用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆gts 40?3?2的lamp引物組及檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40?3?2的LAMP引物組及檢測(cè)方法；是通過(guò)提取待檢大豆品種的DNA，利用設(shè)計(jì)的四條特異性LAMP引物對(duì)模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增，2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，利用是否出現(xiàn)帶狀電泳條帶可確定待檢大豆是否為轉(zhuǎn)基因大豆GTS40?3?2。本發(fā)明檢測(cè)限為每體系模板DNA量為0.001ng。本發(fā)明具有簡(jiǎn)便快捷、特異性高、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，為檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40?3?2提供了新的LAMP檢測(cè)引物組。
【專利說(shuō)明】
用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2的LAMP引物組及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ] 本發(fā)明設(shè)及農(nóng)業(yè)和植物檢疫技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及轉(zhuǎn)基因大豆Roundup Ready(GTS 40-3-2)的LAMP檢測(cè)引物組及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 大豆是世界上重要的油料作物之一，2015年，大豆油約占中國(guó)植物油原料的44%， 我國(guó)大豆每年的需求量大約為8500萬(wàn)噸。然而，我國(guó)大豆生產(chǎn)難W滿足國(guó)內(nèi)需求，自1996年 W來(lái)，我國(guó)開(kāi)始大量進(jìn)口大豆，2014年大豆進(jìn)口量達(dá)到7300萬(wàn)噸，約占世界大豆產(chǎn)量的 20%。目前，我國(guó)進(jìn)口的大豆主要來(lái)自美國(guó)、阿根廷和己西，其中，2014年從美國(guó)進(jìn)口大豆量 約占進(jìn)口總量的42%。而美國(guó)是轉(zhuǎn)基因大豆種植大國(guó)，美國(guó)的轉(zhuǎn)基因大豆主要是孟山都公 司生產(chǎn)的抗草甘麟轉(zhuǎn)基因大豆（Roundup Ready)。其中，GTS 40-3-2是將Agrobacterium tumefaciens strain CP4中分離出的抗草甘麟的5-締醇式丙酬莽草酸-3-憐酸合酶 化PSPS)基因轉(zhuǎn)入商業(yè)大豆品種"A540滬中而育成。
[0003] 轉(zhuǎn)基因作物的發(fā)展引起全世界對(duì)人類健康及環(huán)境安全的深切擔(dān)憂，因此，科學(xué)的 對(duì)轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行有效監(jiān)控，建立有效的檢測(cè)方法，對(duì)于消除民眾憂慮，促進(jìn)國(guó)家間正常商 業(yè)貿(mào)易具有重要的意義。目前，世界上許多國(guó)家紛紛出臺(tái)了嚴(yán)格的管理法規(guī)，對(duì)轉(zhuǎn)基因食品 進(jìn)行嚴(yán)格管理。比如，歐盟規(guī)定食品中基因修飾物質(zhì)的含量超過(guò)1%就必須標(biāo)示。我國(guó)政府 規(guī)定，凡是列入標(biāo)示管理目錄并用于銷售的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因作物都應(yīng)當(dāng)標(biāo)示。
[0004] 目前，轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的方法主要是基于目標(biāo)蛋白的檢測(cè)和基于目的核酸的檢測(cè)。其 中，W蛋白為目標(biāo)的檢測(cè)方法主要是ELISA檢測(cè)和膠體金快速檢測(cè)試紙條法，運(yùn)兩種方法價(jià) 格昂貴，在日常檢測(cè)中難W普及。基于核酸的檢測(cè)方法主要是核酸分子雜交技術(shù)和PCR技 術(shù)。目前，國(guó)內(nèi)外廣泛使用的是定做CR和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法。然而，PCR方法反應(yīng)體系和 操作過(guò)程復(fù)雜，需要專業(yè)人±。另外，PCR擴(kuò)增時(shí)間為1.5-2小時(shí)，所需PCR儀價(jià)格在5-10萬(wàn)元 左右。因此，尋找一種快速、簡(jiǎn)便、容易操作且準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)方法勢(shì)在必行。
[0005] 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Xoop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)是日本 榮研化學(xué)朱式會(huì)社2000年前后開(kāi)發(fā)出的基因擴(kuò)增技術(shù)，具有快速簡(jiǎn)便、不需要大型儀器、操 作方便等優(yōu)點(diǎn)。目前，已利用GTS 40-3-2插入序列與大豆內(nèi)源基因邊界序列、CaMV35S序列、 GTS40-3-2外源基因插入序列等開(kāi)發(fā)了轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2的系列LAMP檢測(cè)方法。
[0006] 本發(fā)明利用轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2的5'-junction插入序列（GenBank accession number:AJ308514.1)設(shè)計(jì)了新的LAMP引物，可用于轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2的快速檢測(cè)。本 發(fā)明對(duì)于準(zhǔn)確快速的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2檢測(cè)提供新的解決方案，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因大豆 GTS40-3-2的LAMP快速檢測(cè)方法，目的在于提供一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的GTS40-3-2的LAMP快 速檢測(cè)方法。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案：
[0009] 一種轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的LAMP快速檢測(cè)方法，包括如下步驟：
[0010] a)設(shè)計(jì)引物，引物序列為：
[00111
[0012] b)大豆基因組的提取:利用Cwbiotech DNA提取試劑盒提取大豆基因組。紫外分光 光度計(jì)化no化op 2000檢測(cè)DNA提取質(zhì)量和濃度，選取0D260/0D280檢測(cè)值為1.7-1.9的DNA 樣品用于LAMP擴(kuò)增，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0013] C化AMP擴(kuò)增:對(duì)步驟b)得到的基因組進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，LAMP體系設(shè)置反應(yīng)溫度梯度 為6rC、63°C和65°C;總體系25化：其中引物FIP(SEQ ID N0:3)，BIP(SEQ ID N0:4)，F(xiàn)3(SEQ ID N0:1)，B3(SEQ ID N0:2)比例為0.祉M:0.祉或0.6咖:0.6咖:0.1咖:0.化 M;4mM MgS〇4,1.6mM dNTPs,0.8M betaine(Si卵a(bǔ)-Al化ich,Tokyo,Japan),l]iL Bst DNA polymerase(化w England Biolabs,Beijing,Qiina);擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間為40min或60min。
[0014] d)分析:對(duì)步驟c)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳。2%瓊脂糖凝膠電泳 出帶狀條帶的為含有轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2的樣品，空白的為不含有轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40- 3-2的樣品。
[0015] 作為優(yōu)選，步驟C)中引物FIP(沈Q ID N0:3)，BIP(SEQ ID N0:4)，F(xiàn)3(沈Q ID NO: 1)，B3(SEQ ID 顯：2)比例為0.祉]?:0.祉]\1:0.化]\1:0.化]\1，擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間為40111111或60111111， LAMP擴(kuò)增反應(yīng)溫度為6rC或63 °C。
[0016] 作為優(yōu)選，步驟c)中引物FIP(沈Q ID N0:3)，BIP(SEQ ID N0:4)，F(xiàn)3(沈Q ID NO: 1)，B3(沈Q ID NO: 2)比例為0.祉M: 0.祉M: 0. liiM: 0. lyM，擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間為40min，LAMP擴(kuò)增 反應(yīng)溫度為ere。
[0017] 本發(fā)明的有益效果是：
[001引本發(fā)明利用GenBank公布的轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2的5 '-junction插入序列 (GenBank accession numbe;r:AJ308514.1)基因序列設(shè)計(jì)LAMPQoop-mediated isothermal amplification)引物，建立了轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2的LAMP檢測(cè)體系，并對(duì)反 應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。LAMP在引物FIP(沈Q ID N0:3)，BIP(沈Q ID N0:4)，F(xiàn)3(SEQ ID N0:1)， B3(沈Q ID ^:2)比例為0.祉]?:0.祉]\1:0.1咖:0.1測(cè)的25化體系下，61°(：反應(yīng)40111111為最佳 反應(yīng)條件。結(jié)果表明，建立的LAMP檢測(cè)體系簡(jiǎn)單、快速、靈敏度好、特異性高，在轉(zhuǎn)基因大豆 GTS 40-3-2的LAMP檢測(cè)方面潛力巨大。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1 lamp引物擴(kuò)增GTS 40-3-2的2%瓊脂糖電泳圖；
[0020] 圖中:M為marker，1，2泳帶為模板DNA為GTS 40-3-2; 3，4泳帶為模板加水對(duì)照。
[0021] 圖1說(shuō)明：1，2泳帶出現(xiàn)帶狀條帶，表明設(shè)計(jì)的LAMP引物及擴(kuò)增體系可w擴(kuò)增出GTS 40-3-2的特異條帶;3，4泳帶未出現(xiàn)條帶，表明反應(yīng)體系未受到DM污染。
[0022] 圖2為特異性檢測(cè)圖；
[0023] 圖2中：M，marker;l-12泳帶分別代表模板DNA來(lái)自轉(zhuǎn)基因大豆（GTS 40-3-2， M0N87701，CV127,356043，M0N89788,305423)及小麥、大豆、玉米、油菜、水稻和空白（水)對(duì) 照；
[0024] 圖2說(shuō)明：1泳帶出現(xiàn)帶狀條帶，表明檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2; 2-11泳帶出現(xiàn) 空白，表明未檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2,說(shuō)明設(shè)計(jì)的引物對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2具 有特異性;12泳帶出現(xiàn)空白，表明反應(yīng)體系未受到DNA污染。
[0025] 圖3為靈敏性檢測(cè)圖；
[0026] 圖3中M為marker, 1-9泳帶分別代表每個(gè)體系（2化L)內(nèi)DNA模板基因組量分別為 60,40,10,1,0.1,0.01,0.005,0.001和O.OOOlng;
[0027] 圖3說(shuō)明：1-8泳帶均出現(xiàn)帶狀泳帶，表明模板DM為0.001-60ng時(shí)該體系可檢測(cè)到 轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2;9泳帶空白，表明模板DNA為O.OOOlng時(shí)不能檢測(cè)到GTS 40-3-2。因 此，該體系檢測(cè)下限為O.OOlng/25化。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面通過(guò)具體實(shí)施案例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的具體說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，本 發(fā)明的實(shí)施例并不局限于下面的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都 將落入本發(fā)明保護(hù)范圍。
[0029] 下述實(shí)施例中的方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。
[0030] LAMP法Bst DNA polymerase由化W Elngland Biolabs公司提供，大豆基因組DNA使 用Cwbiotech DNA提取試劑盒提取，瓊脂糖Agarose H(上海生工），Betaine由Sigma- A1化ich公司提供。
[0031 ] 利用GenBank公布的轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2的5 ' -junction插入序列（GenBank accession number :AJ308514.1)基因序列設(shè)計(jì)LAMP( loop-mediated isothermal amplification)引物。
[0032] 實(shí)施例1
[0033] 轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的LAMP快速檢測(cè)方法，包括如下步驟：
[0034] a)設(shè)計(jì)引物，引物序列為：
[0035]
[0036] b)大豆基因組的提取:稱取2-3g大豆種子，研磨，利用Cwbiotech DNA提取試劑盒 提取大豆基因組。紫外分光光度計(jì)化nodrop 2000檢測(cè)DNA提取質(zhì)量和濃度，選取0D260/ 0D280檢測(cè)值為1.7-1.9的DM樣品用于LAMP擴(kuò)增，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0037] C化AMP擴(kuò)增:對(duì)步驟b)得到的基因組進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，LAMP體系設(shè)置反應(yīng)溫度梯度 為61°C;總體系25化:其中引物FIP(沈Q ID N0:3)，BIP(SEQ ID N0:4)，F(xiàn)3(SEQ ID N0:1)， 63(569 10騰：2)比例為0.如]?:0.如]\1:0.化]\1:0.1礎(chǔ)，4111]\11邑504，1.6111]\1(1^?3,0.81 betaine(Sigma-Aldrich,Tokyo,Japan),luL Bst DNA polymerase(New England Biolabs，Beijing, China);設(shè)置 LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間為 40min。
[0038] d)分析:對(duì)步驟c)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳。2%瓊脂糖凝膠電泳 出帶狀條帶的為含有轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2的樣品，空白的為不含有轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40- 3-2的樣品。
[0039] 實(shí)施例2
[0040] 轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的LAMP快速檢測(cè)方法，包括如下步驟：
[0041] a)設(shè)計(jì)引物，引物序列為：
[0042]
[0044] b)大豆基因組的提取:稱取2-3g大豆種子，研磨，利用Cwbiotech DNA提取試劑盒 提取大豆基因組。紫外分光光度計(jì)化nodrop 2000檢測(cè)DNA提取質(zhì)量和濃度，選取0D260/ 0D280檢測(cè)值為1.7-1.9的DNA樣品用于LAMP擴(kuò)增，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0045] C化AMP擴(kuò)增:對(duì)步驟b)得到的基因組進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，LAMP體系設(shè)置反應(yīng)溫度梯度 為63°C;總體系25化：其中引物FIP(沈Q ID N0:3)，BIP(SEQ ID N0:4)，F(xiàn)3(SEQ ID N0:1)， 63(569 10騰：2)比例為0.64]?:0.64]\1:0.化]\1:0.1礎(chǔ)，4111]\11邑504，1.6111]\1(1^?3,0.81 betaine(Sigma-Aldrich,Tokyo,Japan),luL Bst DNA polymerase(New England Biolabs，Beijing, China);設(shè)置 LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間為 40min。
[0046] d)分析:對(duì)步驟c)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳。2%瓊脂糖凝膠電泳 出帶狀條帶的為含有轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2的樣品，空白的為不含有轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40- 3-2的樣品。
[0047] 實(shí)施例3
[004引轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的LAMP快速檢測(cè)方法，包括如下步驟：
[00例 a)設(shè)計(jì)引物，引物序列為：
[(K)加 ]
[0051 ] b)大豆基因組的提取:稱取2-3g大豆種子，研磨，利用Cwbiotech DM提取試劑盒 提取大豆基因組。紫外分光光度計(jì)化nodrop 2000檢測(cè)DNA提取質(zhì)量和濃度，選取0D260/ 0D280檢測(cè)值為1.7-1.9的DNA樣品用于LAMP擴(kuò)增，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0052] C化AMP擴(kuò)增:對(duì)步驟b)得到的基因組進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，LAMP體系設(shè)置反應(yīng)溫度梯度 為65°C;總體系25化：其中引物FIP(沈Q ID N0:3)，BIP(SEQ ID N0:4)，F(xiàn)3(SEQ ID N0:1)， 63(569 10騰：2)比例為0.如]?:0.如]\1:0.化]\1:0.1礎(chǔ)，4111]\11邑504，1.61111(1^口3,0.81 betaine (Sigma-Aldrich, Tokyo , Japan),lyL Bst DNA polymerase(New England Biolabs，Beijing, China);設(shè)置 LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間為 60min。
[0053] d)分析:對(duì)步驟c)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳。2%瓊脂糖凝膠電泳 出帶狀條帶的為含有轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2的樣品，空白的為不含有轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40- 3-2的樣品。
[0化4]靈敏性檢測(cè):將利用本發(fā)明步驟b)得到的轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2基因組DNA稀釋， W保證每個(gè)體系（2扣L)內(nèi)DNA模板基因組量分別為60，40，10，1，0.1，0.01，0.005，0.001和 O.OOOlng，驗(yàn)證LAMP優(yōu)化體系針對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2的檢測(cè)效果。LAMP結(jié)果如圖3所 示:LAMP檢測(cè)體系靈敏度對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2能夠達(dá)到0.0 Olng/體系。
[0055] 特異性檢測(cè)：利用DNA提取試劑盒(Cwbiotech)提取大豆基因組。紫外分光光度計(jì) Nano化op 2000檢測(cè)DNA提取質(zhì)量和濃度，按照DNA模板濃度20ng/體系進(jìn)行LAMP和PCR擴(kuò)增， 驗(yàn)證LAMP優(yōu)化體系的特異性。從電泳圖1可W看出，含有轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2的擴(kuò)增樣液 能跑出清晰的梯度性LAMP條帶，并且，根據(jù)條帶可W明顯區(qū)分轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2(圖2) 和非轉(zhuǎn)基因大豆及其他作物。結(jié)果表明，本發(fā)明建立的針對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2的LAMP 檢測(cè)方法特異性強(qiáng)。
[0化6]本文發(fā)明中使用的轉(zhuǎn)基因大豆(GTS 40-3-2，M0N87701，CV127,356043，M0N89788， 305423)及小麥、大豆、玉米、油菜、水稻等材料均為中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)黃昆侖教授實(shí)驗(yàn)室提供。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的LAMP快速檢測(cè)方法，其特征在于步驟如下： a) 設(shè)計(jì)引物，引物序列為：b) 大豆基因組的提取:利用Cwbiotech DNA提取試劑盒提取大豆基因組；紫外分光光度 計(jì)Nanodrop 2000檢測(cè)DNA提取質(zhì)量和濃度，選取0D260/0D280檢測(cè)值為1.7-1.9的DNA樣品 用于LAMP擴(kuò)增，-20 °C保存?zhèn)溆茫? c) LAMP擴(kuò)增:對(duì)步驟b)得到的基因組進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，LAMP體系設(shè)置反應(yīng)溫度梯度為61 °(：、63°(：和65°(： ;總體系25此:其中引物卩1?，8^3,83的比例為0.8處:0.8處:0.1處:0.1虛 或0.6iiM:0.6iiM: 0.1祕(mì)：0. lyM;4mM MgS〇4，1.6mM dNTPs，0.8M betaine，lyL Bst DNA polymerase;擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間為40min或60min; d) 分析:對(duì)步驟c)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳;2%瓊脂糖凝膠電泳出帶 狀條帶的為含有轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2的樣品，空白的為不含有轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2的 樣品。2. 如權(quán)利要求1所述的一種轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的LAMP快速檢測(cè)方法，其特征在于所 述步驟(：）中引物？1?，8^3,83的比例為0.8_:0.8福:0.1福:0.1福，擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間為 40min或60min，LAMP擴(kuò)增反應(yīng)溫度為61°C或63°C。3. 如權(quán)利要求1所述的一種轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的LAMP快速檢測(cè)方法，其特征在于所 述步驟(：）中引物？1?，8^3,83的比例為0.8_:0.8福:0.1福:0.1福，擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間為 40min，LAMP擴(kuò)增反應(yīng)溫度為61°C。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK106048049SQ201610566417
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年7月18日
【發(fā)明人】張小村, 許文濤, 黃昆侖
【申請(qǐng)人】山東農(nóng)業(yè)大學(xué)