專利名稱：基于磷脂分子修飾納米金顆粒的團聚反應(yīng)分析檢測酶及其抑制劑的生物傳感方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種基于磷脂分子修飾納米金顆粒團聚的生物分析技術(shù)，其具體涉及基于磷脂分子修飾納米金顆粒方法；磷脂分子修飾納米金顆粒與磷酸激酶、去磷酸化酶等及其抑制劑的特異反應(yīng)；特定磷脂分子的綁定蛋白標(biāo)記納米金顆粒；磷脂分子修飾納米金顆粒與蛋白標(biāo)記的納米金顆粒發(fā)生的團聚反應(yīng)引起紫外可見吸收光度的變化，可定量分析檢測磷酸激酶、去磷酸化酶等及其抑制劑，及其在實際分析中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
磷酸脂酶及其抑制劑等的快速篩選與檢測對于生物學(xué)研究、食品與公共安全、藥毒物分析、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域具有極其重要的意義。目前常用的酶及其抑制劑的檢測方法主要有放射性標(biāo)記法、熒光標(biāo)記法以及測定酶蛋白的免疫活性等。這些檢測方法或存在反應(yīng)步驟復(fù)雜問題，或靈敏度不高、可靠性差，又或需要精密的儀器，不能滿足準(zhǔn)確快速檢測的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，建立了一種基于磷脂分子修飾納米金顆粒的團聚反應(yīng)分析檢測磷酸激酶、去磷酸化酶等及其抑制劑的生物傳感方法。該方法可將磷脂分子直接作用于納米金表面，操作快速、簡單，通用性強，靈敏度高。本發(fā)明的技術(shù)方案是基于不同磷脂分子修飾的納米金顆粒，與其相應(yīng)的磷酸激酶、去磷酸化酶等及其抑制劑發(fā)生特異反應(yīng)，此反應(yīng)后的納米金顆粒與特定磷脂分子的綁定蛋白所標(biāo)記的納米金顆粒發(fā)生團聚反應(yīng)，引起紫外可見吸收光強度的變化，可定量分析檢測磷酸激酶、去磷酸化酶等及其抑制劑。其步驟包括(I)磷脂分子修飾納米金顆粒；(2)磷脂分子修飾納米金顆粒與酶及其抑制劑的特異反應(yīng)；(3)與磷酸分子對應(yīng)的磷脂分子綁定蛋白標(biāo)記納米金顆粒；(4)經(jīng)步驟(2)特異反應(yīng)后的納米金與步驟(3)蛋白標(biāo)記的納米金混合反應(yīng)；(5)定量分析檢測酶及其抑制劑。其中，所述的酶及其抑制劑是磷酸激酶、去磷酸化酶等及其抑制劑；其中，所述的磷脂分子為PIP2，PIP3，DPPC等；其中，步驟(I)所述磷脂分子修飾納米金顆粒是直接合成帶有表面活性劑修飾的納米金顆粒，再將含磷脂分子溶液加入到修飾表面活性劑的納米金溶液中，于納米金表面直接形成單分子磷脂層。表面活性劑修飾的納米金顆粒表面可以直接修飾各種不同的磷脂分子(PIP2，PIP3，DPPC等)形成單分子磷脂層，此時的納米金顆?？膳c磷脂分子對應(yīng)各種不同的磷酸激酶、去磷酸化酶等(PI3K，PTEN，PLD等)及其抑制劑發(fā)生特異反應(yīng)，產(chǎn)生團聚現(xiàn)象，實現(xiàn)對磷酸激酶、去磷酸化酶等及其抑制劑的檢測；
其中，步驟(3)中與修飾的不同磷脂分子對應(yīng)的磷脂分子綁定蛋白直接標(biāo)記于納米金顆粒表面。以下對本發(fā)明做出進(jìn)一步說明。I、磷脂分子修飾納米金顆粒及其與磷酸激酶、去磷酸化酶等及其抑制劑的特異反a、冰水浴中新鮮配制的O. IM NaBH4在攪拌狀態(tài)下加入到4% HAuCl4與O. OlM檸檬酸鈉混合物中，制備成種子液備用。4% HAuCl4溶液中加入表面活性劑，攪拌狀態(tài)下加熱制成生長液。將種子液加入到生長液中，攪拌混合，制備成合適尺寸的表面修飾表面活性劑的納米金溶液。將合成好的納米金溶液與PB (50mM ；pH = 7. 4)以體積比I : 2的比例混合后，濃縮離心洗漆三次(4°C ；10000r/min ；15min) b、將不同的磷脂分子溶液加入到a溶液中，持續(xù)攪拌，使磷脂分子直接修飾到納米金顆粒上。C、在磷脂分子修飾納米金溶液加入牛血清蛋白(BSA)于37°C恒溫水浴下封閉 IOmin,再將酶及其抑制劑加入此納米金溶液中，30°C恒溫水浴反應(yīng)。2、與磷酸分子對應(yīng)的磷脂分子綁定蛋白標(biāo)記納米金顆粒a、250ml超純水中加入2. 5ml I % HAuCl4加熱沸騰后，再加入I %新配制的檸檬酸鈉，繼續(xù)加熱攪拌至溶液呈酒紅色，以制備好裸納米金溶液。將納米金溶液與超純水以
I 2的體積比混合濃縮離心洗滌。洗滌之后以O(shè). ImoVLK2CO3調(diào)節(jié)溶液pH值至待標(biāo)記的特定磷脂分子的綁定蛋白的等電點略偏堿。b、將磷脂分子的綁定蛋白融入相應(yīng)的緩沖液，攪拌狀態(tài)下，逐滴加入裸納米金溶液中。完畢后，繼續(xù)攪拌30min，再將溶液放入4°C冰箱內(nèi)冷藏老化過夜(避光，備用)。3、磷酸激酶、去磷酸化酶等及其抑制劑的定量分析檢測a、與磷酸激酶、去磷酸化酶等及其抑制劑反應(yīng)后的磷脂分子修飾納米金溶液和磷脂分子綁定蛋白標(biāo)記納米金溶液混合反應(yīng)，于37°C恒溫水浴反應(yīng)lOmin。納米金表面的磷脂分子與其特定的綁定蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，引起納米金之間距離發(fā)生改變，產(chǎn)生團聚反應(yīng)。b、將a中反應(yīng)后的溶液取出于紫外比色皿中進(jìn)行測量，不同磷酸激酶、去磷酸化酶等及其抑制劑的反應(yīng)濃度與紫外可見吸收光強度的定量關(guān)系可用于磷酸激酶、去磷酸化酶等及其抑制劑的定量分析檢測。
具體實施例方式實施例I :基于PIP2修飾納米金顆粒的團聚反應(yīng)分析檢測磷酸激酶 (Phosphoinositide 3kinase)及 Phosphoinositide 3 Inhibitor 的生物傳感方法一、檢測磷酸激酶(Phosphoinositide 3 kinase)的方法與步驟(I)冰水浴中新鮮配制的60uL O. IM NaBH4在攪拌狀態(tài)下加入到2mL4% HAuCl4 與O. OlM檸檬酸鈉混合物中，制備成種子液備用。4% HAuCl4溶液中加入十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，攪拌狀態(tài)下加熱制成生長液。將種子液加入到生長液中，攪拌混合，制備成顆徑約為IOnm左右的納米金溶液。將合成好的納米金溶液與PB(50mM ；pH = 7. 4)以體積比I : 2的比例混合后，濃縮離心洗滌三次(40C ；10000r/min ；15min)。將O. 64mM PIP2加入到CTAB修飾的納米金溶液中，持續(xù)攪拌，使PIP2直接修飾到納米金顆粒上。在PIP2修飾的納米金溶液加入1% BSA,于37°C恒溫水浴下封閉lOmin。再將Phosphoinositide 3 kinase (2. 4U/g 2. 4X l(T1QU/g)加入此納米金溶液中，3(TC恒溫水浴反應(yīng),在酶的作用下產(chǎn)生PIP3修飾的納米金溶液。(2) 250ml超純水中加入2. 5ml 1% HAuCl4加熱沸騰后，再加入I %新配制的檸檬酸鈉，繼續(xù)加熱攪拌至溶液呈酒紅色，以制備好裸納米金溶液。將納米金溶液與超純水以 I 2的體積比混合濃縮離心洗滌。洗滌之后以O(shè). ImoVLK2CO3調(diào)節(jié)溶液pH值至8左右。 將IOul O. 002MPIP3綁定蛋白溶液攪拌狀態(tài)下，逐滴加入裸納米金溶液中。完畢后，繼續(xù)攪拌30min，再將溶液放入4°C冰箱內(nèi)冷藏老化過夜(避光，備用)。(3)與Phosphoinositide 3 kinase作用后產(chǎn)生的PIP3修飾納米金溶液和PIP3 綁定蛋白標(biāo)記納米金溶液混合反應(yīng)，于37°C恒溫水浴反應(yīng)lOmin。納米金表面的PIP3與其綁定蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，引起納米金團聚，產(chǎn)生紫外信號。不同Phosphoinositide 3 kinase的濃度(2. 4U/g 2. 4X10^10U/g)與紫外可見吸收光強度(400 800nm波長范圍) 的定量關(guān)系可用于Phosphoinositide 3 kinase的定量分析檢測。二、檢測磷酸激酶抑制劑(Phosphoinositide 3 Inhibitor)的方法與步驟在檢測Phosphoinositide 3 kinase 的步驟(I)中，加入 Phosphoinositide 3 kinase 后，同時再加入 5ul 325uM 的 Phosphoinositide 3 Inhibitor。Inhibitor 的加入阻止了 kinase的作用，納米金的團聚作用也相應(yīng)受到阻礙，同樣引起紫外可見吸收光強度 (400 800nm波長范圍)的相應(yīng)變化，其定量關(guān)系可用于Phosphoinositide 3 Inhibitor 的分析檢測。實施例2 :基于PIP3修飾納米金顆粒的團聚反應(yīng)分析檢測去磷酸化酶(PTEN)的生物傳感方法(I)冰水浴中新鮮配制的60uL O. IM NaBH4在攪拌狀態(tài)下加入到2mL4% HAuCl4與
O.OlM檸檬酸鈉混合物中，制備成種子液備用。4% HAuCl4溶液中加入十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，攪拌狀態(tài)下加熱制成生長液。將種子液加入到生長液中，攪拌混合，制備成顆徑約為IOnm左右的納米金溶液。將合成好的納米金溶液與PB(50mM;pH= 7.4)以體積比 I 2的比例混合后，濃縮離心洗滌三次(4°C;10000r/min ;15min)。將O. 6mM PIP3加入到 CTAB修飾的納米金溶液中，持續(xù)攪拌，使PIP3直接修飾到納米金顆粒上。(2) 250ml超純水中加入2. 5ml 1% HAuCl4加熱沸騰后，再加入I %新配制的檸檬酸鈉，繼續(xù)加熱攪拌至溶液呈酒紅色，以制備好裸納米金溶液。將納米金溶液與超純水以 I 2的體積比混合濃縮離心洗滌。洗滌之后以O(shè). ImoVLK2CO3調(diào)節(jié)溶液pH值至8左右。 將IOul O. 002MPIP3綁定蛋白溶液攪拌狀態(tài)下，逐滴加入裸納米金溶液中。完畢后，繼續(xù)攪拌30min，再將溶液放入4°C冰箱內(nèi)冷藏老化過夜(避光，備用)。(3)本來PIP3修飾納米金溶液和PIP3綁定蛋白標(biāo)記納米金溶液混合后，由于PIP3 與其綁定蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，引起納米金團聚，產(chǎn)生紫外信號。但是，如果在PIP3修飾的納米金溶液加入I % BSA,于37°C恒溫水浴下封閉lOmin，再將PTEN(2pM 2aM)加入此納米金溶液中，30°C恒溫水浴反應(yīng)30min，在PTEN的作用下產(chǎn)生PIP2修飾的納米金溶液。此時，PIPdf飾的納米金將不會與PIP3的綁定蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，納米金則不會發(fā)生團聚， 從而引起紫外可見吸收光強度的逆向變化。不同PTEN的濃度(2pM 2aM)與紫外可見吸收光強度(400 800波長范圍)的定量關(guān)系可用于PTEN的定量分析檢測。
權(quán)利要求
1.一種基于磷脂分子修飾納米金顆粒的團聚反應(yīng)分析檢測酶及其抑制劑的生物傳感方法，包括如下步驟(1)磷脂分子修飾納米金顆粒；(2)磷脂分子修飾納米金顆粒與酶及其抑制劑的特異反應(yīng)；(3)與磷脂分子對應(yīng)的磷脂分子綁定蛋白標(biāo)記納米金顆粒；(4)經(jīng)步驟(2)特異反應(yīng)后的納米金與步驟(3)蛋白標(biāo)記的納米金混合反應(yīng)；(5)定量分析檢測酶及其抑制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于磷脂分子修飾納米金顆粒的團聚反應(yīng)分析檢測酶及其抑制劑的生物傳感方法，其特征在于，所述的酶及其抑制劑是磷酸激酶、去磷酸化酶及其抑制劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的基于磷脂分子修飾納米金顆粒的團聚反應(yīng)分析檢測酶及其抑制劑的生物傳感方法，其特征在于，步驟(I)所述磷脂分子修飾納米金顆粒是直接合成帶有表面活性劑修飾的納米金顆粒，再將含磷脂分子溶液加入到修飾表面活性劑的納米金溶液中，于納米金表面直接形成單分子磷脂層。
4.根據(jù)專利要求I或2所述的基于磷脂分子修飾納米金顆粒的團聚反應(yīng)分析檢測酶及其抑制劑的生物傳感方法，其特征在于，納米金顆粒表面修飾不同的磷脂分子，與磷脂分子對應(yīng)的酶及其抑制劑發(fā)生特異反應(yīng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于磷脂分子修飾納米金顆粒的團聚反應(yīng)分析檢測酶及其抑制劑的生物傳感方法，其特征在于，所述的磷脂分子為PIP2、PIP3或DPPC。
6.根據(jù)專利要求I或2所述的基于磷脂分子修飾納米金顆粒的團聚反應(yīng)分析檢測酶及其抑制劑的生物傳感方法，其特征在于，步驟(3)中所述的磷脂分子綁定蛋白直接標(biāo)記于納米金顆粒表面。
7.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的基于磷脂分子修飾納米金顆粒的團聚反應(yīng)分析檢測酶及其抑制劑的生物傳感方法，其特征在于，步驟(4)所述的定量分析是利用紫外可見光吸收分析技術(shù)對酶及其抑制劑進(jìn)行定量分析。
全文摘要
本發(fā)明建立了一個基于磷脂分子修飾納米金顆粒團聚的生物分析方法，用于生物學(xué)研究、食品檢測、環(huán)境分析的通用的傳感技術(shù)平臺。此技術(shù)包括基于磷脂分子修飾納米金顆粒方法；磷脂分子修飾納米金顆粒與酶及其抑制劑的特異反應(yīng)；特定磷脂分子的綁定蛋白標(biāo)記納米金顆粒技術(shù)；磷脂分子修飾的納米金顆粒與蛋白標(biāo)記的納米金顆粒發(fā)生團聚反應(yīng)引起紫外可見吸收光強度的變化，定量分析檢測酶及其抑制劑。該方法靈敏度高、操作簡單、特異性強，可望成為一種用于生物學(xué)研究、食品檢測、環(huán)境分析的通用技術(shù)。
文檔編號C12Q1/25GK102586400SQ201210073838
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月20日
發(fā)明者俞汝勤, 唐麗娟, 文茜, 楚霞, 蔣健暉 申請人:湖南大學(xué)