專利名稱：一種氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)脂肪酸含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS法)快速檢測(cè)動(dòng)物樣品中脂肪酸含量的方法。
背景技術(shù)：
脂肪酸是構(gòu)成人體脂肪和類脂的基本物質(zhì)，是細(xì)胞膜磷脂的重要成分，直接調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的組成及蛋白質(zhì)與膜內(nèi)受體。脂肪酸根據(jù)飽和度的不同可分為飽和脂肪酸(SFA)、單不飽和脂肪酸(MUFA)、多不飽和脂肪酸(PUFA)。短鏈SFA可調(diào)節(jié)腸道運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)結(jié)腸細(xì)胞増殖，也可増加腸道黏膜損傷處的循環(huán)血流，促進(jìn)腸道黏膜結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)；另外，短鏈飽和脂肪酸可治療轉(zhuǎn)流性結(jié)腸炎、遠(yuǎn)段潰瘍性結(jié)腸炎和放射性結(jié)腸炎。此外，SFA攝入過(guò)多增加高胰島素(Ins)血癥的風(fēng)險(xiǎn)以及患乳腺癌的危險(xiǎn)。MUFA可降低血漿總膽固醇和LDL的水平，降低血小板的聚集率,減少機(jī)體內(nèi)自由基脂質(zhì)超氧化物的作用，也具有降低血壓的作用。MUFA改善了內(nèi)皮白細(xì)胞黏附因子的基因表達(dá)，從而可預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化，降低患冠心病的危險(xiǎn)性。MUFA還能起到降血糖的作用，另夕卜，因?yàn)镸UFA是神經(jīng)元細(xì)胞膜組成成分，它能維持神經(jīng)元細(xì)胞膜完整性，因此MUFA可防止記憶下降。PUFA是腦的成長(zhǎng)、細(xì)胞間相互作用，第二信息向こ酰膽堿的應(yīng)答及神經(jīng)傳導(dǎo)功能等腦功能發(fā)育不可缺少的物質(zhì)，可用于治療精神分裂癥。另外，不飽和脂肪酸有利于膜的流動(dòng)性，更有利于胰島素(Ins)的透膜吸取及與受體的結(jié)合。在正常情況下人體內(nèi)脂肪酸是ー穩(wěn)定的化學(xué)組分，處于相對(duì)平衡，生物體內(nèi)脂肪酸的改變能誘導(dǎo)神經(jīng)生理、認(rèn)知和其他行為的變化，尤其是必需脂肪酸含量的改變。而某些脂肪酸(如亞油酸，亞麻酸等高級(jí)脂肪酸)對(duì)人體保健極為重要，但人體又不能自行合成，根據(jù)測(cè)定含量的高低，可通過(guò)飲食營(yíng)養(yǎng)加以調(diào)節(jié)，提高人們的健康和防止疾病的發(fā)生。血漿中游離脂肪酸的測(cè)定是先將脂肪酸與Cu2+作用，以氯仿萃取后用銅試劑測(cè)定Cu2+的濃度，進(jìn)而得到游離脂肪酸的含量，該方法不僅繁瑣，而且只能測(cè)定脂肪酸總量。氣相色譜法雖然具有高分離能力，但對(duì)脂肪酸定性鑒定時(shí)要有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)照，無(wú)標(biāo)樣時(shí)測(cè)定較困難。另外，脂肪酸組分復(fù)雜，難以分離，傳統(tǒng)方法通常采用酸水解、堿水解以及皂化法等，步驟繁瑣，所需樣品量大，不適用于科研、臨床中微量樣品的檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)單、快速、實(shí)時(shí)的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)脂肪酸含量的方法，特別適合對(duì)動(dòng)物組織中微量樣品的檢測(cè)。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案I)樣品準(zhǔn)備將IOmg動(dòng)物組織剪碎后得樣品，將樣品置于螺ロ玻璃瓶中；2)提取、皂化及甲酯化將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為37%的濃鹽酸與2，2- ニ甲氧基丙烷按照0. 02 0. 98的體積比混合得濃鹽酸2，2-ニ甲氧基丙烷溶液，向螺ロ玻璃瓶?jī)?nèi)的樣品中分別加入20 ii L質(zhì)量濃度為lmg/mL的內(nèi)標(biāo)物石油醚溶液，以及ImL濃鹽酸2，2- ニ甲氧基丙烷溶液，然后充氮?dú)獗Ｗo(hù)下震蕩20min，震蕩后用氮?dú)鈱⒙荪聿Ａ績(jī)?nèi)的液體吹干，吹干后向螺ロ玻璃瓶?jī)?nèi)加入2. 5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13%的三氟化硼甲醇溶液，然后將螺ロ玻璃瓶于80-85 °C水浴中加熱I小吋；3)加熱結(jié)束后向螺ロ玻璃瓶?jī)?nèi)加入2. 5mL去離子水，然后用石油醚萃取2次，取石油醚層，將石油醚層用無(wú)水Na2SO4干燥，干燥后過(guò)濾得濾液，將濾液減壓濃縮至體積不再減少得檢測(cè)樣，向檢測(cè)樣充入氮?dú)膺M(jìn)行保護(hù)；4)采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)檢測(cè)樣內(nèi)的脂肪酸進(jìn)行測(cè)定；5)數(shù)據(jù)分析及樣品鑒定經(jīng)過(guò)步驟4)后，根據(jù)獲得的原始光譜數(shù)據(jù)及質(zhì)譜數(shù)據(jù)，計(jì)算檢測(cè)樣內(nèi)各脂肪酸組分的相對(duì)含量以及絕對(duì)含量。
所述動(dòng)物組織包括大腦、肝臟、腎臟、心臟、血液或肌肉組織。所述動(dòng)物組織的來(lái)源包括小鼠、大鼠、比格犬、恒河猴、豬、牛、雞、鴨、魚(yú)或人。所述氣相色譜的工作條件為檢測(cè)樣溶于500 L正己烷后上樣，進(jìn)樣量為I U L，進(jìn)樣方式為不分流，載氣為流速I. 5mL/min的氦氣，升溫程序?yàn)槌跏紲囟葹?0°C，保持4min,然后以5°C /min升至150°C,然后以4°C /min升至300°C,保持5min。所述質(zhì)譜的工作條件為采用EI源、正離子檢測(cè)，電子能量為70eV，離子源溫度為230°C，單四級(jí)桿溫度為150°C，掃描方式為全掃描方式，電子倍增器電壓為1070V，溶劑延遲為 3. 75min。所述相對(duì)含量采用面積歸ー化方法進(jìn)行計(jì)算。所述絕對(duì)含量的計(jì)算方法為脂肪酸組分對(duì)應(yīng)的峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值乘以內(nèi)標(biāo)物的濃度。所述內(nèi)標(biāo)物包括十五烷酸、十七烷酸、十九烷酸、二十ー烷酸或二十三烷酸。本發(fā)明所述氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)脂肪酸含量的方法與傳統(tǒng)常用的動(dòng)植物、微生物油脂檢測(cè)方法相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)I)本發(fā)明利用2，2-ニ甲氧基丙烷-濃鹽酸對(duì)動(dòng)物組織中脂類進(jìn)行提取和皂化，將提取與皂化合并，簡(jiǎn)化了操作步驟，再利用三氟化硼甲醇溶液甲酯化獲得脂肪酸甲酷，最后利用石油醚提取脂肪酸組分，檢測(cè)組織的樣品用量與現(xiàn)有技術(shù)相比顯著降低，提高了檢測(cè)的靈敏度，同時(shí)，每批次樣品檢測(cè)僅需要約2小時(shí)左右，節(jié)省了人力、物力、財(cái)力，可以達(dá)到快速檢測(cè)的目的，提高了工作效率。2)本發(fā)明可同時(shí)測(cè)定動(dòng)物組織中幾乎所有的脂肪酸，碳數(shù)從碳9到碳26，分子量從100到400，且對(duì)功能性的多不飽和脂肪酸(PUFA)如含有1-6和雙鍵或三鍵的PUFA具有非常好的分離和定性、定量檢測(cè)效果；同時(shí)，對(duì)于具有相同碳數(shù)、相同分子量，而結(jié)構(gòu)不同的PUFA的同分異構(gòu)體(在生理調(diào)解和體內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面具有非常重要的作用)，本方法具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)；同時(shí)，本發(fā)明可對(duì)不同樣品間的脂肪酸組成及含量進(jìn)行比較，應(yīng)用性更廣，為科研實(shí)驗(yàn)、臨床應(yīng)用及食品質(zhì)量和安全監(jiān)測(cè)中對(duì)動(dòng)物樣品脂肪酸組成及含量的快速檢測(cè)提供新的思路和方法。3)本發(fā)明采用質(zhì)譜儀作為氣相色譜的檢測(cè)信號(hào)，與普通的FID和T⑶檢測(cè)器相比有兩大優(yōu)勢(shì)其一是靈敏度高，且沒(méi)有校正因子的影響，色譜峰的峰面積真正代表了試樣中脂肪酸甲酯的質(zhì)量，這ー優(yōu)點(diǎn)對(duì)于未知脂肪酸的定量檢測(cè)尤為重要；其ニ是檢出限低，本發(fā)明直接檢測(cè)的信號(hào)是物質(zhì)的質(zhì)荷比(m/z)，與氫火焰離子和熱導(dǎo)檢測(cè)器相比，省去了將離子濃度(FID)或?qū)嵯禂?shù)(TCD)轉(zhuǎn)化為濃度的步驟，因此，不但降低了檢測(cè)限，而且還縮短了響應(yīng)時(shí)間。另外，本發(fā)明解決了氣相色譜法(GC)定性定量分析檢測(cè)脂肪酸所需標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量眾多且價(jià)格昂貴等問(wèn)題。


圖I為小鼠肝臟樣品GC-MS檢測(cè)的總離子流圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步說(shuō)明，以昆明小鼠肝臟中脂肪酸的檢測(cè)為例，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于該實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明提供了一種基于分步ー鍋法提取及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)微量動(dòng)物脂肪酸含量的方法，具體步驟如下 一、樣品準(zhǔn)備將取得的小鼠臟肝組織至于冰凍緩沖液中保存；準(zhǔn)確稱量10. OOmg ( ±0. 02mg)的肝臟組織，剪至Imm左右，然后將樣品置于5mL的螺ロ玻璃瓶中。檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中該螺ロ玻璃瓶可替代傳統(tǒng)的加熱回流裝置，其具有以下特征體積小，所需樣品量少(I-IOmg),有較好的密封效果(具螺ロ瓶蓋且耐壓0. 2-0. 3Mpa)。 ニ、樣品的提取、皂化及甲酷化取IOmg十七燒酸溶于石油醚(60-90), IOmL容量瓶定容,配置成lmg/mL的十七燒酸石油醚溶液，作為內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)液；將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為37%的濃鹽酸與2，2-ニ甲氧基丙烷按照0.02 0.98的體積比混合得2%的濃鹽酸2，2- ニ甲氧基丙烷溶液；向螺ロ玻璃瓶?jī)?nèi)的樣品中分別加入20 ii L質(zhì)量濃度為lmg/mL的十七烷酸石油醚溶液，以及ImL濃鹽酸2，2- ニ甲氧基丙烷溶液，然后充氮?dú)獗Ｗo(hù)、室溫下于SK-I漩渦振蕩器上震蕩20min，震蕩后用氮?dú)鈱⒙荪聿Ａ績(jī)?nèi)的液體(反應(yīng)中產(chǎn)生的丙酮、甲醇以及2，2-ニ甲氧基丙烷)吹干，吹干后向螺ロ玻璃瓶?jī)?nèi)加入2. 5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13%的三氟化硼甲醇溶液，然后將螺ロ玻璃瓶于80-85°C水浴中加熱I小時(shí)；加熱結(jié)束后向螺ロ玻璃瓶?jī)?nèi)加入2. 5mL去離子水，然后用石油醚萃取2次，取石油醚層，將石油醚層用無(wú)水Na2SO4干燥，干燥后過(guò)濾得濾液，將濾液于循環(huán)真空水泵上減壓濃縮(減壓濃縮條件為常溫、-0. OlMpa)至體積不再減少，得檢測(cè)樣品，沖入氮?dú)獗Ｗo(hù)。與其他的甲酯化方法相比，本發(fā)明采用的方法具有以下優(yōu)點(diǎn)a酷化時(shí)間短，相同條件下，HCl甲醇溶液反應(yīng)需兩小時(shí)；b反應(yīng)易處理，若采用硫酸催化，因其強(qiáng)氧化性，則需要増加一歩水洗處理；c皂化產(chǎn)物較少，更真實(shí)的反應(yīng)脂肪酸的實(shí)際含量，相對(duì)于堿催化的酯化方法，本發(fā)明幾乎沒(méi)有皂化產(chǎn)物。三、分離、檢測(cè)色譜檢測(cè)采用安捷倫7890A/5975C，檢測(cè)樣溶于500 y L正己烷后上樣；
①分析柱是HP-5MS彈性石英毛細(xì)管柱(30m*0. 25id*0. 25um)；②載氣氦氣,流速為I. 5mL/min ； ③進(jìn)樣量I y L，可自動(dòng)進(jìn)樣，也可手動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣方式為不分流；④進(jìn)樣ロ溫度290 0C，傳輸線溫度300 °C ；⑤程序升溫，初始溫度60°C,保持4min,以5°C /min升至150°C,然后以4°C /min升至300°C，保持5min ；質(zhì)譜①EI源，正離子檢測(cè)，電子能量為70eV ；
②離子源溫度230°C，單四級(jí)桿溫度150°C ;③掃描方式為全掃描方式；④電子倍增器電壓1070V，溶劑延遲3. 75min ；四、數(shù)據(jù)分析及處理色譜圖的保留時(shí)間和積分面積由工作站自動(dòng)完成，利用NIST08譜庫(kù)定性色譜峰。各脂肪酸組分的相對(duì)含量通過(guò)面積歸ー化法得到；絕對(duì)含量由對(duì)應(yīng)的峰面積和內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值乘以內(nèi)標(biāo)物的濃度得到。參見(jiàn)圖1，本檢測(cè)樣中可辨認(rèn)的脂肪酸甲酷的峰為18個(gè)，其余峰為小分子溶劑、化合物或膽固醇等留體。可辨認(rèn)的脂肪酸甲酯及其保留時(shí)間列于表I。保留時(shí)間及峰面積用安捷倫Chemstation計(jì)算,相對(duì)含量用面積歸ー化的方法計(jì)算,絕對(duì)含量(mg/g組織)采用與內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)液脂肪酸C17:0的峰面積比獲得。表I.小鼠肝臟中脂肪酸的含量
權(quán)利要求
1.一種氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)脂肪酸含量的方法，其特征在于包括以下步驟 1)樣品準(zhǔn)備將IOmg動(dòng)物組織剪碎后得樣品，將樣品置于螺ロ玻璃瓶中； 2)提取、皂化及甲酯化將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為37%的濃鹽酸與2，2-ニ甲氧基丙烷按照0.020. 98的體積比混合得濃鹽酸2，2- ニ甲氧基丙烷溶液，向螺ロ玻璃瓶?jī)?nèi)的樣品中分別加入20 u L質(zhì)量濃度為lmg/mL的內(nèi)標(biāo)物石油醚溶液，以及ImL濃鹽酸2，2- ニ甲氧基丙烷溶液，然后充氮?dú)獗Ｗo(hù)下震蕩20min，震蕩后用氮?dú)鈱⒙荪聿Ａ績(jī)?nèi)的液體吹干，吹干后向螺ロ玻璃瓶?jī)?nèi)加入2. 5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13%的三氟化硼甲醇溶液，然后將螺ロ玻璃瓶于80-85°C水浴中加熱I小時(shí)； 3)加熱結(jié)束后向螺ロ玻璃瓶?jī)?nèi)加入2.5mL去離子水，然后用石油醚萃取2次，取石油醚層，將石油醚層用無(wú)水Na2SO4干燥，干燥后過(guò)濾得濾液，將濾液減壓濃縮至體積不再減少得檢測(cè)樣，向檢測(cè)樣充入氮?dú)膺M(jìn)行保護(hù)； 4)采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)檢測(cè)樣內(nèi)的脂肪酸進(jìn)行測(cè)定； 5)數(shù)據(jù)分析及樣品鑒定經(jīng)過(guò)步驟4)后，根據(jù)獲得的原始光譜數(shù)據(jù)及質(zhì)譜數(shù)據(jù)，計(jì)算檢測(cè)樣內(nèi)各脂肪酸組分的相對(duì)含量以及絕對(duì)含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述ー種氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)脂肪酸含量的方法，其特征在于所述動(dòng)物組織包括大腦、肝臟、腎臟、心臟、血液或肌肉組織。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述ー種氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)脂肪酸含量的方法，其特征在于所述動(dòng)物組織的來(lái)源包括小鼠、大鼠、比格犬、恒河猴、豬、牛、雞、鴨、魚(yú)或人。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述ー種氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)脂肪酸含量的方法，其特征在于所述氣相色譜的工作條件為檢測(cè)樣溶于500 UL正己烷后上樣，進(jìn)樣量為Iy L，進(jìn)樣方式為不分流，載氣為流速I. 5mL/min的氦氣，升溫程序?yàn)槌跏紲囟葹?0°C，保持4min，然后以5°C /min 升至 15CTC,然后以 4°C /min 升至 30CTC,保持 5min。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述ー種氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)脂肪酸含量的方法，其特征在于所述質(zhì)譜的工作條件為采用EI源、正離子檢測(cè)，電子能量為70eV，離子源溫度為230°C，單四級(jí)桿溫度為150°C，掃描方式為全掃描方式，電子倍増器電壓為1070V，溶劑延遲為3.75min。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述ー種氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)脂肪酸含量的方法，其特征在于所述相對(duì)含量采用面積歸ー化方法進(jìn)行計(jì)算。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述ー種氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)脂肪酸含量的方法，其特征在于所述絕對(duì)含量的計(jì)算方法為脂肪酸組分對(duì)應(yīng)的峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值乘以內(nèi)標(biāo)物的濃度。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述ー種氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)脂肪酸含量的方法，其特征在于所述內(nèi)標(biāo)物包括十五烷酸、十七烷酸、十九烷酸、二十ー烷酸或二十三烷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供一種氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)脂肪酸含量的方法，選擇GC-MS技術(shù)對(duì)動(dòng)物樣品中脂肪酸含量進(jìn)行檢測(cè)，是為了解決在實(shí)際生產(chǎn)、科研工作中，傳統(tǒng)方法中樣品處理步驟繁瑣且價(jià)格昂貴等問(wèn)題，具體步驟包括1)動(dòng)物組織樣品的處理；2)提取、皂化和甲酯化脂肪酸；3)確定GC-MS檢測(cè)脂肪酸的條件；4)數(shù)據(jù)分析及樣品鑒定。本發(fā)明對(duì)動(dòng)物組織中的脂肪酸含量進(jìn)行檢測(cè)具有操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)限低，實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性好，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)直觀可靠等特點(diǎn)，特別適用于微量樣品檢測(cè)，并可對(duì)不同樣品間的脂肪酸組成及含量進(jìn)行比較，應(yīng)用性更廣，為科研實(shí)驗(yàn)、臨床應(yīng)用及食品質(zhì)量和安全監(jiān)測(cè)中對(duì)動(dòng)物樣品脂肪酸組成及含量的快速檢測(cè)提供新的思路和方法。
文檔編號(hào)G01N30/02GK102749396SQ201210247480
公開(kāi)日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2012年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月17日
發(fā)明者陳福欣, 龔頻 申請(qǐng)人:陜西科技大學(xué)