基于cytC基因檢測番茄潰瘍病菌的LAMP檢測引物組、試劑盒及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學技術(shù)領(lǐng)域，涉及植物病害的檢測方法，具體涉及一種利用環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(LAMP)快速檢測番茄潰瘍病菌的引物組、試劑盒和檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]番前細菌性潰瘍病(Bacterial canker of tomato)是由密執(zhí)安棒形桿菌密執(zhí)安亞種(C/aKiAacter michiganensis subsp.引起的一種維管束病害，經(jīng)種子和土壤傳播。自1909年首次在美國密執(zhí)安州的溫室番前上發(fā)現(xiàn)以來，現(xiàn)已廣泛分布于全球60多個國家和地區(qū)，在我國北京、黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古等地均發(fā)生嚴重，近年來發(fā)病呈上升趨勢，成為番茄生產(chǎn)上的一種毀滅性的病害，造成的產(chǎn)量損失高達80%以上。我國1995年將該病原菌列入《全國植物檢疫對象名單》，2007年列入《中華人民共和國進境植物檢疫有害生物名錄》。
[0003]通過種子檢疫和早期病害檢測能對該病害起到較好的防控作用。目前對番茄細菌性潰瘍病菌檢測的方法主要有生理生化反應(yīng)、ELISA、PCR、基因芯片和測序比對等。在上述方法中，PCR方法應(yīng)用最為廣泛，但基于PCR技術(shù)的轉(zhuǎn)基因檢測方法需要PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)等專業(yè)儀器設(shè)備，且擴增和產(chǎn)物檢測時間較長(約3~4 h)，難以實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測，因此，在實際工作中需要一種更加便捷、準確、且適用于現(xiàn)場操作的檢測新技術(shù)。
[0004]LAMP技術(shù)是由日本榮研化學株式會社在2000年開發(fā)的一種新的基因擴增技術(shù)，該技術(shù)的基本特點是:①恒溫擴增:整個擴增反應(yīng)在恒溫條件(60~65°C)進行，不需要特殊儀器設(shè)備；②快速高效:整個擴增和產(chǎn)物檢測可在I h內(nèi)完成；③高特異性:針對靶標序列的6個區(qū)域設(shè)計4條檢測引物，擴增特異性高；④高靈敏度:檢測極限可低至10個拷貝或更低；⑤鑒定簡便:擴增產(chǎn)物有多種鑒定方法，如肉眼觀察或利用濁度儀觀察反應(yīng)管內(nèi)沉淀的濁度變化、加入染料觀察顏色變化等。
[0005]目前雖有報道利用LAMP技術(shù)檢測番茄細菌性潰瘍病菌的檢測方法和試劑盒，但采用的檢測引物大多根據(jù)番茄潰瘍病菌ITS序列進行設(shè)計的，且沒有設(shè)計環(huán)引物。本發(fā)明以番茄潰瘍病菌的特異性基因criC為檢測靶標對象，設(shè)計了 2條內(nèi)引物、2條外引物和I條環(huán)引物，能在60分鐘內(nèi)、63~65°C的反應(yīng)條件下，通過顯色反應(yīng)對番茄潰瘍病菌特異性檢出。檢測特異性更強、靈敏度更高、時間更短、方法更簡單。在進出口檢疫部門和基層植保部門，本發(fā)明具有廣闊的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的一個目的在于公開番茄潰瘍病菌基因的LAMP檢測引物組。
[0007]本發(fā)明的另一個目的在于公開番茄潰瘍病菌cytC基因的LAMP檢測試劑盒。
[0008]本發(fā)明的另一個目的在于公開一種基于上述引物組和試劑盒檢測番茄潰瘍病菌的LAMP檢測方法。
[0009]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:
根據(jù)番茄潰瘍病菌的cytC基因的核苷酸序列，設(shè)計基因的LAMP檢測引物組，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1~5 ;確定LAMP檢測方法的技術(shù)參數(shù)，并對檢測方法的特異性進行驗證。
[0010]番茄潰瘍病菌中g(shù)tc基因的LAMP檢測引物組，包括外引物1、外引物2、內(nèi)引物1、內(nèi)引物2和環(huán)引物，其核苷酸序列分別如下所示:
外引物 I:TATGCCGCCGGTGACG (SEQ ID NO:1);
外引物 2:CCATCCGTGTGCCTGCA (SEQ ID NO:2);
內(nèi)引物 1:ATCGACGGCGTTGGTCCGG-GGTGGAATCCGCTCTTCAC (SEQ ID NO:3);
內(nèi)引物 2:ATCCACGTAGCCGAACGCATCG-GCCCGAACTGGTCAGACC (SEQ ID NO:4);
環(huán)引物:TGCTCCACCCGCATCGA (SEQ ID NO:5)。
[0011]番茄潰瘍病菌中cytC基因的LAMP檢測試劑盒，包括以下組分:
(1)檢測引物溶液:由權(quán)利要求1所述的5條引物配制的檢測引物溶液，外引物1、外引物2、內(nèi)引物1、內(nèi)引物2和環(huán)引物的濃度依次為4~6 MmoI/L,4-6 Mmol/L,32-48 Mmol/L、32—48 Mmol/L、4~6 Mmol/L ；
(2)具有鏈置換活性的DNA聚合酶:濃度為7?9U/ μ L ;
(3)1X 反應(yīng)緩沖液:200 mmol/L Tris-HCl、pH 8.8，100 mmol/L KCl, 100 mmol/L(NH4)2SO4,40-100 mmol/L MgSO4,6-14 mol/L 甜菜堿；
(4)dNTPs溶液，由濃度分別為10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四種脫氧核糖核苷酸溶液等體積混合而成；
(5)顯色齊IJ:1000XSYBR GREEN I 熒光染料。
[0012]優(yōu)選的，所述的檢測引物溶液中含有5 Mmol/L外引物1、5 Mmol/L外引物2、40Mmol/L內(nèi)引物1、40 Mmol/L內(nèi)引物2、5 Mmol/L環(huán)引物。
[0013]優(yōu)選的，所述的具有鏈置換活性的DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶，濃度為8 U/μ L0
[0014]優(yōu)選的，所述的10Χ反應(yīng)緩沖液中MgSO4、甜菜堿的濃度分別為80 mmol/L和8mol/L。
[0015]利用以上所述的試劑盒檢測番茄潰瘍病菌的方法，包括如下步驟:
(1)提取番茄潰瘍病菌基因組DNA:按細菌基因組DNA提取試劑盒提取番茄潰瘍病菌基因組DNA ；
(2)配制待測樣品的LAMP檢測反應(yīng)體系:在200μ L反應(yīng)管內(nèi)加入模板DNA 2~5 μ L、檢測引物溶液I μ L、Bst DNA聚合酶I yL、10X反應(yīng)緩沖液2.5 μ UdNTPs溶液2~5 μ L，用滅菌去離子水或超純水補齊至總體積為25 μ L ;
(3)運行LAMP擴增反應(yīng):63~65°C孵育30~60min，80°C孵育5min終止反應(yīng)；
(4)LAMP擴增結(jié)果的鑒定:在反應(yīng)管中加入1~2μ L顯色劑，通過肉眼觀察顯色結(jié)果來判斷擴增結(jié)果。
[0016]通過實驗證明，本發(fā)明提供的基因的LAMP檢測引物組、試劑盒及檢測方法具有快速高效、操作簡便、特異性強、靈敏度高等優(yōu)點，能夠快速準確鑒定番茄潰瘍病菌。
【附圖說明】
[0017]圖1為實施例2中進行LAMP特異性檢測的結(jié)果圖，I為番茄潰瘍病菌，2為番茄青枯假單胞菌，3為茄青枯假單胞菌、4為馬鈴薯環(huán)腐病菌、5為黃瓜角斑病菌、6為西瓜果斑病菌、7為馬鈴薯瘡痂病菌、8為空白對照。
【具體實施方式】
[0018]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
[0019]實施例1試劑盒及其檢測方法。
[0020]按下列配方制備番茄潰瘍病菌中cytC基因的LAMP檢測試劑盒，每個試劑盒的規(guī)格為100次反應(yīng):
(1)檢測引物溶液:合成外引物1、外引物2、內(nèi)引物1、內(nèi)引物2、環(huán)引物，將引物干粉用滅菌去離子水或超純水分別配成濃度為100 y mol