一種荔枝霜疫霉菌lamp引物及其快速檢測方法和應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)作物病害防治及植物檢疫領(lǐng)域，特別涉及一種荔枝霜疫霉菌LAMP 引物及其快速檢測方法和在荔枝霜疫霉菌的早期診斷、病菌的監(jiān)測和鑒定中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 蒸枝（Litchii chinensis Sonn.)是原產(chǎn)于我國南部和越南北部著名的熱帶亞 熱帶特產(chǎn)水果，在我國主要分布于廣東、廣西、福建、海南、臺灣、四川、云南、貴州、浙江等省 區(qū)。我國荔枝的種植面積和產(chǎn)量為世界之首，且大量出口。荔枝因其經(jīng)濟價值高，是我國在 國際市場上最有競爭力的果品之一。隨著荔枝連作和種植面積的擴大，荔枝產(chǎn)業(yè)的發(fā)展主 要由真菌病害的發(fā)生和危害所影響，尤其是蒸枝霜疫霉?。≒eronophythora litchii Chen ex Ko et al.)，是荔枝上最常見的主要真菌性病害，已成為影響荔枝生產(chǎn)的限制因子之一。 病菌主要危害近成熟的果實，也危害幼果、果柄、花穗和葉片，常造成大量爛果、落果和貯運 期間果品損失，嚴重時爛果率達到30~80%，嚴重威脅了荔枝的產(chǎn)量與品質(zhì)，并常與其他 荔枝病害混合發(fā)生，給病害的診斷造成困難，而生產(chǎn)上則常因不明發(fā)病原因，難以有針對性 的防治措施，故造成更為嚴重的危害。因此建立荔枝霜疫霉菌快速檢測體系，早期對發(fā)病植 株進行荔枝霜疫霉菌的快速準確檢測，對預測病害發(fā)生情況、及時采取有效的防治措施控 制病原菌的傳播和流行、減少經(jīng)濟損失都具有重要的理論和實際意義。
[0003]目前對荔枝霜疫霉菌的檢測大多仍沿用傳統(tǒng)的組織分離培養(yǎng)及形態(tài)學鑒定方法， 但是，這種鑒定方法耗時長，并且分離成功率不高。若是多種病原菌復合侵染，所分離的病 害樣本不新鮮，則更難確診病原菌，難以滿足對荔枝霜疫霉病診斷的實際需要，這對病原菌 的檢測和防控十分不利。
[0004]環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，簡稱 LAMP) 是2000年由日本榮研株式會社Notomi等人開發(fā)的一種新型循環(huán)恒溫核酸擴增技術(shù)。LAMP 反應針對靶基因的6個位點設計出4條引物，利用一種鏈式置換活性的DNA聚合酶（Bst DNApolymerase)，在恒溫條件下（60~65°C )保溫30~90分鐘，即可完成擴增反應。由于 LAMP反應的高效性和等溫快速擴增的特點，在短短的30~90分鐘內(nèi)就能實現(xiàn)10 9~10 w 倍產(chǎn)物的擴增。LAMP擴增產(chǎn)物的檢測一般采用熒光染料目測觀察、瓊脂糖凝膠電泳和濁度 觀察等方法。由于LAMP反應簡單、快速、高效、經(jīng)濟等特征，因而具有極為廣泛的應用前景。 目前LAMP檢測主要應用于人畜病原物、食品安全和環(huán)境衛(wèi)生的檢測，在植物病原菌檢測中 報道極少，荔枝霜疫霉的檢測國內(nèi)外均未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中荔枝霜疫霉菌的生物學檢測方法所需周期長、檢測 方法特異性差，靈敏度低的缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種荔枝霜疫霉菌 (Peronophythora litchii)LAMP 引物。
[0006] 本發(fā)明另一目的在于提供一種基于上述荔枝霜疫霉菌LAMP引物的快速檢測方 法。該檢測方法結(jié)果可靠、易于操作、特異性強、靈敏度高。
[0007] 本發(fā)明再一目的在于提供上述快速檢測方法在荔枝霜疫霉菌的早期診斷、病菌的 監(jiān)測和鑒定中的應用。
[0008] 本發(fā)明的目的通過下述方案實現(xiàn)：
[0009] 一種蒸枝霜疫霉菌（Peronophythora litchii)LAMP引物，包括內(nèi)引物對F3和B3， 以及外引物對FIP和BIP，序列如下所示：
[0010] F3 :5, -TGAGGACGTGTACTCGTTCC-3,；
[0011] B3 :5，-CGCTCATACAGTGGGTGATC-3，；
[0012] FIP ：
[0013] 5' -AGCTAAACTGTGACCAGGGTGGCGTCTCCTTTTGGCTTCGTG-3' ；
[0014] BIP ：
[0015] 5 ' -GTTACCCGGTCAGCTATGCTGGGCGGGCTTTGAACATCTTGT-3 '。
[0016] 本發(fā)明還提供了一種基于上述荔枝霜疫霉菌LAMP引物的快速檢測方法，包括以 下步驟：
[0017] 以待檢測樣本的DNA為模板，利用上述引物進行LAMP反應擴增，再通過熒光染料 目測觀察法或瓊脂糖凝膠電泳法進行檢測。
[0018] 所述LAMP反應體系優(yōu)選為：25yL，其中F3與B3濃度分別為0.2yM，F(xiàn)IP與 BIP 濃度分別為 1.6yM，20mM Tris-HCl，10mM(NH4)2S04，10mM KC1，2 ~4mM MgS04,0.1% Tween-20,0 ~1. 2M Betaine，ImM dNTPs，8U Bst DNA 聚合酶大片段，10 ~50ng DNA 模 板，不足部分用無菌雙蒸水補足；反應條件為在60~65°C溫育30~90min，80°C保溫5~ 10min〇
[0019] 所述LAMP反應體系更優(yōu)選為：25 y L，其中F3與B3濃度分別為0. 2 y M，F(xiàn)IP與 BIP 濃度分別為 1.6yM，20mM Tris-HCl，10mM(NH4)2S04，10mM KC1，2 ~4mM MgS04,0.1% Tween-20,0 ~1.2M Betaine，lmM dNTPs，8U Bst DNA 聚合酶大片段，25ng DNA 模板，不足 部分用無菌雙蒸水補足；反應條件為在65°C溫育60min，80°C保溫lOmin。
[0020] 所述LAMP反應體系更優(yōu)選為：25yL，其中F3與B3濃度分別為0. 2yM，F(xiàn)IP與BIP 濃度分別為 1.6 yM，20mM Tris-HCl，10mM(NH4)2S04，10mM KCl，2mM MgS04,0. 1% Tween-20， 0.2M Betaine，lmM dNTPs，8U Bst DNA聚合酶大片段，25ng DNA模板，不足部分用無菌雙蒸 水補足；反應條件為在65°C溫育60min，80°C保溫lOmin。
[0021] 所述熒光染料目測觀察法：在LAMP反應的最終擴增產(chǎn)物中加入1 yL顯色劑，所述 顯色劑為SYBR Green I，觀察顯示結(jié)果。顯色結(jié)果觀察到綠色熒光判斷為陽性，橙色判斷 為陰性。
[0022] 所述的瓊脂糖凝膠電泳法：取6 y L LAMP反應的最終擴增產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠 電泳檢測，觀察結(jié)果。如果出現(xiàn)LAMP特征性的梯形帶判斷為陽性，沒有出現(xiàn)擴增條帶判斷 為陰性。
[0023] 所述待檢測樣本的DNA優(yōu)選通過DNA抽提試劑盒法提取。
[0024] 當所述的待檢測樣本為菌體時，優(yōu)選使用真菌DNA抽提試劑盒法提取。
[0025] 當所述的待檢測樣本為植物組織時，優(yōu)選使用植物組織DNA抽提試劑盒法提取。
[0026] 本發(fā)明檢測方法結(jié)果可靠、易于操作、特異性強、靈敏度高，適用于發(fā)病組織中荔 枝霜疫霉菌的快速可靠的檢測和鑒定，可直接用于帶菌的植株高靈敏度快速檢測，可用于 荔枝霜疫霉菌的早期診斷、病菌的監(jiān)測和鑒定中。本發(fā)明建立了荔枝霜疫霉菌快速、簡便、 特異性強、靈敏度高的監(jiān)測技術(shù)體系，對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中荔枝霜疫霉菌引起病害顯癥之前的 早期監(jiān)測，確定病害防治最佳時期具有十分重要的意義。
[0027] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點及有益效果：
[0028] 1、結(jié)果可靠：本發(fā)明的LAMP引物及LAMP反應體系，已經(jīng)對荔枝霜疫霉菌和帶荔枝 霜疫霉的植物組織進行了多次重復驗證，結(jié)果可靠。
[0029] 2、特異性強：本發(fā)明的LAMP引物是針對荔枝霜疫霉M90基因序列中6個不同區(qū)域 設計出4條特異性引物，6個區(qū)域中任何區(qū)域與引物不匹配均不能進行核酸擴增，故特異性 尚。
[0030] 3、靈敏度高：本發(fā)明的LAMP檢測方法對荔枝霜疫霉菌的檢測靈敏度在DNA水平上 可達到lpg，比常規(guī)PCR檢測高1000倍。
[0031] 4、操作簡便快速：應用本發(fā)明方法，對帶荔枝霜疫霉菌的組織進行檢測可在1小 時內(nèi)完成，且LAMP核酸擴增是在等溫條件下進行，只需一個水浴鍋即可，不需要復雜的儀 器設備和昂貴的分子試劑，結(jié)果肉眼直接可見。
【附圖說明】
[0032]圖1為荔枝霜疫霉菌的特異LAMP瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖。其中：泳道M為 DL 2000DNAmarker，泳道1為荔枝霜疫霉，泳道2為荔枝炭疽菌，泳道3為黃瓜疫霉菌，泳道 4為黃瓜腐霉菌，泳道5為陰性對照，泳道6為空白對照。