一種利用單層磷脂膜組裝α-溶血素蛋白質(zhì)納米孔的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用單層磷脂膜組裝形成α-溶血素七聚體生物納米孔的方法，本發(fā)明將重組有野生型αHL基因的pT7質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到BL21(DE3)pLys中，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)后，用超濾離心管分子截留法純化單體蛋白，并在DPhPC單層膜上實現(xiàn)αHL單體蛋白的組裝，通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳證明了蛋白表達(dá)，純化及組裝結(jié)果。αHL七聚體生物納米孔單通道電流記錄特征良好。當(dāng)制備的七聚體納米孔用于單分子分析時，能夠?qū)崿F(xiàn)無機離子，小分子，DNA，RNA等檢測。本發(fā)明制備純化蛋白方法簡單、經(jīng)濟(jì)、快速，并且可以適用于αHL的各種突變型蛋白，同源以及異源七聚體納米孔制備。
【專利說明】一種利用單層磷脂膜組裝α-溶血素蛋白質(zhì)納米孔的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用單層磷脂膜組裝α-溶血素蛋白質(zhì)納米孔(proteinnanopore)的方法,屬于生物納米材料領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]納米孔單分子檢測是納米、生物、化學(xué)、電子信息等多學(xué)科交叉融匯而成的一種新興檢測技術(shù)。α -溶血素(a-Hemolysin, a HL)是金黃色葡萄球菌
aureus)分泌的一種分子量為33.2kD的水溶性蛋白質(zhì)單體，在磷脂雙分子層上可組裝成分子量為232.4kD的蘑菇型七聚體蛋白質(zhì)納米孔，孔道總長約10nm，該納米孔結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，能夠完整的裝載在雙層脂膜中不漏電，是理想化的納米孔檢測器件。a HL納米孔從幾何結(jié)構(gòu)上分為cap、cis, stem三大區(qū)域，根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)或原子圖譜，在不同部位進(jìn)行蛋白修飾，可設(shè)計并制造出各種性能的蛋白質(zhì)納米管，從而研究空間效應(yīng)、電荷效應(yīng)等對通道與不同檢測物作用的影響，實現(xiàn)單分子水平上的不同分析物的實時檢測。分析物可包括:無機離子、有機分子、單鏈DNA/RNA、蛋白質(zhì)等。
[0003]目前用于制備a HL納米孔單體蛋白主要采用體外表達(dá)(In Vitro transcriptionand translation, IVTT)方法制備，七聚體納米孔的組裝也基本是在雙分子層膜上實現(xiàn)，如:兔血紅細(xì)胞膜(rabbit red blood cell membrane, rRBCM)、蛋黃卵磷脂、人工脂雙層。這些方法步驟繁瑣、耗時、所需花費較高，且產(chǎn)量有限，限制了 a HL納米孔的進(jìn)一步應(yīng)用和研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種簡單易行、在磷脂單層膜上組裝制備aHL蛋白質(zhì)納米孔的方法。
[0005]本發(fā)明實現(xiàn)過程如下:
1、一種利用單層磷脂膜組裝a -溶血素(a -Hemolysin, a HL)蛋白質(zhì)納米孔的方法，其特征在于:將a HL單體蛋白溶液浸沒在DPhPC/十六烷混合液中，在單體蛋白溶液周圍形成單層磷脂膜，a HL單體在單層磷脂膜上形成七聚體a HL蛋白質(zhì)納米孔，進(jìn)一步經(jīng)分離、純化得到a HL蛋白質(zhì)納米孔。
[0006]2、根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于包括以下步驟:
(1)a HL單體蛋白的表達(dá)
將a HL基因重組在pT7質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化至BL21 (DE3) pLys, IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，收集細(xì)胞并進(jìn)行裂解；
(2)a HL單體蛋白的純化
將細(xì)胞裂解上清液加入截留分子量為50kD的超濾管(Millpore)，5000r/min離心IOmin,取下層液體加入截留分子量為30kD (Millpore)的超濾管,5000r/min離心IOmin,取上層液體，即為a HL單體蛋白溶液；(3)aHL單體蛋白在單層磷脂膜上形成七聚體a HL蛋白質(zhì)納米孔
用十六燒配制 DPhPC (憐脂，I, 2-diphytanoyl-sn-glycero_3-phosp- hocholine),即油脂混合液，用細(xì)針在DPhPC液體中釋放a HL單體蛋白溶液，在蛋白溶液與DPhPC接觸面形成單層磷脂膜，a HL單體在單層磷脂膜上組裝為蛋白質(zhì)納米孔，離心，收集下層液體進(jìn)行SDS-PAGE 電泳；
(4)SDS-PAGE切膠法純化a HL蛋白質(zhì)納米孔
SDS-PAGE電泳完畢后，將凝膠的1/5切下，放入考馬斯亮藍(lán)G250染色液中染色，另外4/5膠存于4°C ;將染好的凝膠放入脫色液中脫色，直至蛋白條帶清晰可見；將此膠與未染色的凝膠對比，切下aHL蛋白質(zhì)納米孔所在區(qū)域，加入超純水，-80°C反復(fù)凍融，低溫離心收集上清液體，真空冷凍干燥，殘留物用超純水溶解，用SDS-PAGE凝膠分析并進(jìn)行蛋白定量;
(5)a -溶血素蛋白質(zhì)納米孔的檢測方法
將預(yù)先打好小孔的Teflon膜裝在電解槽中央，隔電解槽為兩個小槽，用毛細(xì)管在孔周圍滴加含1%戊烷的戊烷和十六烷的混合液，在兩槽中各添加1400μL的IOmM Tris-HCl (含IM KC1)，并用毛細(xì)管滴加磷脂，使液面緩慢沒過小孔，用Ag/AgCl電極檢測跨膜電勢，使膜電流值在120pA，將a HL蛋白質(zhì)納米孔加入，采集和分析a HL蛋白質(zhì)納米孔單孔電流信號。
[0007]傳統(tǒng)方法制備a HL蛋白質(zhì)納米孔是利用兔血紅細(xì)胞膜聚合a HL七聚體，聚合混合物中有過多雜蛋白，不利于后續(xù)蛋白孔的純化。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在DPhPC單層膜上能夠?qū) HL進(jìn)行七聚體組裝，且易于分離純化，有利于大量制備a HL七聚體。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1為a HL單體蛋白表達(dá)及純化結(jié)果在12%的SDS-PAGE電泳結(jié)果圖；
圖2為a HL單體蛋白溶液在油脂混合液中形成單層膜的示意圖；
圖3為a HL單體蛋白分別在兔血紅細(xì)胞膜(雙層膜)以及單層磷脂膜上形成的七聚體在7% SDS-PAGE的電泳結(jié)果圖；
圖4為切膠純化后的a HL七聚體蛋白SDS-PAGE結(jié)果圖；
圖5為兩種七聚體的單通道記錄結(jié)果:B C分別為七聚體蛋白在+40mV和+120mV的單通道記錄圖，其中左邊為a HL在rRBCM中形成的七聚體的單通道記錄，右邊為a HL在油脂混合液中形成的七聚體的單通道記錄圖。
【具體實施方式】
[0009]以下實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法，所使用的材料、試劑等如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實驗涉及的儀器為垂直電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)以及單分子電子檢測系統(tǒng)(主要包括Axon 200B放大器，數(shù)-模轉(zhuǎn)化器和函數(shù)發(fā)生器)。
[0010]具體地說，本發(fā)明在單層磷脂膜上組裝a HL蛋白質(zhì)納米孔包括以下步驟:
(I)a HL單體蛋白的表達(dá)
將a HL基因重組在pT7質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化至BL21 (DE3) pLys, IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，收集細(xì)胞并進(jìn)行裂解。
[0011](2) aHL單體蛋白的純化將細(xì)胞裂解上清液加入截留分子量為50kD的超濾管(Mi I Ipore )，5000r/min離心IOmin,取下層液體加入截留分子量為30kD (Millpore)的超濾管,5000r/min離心10min,取上層液體，即為aHL單體蛋白溶液(如圖1結(jié)果所示)。
[0012](3) aHL單體蛋白在單層磷脂膜上進(jìn)行七聚體組裝
用十六烷配制DPhPC (5-10mM)，用細(xì)針在DPhPC液體中釋放a HL單體蛋白溶液，在蛋白溶液與DPhPC接觸面形成具有單層膜，a HL單體即在單層膜上組裝。37°C放置若干時間，11000r/min離心，去上清油層，收集下層液體，進(jìn)行SDS-PAGE電泳；
圖2為a HL單體蛋白溶液在油脂混合液中形成單層膜的示意圖。
[0013](4) SDS-PAGE切膠法純化a HL七聚體蛋白。
[0014]SDS-PAGE電泳完畢后，將凝膠的1/5切下，放入考馬斯亮藍(lán)G250染色液中染色，另外4/5膠用保鮮膜封好存于4°C。將染好的凝膠放入脫色液中脫色，直至蛋白條帶清晰可見。將此膠與未染色的凝膠對比，用鋒利刀片切下aHL七聚體目的蛋白所在區(qū)域，加入少量超純水，_80°C反復(fù) 凍融，低溫高速離心收集上清液體，真空冷凍干燥，殘留物用一定量超純水溶解，用SDS-PAGE凝膠分析并進(jìn)行蛋白定量；
圖3為a HL單體蛋白分別在兔血紅細(xì)胞膜(雙層膜)以及單層磷脂膜上形成的七聚體在7% SDS-PAGE的電泳結(jié)果圖，2為a HL在單層膜上的組裝，3為a HL在雙層膜上的組裝。圖4為切膠純化后的a HL七聚體蛋白SDS-PAGE結(jié)果圖。
[0015](5)單通道電流記錄
將預(yù)先打好小孔的Teflon膜裝在電解槽中央，隔電解槽為兩個小槽，用毛細(xì)管在孔周圍滴加含1%戊烷的戊烷和十六烷的混合物，在兩槽中添加1400μL的IOmM Tris-HCl (含IM KC1)，并用毛細(xì)管滴加少量磷脂，使液面緩慢沒過小孔，用Ag/AgCl電極檢測跨膜電勢，使膜電流值約在120pA，將a HL七聚體蛋白加入，采集和分析a HL納米孔電流信號。
[0016]具體地說，為了測定七聚體的實用性，本發(fā)明進(jìn)行了單通道電流分析，七聚體蛋白質(zhì)加于電解池順式端(零電位接地端)，如圖5所示，在pH 8.0的IOmM Tris-HCl (含IM KCl)緩沖液中，當(dāng)所加七聚體蛋白濃度較大時，出現(xiàn)了圖5-A所示的電流跳躍式圖，此時得到的為多通道。稀釋七聚體蛋白濃度直到出現(xiàn)單通道電流，將電壓加到+40mV，
5-B分別為雙層膜和單層膜上聚合的七聚體的單通道電流值，分別為33.4±1.6pA (n=10)和32.3±2.1pA (n=10),當(dāng)將電壓加到+120mV時，兩種蛋白的單通道電流值分別為119±1.8pA (n=10)和120±1.3pA (n=10)。該通道可以穩(wěn)定數(shù)小時，并且兩種膜上組裝的七聚體在單通道電流以及穩(wěn)定性方面并沒有表現(xiàn)出太大的差異，基本保持一致。據(jù)此可以實現(xiàn)對所需檢測物的單分子分析。
【權(quán)利要求】
1.一種利用單層磷脂膜組裝α-溶血素蛋白質(zhì)納米孔的方法，其特征在于:將aHL單體蛋白溶液浸沒在DPhPC/十六烷混合液中，在單體蛋白溶液周圍形成單層磷脂膜，a HL單體在單層磷脂膜上形成七聚體aHL蛋白質(zhì)納米孔，進(jìn)一步經(jīng)分離、純化得到a HL蛋白質(zhì)納米孔。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于包括以下步驟: (1)a HL單體蛋白的表達(dá) (2)a HL單體蛋白的純化 (3)a HL單體蛋白在單層磷脂膜上形成七聚體a HL蛋白質(zhì)納米孔 用十六烷配制DPhPC，用細(xì)針在DPhPC液體中釋放a HL單體蛋白溶液，在蛋白溶液與DPhPC接觸面形成單層磷脂膜，a HL單體在單層磷脂膜上組裝為蛋白質(zhì)納米孔，離心，收集下層液體進(jìn)行SDS-PAGE電泳； (4)SDS-PAGE切膠法純化a HL蛋白質(zhì)納米孔。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:步驟(1)中，將aHL基因重組在pT7質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化至BL21 (DE3) pLys, IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，收集細(xì)胞并進(jìn)行裂解。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:步驟(2)中，將細(xì)胞裂解上清液加入截留分子量為50kD的超濾管(Millpore), 5000r/min離心10min,取下層液體加入截留分子量為30kD (Millpore)的超濾管 ,5000r/min離心10min,取上層液體，即為a HL單體蛋白溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:步驟(4)中，SDS-PAGE電泳完畢后，將凝膠的1/5切下，放入考馬斯亮藍(lán)G250染色液中染色，另外4/5膠存于4°C ;將染好的凝膠放入脫色液中脫色，直至蛋白條帶清晰可見；將此膠與未染色的凝膠對比，切下aHL蛋白質(zhì)納米孔所在區(qū)域，加入超純水，-80°C反復(fù)凍融，低溫離心收集上清液體，真空冷凍干燥，殘留物用超純水溶解，用SDS-PAGE凝膠分析并進(jìn)行蛋白定量。
6.—種檢測權(quán)利要求1所述方法制備得到的a -溶血素蛋白質(zhì)納米孔的方法，其特征在于:將預(yù)先打好小孔的Teflon膜裝在電解槽中央，隔電解槽為兩個小槽，用毛細(xì)管在孔周圍滴加含1%戊烷的戊烷和十六烷的混合液，在兩槽中各添加1400μL的IOmM Tris-HCl(含IM KC1)，并用毛細(xì)管滴加磷脂，使液面緩慢沒過小孔，用Ag/AgCl電極檢測跨膜電勢，使膜電流值在120pA，將a HL蛋白質(zhì)納米孔加入，采集和分析a HL蛋白質(zhì)納米孔單孔電流信號。
【文檔編號】G01N27/447GK103983487SQ201410142198
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年4月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月11日
【發(fā)明者】張亞妮, 張春萍, 王瑩, 段靜, 亢曉峰 申請人:西北大學(xué)