一種gii.4型諾如病毒基因組擴增引物和擴增方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種GII. 4型諾如病毒基因組擴增引物和擴 增方法。
【背景技術(shù)】：
[0002] 諾如病毒是全球流行性與散發(fā)性急性胃腸炎的重要病原，每年造成約2. 3億人次 染病，在發(fā)展中國家尤為嚴重，至少導(dǎo)致20萬例5歲以下兒童的死亡，對公共衛(wèi)生安全造成 了極大的威脅。諾如病毒感染為自限性疾病，但對于嬰幼兒、老人及免疫缺陷人群會具有脫 水性死亡的危險。至目前為止，還沒有有效的抗病毒藥物及治療手段。
[0003] 作為RNA病毒，諾如病毒極易變異，具有豐富的遺傳多樣性。根據(jù)其衣殼蛋白序列 同源性可將病毒分成6個基因組（Genogroup)，基因組之間的核酸序列同源性約46%，其中 G I、G II和G IV為人源病毒。同一基因組內(nèi)的核酸同源性為69%~97%，進一步分成不 同的基因型（Genotype)，例如GI含有8個基因型，GII含有19個（并不斷增加）。其中， GII. 4型是目前全球主要流行基因型，近80%的諾如病毒感染是由該型別毒株引起的，并 且該病毒每隔兩三年就會產(chǎn)生新的變異株，同時造成新一輪的大范圍病毒流行。
[0004] 盡管最近在人源諾如病毒培養(yǎng)方面有了突破性進展，但是合適的復(fù)制體系仍然 缺乏。因此，基因組信息的獲得對于諾如病毒研究具有重要意義。諾如病毒基因組長約 7. 5-7. 8kb，包括3個開放閱讀框。目前報道的基因組擴增方法有直接擴增法以及分段擴增 法。其中，直接擴增方法往往難以具有較高的靈敏度，對待處理樣本的質(zhì)量具有較高的要 求，因而不具有較高的成功率。另外，分段擴增法中常用的包括三段法以及多段法，而多段 法的引物一般根據(jù)與待處理樣本中病毒相似度高的基因組序列進行設(shè)計，因而對引物的廣 譜性也造成了一定的限制；三段法中擴增獲得的片段長度較大（>3K)，這不但增加了擴增 的難度，而且難以直接測序，從而降低了獲得病毒基因組序列的成功率。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種高靈敏度的GII. 4型諾如病毒基因組擴增引物和擴增 方法。
[0006] 本發(fā)明的GII. 4型諾如病毒基因組擴增引物，其特征在于，包括六對擴增引物：
[0007]引物對 1:P1F:5，-GTGAATGAAGATGGCGTCTAAC-3'；
[0008] P1596R：5r -TCGACGCCATTGCGTGGGA-3r；
[0009]引物對 2:P1258F:5' -CAACCATATGACCACCTTGCT-3' ；
[0010] P2805R：5r -ATGGCCACCTCCTCATAGTA-3r；
[0011]引物對 3:P2689F:5' -AGGTCTCAGTGATGAAGAG-3，；
[0012] P4248R ： 5r -GGGCCATCCTCATTCATATTCA-3r ；
[0013]引物對 4:P4099F:5' -TGGTAAGATCAAGAAGAGGCT-3，；
[0014] G2SKR：5r -CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT-3r；
[0015]引物對 5:NV2of2:5，-GGAGGGCGATCGCAATC-3，；
[0016] GV132：5, -CCRGCRAAGAAAGCTCCAGCCAT-3r；
[0017]引物對 6:P6484F:5' -CAGCACAATCTGATGTGGC-3'；
[0018] P7513R:5' -TTACACCCGTGACTCCCCT-3，。
[0019] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種GII. 4型諾如病毒基因組的擴增方法，其特征在 于，分別以上述引物 P1F/P1596R、P1258F/P2805R、P2689F/P4248R、P4099F/G2SKR、NV2of2/ GV132和P6484F/P7513R作為擴增引物的上下游引物，以GII. 4型諾如病毒的RNA為模板進 行RT-PCR擴增，分別得到擴增產(chǎn)物，然后對擴增產(chǎn)物進行核酸序列測定，然后再拼接比對， 得到GII. 4型諾如病毒基因組全長序列。
[0020] 優(yōu)選，所述的RT-PCR，其反應(yīng)體系為：含有2 X one-stepRT-PCR mixture 10 y L， 10 y mol/L上游引物和10 y mol/L下游引物各0. 6 y L，MLV/RNasin/HS-Taq酶混合液 0. 8 y L，RNA模板2 y L，其余由雙蒸水補足至20 y L，反應(yīng)條件為：50°C反轉(zhuǎn)錄30min，94°C預(yù) 變性 3min，然后 94°C 30s，55°C 30s，72°C 80s，共 30 次循環(huán)后，72°C最后延伸 7min。
[0021] 本發(fā)明針對GII. 4型諾如病毒主要流行基因型，根據(jù)基因組所包含的三個開放 閱讀框設(shè)計了 "4+1+1"的分段擴增策略，并根據(jù)保守區(qū)域設(shè)計相應(yīng)的擴增引物；在優(yōu)化反 應(yīng)條件的基礎(chǔ)上，各對引物均達到了與常規(guī)檢測引物相同的擴增靈敏度，能有效的擴增出 GII. 4型諾如病毒的全基因組序列。本發(fā)明可廣泛應(yīng)用于醫(yī)療衛(wèi)生、檢驗檢疫等具有諾如病 毒檢測需求及相應(yīng)的科研領(lǐng)域。
【附圖說明】：
[0022] 圖1是適用于GII. 4型諾如病毒基因組擴增用引物的RT-PCR退火溫度優(yōu)化，電 泳順序為M，1-36,其中M為DNA Ladder，1-6、7-12、13-18、19-24、25-30、31-36分別為引 物P1F/P1596R、P1258F/P2805R、P2689F/P4248R、P4099F/G2SKR、NV2of2/GV132、P6484F/ P7513R在不同退火溫度（依次為50 °C、52 °C、54°C、56 °C、58 °C、60 °C)下擴增產(chǎn)物的電泳結(jié) 果。
[0023] 圖2是適用于GII. 4型諾如病毒基因組擴增用引物的RT-PCR靈敏度分析，電泳順 序為M，1-42。其中M為DNA Ladder，1-6、7-12、13-18、19-24、25-30、31-36、37-42分別為基 因組擴增引物PlF/P1596R、P1258F/P2805R、P2689F/P4248R、P4099F/G2SKR、NV2of2/GV132、 P6484F/P7513R和檢測引物G2SKF/G2SKR在病毒RNA不同稀釋度（依次為101-106倍稀 釋）下擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果。
[0024] 圖3是實際樣本中病毒基因組的擴增效果，電泳順序為M，1-30。其中M為DNA Ladder，1-5、6-10、11-15、16-20、21-25、26-30依次為實際樣本110、162、165、1106、1232進 行4+1+1策略擴增基因組6個產(chǎn)物的電泳結(jié)果。
【具體實施方式】：
[0025] 以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0026] 以下實施例所使用的GII. 4型諾如病毒基因組擴增引物，具體如下：
[0027]引物對 1:P1F:5，-GTGAATGAAGATGGCGTCTAAC-3'；
[0028] P1596R：5r-TCGACGCCATTGCGTGGGA-3r；
[0029] 引物對 2:P1258F:5' -CAACCATATGACCACCTTGCT-3' ；
[0030] P2805R ： 5r -ATGGCCACCTCCTCATAGTA-3r ；
[0031] 引物對 3:P2689F:5' -AGGTCTCAGTGATGAAGAG-3，；
[0032] P4248R ： 5r -GGGCCATCCTCATTCATATTCA-3r ；
[0033] 引物對 4:P4099F:5' -TGGTAAGATCAAGAAGAGGCT-3，；
[0034] G2SKR:5， -CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT-3，；
[0035]引物對 5:NV2of2:5，-GGAGGGCGATCGCAATC-3，；
[0036] GV132:5, -CCRGCRAAGAAAGCTCCAGCCAT-3' ；
[0037] 引物對 6:P6484F:5' -CAGCACAATCTGATGTGGC-3' ；
[0038] P7513R:5' -TTACACCCGTGACTCCCCT-3，。
[0039] 實施例1 :
[0040] 適用于GII. 4型諾如病毒基因組擴增用引物的RT-PCR退火溫度優(yōu)化
[0041] (1)病毒樣本處理及核酸提取：通過PBS溶液（pH7. 4, DEPC處理）稀釋收集的待 處理樣品（含有GII.4型諾如病毒L10)至10% (w/v)濃度，充分振蕩混勻，于12000Xg下 離心10min收集上清液140 y L，并通過RNA提取試劑盒抽提樣本中病毒RNA共60 y L。
[0042] (2) "4+1+1"基因組分段擴增法（即分6段擴增，所使用的引物配組如下：P1F/ P1596R、P1258F/P2805R、P2689F/P4248R、P4099F/G2SKR、NV2of2/GV132 和 P6484F/P7513R， 每次RT-PCR反應(yīng)選擇一對引物）：采用20 y L的一步法RT-PCR反應(yīng)體系，含有2 X one-step RT-PCR mixture 10yL，上游引物和下游引物（10ymol/L)各 0.6yL，MLV/RNasin/HS-Taq 酶混合液0. 8 y L，樣本病毒RNA模版2 y L，其余由ddH20補足。
[0043] 反應(yīng)條件為：50°C 反轉(zhuǎn)錄 30min，94°C