低了α1，6-巖藻糖修飾酶的活性。
(1)制備抗體組合物 作為基因組被修飾的產(chǎn)抗體細(xì)胞產(chǎn)生的抗體組合物，所述修飾降低了α1，6-巖藻糖修飾酶的活性，使用從KM2760#58-35-16培養(yǎng)上清物中純化的抗體組合物KM2760-1，其中FUT8基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在實(shí)施例1的(1)項(xiàng)中進(jìn)行描述。
由親代大鼠骨髓瘤細(xì)胞YB2/0細(xì)胞(ATCC CRL1662)產(chǎn)生的抗體組合物制備如下。
通過電穿孔將10μg抗CCR4嵌合抗體表達(dá)載體pKANTEX2160(描述于WO 01/64754中)導(dǎo)入4×106大鼠骨髓瘤YB2/0細(xì)胞(ATCC CRL1662)[Cytotechnology(電穿孔)，3，133(1990)]后，將細(xì)胞懸浮在40mlHybridoma-SFM-FBS(5)[Hybridoma-SFM培養(yǎng)基(由Invitrogen生產(chǎn))添加了5％FBS(由PAA Laboratories生產(chǎn))]中，并以200μl/孔分配進(jìn)96孔培養(yǎng)板(由Sumitomo Bakelite生產(chǎn))。在5％CO2孵箱中37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，添加G418至濃度為1mg/ml，隨后培養(yǎng)1至2周。通過集落形成觀察到顯示G418耐受的轉(zhuǎn)化株生長(zhǎng)，從該孔中回收培養(yǎng)上清物，通過本實(shí)施例(2)項(xiàng)中描述的ELISA測(cè)定上清物中抗CCR4嵌合抗體的抗原結(jié)合活性。
對(duì)于培養(yǎng)上清物中觀察到產(chǎn)生抗CCR4嵌合抗體的孔中的轉(zhuǎn)化株，為了增加用DHFR基因擴(kuò)增系統(tǒng)生產(chǎn)抗體的量，將它們每一個(gè)懸浮在添加了1mg/ml G418和50nM DHFR抑制劑MTX(由SIGMA生產(chǎn))的Hybridoma-SFM-FBS(5)培養(yǎng)基中以得到1-2×105細(xì)胞/ml密度，該懸浮液以1ml分配進(jìn)24孔平板(由Greiner生產(chǎn))的孔中。在5％CO2孵箱中37℃培養(yǎng)1至2周后，誘導(dǎo)了具有50nM MTX耐受的轉(zhuǎn)化株。觀察到轉(zhuǎn)化株生長(zhǎng)的孔中培養(yǎng)上清物內(nèi)抗CCR4嵌合抗體的抗原結(jié)合活性通過本實(shí)施例(2)項(xiàng)中描述的ELISA測(cè)定。
對(duì)于培養(yǎng)上清物中觀察到產(chǎn)生抗CCR4嵌合抗體的孔中的轉(zhuǎn)化株，通過相同的方法提高M(jìn)TX濃度，最終獲得能夠在添加了200nM MTX的Hybridoma-SFM-FBS(5)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并能夠大量生產(chǎn)抗CCR4嵌合抗體的轉(zhuǎn)化株。將獲得的克隆叫做克隆1-15。克隆1-15不通過限制稀釋轉(zhuǎn)變成單細(xì)胞(克隆)。
由轉(zhuǎn)化株克隆1-15產(chǎn)生的抗CCR4嵌合抗體如下純化。
將表達(dá)抗CCR4嵌合抗體的轉(zhuǎn)化株克隆1-15懸浮在添加了200nMMTX和5％Daigo′s GF21(由Wako Pure Chemical Industries生產(chǎn))的Hybridoma-SFM(由Invitrogen生產(chǎn))培養(yǎng)基中以得到2×105細(xì)胞/ml密度，并采用旋轉(zhuǎn)瓶(Iwaki Glass生產(chǎn))在37℃的恒溫倉(cāng)內(nèi)進(jìn)行fed-batch振搖培養(yǎng)。培養(yǎng)8至10天后，用Prosep-A(由Millipore生產(chǎn))柱和凝膠過濾從回收的培養(yǎng)上清物中純化抗CCR4嵌合抗體。純化的抗CCR4嵌合抗體叫做克隆KM2760-2。
(2)抗體組合物的抗體結(jié)合活性 此實(shí)施例(1)項(xiàng)中獲得的兩種抗體組合物的抗體結(jié)合活性通過下面顯示的ELISA檢測(cè)。
選擇化合物1(SEQ ID NO6)作為能夠與抗CCR4嵌合抗體反應(yīng)的人CCR4細(xì)胞外區(qū)域肽。為了在ELISA活性檢測(cè)中使用它，通過以下方法制備與BSA(牛血清白蛋白)(由Nacalai Tesque生產(chǎn))的共扼物并用作抗原。即，含25mg/ml SMCC[4-(N-馬來酰亞胺甲基)-環(huán)己烷-1-甲酸N-羥琥珀酰亞胺酯](由Sigma生產(chǎn))的DMSO溶液100ml在用旋渦器攪拌的情況下逐滴加入900ml含10mg BSA的PBS溶液中，隨后輕輕攪拌30分鐘。在凝膠過濾柱如用25ml PBS平衡的NAP-10柱上，加入1ml反應(yīng)溶液，然后用1.5ml PBS洗脫，將得到的洗出液用作BSA-SMCC溶液(通過280nM處的吸光率計(jì)算BSA濃度)。接著，將250ml PBS加入0.5mg化合物1中，然后通過添加250ml DMF將其完全溶解，在渦旋狀態(tài)下加入BSA-SMCC溶液，隨后輕輕攪拌3小時(shí)。反應(yīng)溶液在4℃下用PBS透析過夜，向其中加入疊氮鈉至終濃度為0.05％，混合物經(jīng)0.22mm濾器過濾，以用作BSA-化合物1溶液。
制備的共扼物以0.05μg/ml和50μl/孔分配進(jìn)96孔EIA板(由Greiner生產(chǎn))，并在4℃過夜孵育以貼附。用PBS沖洗每個(gè)孔后，以100μl/孔向其中加入1％BSA-PBS，令其在室溫下反應(yīng)以阻斷殘余的活性基團(tuán)。用含0.05％Tween20的PBS(此后稱作″Tween-PBS″)沖洗每個(gè)孔后，以50μl/孔添加轉(zhuǎn)化株的培養(yǎng)上清物，并在室溫反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)后，用Tween-PBS沖洗每個(gè)孔，然后，以50μl/孔添加用1％BSA-PBS稀釋6000倍的過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗人IgG(γ)抗體溶液(American Qualex生產(chǎn))作為二抗，并室溫反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)并隨后用Tween-PBS沖洗后，以50μl/孔添加ABTS底物溶液顯色，此后20分鐘，通過以50μl/孔添加5％SDS溶液終止反應(yīng)。其后，測(cè)量415nm處的吸光率。
上述ELISA測(cè)量的結(jié)果是，純化的KM2760-1和KM2760-2在與CCR4部分肽的結(jié)合活性上是相似的。
(3)純化的KM2760-1和2760-2的ADCC活性。
純化的KM2760-1和2760-2的ADCC活性檢測(cè)如下。
抗CCR4嵌合抗體對(duì)高度表達(dá)人CCR4的CCR4/EL-4細(xì)胞(WO01/64754)的ADCC活性。
(a)制備靶細(xì)胞懸浮液 制備1.5×106 WO 01/64754描述的表達(dá)人CCR4的CCR4/EL-4細(xì)胞后，相當(dāng)于5.55MBq當(dāng)量的放射活性物質(zhì)Na251CrO4加入其中，隨后在37℃反應(yīng)1.5小時(shí)因而用放射性同位素標(biāo)記細(xì)胞。反應(yīng)后，通過懸浮在培養(yǎng)基中再離心，沖洗細(xì)胞3次，重新懸浮在培養(yǎng)基中然后在冰上4℃孵育30分鐘以自發(fā)分解放射活性物質(zhì)。離心后，通過加入15ml培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞到2×105細(xì)胞/ml密度，并用作靶細(xì)胞懸浮液。
(b)制備人效應(yīng)細(xì)胞懸浮液 從健康供體采集60ml外周血，其中加入0.6ml肝素鈉(由ShimizuPharmaceutical生產(chǎn))，隨后輕輕混合。采用Lymphoprep(由AXIS SHIELD生產(chǎn))按照廠家使用說明書離心混合物(800g，20分鐘)以分離單核細(xì)胞層。通過用培養(yǎng)基離心(1,400rpm，5分鐘)3次沖洗細(xì)胞，然后重懸浮在培養(yǎng)基中至5×106細(xì)胞/ml密度并被用作人效應(yīng)細(xì)胞懸浮液。
(c)檢測(cè)ADCC活性 在96孔U-形底平板(由Falcon生產(chǎn))的每個(gè)孔中分發(fā)50μl(1×104細(xì)胞/孔)(1)項(xiàng)中制備的靶細(xì)胞懸浮液。然后，添加(2)項(xiàng)中制備的人效應(yīng)細(xì)胞懸浮液100μl(5×105細(xì)胞/孔，效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞比例成為50∶1)。此外，加每種抗CCR4嵌合抗體至終濃度為0.0001到10μg/ml，隨后37℃反應(yīng)4小時(shí)。反應(yīng)后，離心平板并用γ-計(jì)數(shù)器檢測(cè)上清物中的51Cr的量。通過進(jìn)行相同的步驟，采用沒有人效應(yīng)細(xì)胞懸浮液和抗體溶液的單獨(dú)培養(yǎng)基并測(cè)量上清物中51Cr的量，計(jì)算自發(fā)解離的51Cr量。通過進(jìn)行相同的步驟，采用1mol/L鹽酸溶液而非抗體溶液和人效應(yīng)細(xì)胞懸浮液并測(cè)量上清物中51Cr的量，計(jì)算總解離的51Cr量。根據(jù)方程式(I)計(jì)算ADCC活性(％)。

根據(jù)以上方法測(cè)量的結(jié)果，KM2760-1和KM2760-2的活性顯著不同，KM2760-2的活性顯著低于KM2760-1(
圖1)。
(4)抗體組合物的糖鏈分析 KM2760-1和KM2760-2的糖鏈分析如下。
KM2760-1和KM2760-2均接受肼解作用以從蛋白上裂解糖鏈[Method of Enzymology，83，263(1982)]。在通過減壓條件下的蒸發(fā)作用去除肼后，添加醋酸銨水溶液和醋酸酐進(jìn)行N-乙?；饔?。凍干后，進(jìn)行2-氨基嘧啶熒光標(biāo)記[J.Biochem.(生物化學(xué)雜質(zhì))，95，197(1984)]。用Superdex Peptide HR 10/30柱(由Pharmacia生產(chǎn))從多余的試劑中分離熒光標(biāo)記的糖鏈基團(tuán)(PA-處理的糖鏈基團(tuán))。用離心濃縮器干燥糖鏈餾分并被用作純化的PA-處理的糖鏈基團(tuán)。接著，純化的PA-處理的糖鏈基團(tuán)用CLC-ODS柱(Shimadzu生產(chǎn))接受反相HPLC分析(圖2)。
用磷酸鈉緩沖液(pH 3.8)作為緩沖液A，磷酸鈉緩沖液(pH3.8)+0.5％1-丁醇作為緩沖液B，按如下梯度進(jìn)行分析。
圖2中顯示的峰(1)至(8)具有以下結(jié)構(gòu)。


GlcNAc、Gal、Man、Fuc和PA分別表示N-乙酰氨基葡萄糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖和吡啶基氨基。
圖2中，無α1，6-巖藻糖的糖鏈基團(tuán)比例從峰(1)至(4)占峰(1)至(8)的面積計(jì)算，結(jié)合α1，6-巖藻糖的糖鏈基團(tuán)比例從計(jì)算峰(5)至(8)占峰(1)至(8)的面積計(jì)算。
KM2760-1無α1，6-巖藻糖的糖鏈的比例不同于KM2760-2。
(5)產(chǎn)抗體細(xì)胞α1，6-墨角藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)水平 圖3顯示根據(jù)實(shí)施例8的WO 00/61739描述的方法測(cè)量的，親代大鼠骨髓瘤YB2/0細(xì)胞、能夠產(chǎn)生KM2760-1的克隆KM2760#58-35-16和能夠產(chǎn)生KM2760-2的克隆1-15的α1，6-墨角藻糖基轉(zhuǎn)移酶和β-肌動(dòng)蛋白基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物測(cè)定水平的結(jié)果。克隆1-15產(chǎn)生α1，6-墨角藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因的量與親代大鼠骨髓瘤YB2/0細(xì)胞相似，但克隆KM2760#58-35-16產(chǎn)生的量明顯少于其它克隆。
基于上述結(jié)果證實(shí)，基因組被修飾的產(chǎn)抗體細(xì)胞可以比其親代細(xì)胞產(chǎn)生具有更高ADCC活性的抗體組合物，所述修飾使其α1，6-巖藻糖修飾酶活性比其親代細(xì)胞更低或刪除。
實(shí)施例3 制備FUT8基因刪除的CHO細(xì)胞并用該細(xì)胞產(chǎn)生抗體 制備CHO細(xì)胞，并評(píng)價(jià)該細(xì)胞產(chǎn)生的抗體的ADCC活性，所述CHO細(xì)胞中含CHO細(xì)胞FUT8基因外顯子2的基因組區(qū)域被刪除。
1.構(gòu)建中國(guó)倉(cāng)鼠FUT8基因外顯子2靶向載體質(zhì)粒pKOFUT8Puro (1)構(gòu)建質(zhì)粒ploxPPuro 質(zhì)粒ploxPPuro按以下步驟構(gòu)建(圖4)。
在35μl NE緩沖液4(由New England Biolabs生產(chǎn))中溶解1.0μgpKOSelectPuro(由Lexicon生產(chǎn))，向其中加入20單位限制性酶AscI(由New England Biolabs生產(chǎn))，隨后37℃消化2小時(shí)。消化后，溶液進(jìn)行0.8％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳以純化大約1.5Kb的含嘌呤霉素抗性基因表達(dá)單位的DNA片段。
另一方面，在日本公開的未審查專利申請(qǐng)No.314512/99中描述的質(zhì)粒ploxP 1.0μg溶解在35μl NE緩沖液4(由New England Biolabs生產(chǎn))中，向其中加入20單位限制性酶AscI(由New England Biolabs生產(chǎn))，隨后37℃消化2小時(shí)。消化后，溶液進(jìn)行0.8％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳以純化大約2.0Kb的DNA片段。
混合獲得的衍生自質(zhì)粒pKOSelectPuro的AscI-AscI片段(4.5μl，大約1.5Kb)、0.5μl衍生自質(zhì)粒ploxP的AscI-AscI片段(大約2.0Kb)和5.0μlLigation High(由Toyobo生產(chǎn))，隨后16℃結(jié)合30分鐘。通過使用反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α株，按照已知的方法從獲得的氨比西林抗性克隆中分離質(zhì)粒DNA。在此，質(zhì)粒被叫做ploxPPuro。
(2)構(gòu)建質(zhì)粒pKOFUT8gE2-1 采用參考實(shí)施例(2)中獲得的質(zhì)粒pFUT8fgE2-2，通過以下步驟構(gòu)建質(zhì)粒pKOFUT8gE2-1，質(zhì)粒pFUT8fgE2-2具有含中國(guó)倉(cāng)鼠FUT8外顯子2的基因組區(qū)域(圖5)。
在含100μg/ml BSA(New England Biolabs生產(chǎn))的35μl NE緩沖液1(New England Biolabs生產(chǎn))中溶解2.0μg質(zhì)粒pFUT8fgE2-2，向其中加入20單位限制性酶SacI(由New England Biolabs生產(chǎn))，隨后37℃消化2小時(shí)。通過乙醇沉淀從反應(yīng)溶液中回收DNA片段，并溶解在含100μg/ml BSA(New England Biolabs生產(chǎn))的35μl NE緩沖液2(NewEngland Biolabs生產(chǎn))中，向其中加入20單位限制性酶EcoRV(由NewEngland Biolabs生產(chǎn))，隨后37℃消化2小時(shí)。消化后，溶液進(jìn)行0.8％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳以純化大約1.5Kb的DNA片段。
分別地，1.0μg質(zhì)粒LITMUS28(New England Biolabs生產(chǎn))溶解在35μl含100μg/ml BSA(New England Biolabs生產(chǎn))的NE緩沖液1(New EnglandBiolabs生產(chǎn))中，向其中加入20單位限制性酶Sad(由New EnglandBiolabs生產(chǎn))，隨后37℃消化2小時(shí)。通過乙醇沉淀從反應(yīng)溶液中回收DNA片段，并溶解在含100μg/ml BSA(New England Biolabs生產(chǎn))的35μl NE緩沖液2(New England Biolabs生產(chǎn))中，向其中加入20單位限制性酶EcoKV(由New England Biolabs生產(chǎn))，隨后37℃消化2小時(shí)。消化后，溶液進(jìn)行0.8％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳以純化大約2.8Kb的DNA片段。
混合獲得的衍生自質(zhì)粒pFUT8fgE2-2的EcoRV-SacI片段(4.5μl，大約1.5Kb)、0.5μl衍生自質(zhì)粒LITMUS28的EcoKV-SacI片段(大約2.8Kb)和5.0μl Ligation High(由Toyobo生產(chǎn))，隨后16℃結(jié)合30分鐘。用反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α株，按照已知的方法從獲得的氨比西林抗性克隆中分離質(zhì)粒DNA。在此，質(zhì)粒被叫做pKOFUT8gE2-1。
(3)構(gòu)建質(zhì)粒pKOFUT8gE2-2 采用(2)項(xiàng)中獲得的質(zhì)粒pKOFUT8gE2-1，通過以下步驟構(gòu)建質(zhì)粒pKOFUT8gE2-2(圖6)。
在含100μg/ml BSA(New England Biolabs生產(chǎn))的30μl NE緩沖液2(New England Biolabs生產(chǎn))中溶解2.0μg質(zhì)粒pKOFUT8gE2-1，向其中加入20單位限制性酶EcoRV(由New England Biolabs生產(chǎn))，隨后37℃消化2小時(shí)。通過乙醇沉淀從反應(yīng)溶液中回收DNA片段，并溶解在含100μg/ml BSA(New England Biolabs生產(chǎn))的30μl NE緩沖液1(NewEngland Biolabs生產(chǎn))中，向其中加入20單位限制性酶KpnI(由NewEngland Biolabs生產(chǎn))，隨后37℃消化2小時(shí)。消化后，溶液進(jìn)行0.8％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳以純化大約1.5Kb的DNA片段。
分別地，1.0μg質(zhì)粒ploxPPuro溶解在30μl NE緩沖液4(New EnglandBiolabs生產(chǎn))中，向其中加入20單位限制性酶HpaI(由New EnglandBiolabs生產(chǎn))，隨后37℃消化2小時(shí)。通過乙醇沉淀從反應(yīng)溶液中回收DNA片段，并溶解在含100μg/ml BSA(New England Biolabs生產(chǎn))的30μl NE緩沖液1(New England Biolabs生產(chǎn))中，向其中加入20單位限制性酶KpnI(由New England Biolabs生產(chǎn))，隨后37℃消化2小時(shí)。消化后，溶液進(jìn)行0.8％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳以純化大約3.5Kb的DNA片段。
混合獲得的4.0μl衍生自質(zhì)粒pKOFUT8gE2-1的EcoKV-KpnI片段(大約1.5Kb)、1.0μl衍生自質(zhì)粒ploxPPuro的HpaI-KpnI片段(大約3.5Kb)和5.0μl Ligation High(由Toyobo生產(chǎn))后，混合物在16℃進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)30分鐘。用反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α株，按照已知的方法從獲得的氨比西林抗性克隆中分離質(zhì)粒DNA。在此，質(zhì)粒被叫做pKOFUT8gE2-2。
(4)構(gòu)建質(zhì)粒pscFUT8gE2-3 采用參考實(shí)施例(2)中獲得的質(zhì)粒pFUT8fgE2-4，通過以下步驟構(gòu)建質(zhì)粒pscFUT8gE2-3，質(zhì)粒pFUT8fgE2-4具有含中國(guó)倉(cāng)鼠FUT8外顯子2的基因組區(qū)域(圖7)。
在35μl NE緩沖液1(New England Biolabs生產(chǎn))中溶解2.0μg質(zhì)粒pFUT8fgE2-4，向其中加入20單位限制性酶HpaII(由New EnglandBiolabs生產(chǎn))，隨后37℃消化2小時(shí)。通過乙醇沉淀從反應(yīng)溶液中回收DNA片段，然后用Blunting High(Toyobo生產(chǎn))按照廠家使用說明書將DNA末端改變成鈍末端。通過苯/氯仿提取和乙醇沉淀回收DNA片段，并溶解在35μl NE緩沖液2(New England Biolabs生產(chǎn))中，向其中加入20單位限制性酶HindIII(由New England Biolabs生產(chǎn))，隨后37℃消化2小時(shí)。消化后，溶液進(jìn)行0.8％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳以純化大約3.5Kb的DNA片段。
分別地，1.0μg質(zhì)粒LITMUS39(New England Biolabs生產(chǎn))溶解在35μl NE緩沖液2(New England Biolabs生產(chǎn))中，溶液與20單位限制性酶EcoRV(New England Biolabs生產(chǎn))和20單位限制性酶HindIII(NewEngland Biolabs生產(chǎn))混合，并在37℃消化2小時(shí)。消化后，溶液進(jìn)行0.8％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳以純化大約2.8Kb的DNA片段。
混合獲得的衍生自質(zhì)粒pFUT8fgE2-4的HpaII-HindIII片段(4.0μl，大約3.5Kb)、1.0μl衍生自質(zhì)粒LITMUS39的EcoRV-HindIII片段(大約2.8Kb)和5.0μl Ligation High(由Toyobo生產(chǎn))，隨后16℃結(jié)合30分鐘。用反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α株，按照已知的方法從獲得的氨比西林抗性克隆中分離質(zhì)粒DNA。在此，質(zhì)粒被叫做pscFUT8gE2-3。
(5)構(gòu)建質(zhì)粒pKOFUT8gE2-3 采用參考實(shí)施例(2)中獲得的質(zhì)粒pFUT8fgE2-4，通過以下步驟構(gòu)建質(zhì)粒pKOFUT8gE2-3，質(zhì)粒pFUT8fgE2-4具有含中國(guó)倉(cāng)鼠FUT8外顯子2的基因組區(qū)域(圖8)。
在35μl EcoRI的NE緩沖液(New England Biolabs生產(chǎn))中溶解2.0μg質(zhì)粒pFUT8fgE2-4，向其中加入20單位限制性酶EcoRI(由New EnglandBiolabs生產(chǎn))和20單位限制性酶HindIII(New England Biolabs生產(chǎn))，隨后37℃消化2小時(shí)。消化后，溶液進(jìn)行0.8％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳以純化大約1.8Kb的DNA片段。
分別地，1.0μg質(zhì)粒pBluescript II KS(+)(Stratagene生產(chǎn))溶解在35μlEcoRI的NE緩沖液(New England Biolabs生產(chǎn))中，向其中加入20單位限制性酶EcoRI(New England Biolabs生產(chǎn))和20單位限制性酶HindIII(NewEngland Biolabs生產(chǎn))，隨后37℃消化2小時(shí)。消化后，溶液進(jìn)行0.8％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳以純化大約3.0Kb的DNA片段。
混合獲得的衍生自質(zhì)粒pFUT8fgE2-4的Hindlll-EcdRI片段(4.0μl，大約1.8Kb)、1.0μl衍生自質(zhì)粒pBluescript II KS(+)的HindIII-EcoRI片段(大約3.0Kb)和5.0μl Ligation High(由Toyobo生產(chǎn))，隨后16℃結(jié)合30分鐘。用反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α株，按照已知的方法從獲得的氨比西林抗性克隆中分離質(zhì)粒DNA。在此，質(zhì)粒被叫做pKOFUT8gE2-3。
(6)構(gòu)建質(zhì)粒pKOFUT8gE2-4 采用(4)項(xiàng)和(5)項(xiàng)中獲得的質(zhì)粒pscFUT8fgE2-3和pKOFUT8gE2-3，通過以下步驟構(gòu)建質(zhì)粒pKOFUT8gE2-4(圖9)。
在35μl含100μg/ml BSA(New England Biolabs生產(chǎn))的SalI NE緩沖液(New England Biolabs生產(chǎn))中溶解1.0μg質(zhì)粒pscFUT8gE2-3，向其中加入20單位限制性酶SalI(由New England Biolabs生產(chǎn))，隨后37℃消化2小時(shí)。通過乙醇沉淀從反應(yīng)溶液中回收DNA片段，并溶解在30μl含100μg/ml BSA(New England Biolabs生產(chǎn))的NE緩沖液2(New EnglandBiolabs生產(chǎn))中，向其中加入20單位限制性酶HindIII(由New EnglandBiolabs生產(chǎn))，隨后37℃消化2小時(shí)。消化后，溶液進(jìn)行0.8％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳以純化大約3.6Kb的DNA片段。
分別地，1.0μg質(zhì)粒pKOFUT8gE2-3(New England Biolabs生產(chǎn))溶解在35μl SalI的NE緩沖液(New England Biolabs生產(chǎn))中，向其中加入20單位限制性酶SalI(由New England Biolabs生產(chǎn))，隨后37℃消化2小時(shí)。通過乙醇沉淀從反應(yīng)溶液中回收DNA片段，并溶解在35μl NE緩沖液2(New England Biolabs生產(chǎn))中，向其中加入20單位限制性酶HindIII(由New England Biolabs生產(chǎn))，隨后37℃消化2小時(shí)。消化后，向其中加入35μl 1mol/l Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)和3.5μl大腸桿菌CIS衍生的堿性磷酸酶(Takara Shuzo生產(chǎn))，接著在65℃反應(yīng)30分鐘以使DNA末端去磷酸化。去磷酸化作用處理后，通過苯/氯仿提取和乙醇沉淀回收DNA片段，并溶解在l0μl消毒水中。
混合獲得的衍生自質(zhì)粒pscFUT8gE2-3的SalI-HindIII片段(4.0μl，大約3.1Kb)、1.0μl衍生自質(zhì)粒pKOFUT8gE2-3的Sall-HindIII片段(大約4.8Kb)和5.0μl Ligation High(由Toyobo生產(chǎn))，隨后16℃結(jié)合30分鐘。用反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α株，按照已知的方法從獲得的氨比西林抗性克隆中分離質(zhì)粒DNA。在此，質(zhì)粒被叫做pKOFUT8gE2-4。
(7)構(gòu)建質(zhì)粒pKOFUT8gE2-5 采用(3)項(xiàng)和(6)項(xiàng)中獲得的質(zhì)粒pKOFUT8gE2-2和pKOFUT8gE2-4，通過以下步驟構(gòu)建質(zhì)粒pKOFUT8gE2-5(
圖10)。
在30μl NE緩沖液4(New England Biolabs生產(chǎn))中溶解1.0μg質(zhì)粒pKOFUT8gE2-2，向其中加入20單位限制性酶Smal(由New EnglandBiolabs生產(chǎn))，隨后25℃消化2小時(shí)。通過乙醇沉淀從反應(yīng)溶液中回收DNA片段，并溶解在30μl NE緩沖液2(New England Biolabs生產(chǎn))中，向其中加入20單位限制性酶BamHI(由New England Biolabs生產(chǎn))，隨后37℃消化2小時(shí)。消化后，向其中加入30μl 1mol/l Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)和3.0μl大腸桿菌C15衍生的堿性磷酸酶(Takara Shuzo生產(chǎn))，接著在65℃反應(yīng)1小時(shí)以使DNA末端去磷酸化。去磷酸化作用處理后，通過苯/氯仿提取和乙醇沉淀回收DNA片段，并溶解在10μl消毒水中。
分別地，1.0μg質(zhì)粒pKOFUT8gE2-4溶解在30μl NE緩沖液4(NewEngland Biolabs生產(chǎn))中，向其中加入20單位限制性酶SmaI(New EnglandBiolabs生產(chǎn))，隨后25℃消化2小時(shí)。通過乙醇沉淀從反應(yīng)溶液中回收DNA片段，并溶解在30μl NE緩沖液2(New England Biolabs生產(chǎn))中，向其中加入20單位限制性酶BamHI(由New England Biolabs生產(chǎn))，隨后37℃消化2小時(shí)。消化后，溶液進(jìn)行0.8％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳以純化大約5.2Kb的DNA片段。
混合獲得的衍生自質(zhì)粒pKOFUT8gE2-2的SmaI-BamHI片段(0.5μl，大約5.0Kb)、4.5μl衍生自質(zhì)粒pKOFUT8gE2-4的Smal-BamHl片段(大約5.4Kb)和5.0μl Ligation High(由Toyobo生產(chǎn))，隨后16℃結(jié)合15小時(shí)。用反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α株，按照已知的方法從獲得的氨比西林抗性克隆中分離質(zhì)粒DNA。在此，質(zhì)粒被叫做pKOFUT8gE2-5。
(8)構(gòu)建質(zhì)粒pKOFUT8Puro 采用(7)項(xiàng)中獲得的質(zhì)粒pKOFUT8gE2-5，通過以下步驟構(gòu)建質(zhì)粒pKOFUT8Puro(
圖11)。
在50μl NE緩沖液4(New England Biolabs生產(chǎn))中溶解1.0μg質(zhì)粒pKOSelectDT(由Lexicon生產(chǎn))，向其中加入16單位限制性酶RsrII(由New England Biolabs生產(chǎn))，隨后37℃消化2小時(shí)。消化后，溶液進(jìn)行0.8％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳以純化大約1.2Kb含白喉毒素表達(dá)單位的DNA片段。
分別地，1.0μg質(zhì)粒pKOFUT8gE2-5溶解在50μl NE緩沖液4(NewEngland Biolabs生產(chǎn))中，向其中加入16單位限制性酶RsrII(由NewEngland Biolabs生產(chǎn))，隨后37℃消化2小時(shí)。消化后，向其中加入30μl1mol/l Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)和3.0μl大腸桿菌CIS衍生的堿性磷酸酶(Takara Shuzo生產(chǎn))，接著在65℃反應(yīng)1小時(shí)以使DNA末端去磷酸化。去磷酸化作用處理后，通過苯/氯仿提取和乙醇沉淀回收DNA片段，并溶解在10μl消毒水中。
混合獲得的衍生自質(zhì)粒pKOSelectDT的RsrII-RsrII片段(1.0μl，大約1.2Kb)、1.0μl衍生自質(zhì)粒pKOFUT8gE2-5的RsrII-RsrII片段(大約10.4Kb)、3.0μl消毒水和5.0μl Ligation High(由Toyobo生產(chǎn))，隨后16℃結(jié)合30分鐘。用反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α株，按照已知的方法從獲得的氨比西林抗性克隆中分離質(zhì)粒DNA。在此，質(zhì)粒被叫做pKOFUT8Puro。
2.制備CHO細(xì)胞，其中含F(xiàn)UT8基因外顯子2的基因組區(qū)域的一個(gè)拷貝是斷裂的 (1)導(dǎo)入靶向載體 在本實(shí)施方案1項(xiàng)中構(gòu)建的中國(guó)倉(cāng)鼠FUT8基因組區(qū)域靶向載體pKOFUT8Puro被導(dǎo)入實(shí)施例1的(2)項(xiàng)中制備的克隆5-03。
如下所述，按照電穿孔將質(zhì)粒pKOFUT8Puro的基因?qū)肟寺?-03[Cytofechnology，3，133(1990)]。首先，150μg質(zhì)粒pKOFUT8Puro溶解在1.8ml SalI的NE緩沖液(New England Biolabs生產(chǎn))中，向其中加入600單位限制性酶SalI(New England Biolabs生產(chǎn))，隨后37℃消化5小時(shí)以獲得線性片段。用苯/氯仿抽提提取反應(yīng)溶液，隨后乙醇沉淀，回收的線性質(zhì)粒被制成1μg/μl的水溶液。分別地，克隆5-03懸浮在K-PBS緩沖液(137mmol/l KCl，2.7mmol/l NaCl，8.1mmol/l Na2HPO4，1.5mmol/lKH2PO4，4.0mmol/l MgCl2)中至8×107細(xì)胞/ml密度。200μl細(xì)胞懸浮液(1.6×106細(xì)胞)與4μl(4μg)線性質(zhì)?；旌虾?，全部體積的細(xì)胞-DNA混合物被轉(zhuǎn)移進(jìn)Gene Pulser Cuvette(電極間距離2mm)(由BIO-RAD生產(chǎn))，然后用細(xì)胞融合設(shè)備Gene Pulser(由BIO-RAD生產(chǎn))以350V脈沖壓和250μF電容進(jìn)行電穿孔。用30個(gè)試管以相同的方式進(jìn)行電穿孔后，細(xì)胞懸浮液懸浮在添加了10％胎牛血清(由Life Technologies生產(chǎn))和1×濃度HT添加物(Life Technologies生產(chǎn))的IMDM培養(yǎng)基(由Life Technologies生產(chǎn))中，并接種進(jìn)30個(gè)10cm直徑的粘附細(xì)胞培養(yǎng)器(Falcon生產(chǎn))中。在5％CO2中37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，去除培養(yǎng)上清物，給予10ml添加了15μg/ml嘌呤霉素(SIGMA生產(chǎn))和10％胎牛透析血清(Life Technologies生產(chǎn))的IMDM培養(yǎng)基(Life Technologies生產(chǎn))。每隔3至4天重復(fù)更換培養(yǎng)基培養(yǎng)10天后，獲得了嘌呤霉素-抗性克隆。
(2)制備導(dǎo)入了靶向載體的克隆 如下獲取(1)項(xiàng)中獲得的嘌呤霉素-抗性克隆中的任意900個(gè)集落。
首先，從形成了嘌呤霉素-抗性克隆集落的10cm碟中去除培養(yǎng)上清物，并在后來置于立體顯微鏡下的碟中加入7ml磷酸鹽緩沖液。接著，刮下每個(gè)集落，用Pipetteman(由GILSON生產(chǎn))吸取并轉(zhuǎn)移進(jìn)96孔圓底平板(Falcon生產(chǎn))中。胰蛋白酶處理后，每個(gè)克隆被接種進(jìn)96孔平底平板用于貼附細(xì)胞培養(yǎng)(Iwaki Glass生產(chǎn))，在添加了15μg/ml嘌呤霉素(SIGMA生產(chǎn))和10％胎牛透析血清(Life Technologies生產(chǎn))的IMDM培養(yǎng)基(Life Technologies生產(chǎn))中培養(yǎng)1周。
培養(yǎng)后，平板中的每個(gè)克隆被胰蛋白酶處理，然后與兩倍體積的冷凍培養(yǎng)基(20％DMSO，40％胎牛血清，40％IMDM)混合。一半混合物接種進(jìn)貼附細(xì)胞培養(yǎng)的96孔平底平板(Iwaki Glass生產(chǎn))中作為復(fù)制板，而剩下的一半混合物被低溫貯藏作為母板。在添加了15μg/ml嘌呤霉素(SIGMA生產(chǎn))和10％胎牛透析血清(Life Technologies生產(chǎn))的IMDM培養(yǎng)基(Life Technologies生產(chǎn))中培養(yǎng)復(fù)制板1周。
(3)通過基因組PCR診斷同源重組 通過基因組PCR進(jìn)行(2)項(xiàng)中獲得的900個(gè)克隆的同源重組診斷。
首先，按照已知的方法[Analytical Biochemistry，201，331(1992)]制備(2)項(xiàng)中制備的復(fù)制板中每個(gè)克隆的基因組DNA，并在30μl TE-核糖核酸酶緩沖液(pH 8.0)(10mmol/l Tris-HCl，1mmol/l EDTA，200μg/ml核糖核酸酶A)中溶解過夜。此外，設(shè)計(jì)與參考實(shí)施方案中獲得的FUT8基因組區(qū)域間靶向載體同源區(qū)外序列結(jié)合的引物(由SEQ ID NO15描述)，和與載體中l(wèi)oxP序列結(jié)合的引物(由SEQ ID NO16描述)。
用DNA聚合酶ExTaq(Takara Shuzo生產(chǎn))，制備含10μl上面制備的每個(gè)基因組DNA溶液的25μl反應(yīng)溶液[ExTaq緩沖液(Takara Shuzo生產(chǎn))，0.2mmol/l dNTPs和0.5μmol/l基因特異引物(SEQ ID NOs15和16)]，并進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。通過94℃加熱3分鐘，隨后38次循環(huán)的加熱94℃ 1分鐘、60℃ 1分鐘和72℃ 2分鐘，作為一個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR。
PCR后，反應(yīng)溶液進(jìn)行0.8％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳，大約1.7Kb的含CHO細(xì)胞基因組區(qū)和靶向載體同源區(qū)之間邊緣區(qū)的特異性擴(kuò)增片段被確定為陽性克隆。用此方法發(fā)現(xiàn)一個(gè)陽性克隆。
(4)通過基因組Southern印跡診斷同源重組 對(duì)(3)項(xiàng)中證實(shí)的一個(gè)陽性信號(hào)克隆通過基因組Southern印跡進(jìn)行同源重組診斷。
在(2)項(xiàng)中冷凍保存的母板中間，選擇在(3)項(xiàng)中發(fā)現(xiàn)含陽性克隆的96孔平板并在5％CO2下37℃孵育10分鐘。孵育后，從對(duì)應(yīng)于陽性克隆的孔中收集細(xì)胞并接種進(jìn)貼附細(xì)胞的24孔平底板(Greiner生產(chǎn))中。在添加了15μg/ml嘌呤霉素(SIGMA生產(chǎn))和10％胎牛透析血清(LifeTechnologies生產(chǎn))的IMDM培養(yǎng)基(Life Technologies生產(chǎn))中培養(yǎng)1周后，細(xì)胞被接種進(jìn)貼附細(xì)胞的6孔平底板(Greiner生產(chǎn))中。按照已知的方法[Nucleic Acids Research，3，2303(1976)]從平板中制備每個(gè)克隆的基因組DNA，并在150μl TE-核糖核酸酶緩沖液(pH 8.0)(10mmol/l Tris-HCl，1mmol/l EDTA，200μg/ml核糖核酸酶A)中溶解過夜。
在120μl NE緩沖液3(New England Biolabs生產(chǎn))中溶解12μg獲得的基因組DNA，向其中加入25單位限制性酶PstI(New England Biolabs生產(chǎn))，隨后37℃消化過夜。通過乙醇沉淀從反應(yīng)溶液中回收DNA片段，溶解在20μl TE緩沖液(pH 8.0，10mmol/l Tris-HCl，1mmol/l EDTA)中，然后進(jìn)行0.8％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳。電泳后，基因組DNA按照已知的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，3683(1979)]轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。轉(zhuǎn)移完成后，尼龍膜在80℃加熱2小時(shí)。
分別地，Southern印跡中使用的探針制備如下。首先，設(shè)計(jì)與靶向載體同源區(qū)外序列結(jié)合的引物(SEQ ED NOs9和10)，該同源區(qū)與參考實(shí)施例(2)中獲得的FUT8基因組區(qū)同源。接著，用DNA聚合酶ExTaq(Takara Shuzo生產(chǎn))，制備含4.0ng參考實(shí)施例(2)中獲得的質(zhì)粒pFUT8fgE2-2的20μl反應(yīng)溶液[ExTaq緩沖液(Takara Shuzo生產(chǎn))，0.2mmol/l dNTPs和0.5μmol/l基因特異引物(SEQ ID NOs9和10)，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。通過94℃加熱1分鐘，隨后25次循環(huán)的加熱94℃30秒、55℃30秒和74℃1分鐘，作為一個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR。PCR后，反應(yīng)溶液進(jìn)行1.75％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳以純化大約230bp的探針DNA片段。獲得的探針DNA溶液(5μl)被放射性同位素標(biāo)記，采用1.75MBq的[α-32P]dCTP和Megaprime DNA標(biāo)記系統(tǒng)，dCTP(Ainersham PharmaciaBiotech生產(chǎn))。
雜交如下進(jìn)行。首先，尼龍膜密封在滾瓶中，添加15ml雜交液[5×SSPE，50×Denhaldt′s溶液，0.5％(w/v)SDS，100μg/ml鮭精DNA]65℃3小時(shí)進(jìn)行預(yù)雜交。接著，32P-標(biāo)記的探針DNA被熱變性并放入瓶中。然后，在65℃加熱尼龍膜過夜。
雜交后，在50ml 2×SSC-0.1％(w/v)SDS中浸濕尼龍膜并在65℃加熱15分鐘。重復(fù)沖洗步驟兩次后，在50ml 0.2×SSC-0.1％(w/v)SDS中浸濕尼龍膜并在65℃加熱15分鐘。沖洗后，尼龍膜在-80℃與X線膠片接觸兩夜以顯影。
通過限制性酶PstI處理，從野生型FUT8等位基因中形成大約4.4Kb的DNA片段。另一方面，從等位基因中形成了大約6.0Kb的DNA片段，在其中產(chǎn)生了與靶向載體同源的重組。
通過此方法，從(3)項(xiàng)中的陽性克隆基因組DNA中發(fā)現(xiàn)了這種大約4.4Kb和大約6.0Kb的特異片段。由于兩個(gè)片段的數(shù)量比例是1∶1，證實(shí)該克隆是FUT8等位基因的一個(gè)拷貝斷裂了的克隆。此后，該克隆被叫做克隆Ist.FUTS 2-46。
3.從CHO細(xì)胞中刪除耐藥基因，所述CHO細(xì)胞中FUT8基因的一個(gè)拷貝是斷裂的 (1)導(dǎo)入Cre重組酶表達(dá)載體 Cre重組酶表達(dá)載體pBS185(Life Technologies生產(chǎn))被導(dǎo)入本實(shí)施方案2項(xiàng)制備的克隆Ist.FUTS 2-46中。
如下所述，按照電穿孔[Cytolechnology，1，133(1990)]將質(zhì)粒pBS185導(dǎo)入克隆Ist.FUT8 2-46。首先，克隆Ist.FUTS 2-46懸浮在K-PBS緩沖液(137mmol/l KCl，2.7mmol/l NaCl，8.1mmol/l Na2HPO4，1.5mmol/l KH2PO4，4.0mmol/l MgCl2)中至8×107細(xì)胞/ml密度。200μl細(xì)胞懸浮液(1.6×106細(xì)胞)與4μg質(zhì)粒pBS185混合后，全部體積的細(xì)胞-DNA混合物被轉(zhuǎn)移進(jìn)Gene Pulser Cuvette(電極間距離2mm)(由BIO-RAD生產(chǎn))，然后用細(xì)胞融合設(shè)備Gene Pulser(由BIO-RAD生產(chǎn))以350V脈沖壓和250μF電容進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。
基因轉(zhuǎn)移后，細(xì)胞懸浮液懸浮在添加了10％胎牛血清(由LifeTechnologies生產(chǎn))和1×濃度HT添加物(Life Technologies生產(chǎn))的10mlIMDM培養(yǎng)基(由Life Technologies生產(chǎn))中，并用相同的培養(yǎng)基進(jìn)一步稀釋20,000倍。細(xì)胞被接種進(jìn)7個(gè)10cm直徑的粘附細(xì)胞培養(yǎng)器(Falcon生產(chǎn))，然后在5％CO2中37℃培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)后，去除培養(yǎng)上清物，給予10ml添加了10％胎牛透析血清(Life Technologies生產(chǎn))的IMDM培養(yǎng)基(Life Technologies生產(chǎn))。每隔3至4天重復(fù)更換培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)10天。
(2)制備導(dǎo)入了Cre重組酶表達(dá)載體的克隆 如下獲取(1)項(xiàng)中獲得的克隆中的任意400個(gè)集落。
首先，從10cm碟中去除培養(yǎng)上清物，并在后來置于立體顯微鏡下的碟中加入7ml磷酸鹽緩沖液。接著，刮下每個(gè)集落，用Pipetteman(由GILSON生產(chǎn))吸取并轉(zhuǎn)移進(jìn)96孔圓底平板(Falcon生產(chǎn))中。胰蛋白酶處理后，每個(gè)克隆被接種進(jìn)貼附細(xì)胞培養(yǎng)的96孔平底平板(Iwaki Glass生產(chǎn))中，在添加了10％胎牛透析血清(Life Technologies生產(chǎn))的IMDM培養(yǎng)基(Life Technologies生產(chǎn))中培養(yǎng)1周。
培養(yǎng)后，用胰蛋白酶處理平板中的每個(gè)克隆，然后與兩倍體積的冷凍培養(yǎng)基(20％DMSO，40％胎牛血清，40％IMDM)混合。一半混合物接種進(jìn)貼附細(xì)胞培養(yǎng)的96孔平底平板(Iwaki Glass生產(chǎn))中以制備復(fù)制板，而剩下的一半被低溫貯藏作為母板。
接著，在添加了15μg/ml嘌呤霉素(SIGMA生產(chǎn))和10％胎牛透析血清(Life Technologies生產(chǎn))的IMDM培養(yǎng)基(Life Technologies生產(chǎn))中培養(yǎng)復(fù)制板6天。在有嘌呤霉素情況下陽性克隆消失，陽性克隆中由于Cre重組酶的表達(dá)，插入loxP序列間的嘌呤霉素-抗性基因被刪除。通過選擇方法，發(fā)現(xiàn)了91個(gè)陽性克隆。
(3)通過基因組Southern印跡診斷耐藥基因刪除 對(duì)(2)項(xiàng)中發(fā)現(xiàn)的陽性克隆中的隨意6個(gè)克隆進(jìn)行基因組Southern印跡診斷耐藥基因刪除。
在(2)項(xiàng)中冷凍保存的母板中間，選擇含6個(gè)陽性克隆的96孔平板并在5％CO2下37℃孵育10分鐘。孵育后，從對(duì)應(yīng)于每個(gè)陽性克隆的孔中收集細(xì)胞并接種進(jìn)用于貼附細(xì)胞的24孔平底板(Greiner生產(chǎn))中。在添加了10％胎牛透析血清(Life Technologies生產(chǎn))的IMDM培養(yǎng)基(LifeTechnologies生產(chǎn))中培養(yǎng)1周后，細(xì)胞被接種進(jìn)用于貼附細(xì)胞的6孔平底板(Greiner生產(chǎn))中。按照已知的方法[Nucleic Acids Research，3，2303(1976)]從平板中制備每個(gè)克隆的基因組DNA，并在150μl TE-核糖核酸酶緩沖液(pH 8.0)(10mmol/l Tris-HCl，1mmol/l EDTA，200μg/ml核糖核酸酶A)中溶解過夜。
在120μl BamHI的NE緩沖液(New England Biolabs生產(chǎn))中溶解12μg獲得的基因組DNA，向其中加入20單位限制性酶BamUI(New EnglandBiolabs生產(chǎn))，隨后37℃消化過夜。通過乙醇沉淀從反應(yīng)溶液中回收DNA片段，溶解在20μl TE緩沖液(pH 8.0，10mmol/l Tris-HCl，1mmol/lEDTA)中，然后進(jìn)行0.4％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳。電泳后，基因組DNA按照已知的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，3683(1979)]轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。轉(zhuǎn)移完成后，尼龍膜在80℃加熱2小時(shí)。
分別地，Southern印跡中使用的探針制備如下。首先，設(shè)計(jì)與參考實(shí)施方案中獲得的FUT8基因組區(qū)中靶向載體同源區(qū)外序列結(jié)合的引物(SEQ ED NOs9和10)。接著，用DNA聚合酶ExTaq(Takara Shuzo生產(chǎn))，通過制備20μl含4.0ng參考實(shí)施例(2)中獲得的質(zhì)粒pFUT8fgE2-2的反應(yīng)溶液[ExTaq緩沖液(Takara Shuzo生產(chǎn))，0.2mmol/l dNTPs和0.5μmol/l基因特異引物(SEQ ID NOs9和10)，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。通過94℃加熱1分鐘，隨后25次循環(huán)的加熱94℃30秒、55℃30秒和74℃1分鐘，作為一個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR。PCR后，反應(yīng)溶液進(jìn)行1.75％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳以純化大約230bp的探針DNA片段。采用1.75MBq的[α-32P]dCTP和Megaprime DNA標(biāo)記系統(tǒng)，dCTP(Ainersham PharmaciaBiotech生產(chǎn))，5μl獲得的探針DNA溶液被放射性同位素標(biāo)記。
雜交如下進(jìn)行。首先，尼龍膜密封在滾瓶中，添加15ml雜交液[5×SSPE，50×Denhaldt′s溶液，0.5％(w/v)SDS，100μg/ml鮭精DNA]65℃3小時(shí)進(jìn)行預(yù)雜交。接著，32P-標(biāo)記的探針DNA被熱變性并放入瓶中，在65℃加熱尼龍膜過夜。
雜交后，在50ml 2×SSC-0.1％(w/v)SDS中浸濕尼龍膜并在65℃加熱15分鐘。重復(fù)沖洗步驟兩次后，在50ml 0.2×SSC-0.1％(w/v)SDS中浸濕膜并在65℃加熱15分鐘。尼龍膜沖洗后，在-80℃與X線膠片接觸兩夜以顯影。
通過上面描述的限制性酶BamHI處理，從野生型FUT8等位基因中形成了大約25.5Kb的DNA片段。而且，從等位基因中形成了大約20.0Kb的DNA片段，在其中產(chǎn)生了與靶向載體同源的重組。此外，當(dāng)嘌呤霉素-抗性基因(大約1.5Kb)從產(chǎn)生了同源重組的等位基因中被刪除時(shí)，用相同的處理形成大約18.5Kb的DNA片段。
通過此方法，從6個(gè)克隆的5個(gè)克隆基因組DNA中發(fā)現(xiàn)了大約25.5Kb和大約18.5Kb的特異片段。由于兩個(gè)片段的數(shù)量比例是1∶1，顯示嘌呤霉素-抗性基因從克隆中被刪除，該克隆FUT8基因組區(qū)的一個(gè)拷貝是斷裂的。此后，該克隆被叫做克隆Ist.FUTS 2-46-1。同樣，克隆Ist.FUT8 2-46-1、克隆Ist.FUT8 2-46和克隆5-03基因組Southern印跡的結(jié)果顯示在
圖12。而且，克隆Ist.FUT8 2-46-1，以2-46-1的名字于2001年9月26日在International Patent Organism Depositary，National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology(Tsukuba Central 6，1，Higashi1-Chome Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566 Japan)被保藏為FERMBP-7755。
4.純化FUT8基因斷裂克隆產(chǎn)生的抗體 通過斷裂FUT8等位基因的一個(gè)拷貝在本實(shí)施例3項(xiàng)中獲得的克隆Ist.FUT8 2-46-1懸浮在添加了15μg/ml嘌呤霉素(SIGMA生產(chǎn))和10％胎牛透析血清(Life Technologies生產(chǎn))的IMDM培養(yǎng)基(Lfe Technologies生產(chǎn))中至3×105細(xì)胞/ml密度，然后總懸浮液的60ml被接種進(jìn)兩個(gè)T182燒瓶用于貼附細(xì)胞培養(yǎng)(Greiner生產(chǎn))。培養(yǎng)3天后，丟棄上清物并改變?yōu)榭偣?0ml的EXCELL301培養(yǎng)基(由JRH Biosciences生產(chǎn))。
在5％CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)7天后，計(jì)算完整細(xì)胞數(shù)以證實(shí)其生存能力幾乎是相同的(每個(gè)30％或以下)，然后回收每個(gè)細(xì)胞懸浮液。以3,000rpm 4℃離心細(xì)胞懸浮液10分鐘，以10,000rpm 4℃離心回收的上清物1小時(shí)，然后用具有0.22μm孔徑的150ml容量PES FilterUnit(NALGENE生產(chǎn))過濾。
在0.8cm直徑的柱中充填Prosep-A High Capacity(bioPROCESSING生產(chǎn))至2cm厚度，用10ml 0.1mol/l檸檬酸鹽緩沖液(pH 3.0)和10ml1mol/l氨基乙酸/NaOH-0.15mol/l NaCl緩沖液(pH 8.6)按此順序沖洗以達(dá)到平衡載體。接著，每個(gè)培養(yǎng)上清物100ml通過此柱并用50ml 1mol/l氨基乙酸/NaOH-0.15mol/l NaCl緩沖液(pH 8.6)沖洗。沖洗后，Prosep-A吸附的抗體用2.5ml 0.1mol/l檸檬酸鹽緩沖液(pH 3.0)洗脫，洗脫物以500μl分餾，每個(gè)餾分通過與100μl 2mol/l Tris-HCl(pH 8.5)混合被中和。通過BCA方法[Anal.Biochem.，150，76(1985)]選擇兩個(gè)含高濃度抗體的餾分(總共1.2ml)，合并，然后用10mol/l檸檬酸鹽-0.15mol/l NaCl緩沖液(pH 6.0)透析一晝夜。透析后，回收抗體溶液并用0.22μm孔徑的MillexGV(MILLIPORE生產(chǎn))進(jìn)行消毒過濾。
5.FUT8基因斷裂克隆產(chǎn)生的抗體組合物的ADCC活性 為了評(píng)價(jià)本實(shí)施方案4項(xiàng)中純化的抗CCR4抗體的ADCC活性，采用WO 01/34754中描述的CCR4-陽性克隆CCR4/EL-4檢測(cè)ADCC活性。
在添加了10％胎牛血清(Life Technologies生產(chǎn))的RPMI1640培養(yǎng)基(由Life Technologies生產(chǎn))(此后稱為″RPMI1640-FBS(10)″)中傳代培養(yǎng)的1×106細(xì)胞CCR4/EL-4克隆被懸浮在500μl RPMI1640-FBS(10)中，此后向其中加入3.7MBq的Na251CrO4，隨后37℃培養(yǎng)90分鐘以用放射性同位素標(biāo)記細(xì)胞。以1,200rpm離心5分鐘后，丟棄上清物，靶細(xì)胞懸浮在5ml RPMI1640-FBS(10)中。重復(fù)3次沖洗步驟，然后在冰上孵育細(xì)胞懸浮液30分鐘以自發(fā)分解放射活性物質(zhì)。再重復(fù)兩次沖洗步驟，然后在5ml RPMI1640-FBS(10)中懸浮細(xì)胞從而制備2.0×105細(xì)胞/ml的靶細(xì)胞懸浮液。
分別地，從健康供體采集30ml靜脈血，與0.5ml肝素鈉(由ShimizuPharmaceutical生產(chǎn))輕輕混合，然后與30ml生理鹽(Otsuka Pharmaceutical生產(chǎn))混合。混合后，10ml混合物輕輕蓋在4ml Lymphoprep(NYCOMEDPHARMA AS生產(chǎn))上，以2,000rpm室溫離心30分鐘。從離心管中收集分離的單核細(xì)胞部分，合并，然后懸浮在30ml RPMI1640-FBS(10)中。以1,200rpm室溫離心15分鐘后，丟棄上清物，并在20mlRPMI1640-FBS(10)中懸浮細(xì)胞。重復(fù)兩次沖洗步驟，然后用RPMI1640-FBS(10)制備2.5×106細(xì)胞/ml的效應(yīng)細(xì)胞懸浮液。
將靶細(xì)胞懸浮液以50μl(1×104細(xì)胞/孔)分入96孔U形底平板(Falcon生產(chǎn))的每個(gè)孔中。隨后，效應(yīng)細(xì)胞懸浮液以100μl(2.5×105細(xì)胞/孔)分入每孔，從而調(diào)節(jié)效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例為25∶1。接著，用RPMI1640-FBS(10)從本實(shí)施方案4項(xiàng)中獲得的每個(gè)抗CCR4抗體制備0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml和10μg/ml的系列稀釋溶液，稀釋的溶液以50μl分入孔中至終濃度分別為0.0025μg/ml、0.025μg/ml、0.25μg/ml和2.5μg/ml。在5％CO2中37℃反應(yīng)4小時(shí)后，以1,200rpm離心平板5分鐘。分批取出每孔中75μl的上清物到12mm直徑RIA管(IWAKI生產(chǎn))中，用MINAX-γ自動(dòng)-γ計(jì)數(shù)器5550(PACKARD生產(chǎn))測(cè)量解離的51Cr的量。
此外，在添加150μl RPMI 1640-FBS(1O)而沒有效應(yīng)細(xì)胞懸浮液和抗體溶液的反應(yīng)混合物中進(jìn)行相同的反應(yīng)計(jì)算自發(fā)解離的51Cr的量。在添加100μl 1N鹽酸和50μl RPMI1640-FBS(10)而沒有效應(yīng)細(xì)胞懸浮液和抗體溶液的反應(yīng)混合物中進(jìn)行相同的反應(yīng)計(jì)算總解離的51Cr的量。
采用這些值，根據(jù)(3)項(xiàng)中描述的方程式(I)計(jì)算ADCC活性。

圖13顯示每個(gè)抗CCR4抗體的ADCC活性。從FUT8等位基因一個(gè)拷貝斷裂的克隆1st.FUT8 2-46-1中獲得的抗體比CHO克隆基因斷裂前的克隆5-03產(chǎn)生的抗體顯示顯著高的ADCC活性。此外，沒有觀察到這些抗體抗原結(jié)合活性的改變?；诖私Y(jié)果證實(shí)，通過斷裂宿主細(xì)胞中FUT8等位基因可以改善產(chǎn)生的抗體的ADCC活性。
實(shí)施例4 從FUT8基因一個(gè)拷貝被破壞的CHO細(xì)胞制備高耐藥克隆 一般知道，兩個(gè)等位基因均被破壞的克隆是通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，然后分離耐藥克隆而獲得的，培養(yǎng)細(xì)胞中用靶載體通過同源重組技術(shù)獲得的基因組基因的一個(gè)等位基因被破壞，在培養(yǎng)基中用于選擇插入靶載體克隆的陽性選擇劑濃度被升高大約10倍[操控小鼠胚胎，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)；基因靶向，實(shí)用方法，IRL Press at Oxford University Press(1993)，用ES細(xì)胞制備突變體小鼠]。
因此，用實(shí)施方案3的2(3)項(xiàng)中獲得的克隆Ist.FUTS 2-46，根據(jù)已知的方法[Molecular and Cellular Biology，12，2391(1992)]，F(xiàn)UT8基因2個(gè)拷貝被破壞的轉(zhuǎn)化株制備如下。
(1)制備高濃度嘌呤霉素-抗性克隆 1×108細(xì)胞量的克隆Ist.FUTS 2-46懸浮在添加了10％透析胎牛血清(Life Technologies生產(chǎn))的IMDM培養(yǎng)基(Life Technologies生產(chǎn))中，并接種進(jìn)20個(gè)貼附細(xì)胞培養(yǎng)的10cm碟器皿(Falcon生產(chǎn))中，然后在5％CO2條件下37℃培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)后，丟棄上清物，以10ml分發(fā)添加了150μg/ml嘌呤霉素(SIGMA生產(chǎn))和10％透析的胎牛血清(LifeTechnologies生產(chǎn))的IMDM培養(yǎng)基(Life Technologies生產(chǎn))。每隔3至4天重復(fù)更換此培養(yǎng)基，進(jìn)行培養(yǎng)12天。
按以下步驟收集形成的90個(gè)耐藥集落。首先，從10cm碟中丟棄培養(yǎng)上清物，用7ml磷酸鹽緩沖液替換，然后將碟置于立體顯微鏡下。接著，剝離集落，用Pipetteman(GILSON生產(chǎn))吸取并轉(zhuǎn)移進(jìn)96孔圓底平板(Falcon生產(chǎn))。胰蛋白酶處理后，每個(gè)克隆接種進(jìn)貼附細(xì)胞的96孔平底板(Iwaki Glass生產(chǎn))，在添加了150μg/ml嘌呤霉素(SIGMA生產(chǎn))和10％透析的胎牛血清(Life Technologies生產(chǎn))的IMDM培養(yǎng)基(LifeTechnologies生產(chǎn))中培養(yǎng)1周。
培養(yǎng)后，平板上的每個(gè)克隆接受胰蛋白酶處理，并與兩倍體積的冷凍培養(yǎng)基(20％DMSO，40％胎牛血清，40％IMDM)混合。其一半體積接種進(jìn)貼附細(xì)胞的96孔平底平板(Iwaki Glass生產(chǎn))以制備復(fù)制板，剩下的一半體積被低溫貯藏作為母板。在添加了15mg/ml嘌呤霉素(SIGMA生產(chǎn))和10％透析的胎牛血清(Life Technologies生產(chǎn))的IMDM培養(yǎng)基(LifeTechnologies生產(chǎn))中培養(yǎng)復(fù)制板1周。
(2)通過基因組Southern印跡診斷同源重組 按照以下步驟，通過基因組Southern印跡對(duì)(1)項(xiàng)中獲得的所有耐藥克隆進(jìn)行同源重組診斷。
在用胰蛋白酶處理(1)項(xiàng)中制備的復(fù)制板后，所有克隆被接種進(jìn)貼附細(xì)胞的24孔平底板(Greiner生產(chǎn))。所有克隆在添加了150μg/ml嘌呤霉素(SIGMA生產(chǎn))和10％透析的胎牛血清(Life Technologies生產(chǎn))的IMDM培養(yǎng)基(Life Technologies生產(chǎn))中培養(yǎng)1周，用胰蛋白酶處理并接種進(jìn)貼附細(xì)胞的6孔平底板(Greiner生產(chǎn))。根據(jù)已知的方法[NucleicAcids Research，3，2303(1976)]從平板中制備每個(gè)克隆的基因組DNA，并在150μl TE-核糖核酸酶緩沖液(pH 8.0)(10mmol/l Tris-HCl，1mmol/lEDTA，200mg/ml核糖核酸酶A)中溶解過夜。
在120μl BamHI的NE緩沖液(New England Biolabs生產(chǎn))中溶解12μg上面制備的基因組DNA，向其中加入25單位限制性酶Bam HI(NewEngland Biolabs生產(chǎn))，隨后在37℃消化。通過乙醇沉淀法從反應(yīng)溶液中回收DNA片段，溶解在20μl TE緩沖液(pH 8.0，10mmol/l Tris-HCl，1mmol/l EDTA)中，然后進(jìn)行0.6％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳。電泳后，基因組DNA根據(jù)已知的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，3683(1979)]轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。轉(zhuǎn)移后，尼龍膜在80℃進(jìn)行熱處理2小時(shí)。
另一方面，Southern印跡的探針制備如下。采用DNA聚合酶ExTaq(Takara Shuzo生產(chǎn))，通過制備20μl反應(yīng)溶液[ExTaq緩沖液(Takara Shuzo生產(chǎn))，0.2mmol/l dNTPs，0.5μmol/l上述基因特異引物(SEQ ID NOs9和10)]進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。通過94℃加熱1分鐘，隨后25次循環(huán)的94℃30秒、55℃30秒和74℃1分鐘，作為一個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR。PCR后，反應(yīng)溶液進(jìn)行1.75％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳以純化大約230bp的探針DNA片段。采用1.75MBq的[α32P]dCTP和Megaprime DNA標(biāo)記系統(tǒng)，dCTP(Ainersham Pharmacia Biotech生產(chǎn))，5μl獲得的探針DNA溶液被放射性同位素標(biāo)記。
雜交如下進(jìn)行。首先，上面的尼龍膜被密封在滾瓶中，添加15ml雜交液[5×SSPE，50×Denhaldt′s溶液，0.5％(w/v)SDS，100mg/ml鮭精DNA]65℃進(jìn)行預(yù)雜交3小時(shí)。接著，32P-標(biāo)記的探針DNA被熱變性，放入瓶中并65℃加熱過夜。
雜交后，在50ml 2×SSC-0.1％(w/v)SDS中浸濕尼龍膜并65℃加熱15分鐘。重復(fù)此沖洗步驟兩次后，在50ml 0.2×SSC-0.1％(w/v)SDS中浸濕該膜并在65℃加熱15分鐘。沖洗后，尼龍膜在-80℃與X線膠片接觸兩夜以顯影。
通過上面限制性酶BamHI處理，從野生型FUT8等位基因中獲得了大約25.5Kb的DNA片段。另一方面，從等位基因中形成了大約20.0Kb的DNA片段，所述的等位基因產(chǎn)生于通過相同的限制性酶處理與靶向載體的同源重組。
根據(jù)此方法，發(fā)現(xiàn)僅顯示上面大約14.0Kb的同源重組區(qū)特異片段的克隆(
圖14)。此克隆被稱為克隆2-46-H10。
實(shí)施例5 制備基因組上所有現(xiàn)有FUT8基因均斷裂的CHO/DG44細(xì)胞 制備CHO/DG44克隆，其中含F(xiàn)UT8兩個(gè)等位基因的翻譯啟始密碼子的基因組區(qū)被刪除。
1.構(gòu)建中國(guó)倉(cāng)鼠FUT8基因外顯子2靶向載體質(zhì)粒pKOFUT8Neo 按照以下步驟，通過用新霉素-抗性基因表達(dá)單位取代靶向載體質(zhì)粒pKOFUT8Puro中所含的嘌呤霉素-抗性基因表達(dá)單位構(gòu)建質(zhì)粒pKOFUT8Neo(
圖15)，其中質(zhì)粒pKOFUT8Puro在實(shí)施例3的段落1中獲得。
在50μl NE緩沖液4(New England Biolabs生產(chǎn))中溶解1.0μg質(zhì)粒pKOSelectNeo(Lexicon生產(chǎn))，向其中加入16單位限制性酶AscI(由NewEngland Biolabs生產(chǎn))，隨后37℃消化2小時(shí)。用乙醇沉淀法從反應(yīng)溶液中收集DNA片段，并溶解在含100μg/ml BSA(New England Biolabs生產(chǎn))的50μl NE緩沖液4(New England Biolabs生產(chǎn))中，向其中加入20單位限制性酶ApaLI(由New England Biolabs生產(chǎn))，隨后25℃消化2小時(shí)。消化后，獲得的液體進(jìn)行0.8％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳，大約1.6Kb的含新霉素-抗性基因表達(dá)單位的DNA片段被純化。
分別地，1.0μg質(zhì)粒pKOFUT8Puro溶解在50μl NE緩沖液4(NewEngland Biolabs生產(chǎn))中，向其中加入16單位限制性酶Ascl(由NewEngland Biolabs生產(chǎn))，隨后37℃消化2小時(shí)。消化后，向其中加入30μlpH8.0的1mol/l Tris-HCl緩沖液和3.0μl大腸桿菌C15衍生的堿性磷酸酶(Takara Shuzo生產(chǎn))，在65℃反應(yīng)1小時(shí)以使DNA末端去磷酸化。去磷酸化作用后，進(jìn)行苯/氯仿提取和乙醇沉淀，回收的DNA片段溶解在10μl無菌水中。
混合上面獲得的1.0μl衍生自質(zhì)粒pKOSelectNeo的AscI-AscI片段(大約1.6Kb)、1.0μl衍生自質(zhì)粒pKOFUT8Puro的AscI-AscI片段(大約10.1Kb)、3.0μl無菌水和5.0μl Ligation Higb(由Toyobo生產(chǎn))后，在16℃進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)30分鐘。用反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α株，根據(jù)已知的方法從獲得的氨比西林抗性克隆中分離每個(gè)質(zhì)粒DNA。此質(zhì)粒叫做pKOFUT8Neo。
2.制備基因組上FUT8基因一個(gè)拷貝斷裂的CHO/DG44細(xì)胞 (1)制備靶向載體導(dǎo)入克隆 在二氫葉酸還原酶基因(dhfr)缺乏的來自中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢的CHO/DG44細(xì)胞中[Somatic Cell and Molecular Genetics，12，555(1986)]，導(dǎo)入此實(shí)施方案1項(xiàng)中構(gòu)建的中國(guó)倉(cāng)鼠FUT8基因組區(qū)靶向載體pKOFUT8Neo。根據(jù)以下步驟，通過電穿孔將質(zhì)粒pKOFUT8Neo的基因?qū)隒HO/DG44細(xì)胞[Cytotechnology(電穿孔)，3，133(1990)]。首先，280μg質(zhì)粒pKOFUT8Neo被溶解在含100μg/ml BSA(New EnglandBiolabs生產(chǎn))的1.2ml SalI的NE緩沖液(New England Biolabs生產(chǎn))，然后向其中加入400單位限制性酶SalI(New England Biolabs生產(chǎn))，通過37℃消化5小時(shí)進(jìn)行線性化。用苯/氯仿抽提提取反應(yīng)溶液，隨后乙醇沉淀，回收的線性質(zhì)粒被制成1μg/μl的水溶液。分別地，CHO/DG44細(xì)胞懸浮在K-PBS緩沖液(137mmol/l KCl，2.7mmol/l NaCl，8.1mmol/l Na2HPO4，1.5mmol/l KH2PO4，4.0mmol/l MgCl2)中至8×107細(xì)胞/ml密度。200μl細(xì)胞懸浮液(1.6×106細(xì)胞)與4μl(4μg)上述線性化質(zhì)粒混合后，全部量的細(xì)胞-DNA混合物液體被轉(zhuǎn)移進(jìn)Gene Pulser Cuvette(電極間距離2mm)(由BIO-RAD生產(chǎn))，并用細(xì)胞融合設(shè)備Gene Pulser(由BIO-RAD生產(chǎn))以350V脈沖壓和250μF電容進(jìn)行基因?qū)?。?dǎo)入基因的細(xì)胞懸浮液懸浮在添加了10％胎牛血清(由Invitrogen生產(chǎn))和1×濃度HT添加物(Invitrogen生產(chǎn))的IMDM培養(yǎng)基(由Invitrogen生產(chǎn))中，并接種在10cm的粘附細(xì)胞培養(yǎng)器(Falcon生產(chǎn))上。在5％CO2中37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，去除培養(yǎng)上清物，以10ml/孔將添加了600μg/ml G418(Nacalai Tesque生產(chǎn))、1×濃度TIT添加物(Invitrogen生產(chǎn))和10％胎牛血清(Invitrogen生產(chǎn))的IMDM培養(yǎng)基(Invitrogen生產(chǎn))分發(fā)給每個(gè)孔。每隔3至4天重復(fù)更換培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)15天以獲得G418-抗性克隆。
(2)通過基因組PCR診斷同源重組 根據(jù)以下步驟，通過基因組PCR對(duì)(1)項(xiàng)獲得的G418-抗性克隆進(jìn)行同源重組診斷。
用胰蛋白酶處理96孔平板上獲得的G418-抗性克隆，然后與兩倍量的冷凍培養(yǎng)基(20％DMSO，40％胎牛血清，40％IMDM)混合。一半量的混和物被接種進(jìn)貼附細(xì)胞的96孔平底板(Asahi Technoglass生產(chǎn))作為復(fù)制板，而剩下的一半用于低溫貯藏作為母板。
在添加了600μg/ml G418(Nacalai Tesque生產(chǎn))、1×濃度HT添加物(Invitrogen生產(chǎn))和10％胎牛血清(Invitrogen生產(chǎn))的IMDM培養(yǎng)基(Invitrogen生產(chǎn))中孵育復(fù)制板1周，根據(jù)已知的方法[AnalyticalBiochemistry，201，331(1992)]制備每個(gè)克隆的基因組DNA，它們每一個(gè)在30μl TE-核糖核酸酶緩沖液(pH 8.0)(10mmol/l Tris-HCl，1mmol/l ETDA，200μg/ml核糖核酸酶A)中溶解過夜。
其后的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行如下，使用與參考實(shí)施方案獲得的FUT8基因組區(qū)中靶向載體同源區(qū)之外部分的序列結(jié)合的引物(SEQID NO13或15)，和與內(nèi)部載體序列結(jié)合的引物(SEQ ID NO14或16)。特異地，制備25μl反應(yīng)溶液[DNA聚合酶ExTaq(Takara Shuzo生產(chǎn))，ExTaq緩沖液(Takara Shuzo生產(chǎn))，0.2mmol/l dNTPs，0.5μmol/l上述基因特異的引物(正向引物由SEQ ID NO13或15顯示，反向引物由SEQ IDNO14或16顯示)]，所述反應(yīng)溶液含上面制備的每個(gè)基因組DNA溶液10μl，通過94℃加熱3分鐘，隨后94℃加熱1分鐘、60℃1分鐘和72℃2分鐘作為一個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR。
PCR后，反應(yīng)溶液進(jìn)行0.8％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳，觀察到的1.7Kb的特異擴(kuò)增包括CHO細(xì)胞基因組區(qū)和靶向載體同源區(qū)的邊界部分，被確定為陽性克隆(50-10-104)。
(3)通過基因組Southern印跡診斷同源重組 根據(jù)以下步驟，通過基因組Southern印跡對(duì)(2)項(xiàng)中獲得的陽性證實(shí)克隆進(jìn)行同源重組診斷。
在冷凍狀態(tài)貯藏的母板中間，選擇在(2)項(xiàng)中發(fā)現(xiàn)的含陽性克隆的96孔平板，令其在5％CO2下37℃放置10分鐘。放置后，來自對(duì)應(yīng)于陽性克隆孔中的細(xì)胞被接種在貼附細(xì)胞的24孔平底板(Greiner生產(chǎn))上。在添加了600μg/ml G418(由Nacalai Tesque生產(chǎn))，1×濃度HT添加物(Invitrogen生產(chǎn))和10％胎牛血清(Invitrogen生產(chǎn))的IMDM培養(yǎng)基(Invitrogen生產(chǎn))中培養(yǎng)1周后，細(xì)胞被接種在貼附細(xì)胞的6孔平底板(Greiner生產(chǎn))上。按照已知的方法[Nucleic Acids Research，3，2303(1976)]從平板中制備每個(gè)克隆的基因組DNA，并在150μl TE-核糖核酸酶緩沖液(pH 8.0)(10mmol/l Tris-HCl，1mmol/l EDTA，200μg/ml核糖核酸酶A)中溶解過夜。
在含100μg/ml BSA(New England Biolabs生產(chǎn))的120μl BamHI的NE緩沖液(New England Biolabs生產(chǎn))中溶解12μg上面制備的基因組DNA，向其中加入25單位限制性酶BamHL(New England Biolabs生產(chǎn))，隨后37℃消化過夜。通過乙醇沉淀法從反應(yīng)溶液中收集DNA片段，溶解在20μl TE緩沖液(pH 8.0)(10mmol/l Tris-HCl，1mmol/l EDTA)中，并進(jìn)行0.6％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳。電泳后，基因組DNA按照已知的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，3683(1979)]轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。轉(zhuǎn)移后，尼龍膜在80℃進(jìn)行熱處理2小時(shí)。
分別地，Southern印跡的探針制備如下。首先，根據(jù)下面的步驟使用與參考實(shí)施例獲得的FUT8基因組區(qū)中靶向載體同源區(qū)之外部分的序列結(jié)合的引物(SEQ ID NO9和10)進(jìn)行PCR。特異地，制備20μl反應(yīng)溶液[DNA聚合酶ExTaq(Takara Shuzo生產(chǎn))，ExTaq緩沖液(Takara Shuzo生產(chǎn))，0.2mmol/l dNTPs，0.5μmol/l上述基因特異的引物(SEQ ID NO9和10)]，所述反應(yīng)溶液含4.0ng參考實(shí)施例(2)中獲得的質(zhì)粒pFUT8fgE2-2，通過25個(gè)循環(huán)的94℃加熱1分鐘、94℃30秒、55℃30秒和74℃1分鐘作為一個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR。PCR后，反應(yīng)溶液進(jìn)行1.75％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳，大約230bp的探針DNA片段被純化。采用[α-32P]dCTP 1.75MBq和Megaprime DNA標(biāo)記系統(tǒng)，dCTP(Ainersham Pharmacia Biotech生產(chǎn))，對(duì)5μl探針DNA溶液進(jìn)行放射性同位素標(biāo)記。
雜交如下進(jìn)行。首先，上述尼龍膜被封裝在滾瓶中，向其中加入15ml雜交液[5×SSPE，50×Denhaldt′s溶液，0.5％(w/v)SDS，100μg/ml鮭精DNA]，隨后在65℃雜交3小時(shí)。接著，用32P-標(biāo)記的探針DNA被熱變性并倒入瓶中，65℃加熱過夜。
雜交后，在50ml 2×SSC-0.1％(w/v)SDS中浸濕尼龍膜并65℃加熱15分鐘。重復(fù)上述沖洗操作兩次后，在50ml 0.2×SSC-0.1％(w/v)SDS中浸濕該膜并在65℃加熱15分鐘。沖洗后，尼龍膜在-80℃與X線膠片接觸以顯影。
通過上述用限制性酶BamHI處理，從野生型FUT8等位基因中獲得了大約25.5Kb的DNA片段。另一方面，通過相同的限制性酶處理，從發(fā)生靶向載體同源重組的等位基因中獲得了大約20.0Kb的DNA片段。
基于本方法，從陽性克隆50-10-104的基因組DNA中發(fā)現(xiàn)了大約25.5Kb和大約20.0Kb的上述特異片段(
圖16)。由于兩個(gè)片段的數(shù)量比是1∶1，證實(shí)克隆是半敲除的克隆，其中FUT8等位基因的一個(gè)拷貝是斷裂的。
3.制備基因組中FUT8基因被雙敲除的CHO/DG44細(xì)胞 (1)制備靶向載體導(dǎo)入的克隆 在實(shí)施例3的1項(xiàng)中構(gòu)建的中國(guó)倉(cāng)鼠FUT8基因組區(qū)靶向載體pKOFUT8Puro被導(dǎo)入本實(shí)施例2項(xiàng)中獲得的FUT8半敲除克隆50-10-104。
根據(jù)以下步驟，通過電穿孔導(dǎo)入質(zhì)粒pKOFUT8Puro的基因[Cytotechnology(電穿孔)，3，133(1990)]。首先，440μg質(zhì)粒pKOFUT8Puro被溶解在含100μg/ml BSA(New England Biolabs生產(chǎn))的2.4ml SalI的NE緩沖液(New England Biolabs生產(chǎn))中，向其中加入800單位限制性酶SalI(New England Biolabs生產(chǎn))，通過37℃消化5小時(shí)進(jìn)行線性化。用苯/氯仿抽提提取反應(yīng)溶液，隨后乙醇沉淀，回收的線性質(zhì)粒被制成1μg/μl的水溶液。分別地，50-10-104懸浮在K-PBS緩沖液(137mmol/l KCl，2.7mmol/l NaCl，8.1mmol/l Na2HPO4，1.5mmol/l KH2PO4，4.0mmol/lMgCl2)中至8×107細(xì)胞/ml密度。200μl細(xì)胞懸浮液(1.6×l06細(xì)胞)與4μl(4μg)上述線性化質(zhì)?；旌虾?，全部量的細(xì)胞-DNA混合物液體被轉(zhuǎn)移進(jìn)GenePulser Cuvette(電極間距離2mm)(由BIO-RAD生產(chǎn))，并用Gene Pulser細(xì)胞融合設(shè)備(由BIO-RAD生產(chǎn))以350V脈沖壓和250μF電容進(jìn)行基因?qū)搿?dǎo)入基因的細(xì)胞懸浮液懸浮在添加了10％胎牛血清(由Invitrogen生產(chǎn))和1×濃度HT添加物(Invitrogen生產(chǎn))的IMDM培養(yǎng)基(由Invitrogen生產(chǎn))中，并接種在10cm的粘附細(xì)胞培養(yǎng)碟(Falcon生產(chǎn))上。在5％CO2和37℃下孵育細(xì)胞24小時(shí)后，去除培養(yǎng)上清物，以10ml分發(fā)添加了15μg/ml嘌呤霉素(SIGMA生產(chǎn))、1×濃度HT添加物(Invitrogen生產(chǎn))和10％胎牛血清(Invitrogen生產(chǎn))的IMDM培養(yǎng)基(Invitrogen生產(chǎn))。每隔7天重復(fù)進(jìn)行培養(yǎng)基更換培養(yǎng)15天以獲得耐藥克隆。
(2)通過基因組Southern印跡診斷同源重組 根據(jù)以下步驟，通過基因組Southern印跡對(duì)(1)項(xiàng)中獲得的耐藥克隆進(jìn)行同源重組診斷。
從發(fā)現(xiàn)嘌呤霉素-抗性克隆的10cm碟中去除培養(yǎng)上清物，注入7ml磷酸鹽緩沖液，然后轉(zhuǎn)移到立體顯微鏡下。接著，刮下集落，用Pipetteman(GILSON生產(chǎn))吸取并收集到96孔圓底平板(Falcon生產(chǎn))中。胰蛋白酶處理后，每個(gè)克隆被接種在貼附細(xì)胞的96孔平底板(AsahiTechnoglass生產(chǎn))上，在添加了15μg/ml嘌呤霉素(SIGMA生產(chǎn))、1×濃度HT添加物(Invitrogen生產(chǎn))和10％胎牛血清(Invitrogen生產(chǎn))的IMDM培養(yǎng)基(Invitrogen生產(chǎn))中培養(yǎng)1周。
培養(yǎng)后，用胰蛋白酶處理平板的每個(gè)克隆，然后種在貼附細(xì)胞的24孔平底板上(Greiner生產(chǎn))。在添加了15μg/ml嘌呤霉素(SIGMA生產(chǎn))、1×濃度HT添加物(Invitrogen生產(chǎn))和10％胎牛血清(Invitrogen生產(chǎn))的IMDM培養(yǎng)基(Invitrogen生產(chǎn))中培養(yǎng)1周后，克隆被接種在貼附細(xì)胞的6孔平底板(Greiner生產(chǎn))上。根據(jù)已知的方法[Nucleic Acids Research，3，2303，(1976)]從平板上制備每個(gè)克隆的基因組DNA，在150μl TE-核糖核酸酶緩沖液(pH 8.0)(10mmol/l Tris-HCl，1mmol/l ETDA，200μg/ml核糖核酸酶A)中溶解過夜。
在含100μg/ml BSA(New England Biolabs生產(chǎn))的120μl BamHI的NE緩沖液(New England Biolabs生產(chǎn))中溶解12μg上面制備的基因組DNA，加入25單位限制性酶BamHI(New England Biolabs生產(chǎn))，隨后37℃消化過夜。通過乙醇沉淀法從反應(yīng)溶液中收集DNA片段，溶解在20μl TE緩沖液(pH 8.0)(10mmol/l Tris-HCl，1mmol/l EDTA)中，并進(jìn)行0.6％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳。電泳后，基因組DNA按照已知的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，3683(1979)]轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。轉(zhuǎn)移后，尼龍膜在80℃進(jìn)行熱處理2小時(shí)。
分別地，Southern印跡所用的探針制備如下。首先，使用與FUT8基因組區(qū)中靶向載體同源區(qū)之外部分的序列結(jié)合的引物(SEQ ID NO11或12)，根據(jù)以下步驟進(jìn)行PCR。特異地，制備20μl反應(yīng)溶液[DNA聚合酶ExTaq(Takara Shuzo生產(chǎn))，ExTaq緩沖液(Takara Shuzo生產(chǎn))，0.2mmol/l dNTPs，0.5μmol/l上述的基因特異引物(SEQ ID NO11和12)]，所述反應(yīng)溶液含4.0ng參考實(shí)施例(2)中獲得的質(zhì)粒pFUT8fgE2-2，通過94℃加熱1分鐘，隨后25個(gè)循環(huán)的94℃30秒、55℃30秒和74℃1分鐘反應(yīng)作為一個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR。PCR后，反應(yīng)溶液進(jìn)行1.75％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳，大約230bp的探針DNA片段被純化。采用[α-32P]dCTP1.75MBq和Megaprime DNA標(biāo)記系統(tǒng)、dCTP(Amersham PharmaciaBiotech生產(chǎn))對(duì)5μl探針DNA溶液進(jìn)行放射標(biāo)記。
雜交如下進(jìn)行。首先，上述尼龍膜被封裝在滾瓶中，向其中加入15ml雜交液[5×SSPE，50×Denhalt′s溶液，0.5％(w/v)SDS，100μg/ml鮭精DNA]，在65℃進(jìn)行預(yù)雜交3小時(shí)。然后，用32P標(biāo)記的探針DNA被熱變性并倒入瓶中，65℃加熱過夜。
雜交后，在50ml 0.2×SSC-0.1％(w/v)SDS中浸濕尼龍膜并65℃加熱15分鐘。重復(fù)上述沖洗操作兩次，然后在50ml0.2×SSC-0.1％(w/v)SDS中浸濕該膜并在65℃加熱15分鐘。沖洗后，尼龍膜在-80℃與X線膠片接觸以顯影。
通過上述用限制性酶BamHI處理，從野生型FUT8等位基因中獲得了大約25.5Kb的DNA片段。另一方面，通過相同的限制性酶處理，從發(fā)生靶向載體同源重組的等位基因中獲得了大約20.0Kb的DNA片段。
通過本方法，從耐藥克隆WK704的基因組DNA中僅發(fā)現(xiàn)了大約20.0Kb的同源重組區(qū)特異片段(
圖17)。由于對(duì)野生型等位基因特異的片段消失(箭頭所指部分)，證實(shí)克隆是基因組上全部現(xiàn)有FUT8等位基因斷裂的克隆。
4.從FUT8基因雙敲除的CHO/DG44細(xì)胞中去除耐藥基因 (1)導(dǎo)入Cre重組酶表達(dá)載體 Cre重組酶表達(dá)載體pBS185(Life Technologies生產(chǎn))被導(dǎo)入本實(shí)施方案3項(xiàng)制備的FUT8雙敲除克隆的WK704中。
根據(jù)如下步驟，通過電穿孔[Cytolechnology，3，133(1990)]將質(zhì)粒pBS185基因?qū)朊總€(gè)FUT8雙敲除克隆中。首先，每個(gè)FUT8雙敲除克隆被懸浮在K-PBS緩沖液(137mmol/l KCl，2.7mmol/l NaCl，8.1mmol/lNa2HPO4，1.5mmol/l KH2PO4，4.0mmol/l MgCl2)中至8×107細(xì)胞/ml密度。200μl細(xì)胞懸浮液(1.6×106細(xì)胞)與4μg質(zhì)粒pBS185混合后，全部量的細(xì)胞-DNA混合物液體被轉(zhuǎn)移進(jìn)Gene Pulser Cuvette(電極距離2mm)(由BIO-RAD生產(chǎn))，用細(xì)胞融合設(shè)備Gene Pulser(由BIO-RAD生產(chǎn))以350V脈沖壓和250μF電容進(jìn)行基因?qū)?。?dǎo)入后，每個(gè)細(xì)胞懸浮液懸浮在10ml添加了10％胎牛血清(由Invitrogen生產(chǎn))和1×濃度HT添加物(Invitrogen生產(chǎn))的IMDM培養(yǎng)基(由Invitrogen生產(chǎn))中，并用相同的培養(yǎng)基進(jìn)一步稀釋20,000倍。每個(gè)稀釋的溶液接種在7個(gè)10cm的粘附細(xì)胞培養(yǎng)碟(Falcon生產(chǎn))上，在5％CO2中37℃孵育10天以形成集落。
(2)制備Cre重組酶表達(dá)載體導(dǎo)入克隆 根據(jù)以下步驟從由WK704基因?qū)氆@得的集落中收集任意的克隆。首先，從10cm碟中去除培養(yǎng)上清物，注入7ml磷酸鹽緩沖液，然后轉(zhuǎn)移到立體顯微鏡下。接著，刮下集落，用Pipetman(由GILSON生產(chǎn))吸取并收集在96孔圓底平板(Falcon生產(chǎn))中。胰蛋白酶處理后，每個(gè)克隆被接種在貼附細(xì)胞的96孔平底平板(Iwaki Glass生產(chǎn))上，在添加了10％胎牛血清(Invitrogen生產(chǎn))和1×濃度HT添加物(Invitrogen生產(chǎn))的IMDM培養(yǎng)基(Invitrogen生產(chǎn))中培養(yǎng)1周。
培養(yǎng)后，用胰蛋白酶處理上面平板中的每個(gè)克隆，與兩倍量的冷凍培養(yǎng)基(20％DMSO，40％胎牛血清，40％IMDM)混合。其一半量接種在貼附細(xì)胞的96孔平底板(Asahi Technoglass生產(chǎn))上作為復(fù)制板，另一方面，剩下的一半被低溫貯藏作為母板。
然后，在添加了600μg/ml G418(Nacalai Tesque生產(chǎn))、15μg/ml嘌呤霉素(SIGMA生產(chǎn))、10％胎牛血清(Invitrogen生產(chǎn))和1×濃度HT添加物(Invitrogen生產(chǎn))的IMDM培養(yǎng)基(Invitrogen生產(chǎn))中孵育復(fù)制板7天。根據(jù)Cre重組酶的表達(dá)，在有G418和嘌呤霉素情況下陽性克隆消失，陽性克隆中l(wèi)oxP序列間兩個(gè)等位基因上的耐藥基因被去除。用此陰性選擇技術(shù)發(fā)現(xiàn)了陽性克隆。
(3)通過基因組Southern印跡診斷耐藥基因去除 根據(jù)以下步驟，通過基因組Southern印跡對(duì)(2)項(xiàng)中獲得的陽性克隆(4-5-C3)的耐藥基因去除進(jìn)行診斷。
在(2)項(xiàng)中冷凍狀態(tài)貯藏的母板間，選擇含以上陽性克隆的96孔平板并在5％CO2下37℃放置10分鐘。放置后，對(duì)應(yīng)于以上克隆孔的細(xì)胞被接種到貼附細(xì)胞的24孔平底板(Greiner生產(chǎn))上。在添加了10％胎牛血清(Invitrogen生產(chǎn))和1×濃度HT添加物(Invitrogen生產(chǎn))的IMDM培養(yǎng)基(Invitrogen生產(chǎn))中培養(yǎng)1周后，細(xì)胞被接種在用于貼附細(xì)胞的6孔平底板(Greiner生產(chǎn))上。按照已知的方法[Nucleic Acids Research，3，2303(1976)]從平板中制備每個(gè)克隆的基因組DNA，并在150μl TE-核糖核酸酶緩沖液(pH 8.0)(10mmol/l Tris-HCl，1mmol/l EDTA，200μg/ml核糖核酸酶A)中溶解過夜。
在120μl含100μg/ml BSA(New England Biolabs生產(chǎn))NE緩沖液2(New England Biolabs生產(chǎn))中溶解12μg上面制備的基因組DNA，向其中加入20單位限制性酶NheI(New England Biolabs生產(chǎn))，隨后37℃消化過夜。通過乙醇沉淀法從反應(yīng)溶液中收集DNA片段，溶解在20μl TE緩沖液(pH 8.0)(10mmol/l Tris-HCl，1mmol/l EDTA)中，并進(jìn)行0.6％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳。電泳后，基因組DNA通過已知的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，3683(1979)]轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。轉(zhuǎn)移后，尼龍膜在80℃加熱2小時(shí)。
分別地，用于Southern印跡的探針制備如下。首先，使用與FUT8基因組區(qū)中靶向載體同源區(qū)之外部分的序列結(jié)合的引物(SEQ ID NO10和11)，根據(jù)以下步驟進(jìn)行PCR。特異地，制備20μl反應(yīng)溶液[DNA聚合酶ExTaq(Takara Shuzo生產(chǎn))，ExTaq緩沖液(Takara Shuzo生產(chǎn))，0.2mmol/l dNTPs，0.5μmol/l上述的基因特異引物(SEQ ID NOs11和12)]，所述反應(yīng)溶液含4.0ng參考實(shí)施例(2)中獲得的質(zhì)粒pFUT8fgE2-2，通過94℃加熱1分鐘，隨后25個(gè)循環(huán)的94℃30分鐘、55℃30分鐘和74℃1分鐘反應(yīng)作為一個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR。PCR后，反應(yīng)溶液進(jìn)行1.75％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳，大約230bp的探針DNA片段被純化。采用[α-32P]dCTP1.75MBq和Megaprime DNA標(biāo)記系統(tǒng)、dCTP(Amersham PharmaciaBiotech生產(chǎn))對(duì)5μl探針DNA溶液進(jìn)行放射標(biāo)記。設(shè)計(jì)與參考實(shí)施方案中獲得的FUT8基因組區(qū)中靶向載體同源區(qū)外序列結(jié)合的引物(SEQ EDNOs9和10)。
雜交如下進(jìn)行。首先，上述尼龍膜被封裝在滾瓶中，添加15ml雜交液[5×SSPE，50×Denhalt′s溶液，0.5％(w/v)SDS，100μg/ml鮭精DNA]在65℃3小時(shí)進(jìn)行雜交。然后，用32P-標(biāo)記的探針DNA被熱變性并倒入瓶中，并在65℃加熱過夜。
雜交后，在50ml 2×SSC-0.1％(w/v)SDS中浸濕尼龍膜并在65℃加熱15分鐘。重復(fù)上述沖洗操作兩次后，在50ml 0.2×SSC-0.1％(w/v)SDS中浸濕膜并在65℃加熱15分鐘。沖洗后，尼龍膜在-80℃與X線膠片接觸以顯影。
通過上述的限制性酶NheI處理，從野生型FUT8等位基因中形成了大約8.0Kb的DNA片段。此外，通過相同的限制性酶處理，從發(fā)生了靶向載體同源重組的等位基因中獲得了大約9.5Kb的DNA片段。而且，當(dāng)新霉素抗性基因(大約1.6Kb)或嘌呤霉素抗性基因(大約1.5kb)從發(fā)生了同源重組的等位基因中被去除時(shí)，用相同的處理獲得了大約8.0Kb的DNA片段。
通過本方法，從檢測(cè)的陽性克隆4-5-C3(實(shí)施例4(3)項(xiàng)中的陽性克隆)的基因組DNA中僅發(fā)現(xiàn)了大約8.0Kb的同源重組區(qū)特異片段(
圖18)。
實(shí)施例6 FUT8等位基因雙敲除的CHO/DG44細(xì)胞中抗體分子的表達(dá) 1.制備抗CD20嵌合抗體表達(dá)載體 (1)構(gòu)建編碼抗CD20小鼠單克隆抗體VL的cDNA 如下采用PCR構(gòu)建編碼抗CD20小鼠單克隆抗體2B8 VL的氨基酸序列的cDNA(SEQ ID NO17)，所述抗體在WO94/11026中描述。
首先，PCR擴(kuò)增引物的結(jié)合核苷序列(包括為人源化抗體表達(dá)克隆到載體上的限制性酶識(shí)別位點(diǎn))被加到WO94/11026中描述的VL核苷序列的5′-末端和3′-末端。設(shè)計(jì)的核苷序列從5′-末端側(cè)被分成總共6個(gè)核苷序列，每個(gè)大約100個(gè)堿基(以其尾部具有大約20個(gè)堿基的末端共同序列的方式調(diào)節(jié)相鄰的核苷序列)，并以正義鏈和反義鏈的交替順序制備6個(gè)合成的DNA，SEQ ID NOs19，20，21，22，23和24(委托GENSET公司)。
每個(gè)寡核苷加入50μL反應(yīng)溶液[KOD DNA聚合酶添加產(chǎn)物PCR緩沖液#1(Toyobo生產(chǎn))，0.2mM dNTPs，1mM氯化鎂，0.5μM M13引物M4(Takara Shuzo生產(chǎn))，0.5μM M13引物RV(Takara Shuzo生產(chǎn))]中至終濃度0.1μM。采用DNA熱循環(huán)儀GeneAmp PCR System 9600(PerkinElmer生產(chǎn))，添加2.5單位KOD DNA聚合酶(Toyobo生產(chǎn))后，94℃加熱反應(yīng)溶液3分鐘，隨后25個(gè)循環(huán)的94℃30秒、55℃30秒和℃1分鐘加熱為一個(gè)循環(huán)，進(jìn)一步在72℃加熱10分鐘。然后，25μL反應(yīng)溶液用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN生產(chǎn))進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以收集大約0.44kb VL的PCR產(chǎn)物。
然后，通過限制性酶SmaI(Takara Shuzo生產(chǎn))從質(zhì)粒pBluescriptllSK(-)(Stratagene生產(chǎn))中獲得的DNA 0.1μg和上面獲得的大約0.1μg PCR產(chǎn)物中加入無菌水至總體積7.5μL，向其中加入7.5μL TAKARA連接試劑盒ver.2(Takara Shuzo生產(chǎn))的溶液I和0.3μL限制性酶SmaI(TakaraShuzo生產(chǎn))，隨后在22℃反應(yīng)2小時(shí)。采用如此獲得的重組體質(zhì)粒DNA溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a株(Toyobo生產(chǎn))。從轉(zhuǎn)化株克隆中制備每個(gè)質(zhì)粒DNA，用BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kitv2.0(Applied Biosystems生產(chǎn))根據(jù)所附的廠家說明書進(jìn)行反應(yīng)，然后用同一公司的DNA測(cè)序儀ABI PRISM 377分析核苷序列。從而，獲得
圖19中顯示的具有目的核苷序列的質(zhì)粒pBS-2B8L。
(2)構(gòu)建編碼抗CD20小鼠單克隆抗體VH的cDNA 如下采用PCR構(gòu)建編碼抗CD20小鼠單克隆抗體2B8 VH的氨基酸序列的cDNA(SEQ ID NO18)，所述抗體在WO94/11026中描述。
首先，PCR擴(kuò)增引物的結(jié)合核苷序列(包括為人源化抗體表達(dá)克隆到載體上的限制性酶識(shí)別序列)被加到WO94/11026中描述的VH核苷序列的5′-末端和3′-末端。設(shè)計(jì)的核苷序列從5′-末端側(cè)被分成總共6個(gè)核苷序列，每個(gè)大約100個(gè)堿基(以其尾部具有大約20個(gè)堿基的末端共同序列的方式調(diào)節(jié)相鄰的核苷序列)，并以正義鏈和反義鏈的交替順序制備6個(gè)合成的DNA，SEQ ID NOs25，26，27，28，29和30(委托GENSET公司)。
每個(gè)寡核苷加入50μL反應(yīng)溶液[KOD DNA聚合酶添加產(chǎn)物PCR緩沖液#1(Toyobo生產(chǎn))，0.2mM dNTPs，1mM氯化鎂，0.5μM M13引物M4(Takara Shuzo生產(chǎn))，0.5μM M13引物RV(Takara Shuzo生產(chǎn))]中至終濃度0.1μM，和采用DNA熱循環(huán)儀GeneAmp PCR System 9600(PerkinElmer生產(chǎn))，在其中加入2.5單位KOD DNA聚合酶(Toyobo生產(chǎn))后，94℃加熱3分鐘，隨后25個(gè)循環(huán)的94℃30秒、55℃30秒和℃1分鐘加熱為一個(gè)循環(huán)，進(jìn)一步在72℃加熱19分鐘。然后，25μL反應(yīng)溶液用QIAquickGel Extraction Kit(QIAGEN生產(chǎn))進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以收集大約0.49kb VH的PCR產(chǎn)物。
然后，通過限制性酶SmaI(Takara Shuzo生產(chǎn))從質(zhì)粒pBluescriptIISK(-)(Stratagene生產(chǎn))中獲得的DNA 0.1μg和上述獲得的大約0.1μgPCR產(chǎn)物中加入無菌水至總體積7.5μL，向其中加入7.5μL TAKARA連接試劑盒ver.2(Takara Shuzo Co生產(chǎn))的溶液I和0.3μL限制性酶SmaI(Takara Shuzo生產(chǎn))，隨后22℃反應(yīng)過夜。
采用如此獲得的重組體質(zhì)粒DNA溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α株(Toyobo生產(chǎn))。從轉(zhuǎn)化株克隆中制備每個(gè)質(zhì)粒DNA，用BigDyeTerminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit V2.0(AppliedBiosystems生產(chǎn))根據(jù)所附的廠家說明書進(jìn)行反應(yīng)，然后用同一公司的DNA測(cè)序儀ABI PRISM 377分析核苷序列。從而，獲得圖20中顯示的具有目的核苷序列的質(zhì)粒pBS-2B8H。
然后，設(shè)計(jì)表示為SEQ ID NO31的合成DNA以將位置14的氨基酸殘基從Ala取代為Pro，該取代使用pBluescriptII的LA PCR體外突變引物對(duì)(Takara Shuzo生產(chǎn))通過PCR進(jìn)行如下。制備50μL含lng上述質(zhì)粒pBS-2B8H的反應(yīng)溶液[LA PCR緩沖液II(由Takara Shuzo生產(chǎn))，2.5單位TAKARA LA Taq，0.4mM dNTPs，2.5mM氯化鎂，50nM T3 BcaBEST測(cè)序引物(Takara Shuzo生產(chǎn))，50nM上述引物以誘導(dǎo)突變(SEQ ID NO31，由GENSET生產(chǎn))]后，用DNA熱循環(huán)儀GeneAmp PCR System9600(Perkin Elmer生產(chǎn))，使反應(yīng)溶液進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的94℃加熱30秒、55℃2分鐘和72℃一分半鐘為一個(gè)循環(huán)的反應(yīng)。然后，30μL反應(yīng)溶液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN生產(chǎn))收集大約0.44kb的PCR產(chǎn)物并制成30的水溶液。此外，用50μL含1ng上述質(zhì)粒pBS-2B8H的反應(yīng)溶液[LA PCR緩沖液II(由Takara Shuzo Co.，Ltd.生產(chǎn))，2.5單位TAKARA LA Taq，0.4mM dNTPs，2.5mM氯化鎂，50nM T7BcaBEST測(cè)序引物(Takara Shuzo Co.，Ltd.生產(chǎn))，50nM MUT Bl引物(Takara Shuzo Co.，Ltd.生產(chǎn))]，以相同的方式進(jìn)行PCR。然后，30μL反應(yīng)溶液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN生產(chǎn))收集大約0.63kb的PCR產(chǎn)物并制成30μL的水溶液。隨后，0.5μL上面分別獲得的大約0.44kb的PCR產(chǎn)物和大約0.63kb的PCR產(chǎn)物被加入47.5μL反應(yīng)溶液[LA PCR緩沖液II(Takara Shuzo生產(chǎn))，0.4mM dNTPs，2.5mM氯化鎂]中，用DNA熱循環(huán)儀GeneAmp PCR System 9600(PerkinElmer生產(chǎn))，使反應(yīng)溶液進(jìn)行如下反應(yīng)90℃加熱10分鐘，隨后冷卻至37℃超過60分鐘，然后保持37℃溫度15分鐘從而進(jìn)行DNA退火。添加2.5單位TAKARA LA Taq(Takara Shuzo生產(chǎn))并在72℃反應(yīng)3分鐘后，分別加入10pmol T3 BcaBEST測(cè)序引物(Takara Shuzo生產(chǎn))和T7 BcaBEST測(cè)序引物(Takara Shuzo生產(chǎn))，將反應(yīng)溶液制成50μL并進(jìn)行10次循環(huán)反應(yīng)94℃加熱30秒，55℃2分鐘和72℃一分半鐘為一循環(huán)。然后，用QIA快速PCR純化試劑盒(QIAGEN生產(chǎn))純化25μL反應(yīng)溶液，一半量用10單位限制性酶KpnI(Takara Shuzo Co.，Ltd.生產(chǎn))和10單位限制性酶SacI(Takara Shuzo Co.，Ltd.生產(chǎn))在37℃進(jìn)行反應(yīng)1小時(shí)。通過瓊脂糖凝膠電泳分餾反應(yīng)溶液并收集大約0.59kb的KpnI-SacI片段。
接著，用10單位限制性酶KpnI(Takara Shuzo生產(chǎn))和10單位限制性酶SacI(Takara Shuzo生產(chǎn))在37℃與1μg pBluescriptll SK(-)(Stratagene生產(chǎn))反應(yīng)1小時(shí)，然后，通過瓊脂糖凝膠電泳分餾反應(yīng)溶液以收集大約2.9kb的KpnI-SacI片段。
采用DNA Ligation Kit Ver.2(Takara Shuzo生產(chǎn))的溶液I，根據(jù)所附的廠家說明書連接衍生自如上所述獲得的PCR產(chǎn)物的KpnI-SacI片段和衍生自質(zhì)粒pBluescriptII SK(-)的KpnI-SacI片段。采用如此獲得的重組體質(zhì)粒DNA溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α株(Toyobo生產(chǎn))。從轉(zhuǎn)化株克隆中制備每個(gè)質(zhì)粒DNA，用BigDye Terminator Cycle Sequencing ReadyReaction Kit v2.0(Applied Biosystems生產(chǎn))根據(jù)所附的廠家說明書進(jìn)行反應(yīng)，然后用同一公司的DNA測(cè)序儀ABI PRISM 377分析核苷序列。
從而，獲得圖20中顯示的具有目的核苷序列的質(zhì)粒pBS-2B8Hm。
(3)構(gòu)建抗CD20人嵌合抗體的表達(dá)載體。
采用為人源化抗體表達(dá)的載體pKANTEX93[Mol.ImmunoL，37，1035(2000)]及(1)和(2)項(xiàng)中獲得的質(zhì)粒pBS-2B8L和pBS-2B8Hm，抗CD20人嵌合抗體(此后稱為″抗CD20嵌合抗體″)的表達(dá)載體pKANTEX2B8P構(gòu)建如下。
在2μg(1)項(xiàng)獲得的質(zhì)粒pBS-2B8L用10單位限制性酶BsiWI(NewEngland Biolabs生產(chǎn))在55℃反應(yīng)1小時(shí)后，進(jìn)一步用10單位限制性酶EcoRI(Takara Shuzo生產(chǎn))在37℃進(jìn)行反應(yīng)1小時(shí)。通過瓊脂糖凝膠電泳分餾反應(yīng)溶液以收集大約0.41kb的BsiWI-EcoRI片段。
然后，2μg人源化抗體表達(dá)的質(zhì)粒pKANTEX93用10單位限制性酶BsiWI(New England Biolabs生產(chǎn))在55℃反應(yīng)1小時(shí)，并進(jìn)一步用10單位限制性酶EcoRI(Takara Shuzo生產(chǎn))在37℃進(jìn)行反應(yīng)1小時(shí)。通過瓊脂糖凝膠電泳分餾反應(yīng)溶液以收集大約12.75kb的BsiWI-EcoRI片段。
接著，采用DNA Ligation Kit Ver.2(Takara Shuzo生產(chǎn))的溶液I，根據(jù)所附的廠家說明書連接上面獲得的衍生自質(zhì)粒pBS-2B8L的BsiWI-EcoRI片段和衍生自質(zhì)粒pKANTEX93的BsiWI-EcoRI片段。采用如此獲得的重組體質(zhì)粒DNA溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α株(Toyobo生產(chǎn))以獲得圖21顯示的質(zhì)粒pKANTEX2B8-L。
然后，2μg(2)項(xiàng)獲得的質(zhì)粒pBS-2B8Hm用10單位限制性酶ApaI(Takara Shuzo Co.，Ltd.生產(chǎn))在37℃反應(yīng)1小時(shí)，再進(jìn)一步用10單位限制性酶NotI(Takara Shuzo Co.，Ltd生產(chǎn))在37℃進(jìn)行反應(yīng)1小時(shí)。通過瓊脂糖凝膠電泳分餾反應(yīng)溶液以收集大約0.45kb的ApaI-NotI片段。
接著，3μg質(zhì)粒pKANTEX2B8-L用10單位限制性酶ApaI(TakaraShuzo Co.，Ltd.生產(chǎn))在37℃反應(yīng)1小時(shí)，再進(jìn)一步用10單位限制性酶NotI(Takara Shuzo Co.，Ltd生產(chǎn))在37℃進(jìn)行反應(yīng)1小時(shí)。通過瓊脂糖凝膠電泳分餾反應(yīng)溶液以收集大約13.16kb的ApaI-NotI片段。
然后，采用DNA Ligation Kit Ver.2(Takara Shuzo生產(chǎn))的溶液I，根據(jù)所附的廠家說明書連接上面獲得的衍生自質(zhì)粒pBS-2B8Hm的ApaI-NotI片段和衍生自質(zhì)粒pKANTEX2B8-L的ApaI-NotI片段。采用如此獲得的重組體質(zhì)粒DNA溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α株(Toyobo生產(chǎn))，從轉(zhuǎn)化株克隆制備每個(gè)質(zhì)粒DNA。
用獲得的質(zhì)粒，采用BigDye Terminator Cycle Sequencing ReadyReaction Kit v2.0(Applied Biosystems生產(chǎn))，以同一公司的DNA測(cè)序儀ABI PRISM 377分析核苷序列。結(jié)果證實(shí)，獲得了圖21顯示的以目的DNA克隆的質(zhì)粒pKANTEX2B8P。
2.抗CD20嵌合抗體的表達(dá) 本實(shí)施例的1項(xiàng)獲得的抗CD20抗體表達(dá)載體pKANTEX2B8P被導(dǎo)入實(shí)施例5的3項(xiàng)制備的FUT8基因雙敲除克隆WK704中。
按如下步驟通過電穿孔[Cytotechnology(電穿孔)，3，133(1990)]進(jìn)行WK704的質(zhì)粒pKANTEX2B8P基因?qū)搿Ｊ紫龋?0μg質(zhì)粒pKANTEX2B8P溶解在100μl NE緩沖液4(New England Biolabs生產(chǎn))中，向其中加入40單位限制性酶AatII(New England Biolabs生產(chǎn))，然后37℃消化2小時(shí)進(jìn)行線性化。用苯/氯仿抽提提取反應(yīng)溶液，隨后乙醇沉淀，并將回收的線性質(zhì)粒制成1μg/μl的水溶液。分別地，WK704懸浮在K-PBS緩沖液(137mmol/l KCl，2.7mmol/l NaCl，8.1mmol/l Na2HPO4，1.5mmol/l KH2PO4，4.0mmol/l MgCl2)中至8×107細(xì)胞/ml密度。200μl細(xì)胞懸浮液(1.6×106細(xì)胞)與4μl(4μg)上述線性化質(zhì)粒結(jié)合后，全部細(xì)胞-DNA混合物被轉(zhuǎn)移到Gene Pulser Cuvette(電極距離2mm)(由BIO-RAD生產(chǎn))，用細(xì)胞融合設(shè)備Gene Pulser(由BIO-RAD生產(chǎn))以350V脈沖壓和250μF電容進(jìn)行基因?qū)?。基因?qū)牒?，?xì)胞懸浮液懸浮在添加了10％胎牛血清(由Invitrogen生產(chǎn))和1×濃度HT添加物(Invitrogen生產(chǎn))的IMDM培養(yǎng)基(由Invitrogen生產(chǎn))中，并接種在粘附細(xì)胞培養(yǎng)的T75燒瓶(Greiner生產(chǎn))上。在5％CO2中37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，去除培養(yǎng)上清物，向其中加入10ml添加了10％胎牛透析血清(Invitrogen生產(chǎn))的IMDM培養(yǎng)基(Invitrogen生產(chǎn))。每隔3至4天重復(fù)更換培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)15天，獲得WK704-2B8P轉(zhuǎn)化株。此外，克隆WK704-2B8P，以WK704-2B8P的名字于2003年3月20日存儲(chǔ)在International Patent Organism Depositary，National Institute of Advanced Industrial Science and Technology(Tsukuba Central 6，1，Higashi 1-Chome Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566Japan)，作為FERM BP-8337。
3.抗神經(jīng)節(jié)苷脂GD3嵌合抗體的表達(dá) 表達(dá)抗神經(jīng)節(jié)苷脂GD3嵌合抗體的載體質(zhì)粒pKANTEX641被導(dǎo)入實(shí)施例5的3項(xiàng)中制備的FUT8基因雙敲除克隆WK704中，制備抗GD3嵌合抗體的穩(wěn)定表達(dá)克隆。pKANTEX641是包含載體質(zhì)粒pChi641LHGM4和載體pKANTEX93的衍生物，前者表達(dá)WOOO/61739中描述的抗GD3嵌合抗體，后者表達(dá)人源化抗體[Mol.Immunol.，37，1035(2000)]，其中含來自pChi641LHGM4的串聯(lián)抗體表達(dá)單位的EcoRI-HindIII片段與含來自pKANTEX93的復(fù)制起始的EcoRI-HindIII片段連接。
按如下步驟通過電穿孔[Cytotechnology(電穿孔)，3，133(1990)]進(jìn)行WK704的質(zhì)粒pKANTEX641基因?qū)?。首先?0μg質(zhì)粒pKANTEX641溶解在100μl NE緩沖液4(New England Biolabs生產(chǎn))中，向其中加入40單位限制性酶AatII(New England Biolabs生產(chǎn))，然后37℃消化2小時(shí)進(jìn)行線性化。用苯/氯仿抽提提取反應(yīng)溶液，隨后乙醇沉淀，并將回收的線性質(zhì)粒制成1μg/μl的水溶液。分別地，WK704懸浮在K-PBS緩沖液(137mmol/l KCl，2.7mmol/l NaCl，8.1mmol/l Na2HPO4，1.5mmol/l KH2PO4，4.0mmol/l MgCl2)中至8×107細(xì)胞/ml密度。200μl細(xì)胞懸浮液(1.6×106細(xì)胞)與4μl(4μg)上述線性化質(zhì)?；旌秃螅考?xì)胞-DNA混合物被轉(zhuǎn)移到Gene Pulser Cuvette(電極距離2mm)(由BIO-RAD生產(chǎn))，用細(xì)胞融合設(shè)備Gene Pulser(由BIO-RAD生產(chǎn))以350V脈沖壓和250μF電容進(jìn)行基因?qū)??；驅(qū)牒?，?xì)胞懸浮液懸浮在添加了10％胎牛血清(由Invitrogen生產(chǎn))和1×濃度HT添加物(Invitrogen生產(chǎn))的IMDM培養(yǎng)基(由Invitrogen生產(chǎn))中，并接種在粘附細(xì)胞培養(yǎng)的T75燒瓶(Greiner生產(chǎn))上。在5％CO2中37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，去除培養(yǎng)上清物，向其中加入10ml添加了10％胎牛透析血清(Invitrogen生產(chǎn))的IMDM培養(yǎng)基(Invitrogen生產(chǎn))。每隔3至4天重復(fù)更換培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)15天，獲得轉(zhuǎn)化株WK704-2871。此外，克隆WK704-2871，以WK704-2871的名字于2003年3月20日在International Patent Organism Depositary，NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology(Tsukuba Central6，1，Higashi 1-Chome Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566 Japan)存儲(chǔ)為FERM BP-8336。
4.抗CCR4嵌合抗體的表達(dá) 表達(dá)WO 01/64754描述的抗CCR4嵌合抗體的載體pKANTEX2160被導(dǎo)入實(shí)施方案5的3項(xiàng)中制備的FUT8基因雙敲除克隆WK704中，制備抗CCR4嵌合抗體的穩(wěn)定表達(dá)克隆。
按如下步驟進(jìn)行電穿孔技術(shù)[Cytotechnology(電穿孔)，3，133(1990)]將質(zhì)粒pKANTEX2160的基因?qū)隬K704。首先，15μg質(zhì)粒pKANTEX2160溶解在100μl NE緩沖液4(New England Biolabs生產(chǎn))中，向其中加入40單位限制性酶AatII(New England Biolabs生產(chǎn))，然后37℃消化2小時(shí)進(jìn)行線性化。用苯/氯仿抽提提取反應(yīng)溶液，隨后乙醇沉淀，并將回收的線性質(zhì)粒制成1μg/μl的水溶液。分別地，WK704懸浮在K-PBS緩沖液(137mmol/l KCl，2.7mmol/l NaCl，8.1mmol/l Na2HPO4，1.5mmol/l KH2PO4，4.0mmol/l MgCl2)中至8×l07細(xì)胞/ml密度。200μl細(xì)胞懸浮液(1.6×106細(xì)胞)與4μl(4μg)上述線性化質(zhì)粒結(jié)合后，全部細(xì)胞-DNA混合物被轉(zhuǎn)移到Gene Pulser Cuvette(電極距離2mm)(由BIO-RAD生產(chǎn))，用細(xì)胞融合設(shè)備Gene Pulser(由BIO-RAD生產(chǎn))以350V脈沖壓和250μF電容進(jìn)行基因?qū)?。基因?qū)牒?，?xì)胞懸浮液懸浮在添加了10％胎牛血清(由Invitrogen生產(chǎn))和1×濃度HT添加物(Invitrogen生產(chǎn))的IMDM培養(yǎng)基(由Invitrogen生產(chǎn))中，并接種在粘附細(xì)胞培養(yǎng)的T75燒瓶(Greiner生產(chǎn))上。在5％CO2中37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，去除培養(yǎng)上清物，向其中加入10ml添加了10％胎牛透析血清(Invitrogen生產(chǎn))的IMDM培養(yǎng)基(Invitrogen生產(chǎn))。每隔3至4天重復(fù)更換培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)15天，獲得轉(zhuǎn)化株WK704-2760。此外，克隆WK704-2760，以WK704-2760的名字于2003年3月20日在International Patent Organism Depositary，NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology(Tsukuba Central6，1，Higashi 1-Chome Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566 Japan)b保藏為FERM BP-8335。
5.抗體分子的純化 在本實(shí)施方案的2項(xiàng)中獲得的表達(dá)抗CD20抗體的克隆WK704-2B8P被懸浮在添加了10％胎牛透析血清(Invitrogen生產(chǎn))的IMDM培養(yǎng)基(Invitrogen生產(chǎn))中至3×105細(xì)胞/ml密度，300ml總體積被接種在10個(gè)貼附細(xì)胞培養(yǎng)的T182燒瓶(Greiner生產(chǎn))上。本實(shí)施方案3項(xiàng)中獲得的表達(dá)抗GD3抗體的克隆WK704-2871和本實(shí)施方案4項(xiàng)中獲得的表達(dá)抗CCR4抗體的克隆WK704-2760以相同的方式接種。培養(yǎng)3天后，去除每個(gè)克隆的所有培養(yǎng)上清物并換成EXCELL301培養(yǎng)基(JRHBiosciences生產(chǎn))。它們?cè)?％CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)7天，然后收集每個(gè)細(xì)胞懸浮液。收集的所有細(xì)胞懸浮液的每一個(gè)以3000rpm和4℃離心10分鐘以回收上清物，然后用0.22μm孔徑和500ml體積的PES膜(AsahiTechnoglass生產(chǎn))過濾上清物。
在直徑0.8cm的柱上充填0.5ml Mab Select(Amersham PharmaciaBiotech生產(chǎn))，然后順序地將3.0ml純化水和3.0ml 0.2mol/l硼酸-0.15mol/l NaCl緩沖液(pH 7.5)灌注到管中。此外，用2.0ml 0.1mol/l檸檬酸鹽緩沖液(pH 3.5)和1.5ml 0.2mol/l硼酸-0.15mol/l NaCl緩沖液(pH7.5)連續(xù)清洗以平衡載體。然后，300ml上述上清物充填到柱上后，用3.0ml 0.2mol/l 硼酸-0.15mol/l NaCl緩沖液(pH 7.5)沖洗。沖洗后，載體上吸附的抗體用1.25ml 0.1mol/l檸檬酸鹽緩沖液(pH 3.5)洗脫。在第一個(gè)250μl的洗脫部分被處理后，回收下一個(gè)洗脫部分1ml，通過與200μl2mol/l Tris-HCl(pH 8.5)混和被中和。獲得的洗脫溶液用10mol/l檸檬酸-0.15mol/l NaCl緩沖液(pH 6.0)在4℃透析過夜。透析后，回收抗體溶液，消毒并用0.22μm孔徑的Millex GV(MILLIPORE生產(chǎn))過濾。
實(shí)施例7 由FUT8等位基因雙敲除的CHO/DG44細(xì)胞產(chǎn)生的抗體組合物的體外細(xì)胞毒活性(ADCC活性) 為了評(píng)價(jià)實(shí)施方案6中純化的抗CD20抗體的體外細(xì)胞毒活性，ADCC活性檢測(cè)如下。
(1)制備靶細(xì)胞懸浮液 用RPMI 1640-FCS(5)培養(yǎng)基[添加了5％PCS的PRMI1640培養(yǎng)基(由GIBCO BRL生產(chǎn))]通過離心分離和懸浮沖洗培養(yǎng)在RPMI1640-FCS(10)培養(yǎng)基[添加了10％PCS的PRMI1640培養(yǎng)基(由GIBCO BRL生產(chǎn))]中的人B淋巴細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞系Raji細(xì)胞(JCRB9012)。然后，用RPMI1640-FCS(5)培養(yǎng)基制備懸浮液至2×106細(xì)胞/ml密度作為靶細(xì)胞懸浮液。
(2)制備效應(yīng)細(xì)胞懸浮液 采集50ml健康個(gè)體靜脈血后，在其中加入0.5ml肝素鈉(由ShimizuSeiyaku生產(chǎn))，隨后輕輕地混合。用Lymphoprep(由AXIS SHIELD生產(chǎn))根據(jù)廠家的使用說明書離心混合物(800g，20分鐘)以分離單核細(xì)胞相。用RPMI1640-FCS(5)培養(yǎng)基通過離心分離沖洗細(xì)胞3次，并用相同的培養(yǎng)基重懸浮至4×106細(xì)胞/ml密度，得到的懸浮液被用作效應(yīng)細(xì)胞懸浮液。
(3)ADCC活性的檢測(cè) 在96孔U-形底平板(由Falcon生產(chǎn))的每個(gè)孔中分發(fā)50μl(1×104細(xì)胞/孔)在上面(1)項(xiàng)中制備的靶細(xì)胞懸浮液。然后，添加上面(2)項(xiàng)中制備的效應(yīng)細(xì)胞懸浮液50μl(2×105細(xì)胞/孔，效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞比例成為20∶1)。此外，加各種抗CD20嵌合抗體至終濃度為0.3到3000ng/ml和總體積150μl，在37℃進(jìn)行反應(yīng)4小時(shí)。反應(yīng)后，離心平板并通過CytoTox96非放射活性細(xì)胞毒性試驗(yàn)(由Promega生產(chǎn))檢測(cè)上清物中的乳酸脫氫酶(LDH)活性。通過進(jìn)行上述相同的步驟計(jì)算靶細(xì)胞自發(fā)釋放的LDH量，除僅使用培養(yǎng)基而沒有效應(yīng)細(xì)胞懸浮液和抗體溶液外，并測(cè)量上清物中的LDH活性。通過進(jìn)行上述相同的步驟獲得效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放的吸光率數(shù)據(jù)，除僅使用培養(yǎng)基而沒有效應(yīng)細(xì)胞懸浮液和抗體溶液外。通過進(jìn)行上述相同的步驟測(cè)量上清物中的LDH活性計(jì)算與所有靶細(xì)胞壞死有關(guān)的總游離LDH量，除僅使用培養(yǎng)基而沒有效應(yīng)細(xì)胞懸浮液和抗體溶液外，在反應(yīng)中止前45分鐘添加15μl 9％Triton X-100溶液。根據(jù)以下公式(II)用這些值計(jì)算ADCC活性。

每個(gè)抗CD20抗體的ADCC活性顯示在圖22中。從FUT8基因雙敲除克隆WK704-2B8P獲得的抗體在所有抗體濃度上比商業(yè)獲得的RituxanTM顯示較高的ADCC活性，且最大細(xì)胞毒活性值也較高。RituxanTM是用CHO細(xì)胞作為宿主細(xì)胞產(chǎn)生的抗CD20嵌合抗體，其中FUT8基因是沒有斷裂的。此外，從FUT8基因雙敲除克隆WK704-2871和克隆WK704-2760獲得的每個(gè)抗體ADCC活性的檢測(cè)結(jié)果顯示，就抗CD20抗體而言，以相同方式獲得了比FUT8基因沒有斷裂的普通CHO細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體更高的細(xì)胞毒活性。根據(jù)以上結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同采用FUT8基因沒有斷裂的宿主細(xì)胞相比，采用FUT8等位基因斷裂的宿主細(xì)胞可以制備具有較高細(xì)胞毒活性的抗體。
實(shí)施例8 在FUT8等位基因雙敲除的CHO/DG44細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體組合物的糖鏈分析 根據(jù)實(shí)施方案2(4)項(xiàng)中描述的方法，進(jìn)行在實(shí)施方案6中獲得的FUT8基因雙敲除克隆產(chǎn)生的抗CD20抗體、抗GD3抗體和抗CCR4抗體的糖鏈分析。而且，根據(jù)已知的方法[Joumal of Liquid Chromatography，6，1577，(1983)]對(duì)抗體的糖鏈組合物進(jìn)行單糖組合物分析。結(jié)果，在從FUT8基因雙敲除克隆WK704獲得的任何抗體中沒有發(fā)現(xiàn)含巖藻糖的糖鏈結(jié)構(gòu)。根據(jù)上述結(jié)果表明，通過在宿主細(xì)胞中斷裂FUT8等位基因，可以完全地去除復(fù)合N-糖苷連接的糖鏈中巖藻糖的1位經(jīng)α-鍵在還原端與N-乙酰氨基葡萄糖的6位結(jié)合的功能。
參考實(shí)施例 制備CHO細(xì)胞FUT8基因 (1)制備CHO細(xì)胞FUT8cDNA序列 從WO 00/61739實(shí)施方案8(1)項(xiàng)中培養(yǎng)第2天的CHO/DG44細(xì)胞制備的單鏈cDNA，通過以下步驟獲得中國(guó)倉(cāng)鼠FUT8 cDNA(圖23)。
首先，從小鼠FUT8 cDNA序列(GenBank，AB025198)設(shè)計(jì)對(duì)5’端非翻譯區(qū)特異的正向引物(顯示為SEQ ID NO7)和對(duì)3’端非翻譯區(qū)特異的反向引物(顯示為SEQ ID NO8)。
接著，制備含1μl CHO/DG44細(xì)胞來源cDNA的25μl反應(yīng)溶液[ExTaq緩沖液(由Takara Shuzo生產(chǎn))，0.2mmol/l dNTPs，4％DMSO和0.5μmol/l特異引物(SEQ ID NOs7和8)]，采用DNA聚合酶ExTaq(由Takara Shuzo生產(chǎn))進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)條件94℃加熱1分鐘，隨后94℃30秒反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，55℃30秒和72℃2分鐘一個(gè)循環(huán)，再在72℃加熱10分鐘。
PCR后，反應(yīng)溶液進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳，特異擴(kuò)增的大約2Kb片段被純化。按照TOPO TA克隆試劑盒(由Invitrogen生產(chǎn))所附的使用說明書將4μl DNA片段插入質(zhì)粒pCR2.1中，用反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α株。按照已知的方法在獲得的卡那霉素耐藥克隆中從插入cDNA的8個(gè)克隆中分離質(zhì)粒DNA。
采用DNA測(cè)序儀377(由Parkin Elmer生產(chǎn))和BigDye TerminatorCycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(由Parkin Elmer生產(chǎn))，按照廠家的使用說明書測(cè)定每個(gè)插入質(zhì)粒的cDNA核苷酸序列。該方法證實(shí)所有插入的cDNA編碼含CHO細(xì)胞FUT8全ORF的序列。在其中，選擇序列中通過PCR完全不含堿基閱讀錯(cuò)誤的質(zhì)粒DNA。在此，質(zhì)粒被叫做CHfFUT8-pCR2.1。測(cè)定的CHO FUT8 cDNA的核苷酸序列和氨基酸序列分別由SEQ ID NOs1和4顯示。
(2)制備CHO細(xì)胞FUT8基因組序列 采用項(xiàng)目(1)中獲得的CHO細(xì)胞FUT8 ORF全長(zhǎng)cDNA片段作為探針，按照如分子克隆，第二版，分子生物學(xué)通用方法，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版(1989)中所描述的已知基因組篩選方法，獲得CHO細(xì)胞FUT8基因組克隆。接著，用各種限制性酶消化獲得的基因組克隆后，用含CHO細(xì)胞FUT8 cDNA起始密碼子的AfaI-Sau3AI片段(大約280bp)作為探針進(jìn)行Southern雜交，然后從顯示陽性反應(yīng)的限制性酶片段中選擇XbaI-XbaI片段(大約2.5Kb)和SacI-SacI片段(大約6.5Kb)，分別插入pBluescript II KS(+)(由Stratagene生產(chǎn))中。
采用DNA測(cè)序儀377(由Parkin Elmer生產(chǎn))和BigDye TerminatorCycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(由Parkin Elmer生產(chǎn))，按照廠家的使用說明書測(cè)定每個(gè)獲得的基因組片段的核苷酸序列。因此證實(shí)，XbaI-XbaI片段編碼含CHO細(xì)胞FUT8外顯子2的大約2.5Kb的上游內(nèi)含子序列，SacI-SacI片段編碼含CHO細(xì)胞FUT8外顯子2的大約6.5Kb的下游內(nèi)含子序列。在此，含XbaI-XbaI片段的質(zhì)粒被叫做pFUT8fgE2-2，含SacI-SacI片段的質(zhì)粒被叫做pFUT8fgE2-4。所測(cè)定的含CHO細(xì)胞FUT8外顯子2的基因組區(qū)域核苷酸序列(大約9.0Kb)由SEQ ID NO3顯示。
工業(yè)實(shí)用性 本發(fā)明提供了基因組被修改的細(xì)胞，所述修改使與糖鏈修飾相關(guān)的酶活性較其親代細(xì)胞更降低或消失，在所述修飾中，復(fù)合N-糖苷連接的糖鏈中巖藻糖的1位與N-乙酰氨基葡萄糖的6位在還原端通過α-鍵連接，提供了使用該細(xì)胞以及由該細(xì)胞制備的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物或植物生產(chǎn)抗體的方法，提供了通過所述生產(chǎn)方法生產(chǎn)的抗體組合物以及含所述抗體組合物的藥物。
序列列表中的文本
SEQ ID NO7-說明合成的序列合成的DNA
SEQ ID NO8-說明合成的序列合成的DNA
SEQ ID NO9-說明合成的序列合成的DNA
SEQ ID NO10-說明合成的序列合成的DNA
SEQ ED NO11-說明合成的序列合成的DNA
SEQ ID NO12-說明合成的序列合成的DNA
SEQ ID NO13-說明合成的序列合成的DNA
SEQ ID NO14-說明合成的序列合成的DNA
SEQ ID NO15-說明合成的序列合成的DNA
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序列表
<110>協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會(huì)社
<120>基因組被修飾的細(xì)胞
<130>P044080
<150>JP 2002-106953
<151>2002-04-09
<160>31
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>2008
<212>DNA
<213>中國(guó)地鼠
<400>1
aacagaaact tattttcctg tgtggctaac tagaaccaga gtacaatgtt tccaattctt 60
tgagctccga gaagacagaa gggagttgaa actctgaaaa tgcgggcatg gactggttcc 120
tggcgttgga ttatgctcat tctttttgcc tgggggacct tattgtttta tataggtggt 180
catttggttc gagataatga ccaccctgac cattctagca gagaactctc caagattctt 240
gcaaagctgg agcgcttaaa acaacaaaat gaagacttga ggagaatggc tgagtctctc 300
cgaataccag aaggccctat tgatcagggg acagctacag gaagagtccg tgttttagaa 360
gaacagcttg ttaaggccaa agaacagatt gaaaattaca agaaacaagc taggaatgat 420
ctgggaaagg atcatgaaat cttaaggagg aggattgaaa atggagctaa agagctctgg 480
ttttttctac aaagtgaatt gaagaaatta aagaaattag aaggaaacga actccaaaga 540
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tactacctca gtcaaacaga tggagcaggt gagtggcggg aaaaagaagc caaagatctg 660
acagagctgg tccagcggag aataacatat ctgcagaatc ccaaggactg cagcaaagcc 720
agaaagctgg tatgtaatat caacaaaggc tgtggctatg gatgtcaact ccatcatgtg 780
gtttactgct tcatgattgc ttatggcacc cagcgaacac tcatcttgga atctcagaat 840
tggcgctatg ctactggagg atgggagact gtgtttagac ctgtaagtga gacatgcaca 900
gacaggtctg gcctctccac tggacactgg tcaggtgaag tgaaggacaa aaatgttcaa 960
gtggtcgagc tccccattgt agacagcctc catcctcgtc ctccttactt acccttggct 1020
gtaccagaag accttgcaga tcgactcctg agagtccatg gtgatcctgc agtgtggtgg 1080
gtatcccagt ttgtcaaata cttgatccgt ccacaacctt ggctggaaag ggaaatagaa 1140
gaaaccacca agaagcttgg cttcaaacat ccagttattg gagtccatgt cagacgcact 1200
gacaaagtgg gaacagaagc agccttccat cccattgagg aatacatggt acacgttgaa 1260
gaacattttc agcttctcga acgcagaatg aaagtggata aaaaaagagt gtatctggcc 1320
actgatgacc cttctttgtt aaaggaggca aagacaaagt actccaatta tgaatttatt 1380
agtgataact ctatttcttg gtcagctgga ctacacaacc gatacacaga aaattcactt 1440
cggggcgtga tcctggatat acactttctc tcccaggctg acttccttgt gtgtactttt 1500
tcatcccagg tctgtagggt tgcttatgaa atcatgcaaa cactgcatcc tgatgcctct 1560
gcaaacttcc attctttaga tgacatctac tattttggag gccaaaatgc ccacaaccag 1620
attgcagttt atcctcacca acctcgaact aaagaggaaa tccccatgga acctggagat 1680
atcattggtg tggctggaaa ccattggaat ggttactcta aaggtgtcaa cagaaaacta 1740
ggaaaaacag gcctgtaccc ttcctacaaa gtccgagaga agatagaaac agtcaaatac 1800
cctacatatc ctgaagctga aaaatagaga tggagtgtaa gagattaaca acagaattta 1860
gttcagacca tctcagccaa gcagaagacc cagactaaca tatggttcat tgacagacat 1920
gctccgcacc aagagcaagt gggaaccctc agatgctgca ctggtggaac gcctctttgt 1980
gaagggctgc tgtgccctca agcccatg2008
<210>2
<211>1728
<212>DNA
<213>小家鼠
<400>2
atgcgggcat ggactggttc ctggcgttgg attatgctca ttctttttgc ctgggggacc 60
ttgttatttt atataggtgg tcatttggtt cgagataatg accaccctga tcactccagc 120
agagaactct ccaagattct tgcaaagctt gaacgcttaa aacagcaaaa tgaagacttg 180
aggcgaatgg ctgagtctct ccgaatacca gaaggcccca ttgaccaggg gacagctaca 240
ggaagagtcc gtgttttaga agaacagctt gttaaggcca aagaacagat tgaaaattac 300
aagaaacaag ctagaaatgg tctggggaag gatcatgaaa tcttaagaag gaggattgaa 360
aatggagcta aagagctctg gttttttcta caaagcgaac tgaagaaatt aaagcattta 420
gaaggaaatg aactccaaag acatgcagat gaaattcttt tggatttagg acaccatgaa 480
aggtctatca tgacagatct atactacctc agtcaaacag atggagcagg ggattggcgt 540
gaaaaagagg ccaaagatct gacagagctg gtccagcgga gaataacata tctccagaat 600
cctaaggact gcagcaaagc caggaagctg gtgtgtaaca tcaataaagg ctgtggctat 660
ggttgtcaac tccatcacgt ggtctactgt ttcatgattg cttatggcac ccagcgaaca 720
ctcatcttgg aatctcagaa ttggcgctat gctactggtg gatgggagac tgtgtttaga 780
cctgtaagtg agacatgtac agacagatct ggcctctcca ctggacactg gtcaggtgaa 840
gtaaatgaca aaaacattca agtggtcgag ctccccattg tagacagcct ccatcctcgg 900
cctccttact taccactggc tgttccagaa gaccttgcag accgactcct aagagtccat 960
ggtgaccctg cagtgtggtg ggtgtcccag tttgtcaaat acttgattcg tccacaacct 1020
tggctggaaa aggaaataga agaagccacc aagaagcttg gcttcaaaca tccagttatt 1080
ggagtccatg tcagacgcac agacaaagtg ggaacagaag cagccttcca ccccatcgag 1140
gagtacatgg tacacgttga agaacatttt cagcttctcg cacgcagaat gcaagtggat 1200
aaaaaaagag tatatctggc tactgatgat cctactttgt taaaggaggc aaagacaaag 1260
tactccaatt atgaatttat tagtgataac tctatttctt ggtcagctgg actacacaat 1320
cggtacacag aaaattcact tcggggtgtg atcctggata tacactttct ctcacaggct 1380
gactttctag tgtgtacttt ttcatcccag gtctgtcggg ttgcttatga aatcatgcaa 1440
accctgcatc ctgatgcctc tgcgaacttc cattctttgg atgacatcta ctattttgga 1500
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attccaatgg aacctggaga tatcattggt gtggctggaa accattggga tggttattct 1620
aaaggtatca acagaaaact tggaaaaaca ggcttatatc cctcctacaa agtccgagag 1680
aagatagaaa cagtcaagta tcccacatat cctgaagctg aaaaatag 1728
<210>3
<211>9196
<212>DNA
<213>中國(guó)地鼠
<400>3
tctagaccag gctggtctcg aactcacaga gaaccacctg cctctgccac ctgagtgctg 60
ggattaaagg tgtgcaccac caccgcccgg cgtaaaatca tatttttgaa tattgtgata 120
atttacatta taattgtaag taaaaatttt cagcctattt tgttatacat ttttgcgtaa 180
attattcttt tttgaaagtt ttgttgtcca taatagtcta gggaaacata aagttataat 240
ttttgtctat gtatttgcat atatatctat ttaatctcct aatgtccagg aaataaatag 300
ggtatgtaat agcttcaaca tgtggtatga tagaattttt cagtgctata taagttgtta 360
cagcaaagtg ttattaattc atatgtccat atttcaattt tttatgaatt attaaattga 420
atccttaagc tgccagaact agaattttat tttaatcagg aagccccaaa tctgttcatt 480
ctttctatat atgtggaaag gtaggcctca ctaactgatt cttcacctgt tttagaacat 540
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tacttgtttc tatgtcttta tagaaaaaca tatttttttt gccacatgca gcttgtcctt 780
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aaagttggct attgtatgag acttcagccc acttcaatta ttggcttcat tctctcagat 900
cccaccacct ccagagtggt aaacaacttg aaccattaaa cagactttag tctttatttg 960
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cagtagagtt taacaacaac aaaaagtata ctttgtaaac gtaaaactat ttattaaagt 1080
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caataaaaat taaggttcag taatagaaaa aaaactctga tttttggaat cccctttctt 1320
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tttaaaatac atagccaccc taagggttta actgttgtta gccttctttt ggaattttta 1680
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ttcacttata ctgagaactt gttttgcttt tagataatga acatattagc ctgaagtaca 2040
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cacaacaatt caagaaagat agaattagac ttccagtatt ggagtgaacc atttgttatc 2160
aggtagaacc ctaacgtgtg tggttgactt aaagtgttta ctttttacct gatactgggt 2220
agctaattgt ctttcagcct cctggccaaa gataccatga aagtcaactt acgttgtatt 2280
ctatatctca aacaactcag ggtgtttctt actctttcca cagcatgtag agcccaggaa 2340
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attttcctgt gtggctaact agaaccagag tacaatgttt ccaattcttt gagctccgag 2520
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tatgctcatt ctttttgcct gggggacctt attgttttat ataggtggtc atttggttcg 2640
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gcgcttaaaa caacaaaatg aagacttgag gagaatggct gagtctctcc ggtaggtttg 2760
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ctgttgaaaa atataatttc tacaaaccgt ctttgtaaaa ttttaagtat tgtagcagac 2880
tttttaaaag tcagtgatac atctatatag tcaatatagg tttacatagt tgcaatctta 2940
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aaatgtctat ggatgataat gttgtatgtt aacactttta caaaaacaaa tgaagccata 3720
tcctcggtgt gagttgtgat ggtggtaatt gtcacaatag gattattcag caaggaacta 3780
agtcagggac aagaagtggg cgatactttg ttggattaaa tcattttact ggaagttcat 3840
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tgttttcagc cattttacag atgaagaatc ttaaaaaatg ttaaataatt tagtttgccc 4080
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tccgaactct tatcttccta agctgaaaac agaaaaagca atgacccaga aaattttatt 4200
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tccttttttc ttaccacaaa gtatcttgtt tttgctgtat gaaagaaaat gtgttattgt 4380
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ctgtcttaat tattaaacca taactactat tgtaagtatt tccatgtggt cttatcttac 4560
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cgatttccta tttgtctctg cttattttct gattctgctc agctatgtca cttcctgcct 4680
ggccaatcag ccaatcagtg ttttattcat tagccaataa aagaaacatt tacacagaag 4740
gacttccccc atcatgttat ttgtatgagt tcttcagaaa atcatagtat cttttaatac 4800
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tgttctaaga tttcttagca agttcatatc actgatttta acagttgctt cttttgtaat 6120
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gttgtttgtt aggtagttga ttatgctggt cagattgtct tgagtttatg caaatgtaaa 6660
atatttagat gcttgttttg ttgtctaaga acaaagtatg cttgctgtct cctatcggtt 6720
ctggtttttc cattcatctc ttcaagctgt tttgtgtgtt gaatactaac tccgtactat 6780
cttgttttct gtgaattaac cccttttcaa aggtttcttt tctttttttt tttaagggac 6840
aacaagttta ttcagattac attttaagct gataatgtat gattgcaagg ttatcaacat 6900
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accttaattg acatgtatcc ttatatttag acacagattt aaatatttga agtttttttt 8460
tttttttttt ttaaagattt atttattttt tatgtcttct gcctgcatgc cagaagaggg 8520
caccagatct cattcaaggt ggttgtgagc caccatgtgg ttgctgggaa ttgaactcag 8580
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aggatcccaa gagctc 9196
<210>4
<211>575
<212>PRT
<213>中國(guó)地鼠
<400>4
Met Arg Ala Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe
1 5 10 15
Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp
20 25 30
Asn Asp His Pro Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala
35 40 45
Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala
50 55 60
Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp Gln Gly Thr Ala Thr
65 70 75 80
Gly Arg Val Arg Val Leu Glu Glu Gln Leu Val Lys Ala Lys Glu Gln
85 90 95
Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Ala Arg Asn Asp Leu Gly Lys Asp His
100 105 110
Glu Ile Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys Glu Leu Trp Phe
115 120 125
Phe Leu Gln Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys Lys Leu Glu Gly Asn Glu
130 135 140
Leu Gln Arg His Ala Asp Glu Ile Leu Leu Asp Leu Gly His His Glu
145 150 155 160
Arg Ser Ile Met Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Gln Thr Asp Gly Ala
165 170 175
Gly Glu Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Leu Val Gln
180 185 190
Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys Ser Lys Ala Arg
195 200 205
Lys Leu Val Cys Asn Ile Asn Lys Gly Cys Gly Tyr Gly Cys Gln Leu
210 215 220
His His Val Val Tyr Cys Phe Met Ile Ala Tyr Gly Thr Gln Arg Thr
225 230 235 240
Leu Ile Leu Glu Ser Gln Asn Trp Arg Tyr Ala Thr Gly Gly Trp Glu
245 250 255
Thr Val Phe Arg Pro Val Ser Glu Thr Cys Thr Asp Arg Ser Gly Leu
260 265 270
Ser Thr Gly His Trp Ser Gly Glu Val Lys Asp Lys Asn Val Gln Val
275 280 285
Val Glu Leu Pro Ile Val Asp Ser Leu His Pro Arg Pro Pro Tyr Leu
290 295 300
Pro Leu Ala Val Pro Glu Asp Leu Ala Asp Arg Leu Leu Arg Val His
305 310 315 320
Gly Asp Pro Ala Val Trp Trp Val Ser Gln Phe Val Lys Tyr Leu Ile
325 330 335
Arg Pro Gln Pro Trp Leu Glu Arg Glu Ile Glu Glu Thr Thr Lys Lys
340 345 350
Leu Gly Phe Lys His Pro Val Ile Gly Val His Val Arg Arg Thr Asp
355 360 365
Lys Val Gly Thr Glu Ala Ala Phe His Pro Ile Glu Glu Tyr Met Val
370 375 380
His Val Glu Glu His Phe Gln Leu Leu Glu Arg Arg Met Lys Val Asp
385 390 395 400
Lys Lys Arg Val Tyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro Ser Leu Leu Lys Glu
405 410 415
Ala Lys Thr Lys Tyr Ser Asn Tyr Glu Phe Ile Ser Asp Asn Ser Ile
420 425 430
Ser Trp Ser Ala Gly Leu His Asn Arg Tyr Thr Glu Asn Ser Leu Arg
435 440 445
Gly Val Ile Leu Asp Ile His Phe Leu Ser Gln Ala Asp Phe Leu Val
450 455 460
Cys Thr Phe Ser Ser Gln Val Cys Arg Val Ala Tyr Glu Ile Met Gln
465 470 475 480
Thr Leu His Pro Asp Ala Ser Ala Asn Phe His Ser Leu Asp Asp Ile
485 490 495
Tyr Tyr Phe Gly Gly Gln Asn Ala His Asn Gln Ile Ala Val Tyr Pro
500 505 510
His Gln Pro Arg Thr Lys Glu Glu Ile Pro Met Glu Pro Gly Asp Ile
515 520 525
Ile Gly Val Ala Gly Asn His Trp Asn Gly Tyr Ser Lys Gly Val Asn
530 535 540
Arg Lys Leu Gly Lys Thr Gly Leu Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Arg Glu
545 550 555 560
Lys Ile Glu Thr Val Lys Tyr Pro Thr Tyr Pro Glu Ala Glu Lys
565 570 575
<210>5
<211>575
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>5
Met Arg Ala Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe
1 5 10 15
Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp
20 25 30
Asn Asp His Pro Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala
35 40 45
Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala
50 55 60
Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp Gln Gly Thr Ala Thr
65 70 75 80
Gly Arg Val Arg Val Leu Glu Glu Gln Leu Val Lys Ala Lys Glu Gln
85 90 95
Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Ala Arg Asn Gly Leu Gly Lys Asp His
100 105 110
Glu Ile Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys Glu Leu Trp Phe
115 120 125
Phe Leu Gln Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys His Leu Glu Gly Asn Glu
130 135 140
Leu Gln Arg His Ala Asp Glu Ile Leu Leu Asp Leu Gly His His Glu
145 150 155 160
Arg Ser Ile Met Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Gln Thr Asp Gly Ala
165 170 175
Gly Asp Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Leu Val Gln
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Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys Ser Lys Ala Arg
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305 310 315 320
Gly Asp Pro Ala Val Trp Trp Val Ser Gln Phe Val Lys Tyr Leu Ile
325 330 335
Arg Pro Gln Pro Trp Leu Glu Lys Glu Ile Glu Glu Ala Thr Lys Lys
340 345 350
Leu Gly Phe Lys His Pro Val Ile Gly Val His Val Arg Arg Thr Asp
355 360 365
Lys Val Gly Thr Glu Ala Ala Phe His Pro Ile Glu Glu Tyr Met Val
370 375 380
His Val Glu Glu His Phe Gln Leu Leu Ala Arg Arg Met Gln Val Asp
385 390 395 400
Lys Lys Arg Val Tyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro Thr Leu Leu Lys Glu
405 410 415
Ala Lys Thr Lys Tyr Ser Asn Tyr Glu Phe Ile Ser Asp Asn Ser Ile
420 425 430
Ser Trp Ser Ala Gly Leu His Asn Arg Tyr Thr Glu Asn Ser Leu Arg
435 440 445
Gly Val Ile Leu Asp Ile His Phe Leu Ser Gln Ala Asp Phe Leu Val
450 455 460
Cys Thr Phe Ser Ser Gln Val Cys Arg Val Ala Tyr Glu Ile Met Gln
465 470 475 480
Thr Leu His Pro Asp Ala Ser Ala Asn Phe His Ser Leu Asp Asp Ile
485 490 495
Tyr Tyr Phe Gly Gly Gln Asn Ala His Asn Gln Ile Ala Val Tyr Pro
500 505 510
His Lys Pro Arg Thr Glu Glu Glu Ile Pro Met Glu Pro Gly Asp Ile
515 520 525
Ile Gly Val Ala Gly Asn His Trp Asp Gly Tyr Ser Lys Gly Ile Asn
530 535 540
Arg Lys Leu Gly Lys Thr Gly Leu Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Arg Glu
545 550 555 560
Lys Ile Glu Thr Val Lys Tyr Pro Thr Tyr Pro Glu Ala Glu Lys
565 570 575
<210>6
<211>18
<212>PRT
<213>現(xiàn)代人
<400>6
Asp Glu Ser Ile Tyr Ser Asn Tyr Tyr Leu Tyr Glu Ser Ile Pro Lys
1 5 10 15
Pro Cys
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述合成DNA
<400>7
gtctgaagca ttatgtgttg aagc 24
<210>8
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述合成DNA
<400>8
gtgagtacat tcattgtact gtg 23
<210>9
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述合成DNA
<400>9
ggtaggcctc actaactg18
<210>10
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述合成DNA
<400>10
catagaaaca agtaacaaca gccag25
<210>11
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述合成DNA
<400>11
gtgagtccat ggctgtcact g21
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述合成DNA
<400>12
cctgacttgg ctattctcag 20
<210>13
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述合成DNA
<400>13
gagacttcag cccacttcaa ttattggc 28
<210>14
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>14
gaggccactt gtgtagcgcc aagtg25
<210>15
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述合成DNA
<400>15
cttgtgtgac tcttaactct cagag25
<210>16
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述合成DNA
<400>16
ccctcgagat aacttcgtat agc 23
<210>17
<211>384
<212>DNA
<213>小家鼠
<400>17
atg gat ttt cag gtg cag att atc agc ttc ctg cta atc agt gct rca48
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Ile Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
gtc ata atg tcc aga gga caa att gtt ctc tcc cag tct cca gca atc96
Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile
20 25 30
ctg tct gca tct cca ggg gag aag gtc aca atg act tgc agg gcc agc144
Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser
35 40 45
tca agt gta agt tac arc cac tgg ttc cag cag aag cca gga tcc tcc192
Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser
50 55 60
ccc aaa ccc tgg att tat gcc aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cct240
Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
gtt cgc ttc agt ggc agt ggg tct ggg act tct tac tct ctc acc atc288
Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile
85 90 95
agc aga gtg gag gct gaa gat gct gcc act tat tac tgc cag cag tgg336
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
100 105 110
act agt aac cca ccc acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa arc aaa384
Thr Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
<210>18
<211>420
<212>DNA
<213>小家鼠
<400>18
atg ggt tgg agc crc arc ttg crc ttc ctt gtc gct gtt gct acg cgt48
Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg
1 5 10 15
gtc ctg tcc cag gta caa ctg cag cag cct ggg gct gag ctg gtg aag96
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys
20 25 30
cct ggg gcc rca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct ggc tac aca ttt144
Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
acc agt tac aat atg cac tgg gta aaa cag aca cct ggt cgg ggc ctg192
Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu
50 55 60
gaa tgg att gga gct att tat ccc gga aat ggt gat act tcc tac aat240
Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn
65 70 75 80
cag aag ttc aaa ggc aag gcc aca ttg act gca gac aaa tcc tcc agc288
Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
aca gcc tac atg cag crc agc agc ctg aca tct gag gac tct gcg gtc336
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
tat tac tgt gca aga tcg act tac tac ggc ggt gac tgg tac ttc aat384
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn
115 120 125
gtc tgg ggc gca ggg acc acg gtc acc gtc tct gca420
Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala
130 135 140
<210>19
<211>91
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述合成DNA
<400>19
caggaaacag ctatgacgaa ttcgcctcct caaaatggat tttcaggtgc agattatcag 60
cttcctgcta atcagtgctt cagtcataat g 91
<210>20
<211>91
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述合成DNA
<400>20
gtgaccttct cccctggaga tgcagacagg attgctggag actgggagag aacaatttgt 60
cctctggaca ttatgactga agcactgatt a 91
<210>21
<211>90
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述合成DNA
<400>21
ctccagggga gaaggtcaca atgacttgca gggccagctc aagtgtaagt tacatccact 60
ggttccagca gaagccagga tcctccccca 90
<210>22
<211>89
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述合成DNA
<400>22
ccagacccac tgccactgaa gcgaacaggg actccagaag ccaggttgga tgtggcataa 60
atccagggtt tgggggagga tcctggctt89
<210>23
<211>91
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述合成DNA
<400>23
tcagtggcag tgggtctggg acttcttact ctctcaccat cagcagagtg gaggctgaag 60
atgctgccac ttattactgc cagcagtgga c 91
<210>24
<211>90
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述合成DNA
<400>24
gttttcccag tcacgaccgt acgtttgatt tccagcttgg tcccccctcc gaacgtgggt 60
gggttactag tccactgctg gcagtaataa 90
<210>25
<211>99
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述合成DNA
<400>25
caggaaacag ctatgacgcg gccgcgaccc ctcaccatgg gttggagcct catcttgctc 60
ttccttgtcg ctgttgctac gcgtgtcctg tcccaggta 99
<210>26
<211>98
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述合成DNA
<400>26
atgtgtagcc agaagccttg caggacatct tcactgaggc cccagccttc accagctcag 60
ccccaggctg ctgcagttgt acctgggaca ggacacgc 98
<210>27
<211>97
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述合成DNA
<400>27
caaggcttct ggctacacat ttaccagtta caatatgcac tgggtaaaac agacacctgg 60
tcggggcctg gaatggattg gagctattta tcccgga 97
<210>28
<211>99
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述合成DNA
<400>28
gtaggctgtg ctggaggatt tgtctgcagt caatgtggcc ttgcctttga acttctgatt 60
gtaggaagta tcaccatttc cgggataaat agctccaat99
<210>29
<211>99
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>29
aatcctccag cacagcctac atgcagctca geagcctgac atctgaggac tctgcggtct 60
attactgtgc aagatcgact tactacggcg gtgactggt 99
<210>30
<211>98
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>30
gttttcccag tcacgacggg cccttggtgg aggctgcaga gacggtgacc gtggtccctg 60
cgccccagac attgaagtac cagtcaccgc cgtagtaa 98
<210>31
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述合成DNA
<400>31
gagctggtga agcctggggc ctcag25
1/2權(quán)利要求
1.一種修飾基因組以使與糖鏈修飾相關(guān)的酶的活性比其親代細(xì)胞更低或消失的細(xì)胞，所述糖鏈中巖藻糖的1位與N-糖苷連接的糖鏈復(fù)合體中還原端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通過α-鍵連接。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其特征在于編碼糖鏈修飾相關(guān)酶的基因組基因被敲除，所述糖鏈中巖藻糖的1位與N-糖苷連接的糖鏈復(fù)合體中還原端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通過α-鍵連接。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的細(xì)胞，其特征在于編碼糖鏈修飾相關(guān)酶的基因組上的所有等位基因被敲除，所述糖鏈修飾中巖藻糖的1位與N-糖苷連接的糖鏈復(fù)合體中還原端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通過α-鍵連接。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)中所述的細(xì)胞，其特征在于與糖鏈修飾相關(guān)的酶是α1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，所述糖鏈中巖藻糖的1位與N-糖苷連接的糖鏈復(fù)合體中還原端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通過α-鍵連接。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)胞，其特征在于所述的α1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是選自以下(a)至(d)的DNA編碼的蛋白質(zhì)
(a)含有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列的DNA；
(b)含有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列的DNA；
(c)在嚴(yán)格條件下，與包含SEQ ID NO1所示的核苷酸序列的DNA雜交，并具有α1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的DNA；
(d)在嚴(yán)格條件下，與包含SEQ ID NO2所示的核苷酸序列的DNA雜交，并具有α1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的DNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的細(xì)胞，其特征在于所述的α1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是選自以下(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(f)的蛋白質(zhì)
(a)含有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；
(b)含有SEQ ID NO5所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；
(c)含有SEQ ID NO4所示氨基酸序列中至少一個(gè)氨基酸被刪除、取代、插入、和/或添加的氨基酸序列，并具有α1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；
(d)含有SEQ ID NO5所示氨基酸序列中至少一個(gè)氨基酸被刪除、取代、插入、和/或添加的氨基酸序列，并具有α1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；
(e)含有與SEQ ID NO4所示氨基酸序列具有80％或以上同源性的氨基酸序列，并具有α1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；
(f)含有與SEQ ID NO5所示氨基酸序列具有80％或以上同源性的氨基酸序列，并具有α1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)中所述的細(xì)胞，其特征在于所述細(xì)胞對(duì)識(shí)別糖鏈的凝集素具有抗性，所述糖鏈中巖藻糖的1位與N-糖苷連接的糖鏈復(fù)合體中還原端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通過α-鍵連接。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的細(xì)胞，其特征在于所述細(xì)胞對(duì)選自以下(a)至(d)的至少一個(gè)凝集素具有抗性
(a)小扁豆凝集素；
(b)豌豆凝集素；
(c)蠶豆凝集素；
(d)陳皮木耳凝集素。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)中所述的細(xì)胞，其特征在于所述細(xì)胞選自以下(a)至(j)
(a)來源于中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢組織的CHO細(xì)胞；
(b)大鼠骨髓瘤細(xì)胞系YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細(xì)胞；
(c)小鼠骨髓瘤細(xì)胞系NS0細(xì)胞；
(d)小鼠骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0-Agl4細(xì)胞；
(e)來源于敘利亞倉(cāng)鼠腎組織的BHK細(xì)胞；
(f)產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞；
(g)人白血病細(xì)胞系Namalwa細(xì)胞；
(h)胚胎干細(xì)胞；
(i)受精卵細(xì)胞；
j)植物細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)中所述的細(xì)胞，其特征在于所述細(xì)胞含有編碼抗體分子的基因。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的細(xì)胞，其特征在于所述的抗體分子選自以下的(a)至(d)
(a)人抗體；
(b)人源化抗體；
(c)含(a)或(b)Fc區(qū)的抗體片段；
(d)含(a)或(b)Fc區(qū)的融合蛋白質(zhì)。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的細(xì)胞，其特征在于所述的抗體分子屬于IgG型。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12任一項(xiàng)中所述的細(xì)胞，其特征在于所述細(xì)胞產(chǎn)生的抗體組合物比其親代細(xì)胞產(chǎn)生的抗體組合物具有更高的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒活性。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的細(xì)胞，其特征在于所述的具有更高抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒活性的抗體組合物比其親代細(xì)胞產(chǎn)生的抗體組合物具有更高的糖鏈比例，所述糖鏈中巖藻糖不與Fc區(qū)結(jié)合的N-糖苷連接的糖鏈總復(fù)合體中還原端的N-乙酰氨基葡萄糖連接。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的細(xì)胞，其特征在于所述的不連接巖藻糖的糖鏈中，巖藻糖的1位不與N-糖苷連接的糖鏈復(fù)合體中還原端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通過α-鍵連接。
16.根據(jù)權(quán)利要求13至15任一項(xiàng)中所述的細(xì)胞，其特征在于所述的巖藻糖不與還原端的N-乙酰氨基葡萄糖通過α-鍵連接的糖鏈比例是抗體組合物中與Fc區(qū)結(jié)合的N-糖苷連接糖鏈總復(fù)合體的20％或以上。
17.根據(jù)權(quán)利要求13至16任一項(xiàng)中所述的細(xì)胞，其特征在于所述具有更高抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒活性的抗體組合物沒有巖藻糖與糖鏈還原端的N-乙酰氨基葡萄糖結(jié)合的糖鏈。
18.一種產(chǎn)生抗體組合物的方法，其特征在于所述方法包括使用根據(jù)權(quán)利要求10至17任一項(xiàng)中所述的細(xì)胞。
19.一種產(chǎn)生抗體組合物的方法，其特征在于所述方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求10至18任一項(xiàng)中所述的細(xì)胞，在培養(yǎng)基中形成和積累抗體組合物；并從培養(yǎng)基中回收抗體組合物。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的方法，其特征在于所述抗體組合物是比其親代細(xì)胞產(chǎn)生的抗體組合物具有更高抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒活性的抗體組合物。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的步驟，其特征在于所述的具有更高抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒活性的抗體組合物比其親代細(xì)胞產(chǎn)生的抗體組合物具有更高的糖鏈比例，所述糖鏈中巖藻糖不與Fc區(qū)結(jié)合的N-糖苷連接的糖鏈總復(fù)合體中還原端的N-乙酰氨基葡萄糖連接。糖不與N-乙酰氨基葡萄糖在還原端結(jié)合。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的步驟，其特征在于所述的不連接巖藻糖的糖鏈中，巖藻糖的1位不與N-糖苷連接的糖鏈總復(fù)合體中還原端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通過α-鍵連接。
23.根據(jù)權(quán)利要求20至22任一項(xiàng)中所述的細(xì)胞，其特征在于所述的具有更高抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒活性的抗體組合物是與抗體組合物Fc區(qū)結(jié)合的N-糖苷連接的糖鏈總復(fù)合體中，巖藻糖不與還原端的N-乙酰氨基葡萄糖通過α-鍵連接的糖鏈比例是抗體組合物中與Fc區(qū)結(jié)合的N-糖苷連接糖鏈總復(fù)合體的20％或以上。
24.根據(jù)權(quán)利要求20至23任一項(xiàng)中所述的細(xì)胞，其特征在于所述的具有更高抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒活性的抗體組合物是沒有巖藻糖與糖鏈中還原端N-乙酰氨基葡萄糖連接的抗體組合物。
25.使用根據(jù)權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)中所述的細(xì)胞產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物或植物或其后代。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物或植物或其后代，其特征在于所述的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物選自牛、綿羊、山羊、豬、馬、小鼠、大鼠、家禽、猴和兔。
27.根據(jù)權(quán)利要求25或26所述的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物或植物或其后代，其特征在于其被導(dǎo)入了編碼抗體分子的基因。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物或植物或其后代，其特征在于所述的抗體分子選自以下(a)至(d)
(a)人抗體；
(b)人源化抗體；
(c)含(a)或(b)Fc區(qū)的抗體片段；
(d)含(a)或(b)Fc區(qū)的融合蛋白質(zhì)。
29.根據(jù)權(quán)利要求27或28所述的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物或植物或其后代，其特征在于所述的抗體分子屬于IgG族。
30.一種產(chǎn)生抗體組合物的步驟，其特征在于包括培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求27至29任一項(xiàng)中所述的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物或植物；分離從培養(yǎng)的動(dòng)物或植物中誘導(dǎo)的含有抗體分子的組織或體液；從分離的組織或體液中回收含所需抗體分子的抗體組合物。
31.一種產(chǎn)生抗體組合物的步驟，其特征在于包括從根據(jù)權(quán)利要求26至29任一項(xiàng)中所述的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物或植物或其后代中分離產(chǎn)生抗體的細(xì)胞；在培養(yǎng)基中培養(yǎng)分離的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，在培養(yǎng)基中形成和積累抗體組合物；從培養(yǎng)基中回收抗體組合物。
32.根據(jù)權(quán)利要求30或31所述的步驟，其特征在于所述的抗體組合物是比基因組未被修飾的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物或植物或其后代產(chǎn)生的抗體組合物具有更高抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒活性的抗體組合物。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的步驟，其特征在于所述的具有更高抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒活性的抗體組合物比基因組未被修飾的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物或植物或其后代產(chǎn)生的抗體組合物具有較高比例的糖鏈，所述糖鏈中巖藻糖不與和抗體組合物Fc區(qū)結(jié)合的N-糖苷連接的糖鏈總復(fù)合體的還原端的N-乙酰氨基葡萄糖連接。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的步驟，其特征在于所述的糖鏈中巖藻糖的1位不與N-糖苷連接的糖鏈還原端位置的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通過α-鍵連接。
35.根據(jù)權(quán)利要求32至34任一項(xiàng)中所述的步驟，其特征在于所述的具有更高抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒活性的抗體組合物中巖藻糖不與還原端的N-乙酰氨基葡萄糖通過α-鍵連接的糖鏈比例是抗體組合物中與Fc區(qū)結(jié)合的N-糖苷連接糖鏈總復(fù)合體的20％或以上。
36.根據(jù)權(quán)利要求32至35任一項(xiàng)中所述的細(xì)胞，其特征在于所述的具有更高抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒活性的抗體組合物是糖鏈中沒有巖藻糖與還原端的N-乙酰氨基葡萄糖連接的抗體組合物。
37.一種含有Fc區(qū)具有N-糖苷連接糖鏈的抗體分子的抗體組合物，其特征在于具有巖藻糖不與和抗體組合物Fc區(qū)結(jié)合的N-糖苷連接的糖鏈總復(fù)合體的還原端的N-乙酰氨基葡萄糖連接的糖鏈。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的抗體組合物，其特征在于所述的不連接巖藻糖的糖鏈?zhǔn)菐r藻糖的1位不與N-糖苷連接的糖鏈復(fù)合體的還原端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通過α-鍵連接的糖鏈。
39.一種通過權(quán)利要求18至24任一項(xiàng)中所述的步驟產(chǎn)生的抗體組合物。
40.一種通過權(quán)利要求27至36任一項(xiàng)中所述的步驟產(chǎn)生的抗體組合物。
41.含有根據(jù)權(quán)利要求37至40任一項(xiàng)中所述的抗體組合物作為活性成分的藥物。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的藥物，其特征在于所述藥物是以下疾病的診斷劑、預(yù)防劑或治療劑腫瘤相關(guān)疾病、變態(tài)反應(yīng)相關(guān)疾病、炎癥相關(guān)疾病、自身免疫性疾病、心血管疾病、病毒感染相關(guān)疾病或細(xì)菌感染相關(guān)疾病。
43.在生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求41或42所述的藥物中對(duì)根據(jù)權(quán)利要求37至40任一項(xiàng)的抗體組合物的應(yīng)用。
全文摘要
一個(gè)基因組被修飾的細(xì)胞，所述的修飾使與糖鏈修飾相關(guān)的酶活性較其親代細(xì)胞更降低或消失，在所述修飾中，N－糖苷連接的糖鏈復(fù)合體中巖藻糖的1位與還原端的N－乙酰氨基葡萄糖的6位在通過α－鍵連接，以及用該細(xì)胞產(chǎn)生抗體組合物的方法。
文檔編號(hào)A01K67/027GK1930288SQ03813399
公開日2007年3月14日 申請(qǐng)日期2003年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月9日
發(fā)明者大貫尚子, 佐藤光男, 森勝弘, 山野和也 申請(qǐng)人:協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會(huì)社