專利名稱：自組裝仿生磷脂聚合物組織細(xì)胞膜的制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬高分子材料膜技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種自組裝仿生磷脂聚合物組織細(xì)胞膜
的制備和在藥物滲透中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
生物利用度是衡量一種藥物能否開發(fā)成有效的臨床藥物的重要指標(biāo)之一。藥物的生物
利用度受一系列因素的影響，具有關(guān)報(bào)道，80%的藥物通過腸上皮細(xì)胞的非自發(fā)擴(kuò)散滲透 進(jìn)入血液。有研究表明，吸收性的數(shù)據(jù)能夠用于早期藥物開發(fā)中的體外活性分析。
近十余年來，國(guó)外已普遍采用組織細(xì)胞模型作為藥物吸收性研究的工具，主要有 Caco-2細(xì)胞單層模型、MDCK細(xì)胞模型等。
Caco-2細(xì)胞模型來源于人的結(jié)腸癌細(xì)胞，是著名的小腸吸收模型，該模型的研究結(jié)果 與體內(nèi)藥物的處置有較好的相關(guān)性。Caco-2細(xì)胞模型現(xiàn)己被作為小分子藥物口服吸收的體 外篩選模型，為發(fā)達(dá)國(guó)家的藥物研究機(jī)構(gòu)或開發(fā)公司廣泛采用。
MDCK細(xì)胞模型來源于犬科動(dòng)物的腎細(xì)胞，該細(xì)胞可以形成緊密結(jié)合的單細(xì)胞層。
Caco-2細(xì)胞單層模型、MDCK細(xì)胞模型在使用時(shí)均需要實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，利用傳統(tǒng)培養(yǎng)方 法至少需要21天才具有模擬細(xì)胞膜的性質(zhì)，而且不同研究者所建立的細(xì)胞模型方法存在 一些差異，不同實(shí)驗(yàn)室對(duì)同一模型的評(píng)價(jià)結(jié)果也可能不盡相同。另外，還存在儲(chǔ)存時(shí)間短， 操作麻煩，成本高等缺陷。因而建立一種用于分析藥物滲透和吸收性的體外仿生膜模型己 成為世界藥物學(xué)家關(guān)注的前沿。
2002年7月在舊金山召開了第一屆人工膜滲透性研究的國(guó)際會(huì)議，會(huì)上介紹了一種新 的人工膜PAMPA模型，但該模型尚存在不足之處，主要在于U)PAMPA價(jià)格雖然比Caco-2 細(xì)胞模型低，但此模型自動(dòng)化程度高，對(duì)少量樣品的試驗(yàn)來說，其成本較大，因而對(duì)普通 實(shí)驗(yàn)室的少樣測(cè)試不方便；(2)PAMPA是溶液成膜，會(huì)對(duì)某些試驗(yàn)測(cè)試造成誤差；(3)PAMPA 是小分子磷脂制成的雙分子膜，不穩(wěn)定，影響藥物檢測(cè)的結(jié)果；(4)目前PAMPA采用卵磷 脂膜以模擬腸的吸收性能，模擬的細(xì)胞膜部位尚嫌單一。
本發(fā)明制備的自組裝仿生磷脂聚合物組織細(xì)胞膜的原理是細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)具有親水的 頭、疏水的尾，膜中磷脂呈液晶結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)容許離子傳遞和分子運(yùn)動(dòng)；將極性磷酸膽 堿基或其衍生物引入疏水脂肪鏈上，這種材料在水溶液中或在生理?xiàng)l件下可以自組裝成親
水頭、疏水尾的結(jié)構(gòu)；材料自組裝以后，將疏水鏈末端的雙鍵打開，使分子間疏水端縮合，
從而保證了疏水鏈?zhǔn)冀K在內(nèi)部，親水端始終在表面，這種磷脂聚合物保證了材料在成膜以
后，更好模擬組織細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和性能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種自組裝仿生磷脂聚合物組織細(xì)胞膜的制備方法及其在藥物吸 收中的用途。該制備方法簡(jiǎn)單快速、成本低、所得膜儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)，可加快新藥篩選和開發(fā) 的速度。
本發(fā)明的一種自組裝仿生磷脂聚合物組織細(xì)胞膜的制備方法，包括下列步驟-(1)按式(I )的路線合成單體-
<formula>formula see original document page 5</formula>脂肪族二元醇，Et3N溶于干燥的THF中，冷卻至0'C，攪拌滴加甲基丙稀酰氯，溫度 在0'C，混合物升溫至50'C反應(yīng)2h，過濾，洗滌，層析柱分離得甲基丙稀酸脂肪族二元醇 酯，展開劑為Et0Ac/hexanes 20/80;所得甲基丙稀酸脂肪族二元醇酯，Et3N溶于干燥的 THF中，冷卻至-20°C， C0P溶于干燥的THF中，攪拌滴加溶液，溫度在-2(TC -30'C， 3h， 過濾，洗滌，干燥得單體中間體無色液體；單體中間體和干燥乙腈，冷卻至-20'C，加入
無水Me3N，混合物升溫至6(TC反應(yīng)16h,冷卻至-20°C，氮?dú)庀逻^濾沉淀，干燥的乙腈洗 滌，減壓干燥得磷脂聚合物單體；
(2)按式(II)的路線制備齊聚物: CH,
n H,C=l
o
<formula>formula see original document page 6</formula>物。
單體在引發(fā)劑偶氮二異丁腈(AIBN)存在下5(TC 70'C反應(yīng)10-24h，得到齊聚物產(chǎn)
所述的脂肪族二元醇選自1,8-辛二醇，1, IO—癸二醇或1， 12-十二元二醇； 所述合成仿生膜單體的一般具有式(III)的結(jié)構(gòu)
<formula>formula see original document page 6</formula>(III)
其中n二8， 10， 12。
所述的齊聚物是指特征為原料中水份0 0.3 (%)，分子量12000 20000，疏水鏈 段碳原子的數(shù)目8 12，極性磷脂含量0. 5wt % 20wt%，玻璃轉(zhuǎn)化溫度(Tg) 48. 3 63. 2 'C，接觸角(0A) 70° 120°的齊聚物；
所述的仿生磷脂聚合物組織細(xì)胞膜是指含有疏水性脂肪烴端和親水性磷脂基團(tuán)齊聚 物，其單體包括含親水性磷脂極性頭部端基和疏水性脂肪烴尾部鏈段，其齊聚物作為成膜
聚合物的原料；
所述的親水性磷脂基團(tuán)選自卵磷脂，腦磷脂； 所述的疏水性脂肪烴選自辛基，癸基或十二烷基，優(yōu)選不飽和脂肪烴；
所述的仿生磷脂聚合物組織細(xì)胞膜是指其分子形態(tài)隨環(huán)境PH值變化，當(dāng)pH值為2 6.5時(shí)，表現(xiàn)為脂質(zhì)雙分子層樣結(jié)構(gòu)；pH值為7.3 10.5時(shí)，表現(xiàn)為單分子層；pH值〉10.5 時(shí)，表現(xiàn)為雙分子層微管；
所述的仿生磷脂聚合物細(xì)胞膜是指分子形態(tài)為單分子層，其厚度〈0.75mra，分子形態(tài) 為雙分子層，其厚度〉0.75mm;
所述的仿生磷脂聚合物細(xì)胞膜是可通過控制聚合物的分子量大小、疏水性脂肪烴端的 長(zhǎng)度和磷脂含量，調(diào)節(jié)合成磷脂聚合物的穩(wěn)定性和彈性。
在疏水鏈上引入不同極性磷脂基或其衍生物如卵磷脂、腦磷脂等，可用于制備建立不 同靶目標(biāo)的模擬細(xì)胞膜模型，該模型可以是卵磷脂基仿生膜建立小腸模擬細(xì)胞膜模型或腦 磷脂基仿生膜建立腦組織模擬細(xì)胞膜模型，與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)或藥物參數(shù)比較，可以建立模 擬模型P=VdC/ACodT， P—滲透率，V—接受液體積，A—膜表面積，Co—供體液濃度，dC/dT 一濃度變化速率。
本發(fā)明的有益效果-
(1) 合成的磷脂聚合物含有兩性端基，使得磷脂聚合物容易自組裝形成與生物膜非 常相似的微觀非均相結(jié)構(gòu)；
(2) 由于兩性端基的存在，磷脂聚合物的分子形態(tài)隨著周圍環(huán)境pH值的變化而變化， 因而表現(xiàn)出環(huán)境敏感性，可以調(diào)節(jié)滲透液體的pH值的大小，而模擬不同器官組織的pH值 變化；
(3) 通過控制聚合物的分子量大小、疏水鏈段的長(zhǎng)度和磷脂含量，調(diào)節(jié)合成磷脂聚 合物的穩(wěn)定性和彈性，也可根據(jù)分子形態(tài)隨環(huán)境pH值變化制備單層膜，或制備雙層膜；
(4) 在疏水鏈上引入不同極性磷脂基或其衍生物如卵磷脂、腦磷脂等，可以建立不 同靶目標(biāo)的模擬細(xì)胞膜模型。


圖是聚合物在不同PH值水溶液中的形態(tài)，其中，(a)脂質(zhì)雙分子層樣結(jié)構(gòu)，pH值在2 6.5; (b)單分子層，pH值在7.3 10.5; (c)雙分子層微管，pH值在〉10.5。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限 定的范圍。
實(shí)施例1
精確稱取1, 8-辛二醇28. 76g (0. 197mol), Et3N33. lg (0. 327mol)溶于200mL干燥 的THF中，冷卻至0t:，攪拌緩慢滴加甲基丙稀酰氯20.6g (0. 197mol)，保持溫度在0。C， 混合物升溫至5(TC反應(yīng)2h,經(jīng)過濾，洗滌，層析柱分離得無色液體甲基丙稀酸辛二醇酯， 展開劑為EtOAc/hexanes 20/80。精確稱取甲基丙稀酸辛二醇酯32. 96g (0. 154mol)， 15. 6g Et3N (0.154 mol)溶于200mL干燥的THF中，冷卻至-20。C， 21. 9g (0.154mol) COP溶 于lOOmL干燥的THF中，攪拌緩慢滴加溶液，保持溫度在-20 -3(TC3h，經(jīng)過濾，洗滌， 干燥得2- (2-oxo-l， 3, 2-diox即hospholoyloxy) ethyl raethacrylate無色液體。精確稱 取2- (2-oxo-l， 3, 2-diox鄰hospholoyloxy) ethyl methacrylate5. 0g禾口 30ml干燥乙腈， 冷卻至-20°C，快速向溶液中加入2ml無水Me3N，混合物升溫至6(TC反應(yīng)16h，冷卻至-20 °C，氮?dú)庀逻^濾沉淀，干燥的乙腈洗滌，減壓干燥得磷脂聚合物單體。稱量適當(dāng)?shù)牧字?合物單體和AIBN溶于甲醇一THF混合液中置入聚合試管中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下封閉試管，試管 6(TC振蕩反應(yīng)16h，冷卻停止反應(yīng)，減壓收集得到磷脂聚合物。
實(shí)施例2
精確稱取1， 9-壬二醇31, 52g (0. 197mol)， Et3N33. lg (0. 327mol)溶于200mL干燥 的THF中，冷卻至0。C，攪拌緩慢滴加甲基丙稀酰氯20.6g (0. 197m0l)，保持溫度在0。C， 混合物升溫至5(TC反應(yīng)2h，經(jīng)過濾，洗滌，層析柱分離得無色液體甲基丙稀酸辛二醇酯， 展開劑為EtOAc/hexanes 20/80。精確稱取甲基丙稀酸辛二醇酯34. 25g (0.154mol)， 15. 6g Et3N (0.154 mol)溶于200mL干燥的THF中，冷卻至-20°C， 21. 9g (0.154mol) COP溶 于100mL干燥的THF中，攪拌緩慢滴加溶液，保持溫度在-20~-30°C3h，經(jīng)過濾，洗滌， 干燥得2- (2-oxo-l， 3, 2-dioxaphospholoyloxy) ethyl methacrylate無色液體。精確稱 取2- (2-oxo-l， 3， 2 dioxaphospholoyloxy) ethyl methacrylate5. 0g和30ml干燥乙腈， 冷卻至-2(TC，快速向溶液中加入2ml無水Me3N，混合物升溫至6(TC反應(yīng)16h,冷卻至-20 'C，氮?dú)庀逻^濾沉淀，千燥的乙腈洗滌，減壓干燥得磷脂聚合物單體。稱量適當(dāng)?shù)牧字?合物單體和AIBN溶于甲醇一THF混合液中置入聚合試管中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下封閉試管，試管 6CTC振蕩反應(yīng)16h，冷卻停止反應(yīng)，減壓收集得到磷脂聚合物。
實(shí)施例3
將少量的合成的卵磷脂聚合物放置在PAMPA的微孔上，PAMPA由上下兩個(gè)腔室組成， 上層為供體液(緩沖溶液和藥物)，下層為接收液(緩沖溶液)，緩沖溶液由50mM磷酸鈉 (p服.0-7.5)， 50mM擰檬酸鈉(pH3.0-5. 5)， 50mM硼酸鈉(pH8. 0-10.0)組成，30。C培 養(yǎng)2 15小時(shí)形成卵磷脂聚合物仿生細(xì)胞膜。接收液中溶液的濃度由UV光譜來測(cè)量。少 量測(cè)試磺胺撒克西啶，諾?？耍p氫克尿塞，立痛定，心得安，戊脈安等幾種藥物滲透率 分別為16.0， 45.0， 16.0， 128.0， 133.0， 148. Onm/s。
權(quán)利要求
1.一種自組裝仿生磷脂聚合物組織細(xì)胞膜的制備方法，包括下列步驟(1)合成單體脂肪族二元醇，Et3N溶于干燥的THF中，冷卻至0℃，攪拌滴加甲基丙稀酰氯，溫度在0℃，混合物升溫至50℃反應(yīng)2h，過濾，洗滌，層析柱分離得甲基丙稀酸脂肪族二元醇酯，展開劑為EtOAc/hexanes 20/80；所得甲基丙稀酸脂肪族二元醇酯，Et3N溶于干燥的THF中，冷卻至-20℃，COP溶于干燥的THF中，攪拌滴加溶液，溫度在-20℃～-30℃，3h，過濾，洗滌，干燥得單體中間體無色液體；單體中間體和干燥乙腈，冷卻至-20℃，加入無水Me3N，混合物升溫至60℃反應(yīng)16h，冷卻至-20℃，氮?dú)庀逻^濾沉淀，干燥的乙腈洗滌，減壓干燥得磷脂聚合物單體；(2)制備齊聚物單體在引發(fā)劑偶氮二異丁腈(AIBN)存在下50℃～70℃反應(yīng)10-24h，得到齊聚物產(chǎn)物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的自組裝仿生磷脂聚合物組織細(xì)胞膜的制備方法，其特征在于 所述的脂肪族二元醇是1,8-辛二醇，1， IO—癸二醇或1， 12-十二元二醇。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的自組裝仿生磷脂聚合物組織細(xì)胞膜的制備方法，其特征在于所述合成仿生膜單體具有式(III)的結(jié)構(gòu)<formula>formula see original document page 2</formula>(m)n二8， 10， 12 ， X基團(tuán)是H時(shí)，磷脂是磷酸(PA)， x基團(tuán)是GH2CH2W(eH3)3，磷脂 是卵磷脂(PC)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的自組裝仿生磷脂聚合物組織細(xì)胞膜的制備方法，其特征在于 所述的齊聚物是指原料中水份0 0.3 (%)，分子量12000 20000,疏水鏈段碳原子的 數(shù)目8 12，極性磷脂含量0.5wt % 20wt%，玻璃轉(zhuǎn)化溫度(Tg) 48.3 63.2°C，接觸 角(6 J 70。 120°的齊聚物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的自組裝仿生磷脂聚合物組織細(xì)胞膜的制備方法，其特征在于<formula>formula see original document page 2</formula> 所述的仿生磷脂聚合物組織細(xì)胞膜是指含有疏水性脂肪烴端和親水性磷脂基團(tuán)齊聚物，其 單體包括含親水性磷脂極性頭部端基和疏水性脂肪烴尾部鏈段，其齊聚物作為成膜聚合物 的原料。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的自組裝仿生磷脂聚合物組織細(xì)胞膜的制備方法，其特征在于所述的仿生磷脂聚合物組織細(xì)胞膜，其分子形態(tài)隨環(huán)境pH值變化，當(dāng)pH值為2 6.5時(shí)， 表現(xiàn)為脂質(zhì)雙分子層樣結(jié)構(gòu)；pH值為7.3 10.5時(shí)，表現(xiàn)為單分子層；pH值M0.5時(shí)，表 現(xiàn)為雙分子層微管。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的自組裝仿生磷脂聚合物組織細(xì)胞膜的制備方法，其特征在于 所述的仿生磷脂聚合物細(xì)胞膜是指分子形態(tài)為單分子層，其厚度〈0.75mm，分子形態(tài)為雙 分子層，其厚度〉0.75mm。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的自組裝仿生磷脂聚合物組織細(xì)胞膜的制備方法，其特征在于 所述的仿生磷脂聚合物細(xì)胞膜是可通過控制聚合物的分子量大小、疏水性脂肪烴端的長(zhǎng)度 和磷脂含量，調(diào)節(jié)合成磷脂聚合物的穩(wěn)定性和彈性。
9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的自組裝仿生磷脂聚合物組織細(xì)胞膜的制備方法，其特征在于-所述的親水性磷脂選自卵磷脂，腦磷脂，疏水性脂肪烴選自辛基，癸基或十二烷基。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的自組裝仿生磷脂聚合物組織細(xì)胞膜的制備方法，其特征在于 疏水性脂肪烴是不飽和脂肪烴。
11. 一種自組裝仿生磷脂聚合物組織細(xì)胞膜的應(yīng)用于建立不同靶目標(biāo)的模擬細(xì)胞膜模型。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的一種自組裝仿生磷脂聚合物組織細(xì)胞膜的應(yīng)用，其特征在于 所述的仿生磷脂聚合物組織細(xì)胞膜是卵磷脂基仿生膜建立小腸模擬細(xì)胞膜模型或腦磷脂 基仿生膜建立腦組織模擬細(xì)胞膜模型。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種自組裝仿生磷脂聚合物組織細(xì)胞膜的制備及應(yīng)用，制備包括(1)單體制備；(2)齊聚物制備；將親水性的磷脂基團(tuán)或其衍生物連接端基含有雙鍵的疏水性脂肪烴上，合成出能自組裝形成與生物膜非常相似的微觀非均相結(jié)構(gòu)，通過調(diào)節(jié)滲透液體pH值大小，可模擬不同器官組織的pH值變化，或通過控制聚合物的分子量大小、疏水鏈段的長(zhǎng)度和磷脂含量，調(diào)節(jié)合成磷脂聚合物的穩(wěn)定性和彈性，根據(jù)需要調(diào)節(jié)成膜面積的大小和成膜的厚度，根據(jù)分子形態(tài)隨環(huán)境pH值變化制備單層膜，或制備雙層膜，該方法簡(jiǎn)單快速，儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)，成本低，有助于加快新藥篩選和開發(fā)的速度。本發(fā)明應(yīng)用于在疏水鏈上引入不同極性磷脂基或其衍生物如卵磷脂、腦磷脂等，建立不同靶目標(biāo)的模擬細(xì)胞膜模型。
文檔編號(hào)A61L31/06GK101108260SQ200710041290
公開日2008年1月23日 申請(qǐng)日期2007年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月25日
發(fā)明者暉 于, 亓雪蓮, 艷 付, 恒 吳, 麗 張, 段友容, 沈新元, 郈 羅, 顧曉華 申請(qǐng)人:東華大學(xué)