虹鱒魚脂肪酸延長(zhǎng)酶基因、重組表達(dá)載體、應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種虹鱒魚脂肪酸延長(zhǎng)酶基因及其編碼蛋白、重組載體，以及增加蠶 蛹組織11，14, 17-順-二十碳三烯酸含量的方法，屬于基因工程、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物育種領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂肪酸按不飽和度不同可以分為飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸是和多不飽和脂肪 酸（PUFAs)。在生物體內(nèi)，許多代謝過程都在膜上進(jìn)行或與膜有關(guān)，而不飽和脂肪酸是細(xì)胞 膜磷脂的重要組成成分。由于脂肪酸的凝固點(diǎn)隨其不飽和度升高而降低，因此膜脂中的不 飽和脂肪酸含量越高，其相變溫度越低，流動(dòng)性越大。進(jìn)而，細(xì)胞膜的各種功能，如細(xì)胞識(shí) 另IJ、轉(zhuǎn)運(yùn)作用和膜結(jié)合酶的活性等等都和細(xì)胞膜的流動(dòng)性密切相關(guān)，因此不飽和脂肪酸在 生物體內(nèi)直接或間接的發(fā)揮著重要的功能，如抗癌抗腫瘤活性、免疫調(diào)節(jié)活性、促生長(zhǎng)發(fā)育 活性和降低膽固醇活性等。
[0003] 多不飽和脂肪酸對(duì)人體的生理功能有著重要的生理意義，其功能的研究一直備受 關(guān)注。其中，亞油酸（linoleic acid，LA)和α-亞麻酸（a-Linolenic acid, ALA)被認(rèn)為 是人類飲食中的必需脂肪酸。更長(zhǎng)鏈的PUFAs，如二十碳五稀酸（eicosapentaenoic acid， EPA)和二十二碳六稀酸（docosahexenoic acid，DHA)等在人體的新陳代謝中發(fā)揮著至關(guān) 重要的作用。
[0004] 家蠶是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲。蠶蛹不僅是優(yōu)質(zhì)的飼料蛋白源，而且富含豐富的不飽和 脂肪酸。家蠶組織內(nèi)，脂肪酸占干重的約30%，其中不飽和脂肪酸約占70%，以α-亞麻酸 為主。但是目前蠶蛹的加工利用方式主要是用于家畜飼料的蛋白源添加組分，其組織中脂 肪酸成分利用非常有限。因此，提高蠶蛹不飽和脂肪酸含量尤其是主要的亞油酸和α亞麻 酸含量對(duì)蠶蛹的進(jìn)一步綜合利用有著重要意義。近幾年來，家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)的建立以及成 熟使家蠶成為了新型的真核生物反應(yīng)器，已有研究者通過將家蠶作為反應(yīng)器成功的表達(dá)了 多種高附加值產(chǎn)物，如人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、貓干擾素和人III型前膠原蛋白等。然而用家 蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)在家蠶體內(nèi)表達(dá)外源脂肪酸去飽和酶基因，增加家蠶組織中某特定不飽和脂 肪酸含量的研究還未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的就是提供一種虹鱒魚脂肪酸延長(zhǎng)酶基因、由該基因指導(dǎo)編碼的蛋 白，以及由該基因重組表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)的提高蠶蛹組織11，14, 17-順-二十碳三烯酸含量的 方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明技術(shù)方案分別如下：
[0006] 本發(fā)明首先提供一種虹鱒魚脂肪酸延長(zhǎng)酶基因。
[0007] -種虹鱒魚脂肪酸延長(zhǎng)酶基因，命名為OmElo基因，其特征在于：核苷酸序列如 SEQ ID No. 1。
[0008] 上述虹鱒魚脂肪酸延長(zhǎng)酶基因 OmElo是根據(jù)家蠶基因組序列數(shù)據(jù)中編碼基因表 達(dá)序列密碼子的偏好性，對(duì)來源于虹鱒魚的脂肪酸延長(zhǎng)酶基因（OmElo)序列（NCBI登陸 號(hào)：NP_001118108. 1)進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，優(yōu)化后獲得新的去飽和酶基因，命名為OmElo,其核苷 酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0009] 由上述虹鱒魚脂肪酸延長(zhǎng)酶基因 OmElo指導(dǎo)編碼的蛋白質(zhì)，其技方案如下：
[0010] -種由上述虹鱒魚脂肪酸延長(zhǎng)酶基因 OmElo指導(dǎo)編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于：氨 基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0011] 上述由OmElo基因指導(dǎo)編碼的蛋白能夠以特定碳鏈長(zhǎng)度及不飽和度的脂酰輔酶A 作為底物，在羧基端增加一個(gè)二碳單位，從而對(duì)碳鏈進(jìn)行延長(zhǎng)。
[0012] 利用上述OmElo基因可以得到重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系統(tǒng)或重組菌株，其 技術(shù)方案如下：
[0013] -種包含核苷酸序列如SEQ ID No. 1的重組表達(dá)載體或基因表達(dá)盒或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞 系或重組菌株。
[0014] 上述重組表達(dá)載體，其表達(dá)框的啟動(dòng)子是BmNPV極早期啟動(dòng)子IEl。
[0015] 進(jìn)一步地，上述重組表達(dá)載體是以家蠶肌動(dòng)蛋白3的啟動(dòng)子A3啟動(dòng)的加強(qiáng)型綠 色熒光蛋白（EGFP)作為表達(dá)盒，加強(qiáng)型綠色熒光蛋白作作為篩選標(biāo)記，篩選標(biāo)記后帶有以 IEl啟動(dòng)子啟動(dòng)虹鱒魚脂肪酸延長(zhǎng)酶基因 OmElo的表達(dá)盒。
[0016] 本發(fā)明還提供構(gòu)建包括核苷酸序列如SEQ ID No. 1的重組表達(dá)載體的方法。
[0017] 構(gòu)建包括核苷酸序列如SEQ ID No. 1的重組表達(dá)載體的方法，其特征在于：是將 所述OmElo基因插入到出發(fā)載體pSLllSO的多克隆位點(diǎn)得到中間載體，然后再將完整的含 有OmElo基因的表達(dá)盒IEl-0mEl〇-SV40插入到最終載體pBac[A3-EGFP]得到重組表達(dá)載 體。
[0018] 上述重組表達(dá)載體在獲得蠶蛹組織高11，14, 17-順-二十碳三烯酸含量家蠶轉(zhuǎn)基 因品系中的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明還提供提高蠶蛹組織中11，14, 17-順-二十碳三烯酸含量的方法，其技術(shù) 方案如下：
[0020] 提高蠶蛹組織中11，14, 17-順-二十碳三烯酸含量的方法，其特征在于：將虹鱒魚 脂肪酸延長(zhǎng)酶基因 OmElo導(dǎo)入家蠶胚胎中，經(jīng)篩選，得到目標(biāo)家蠶轉(zhuǎn)基因系。
[0021] 進(jìn)一步地，上述方法，是利用piggyBac重組表達(dá)載體將所述OmElo基因整合入 家蠶基因組，重組表達(dá)載體是將含有OmElo基因的表達(dá)盒插入到載體pBac[A3-EGFP]的 Bgl II酶切位點(diǎn)得到。
[0022] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：（1)設(shè)計(jì)優(yōu)化并人工合成了適用于家蠶 體內(nèi)表達(dá)的虹鱒魚脂肪酸延長(zhǎng)酶基因 OmElo。（2)根據(jù)家蠶基因組序列數(shù)據(jù)中內(nèi)源編碼序 列密碼子的偏好性，對(duì)虹鱒魚脂肪酸延長(zhǎng)酶基因 OmElo序列進(jìn)行了優(yōu)化設(shè)計(jì)，使人工合成 的OmElo基因更有利于在家蠶個(gè)體中表達(dá)。（3)提供了包含核苷酸序列如SEQ ID No. 1的 重組表達(dá)載體或基因表達(dá)盒或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌株。（4)包括核苷酸序列如SEQ ID No. 1的重組表達(dá)載體可應(yīng)用于獲得高11，14, 17-順-二十碳三烯酸含量家蠶轉(zhuǎn)基因品系。 (5)利用piggyBac轉(zhuǎn)座子結(jié)合BmNPV極早期啟動(dòng)子IEl驅(qū)動(dòng)其表達(dá)，從而獲得了可穩(wěn)定在 家蠶中表達(dá)虹鱒魚脂肪酸延長(zhǎng)酶基因 OmElo的家蠶轉(zhuǎn)基因系，該品系蠶蛹期組織含有高含 量11，14, 17-順-二十碳三烯酸。
【附圖說明】
[0023] 圖1是真核生物多不飽和脂肪酸合成途徑。
[0024] 圖 2 是重組載體 pBac[A3-EGFP+IEl-0mEl0-SV40]結(jié)構(gòu)圖。
[0025] 圖3是轉(zhuǎn)基因家蠶的鑒定圖。
[0026] 圖4是非轉(zhuǎn)基因305多化品系蛹期3天脂肪酸甲酯的氣相色譜圖。
[0027] 圖5是305多化品系家蠶虹鱒魚脂肪酸延長(zhǎng)酶基因（OmElo)品系蛹期3天脂肪酸 甲酯的氣相色譜圖。
[0028] 圖6是305多化品系家蠶轉(zhuǎn)虹鱒魚的脂肪酸延長(zhǎng)酶基因（OmElo)品系和非轉(zhuǎn)基因 305多化品系蛹期3天脂肪酸的11，14, 17-順-二十碳三烯酸含量變化圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例作進(jìn)一步的描述。
[0030] 實(shí)施例一
[0031] 虹鱒魚脂肪酸延長(zhǎng)酶基因 OmElo的制備。
[0032] 來源基因：虹鱒魚的脂肪酸延長(zhǎng)酶基因（OmElo)序列（NCBI登陸號(hào)： NP_001118108. 1) 〇
[0033] 根據(jù)家蠶基因組序列數(shù)據(jù)中編碼基因表達(dá)序列密碼子的偏好性，對(duì)來源基因進(jìn)行 優(yōu)化設(shè)計(jì)，優(yōu)化后得到虹鱒魚脂肪酸延長(zhǎng)酶基因 OmElo,核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，命 名為OmElo基因。
[0034] 由OmElo基因指導(dǎo)編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0035] 實(shí)施例二
[0036] 構(gòu)建家蠶轉(zhuǎn)基因重組載體 pBac [A3-EGFP+IEl-0mEl0-SV40]。
[0037] 如圖2所示，將OmElo基因插入到出發(fā)載體pSL1180的多克隆位點(diǎn)得到的中 間載體，然后再將完整的含有OmElo基因的表達(dá)盒IEl-0mEl〇-SV40插入到最終載體 pBac[A3-EGFP]得到重組表達(dá)載體。
[0038] 具體實(shí)施操作：
[0039] 步驟 S1、制備載體 pSL1180[Serl-0mEl0-SV40]
[0040] 將OmElo基因連接于pUC57載體質(zhì)粒；通過BamH I /Not I雙酶切pUC57載體 質(zhì)粒，回收得到OmElo基因片段（回收操作按照TAKARA膠回收（小量）試劑盒使用說明 進(jìn)行），將回收片段與相同酶切的pSL1180 [Ser I-pGH-SV40]載體骨架片段按照TAKARA DNA ligation kit Ver2.1使用說明進(jìn)行連接，即將pGH序列替換為OmElo序列，得到 pSL1180[Serl-0mEl0-SV40]載體。
[0041] 步驟S2、制備IEl啟動(dòng)子序列
[0042] PCR體外擴(kuò)增，從BmNPV基因組中擴(kuò)增IEl啟動(dòng)子序列，并在擴(kuò)增片段上下游分別 添加 EcoR I和BamH I酶切位點(diǎn)，經(jīng)T-A克隆到載體pMD19-T獲得質(zhì)粒，將獲得的pMD19-T 載體質(zhì)粒用EcoR I和BamH I雙酶切，回收IEl啟動(dòng)子序列（回收操作按照TAKARA膠回收 (小量