專利名稱：基于通用pcr擴(kuò)增進(jìn)行生物編碼的多組分色譜單核苷酸多態(tài)性檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種檢測單核苷酸多態(tài)性的生物傳感方法，包括等位特異性連接酶鏈反應(yīng)，通用PCR擴(kuò)增反應(yīng)，限制性內(nèi)切酶消化反應(yīng)以及利用液相色譜對目標(biāo)基因型特異性的生物編碼長度熒光標(biāo)記核酸片段的多組分定量檢測。
背景技術(shù)：
基因多態(tài)性的檢測在分子生物學(xué)、病原檢測、臨床檢驗(yàn)、新藥開發(fā)和人類的起源與進(jìn)化方面的研究中具有非常重要的作用。人類的許多遺傳疾病如α和β地中海貧血癥等都是由于單基因突變產(chǎn)生的。這些遺傳疾病是我國最主要的出生缺陷之一，嚴(yán)重影響我國的人口質(zhì)量，給社會與家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此，需要建立一種快速、靈敏、特異性的高通量檢測技術(shù)。傳統(tǒng)基因突變檢測主要借助于電泳、質(zhì)譜或基因芯片方法，這些方法需昂貴精密儀器，操作程序復(fù)雜，技術(shù)外延性差，分析周期長，故不適于進(jìn)行大規(guī)模人群篩查與產(chǎn)前的生物學(xué)研究。目前國際上的主要趨勢都集中于以DNA修飾酶為基礎(chǔ)，利用酶催化反應(yīng)提高基因突變鑒定方法的忠實(shí)性、可靠性與靈敏度，發(fā)展操作簡便、快速可靠、低成本、高通量的基因突變分析手段。例如，基于DNA聚合酶的等位特異性延伸或外切建立的TaqMan 探針分析、單核苷酸延伸分析等，基于DNA連接酶的等位特異性連接建立的寡核苷酸連接分析、連接酶鏈分析等，基于DNA內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)識別的Invader分析等。但是,這些檢測方法大多基于核酸分子雜交、凝膠電泳分析，核酸鏈的多重標(biāo)記，要么靈敏度不高、重現(xiàn)性不好、 可靠性差，要么分析通量較低、成本較高，且需要精密的儀器，不能滿足經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確、快速檢測的需求。本發(fā)明建立的基于通用PCR擴(kuò)增進(jìn)行生物編碼的多組分色譜單核苷酸多態(tài)性檢測方法，樣品用量少、操作簡便、成本較低，且可進(jìn)行多組分同時測定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提出了一種基于通用PCR 擴(kuò)增進(jìn)行生物編碼的多組分色譜單核苷酸多態(tài)性檢測方法，這種方法樣品用量少、操作簡便、成本較低，且可進(jìn)行多組分同時測定。本發(fā)明的技術(shù)方案是，基于通用PCR擴(kuò)增進(jìn)行生物編碼的多組分色譜單核苷酸多態(tài)性檢測方法，包括以下步驟(I)等位特異性連接酶鏈反應(yīng)；(2)通用PCR擴(kuò)增反應(yīng)；(3)限制性內(nèi)切酶消化反應(yīng)；(4)基于液相色譜的核酸片段多組分定量檢測。以下對本發(fā)明做出進(jìn)一步說明。所述基于通用PCR擴(kuò)增進(jìn)行生物編碼的多組分色譜單核苷酸多態(tài)性檢測方法采用以下步驟實(shí)現(xiàn)
等位特異性連接酶鏈反應(yīng)產(chǎn)生與目標(biāo)基因型匹配的連接產(chǎn)物，經(jīng)通用PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生連接產(chǎn)物的熒光標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物，通過限制性內(nèi)切酶消化反應(yīng)將擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為目標(biāo)基因型特異性的長度編碼熒光標(biāo)記核酸片段，利用液相色譜實(shí)施核酸片段多組分定量檢測。本發(fā)明中，所述基于通用PCR擴(kuò)增進(jìn)行生物編碼的多組分色譜單核苷酸多態(tài)性檢測分以下幾個步驟實(shí)現(xiàn)等位特異性連接酶鏈反應(yīng)20 μ L IXTaq ligase buffer反應(yīng)緩沖溶液(20mM Tris-HCl,25mM KAC,IOmM Mg(AC)2，and IOmM DTT，ImM NAD+,and 0. 1% Triton X_100，pH 7.9)中包含IOpM等位特異性區(qū)分探針對，IU/μ L熱穩(wěn)定Taq DNA連接酶和一定濃度的相應(yīng)目標(biāo)鏈，于熱循環(huán)儀中進(jìn)行連接酶鏈反應(yīng)。95°C變性3min，10個循環(huán)95°C變性lmin，60°C 退火雜交連接5min。通用PCR反應(yīng)連接酶鏈反應(yīng)之后取10 μ L上述反應(yīng)液，添加I μ L dNTPs混合溶液(IOmM)，O. 5 μ L Vent exo-DNA聚合酶，12. 5 μ L通用引物混合溶液(濃度分別為4 μ Μ)， 5μ L IOXThermopol buffer (IOOmM KCl,200mM Tris-HCl, IOOmM (NH4) 2S04, and I % Trion-X-100, pH 8. 8)，同時調(diào)整溶液反應(yīng)體積到50 μ L，于PCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。 95°C變性3min，30個循環(huán)95°C變性IOs ;70°C退火30s ;72°C延伸反應(yīng)15s，最后72°C延伸 7min，4°C避光保存?zhèn)溆?。限制性?nèi)切酶反應(yīng)通用PCR反應(yīng)之后取26 μ L上述反應(yīng)液，添加IyL RsaI限制性內(nèi)切酶，3 μ L 10ΧΝΕΒ buffer 4(200mM Tris-Ac, IOOmM Mg (AC) 2，500mM KAC，and IOmM DT T，pH 7. 9)，混勻，于37°C反應(yīng)2h，然后65°C加熱20min進(jìn)行RsaI限制性內(nèi)切酶的滅活處理，然后4°C避光保存?zhèn)溆?。注意，以上反?yīng)條件為最優(yōu)條件，所述溶液體積均可成倍變化不改變最優(yōu)結(jié)果。本發(fā)明中，所述基于通用PCR擴(kuò)增進(jìn)行生物編碼的多組分色譜單核苷酸多態(tài)性檢測方法的定量檢測可采用常規(guī)的高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行，以下是用HPLC法對基于通用PCR擴(kuò)增進(jìn)行生物編碼的多組分色譜檢測單核苷酸多態(tài)性的定量檢測步驟取10 μ L限制性內(nèi)切酶反應(yīng)混合溶液注入LC-20AT高效液相色譜儀(Shimadzu， Japan)中進(jìn)行分析。色譜條件為分離色譜柱為Shim-pack VP-ODS (4. 6 μ m, 150X4. 6mm), 保護(hù)柱為 Shim-pack VP-ODS (4. 6 μ m, I X 4. 6mm)，柱溫為 40。。，流速為 lmLl/min。流動相 A 為O. IM醋酸三乙胺水溶液(TEAA)，pH 7. O ;流動相B為O. IM含25%乙腈的ΤΕΑΑ,ρΗ 7. O。 線性洗脫梯度為25min內(nèi)流動相B從50%增加到58%, IOmin內(nèi)流動相B從58%增加到 60%。檢測器為RF-IOAxl突光檢測器(Shimadzu, Japan),最大激發(fā)光波長設(shè)定為490nm, 最大發(fā)射光波長設(shè)定為520nm。本發(fā)明提出了一種基于通用PCR擴(kuò)增進(jìn)行生物編碼的多組分色譜單核苷酸多態(tài)性檢測方法，該方法依靠連接酶鏈反應(yīng)進(jìn)行等位基因的基因分型，利用通用PCR進(jìn)行連接產(chǎn)物的擴(kuò)增，從而產(chǎn)生大量的熒光標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物，然后通過限制性內(nèi)切酶將該擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成目標(biāo)基因型特異的編碼長度熒光標(biāo)記核酸片段，最后利用HPLC進(jìn)行分離檢測，從而可實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)基因的便捷，穩(wěn)健，多組分同時檢測。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例I :基于通用PCR擴(kuò)增進(jìn)行生物編碼的多組分色譜單核苷酸多態(tài)性檢測方法用于β地中海貧血IVS-II-654(C > T)和⑶17(A > T)基因突變位點(diǎn)的突變檢測I)等位特異性連接酶鏈反應(yīng)20 μ L I XTaq ligase buffer反應(yīng)緩沖溶液 (20mM Tris-HCl,25mM KAC,IOmM Mg(AC)2, and IOmM DTT，ImM NAD+, and 0. 1% Triton X-100, pH7. 9)中包含 IOpM 等位特異性區(qū)分探針對(Probe LI :5，-P032—CCTTAACCC AGAAATTCATTGTTCGTAGCGCCCTGCCAC-3’ ；Probe Rl-M :5’ -GCGCCAGCAAGATCCAATCTAGAG TACAGAGATATTGCT ATTA-3’ ；Probe IU-W :5’ -GCGCCAGCAAGATCCAATCTAGAGTGTGTGTGT GTACAGAGATATTGCTATTG-3，；Probe L2 :5’-P032-GCCCCACAGGGATTGTTCGTAGCGCCCTGCCAC-3，； Probe R2-M :5’ -GCGCCAGCAAGATCCAATCTAGAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTACCACGTTCACCTA-3’； Probe R2-ff :5’-GCGCCAGCAAGATCCAATCTAGAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTACCACGTT CACCTT-3’)，lU/μ L熱穩(wěn)定Taq DNA連接酶和一定濃度的相應(yīng)目標(biāo)鏈，于熱循環(huán)儀中進(jìn)行連接酶鏈反應(yīng)。95°C變性3min，10個循環(huán)95°C變性Imin，60°C退火雜交連接5min。2)通用PCR反應(yīng)連接酶鏈反應(yīng)之后取10 μ L上述反應(yīng)液，添加I μ L dNTPs混合溶液(IOmM) ,0. 5μ L Vent exo-DNA聚合酶，12. 5 μ L通用引物(引物I : 5’ -GTGGCAGGGCGCTACGAACAAT-3’ ；引物 2 :5’ -FAM-GCGCCAGCAAGATCCAATCTAGA-3’ )混合溶液(濃度分別為 4μΜ)，5μ IOXThermopol buffer(IOOmM KCl,200mM Tris-HCl, IOOmM (NH4)2S04, and 1% Trion-X-100, pH 8. 8)，同時調(diào)整溶液反應(yīng)體積到 50 μ L，于 PCR 儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。95°C變性3min，30個循環(huán)95°C變性10s ;70°C退火30s ;72°C延伸反應(yīng)15s，最后72°C延伸7min，4°C避光保存?zhèn)溆谩?)限制性內(nèi)切酶反應(yīng)通用PCR反應(yīng)之后取26 μ L上述反應(yīng)液，添加IyL RsaI 限制性內(nèi)切酶，3yL 10XNEB buffer 4(200mM Tris-Ac, IOOmM Mg (AC) 2, 5 OOmMKAC, and IOmMDTT, pH 7. 9)，混勻，于37°C反應(yīng)2h，然后65°C加熱20min進(jìn)行RsaI限制性內(nèi)切酶的滅活處理，然后4°C避光保存?zhèn)溆谩?)高效液相色譜測定取10 μ L限制性內(nèi)切酶反應(yīng)混合溶液注入LC-20AT高效液相色譜儀(Shimadzu, Japan)中進(jìn)行分析。色譜條件為分離色譜柱為Shim-pack VP-ODS (4. 6 μ m，150 X 4. 6mm)，保護(hù)柱為 Shim-pack VP-ODS (4· 6 μ m，I X 4. 6mm)，柱溫為 40°C，流速為lmLl/min。流動相A為0. IM醋酸三乙胺水溶液(TEAA)，pH 7. O ;流動相B為 O. IM含25%乙腈的ΤΕΑΑ,ρΗ 7.0。線性洗脫梯度為25min內(nèi)流動相B從50%增加到58%， IOmin內(nèi)流動相B從58%增加到60%。檢測器為RF-IOAxl熒光檢測器(Shimadzu，Japan)， 最大激發(fā)光波長設(shè)定為490nm,最大發(fā)射光波長設(shè)定為520nm。按照上述步驟1)、2)、3)、4)對4個四種不同基因型的目標(biāo)鏈(人工合成)的標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度分別為0fM、0. lfM、lfM、10fM、100fM、lpM、5pM、10pM。)進(jìn)行檢測，記錄各標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對保留時間和所對應(yīng)的色譜峰的熒光強(qiáng)度，未知樣品的相對保留時間和熒光強(qiáng)度與和標(biāo)準(zhǔn)的液的相對保留時間和熒光強(qiáng)度對照，從而實(shí)現(xiàn)對未知樣品的基因分型。
權(quán)利要求
1.一種基于通用PCR擴(kuò)增進(jìn)行生物編碼的多組分色譜單核苷酸多態(tài)性檢測方法，其特征是，該方法包括以下步驟(1)等位特異性連接酶鏈反應(yīng)；(2)通用PCR擴(kuò)增反應(yīng)；(3)限制性內(nèi)切酶消化反應(yīng)；(4)基于液相色譜的核酸片段多組分定量檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于通用PCR擴(kuò)增進(jìn)行生物編碼的多組分色譜單核苷酸多態(tài)性檢測方法，其特征在于，步驟(4)中所述的核酸片段為目標(biāo)基因特異性的長度編碼熒光標(biāo)記核酸片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于通用PCR擴(kuò)增進(jìn)行生物編碼的多組分色譜單核苷酸多態(tài)性檢測方法，其特征在于，步驟(4)中所述的定量檢測是采用高效液相色譜進(jìn)行多組分同時檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于通用PCR擴(kuò)增進(jìn)行生物編碼的多組分色譜單核苷酸多態(tài)性檢測方法，它包括等位特異性連接酶鏈反應(yīng)，通用PCR擴(kuò)增反應(yīng)，限制性內(nèi)切酶消化反應(yīng)以及利用液相色譜對目標(biāo)基因型特異性的生物編碼長度熒光標(biāo)記核酸片段的多組分定量檢測。本發(fā)明利用等位特異性連接酶鏈反應(yīng)產(chǎn)生與目標(biāo)基因型匹配的連接產(chǎn)物，經(jīng)通用PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生連接產(chǎn)物的熒光標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物，通過限制性內(nèi)切酶消化反應(yīng)將擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為目標(biāo)基因型特異性的長度編碼熒光標(biāo)記核酸片段，利用液相色譜實(shí)施核酸片段多組分定量檢測。該方法樣品用量少、操作簡便、成本較低，且可進(jìn)行多組分同時測定，可望為人群篩查、產(chǎn)前的生物學(xué)研究提供一個通用的技術(shù)平臺。
文檔編號C12Q1/68GK102586462SQ20121007384
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月20日
發(fā)明者俞汝勤, 唐麗娟, 楚霞, 王紅旗, 蔣健暉, 譚蔚泓 申請人:湖南大學(xué)