用于鑒別大西洋鮭和虹鱒的生物傳感檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于鑒別大西洋鮭和虹鱒的生物傳感檢測方法，包括如下步驟：步驟一、提取待檢測樣品的基因組DNA，利用大西洋鮭特異性引物對，以待檢測樣品的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到待檢測樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Ⅰ，且大西洋鮭特異性引物對各自分別于堿基序列的上游帶有電化學(xué)活性標(biāo)記分子和錨定標(biāo)記分子；步驟二、將步驟一中得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加于修飾有錨定受體的電極表面進(jìn)行反應(yīng)，錨定標(biāo)記分子可被錨定受體捕獲，以使帶有錨定標(biāo)記分子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物被電極表面捕獲；和步驟三、檢測電化學(xué)活性標(biāo)記分子的電化學(xué)信號，若存在電化學(xué)標(biāo)記分子的電化學(xué)信號，則待檢測樣品來自于大西洋鮭。本方法適用于任何發(fā)育時期、任意形態(tài)的魚類樣本。
【專利說明】
用于鑒別大西洋鮭和虹鱒的生物傳感檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物傳感技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于鑒別魚卵、魚苗、成魚、魚肉及其制 品的所屬物種的檢測技術(shù)，特別涉及一種用于鑒別大西洋鮭和虹鱒的生物傳感檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 大西洋娃（Salmo salar)，屬于娃形目（Salmoniformes)、娃科（Salmonidae)、娃屬 (Salmo)，原始棲息地為大西洋北部的溫帶和亞北極地區(qū)，20世紀(jì)60年代在挪威人工養(yǎng)殖成 功，目前已經(jīng)成為世界性的養(yǎng)殖魚類，主要以海水網(wǎng)箱的形式養(yǎng)殖生產(chǎn)商品魚，在我國水產(chǎn) 品市場上稱為"挪威三文魚"，銷售價格較高。
[0003] 虹蹲（Oncorhynchus mykiss)，屬于娃形目（Salmoniformes)、娃科（Salmonidae)、 大馬哈魚屬(Oncorhynchus)，原始棲息地為北美洲北部和太平洋西岸，自19世紀(jì)起就在美 國開始淡水養(yǎng)殖，我國曾從朝鮮、美國、日本等國多次引種，目前在20多個省市區(qū)都有人工 養(yǎng)殖，是國內(nèi)養(yǎng)殖范圍較廣的冷水魚類。
[0004] 我國國內(nèi)大西洋鮭養(yǎng)殖產(chǎn)量較低，但以其為原料制作的三文魚刺身、煙熏三文魚 等產(chǎn)品很受消費者歡迎，因而部分不法養(yǎng)殖者和經(jīng)營者使用虹鱒來冒充大西洋鮭:有的利 用虹鱒和大西洋鮭分類學(xué)上的近緣關(guān)系，將虹鱒冠以"淡水三文魚"的名稱混淆視聽，高價 銷售;有的向虹鱒飼料中添加色素，使原本為白色、青色的虹鱒肉呈現(xiàn)出類似大西洋鮭的橘 紅色澤，冒充進(jìn)口 "挪威三文魚"銷售，嚴(yán)重侵害消費者的知情權(quán)，甚至存在非法色素添加等 健康隱患。
[0005] 綜上所述，迫切需要準(zhǔn)確可靠的檢測技術(shù)，用于大西洋鮭和虹鱒的物種鑒別。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個目的是解決至少上述問題和/或缺陷，并提供至少后面將說明的優(yōu) 點。
[0007] 本發(fā)明還有一個目的是提供一種用于鑒別大西洋鮭和虹鱒的生物傳感檢測方法。
[0008] 為此，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:一種用于鑒別大西洋鮭和虹鱒的生物傳感檢測 方法，包括如下步驟：
[0009] 步驟一、提取待檢測樣品的基因組DNA，利用大西洋鮭特異性引物對，以所述待檢 測樣品的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到待檢測樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物I，且大西洋鮭特 異性引物對各自分別于堿基序列的上游帶有電化學(xué)活性標(biāo)記分子和錨定標(biāo)記分子；
[0010] 步驟二、將步驟一中得到的所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加于修飾有錨定受體的電極表面進(jìn) 行反應(yīng)，所述錨定標(biāo)記分子可被所述錨定受體捕獲，以使帶有錨定標(biāo)記分子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 被電極表面捕獲;和
[0011]步驟三、檢測所述電化學(xué)活性標(biāo)記分子的電化學(xué)信號，若存在所述電化學(xué)標(biāo)記分 子的電化學(xué)信號，則所述待檢測樣品來自于大西洋鮭。
[0012]優(yōu)選的是，所述的用于鑒別大西洋鮭和虹鱒的生物傳感檢測方法中，所述大西洋 鮭特異引物對為如SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所示的堿基序列。
[0013] 優(yōu)選的是，所述的用于鑒別大西洋鮭和虹鱒的生物傳感檢測方法，還包括：
[0014] 步驟四、以步驟一中得到的所述待檢測樣品的基因組DNA為模板，利用虹鱒特異性 引物對，以所述待檢測樣品的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到待檢測樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物Π，其中，所述虹鱒特異性引物對也各自分別于堿基序列的上游帶有電化學(xué)活性標(biāo)記分 子和錨定標(biāo)記分子；
[0015] 步驟五、將步驟四中得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Π加入到一新的所述修飾有錨定受體的 電極表面進(jìn)行反應(yīng)；
[0016] 步驟六、檢測所述電化學(xué)活性標(biāo)記分子的電化學(xué)信號，若存在所述電化學(xué)標(biāo)記分 子的電化學(xué)信號，則所述待檢測樣品來自于虹鱒；
[0017] 若在步驟六中未檢測到所述電化學(xué)活性標(biāo)記分子的電化學(xué)信號，而在步驟三中檢 測到所述電化學(xué)活性分子標(biāo)記的電化學(xué)信號，則所述待檢測樣品來自于大西洋鮭。
[0018] 優(yōu)選的是，所述的用于鑒別大西洋鮭和虹鱒的生物傳感檢測方法中，虹鱒特異性 引物對為如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示的堿基序列。
[0019] 優(yōu)選的是，所述的用于鑒別大西洋鮭和虹鱒的生物傳感檢測方法，還包括：
[0020] 步驟七、以步驟一中得到的所述待檢測樣品的基因組DNA為模板，利用如SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所示的堿基序列的通用引物對，以所述待檢測樣品的基因組DNA為模板 進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到待檢測樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物ΙΠ，其中，所述通用引物對也各自分別于堿基 序列的上游帶有電化學(xué)活性標(biāo)記分子和錨定標(biāo)記分子；
[0021 ]步驟八、將步驟七中得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物m加到另一所述修飾有錨定受體的電極 表面進(jìn)行反應(yīng)；
[0022] 步驟九、檢測所述電化學(xué)活性標(biāo)記分子的電化學(xué)信號，若存在所述電化學(xué)標(biāo)記分 子的電化學(xué)信號，則表明反應(yīng)體系正常，鑒別結(jié)果可信，若未檢測到所述電化學(xué)活性標(biāo)記分 子的電化學(xué)信號，則表明反應(yīng)體系異常，鑒別結(jié)果不可信。
[0023] 優(yōu)選的是，所述的用于鑒別大西洋鮭和虹鱒的生物傳感檢測方法中，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 加到修飾有錨定受體的電極表面進(jìn)行反應(yīng)的步驟包括：
[0024] 1)將獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，滴加到修飾的電極表面中，于溫度37°C下反應(yīng)30min進(jìn) 行錨定反應(yīng)；
[0025] 2)對電極表面未結(jié)合的分子進(jìn)行洗脫，洗脫條件為利用pH 7.0的Tris-EDTA緩沖 液洗脫3次，每次洗脫5min;
[0026] 3)以鉑絲為對電極，以Ag/AgCl為參比電極，pH 7.0磷酸緩沖液為支持電解質(zhì)，初 始電位設(shè)為OmV，折回電位設(shè)為+600mV，掃描速度設(shè)為50mV/s，測定工作電極的循環(huán)伏安曲 線。
[0027] 優(yōu)選的是，所述的用于鑒別大西洋鮭和虹鱒的生物傳感檢測方法中，所述PCR反應(yīng) 的條件為:退火溫度60°C，延伸時間90s，循環(huán)次數(shù)25次。
[0028] 優(yōu)選的是，所述的用于鑒別大西洋鮭和虹鱒的生物傳感檢測方法中，步驟二中，所 述待檢測樣品組織為魚鰭或魚肉。
[0029] 優(yōu)選的是，所述的用于鑒別大西洋鮭和虹鱒的生物傳感檢測方法中，所述電化學(xué) 活性標(biāo)記分子為二茂鐵，所述錨定標(biāo)記分子為生物素。
[0030] 優(yōu)選的是，所述的用于鑒別大西洋鮭和虹鱒的生物傳感檢測方法中，檢測到所述 電化學(xué)活性標(biāo)記分子的電化學(xué)信號指檢測到呈現(xiàn)所述電化學(xué)活性標(biāo)記分子的氧化還原峰。
[0031] 本發(fā)明至少包括以下有益效果：
[0032] 本發(fā)明提供了一種準(zhǔn)確可靠的大西洋鮭和虹鱒鑒定技術(shù)，適用于處在生活史任何 階段、任意形態(tài)的魚類樣本，包括魚卵、魚苗、成魚、冰鮮魚肉、冷凍魚肉、煙熏制品，以及其 它DNA未完全降解的組織和制品。
[0033]本發(fā)明中PCR擴(kuò)增靶標(biāo)為核基因組肌紅蛋白基因，規(guī)避了常規(guī)物種鑒定技術(shù)中DNA 條形碼來源于線粒體基因組的母系遺傳特征，能夠避免人工養(yǎng)殖中雜交制種對檢測結(jié)果的 誤導(dǎo)。
[0034]本發(fā)明基于電化學(xué)生物傳感檢測原理，易于集成化，可在其基礎(chǔ)上構(gòu)建芯片進(jìn)行 高通量多位點快速檢測。
[0035] 本發(fā)明不使用任何有毒有害試劑，檢測操作全程不存在人身健康或環(huán)境污染隱 患。
[0036] 本發(fā)明的其它優(yōu)點、目標(biāo)和特征將部分通過下面的說明體現(xiàn)，部分還將通過對本 發(fā)明的研究和實踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。
【附圖說明】
[0037] 圖1為本發(fā)明中大西洋鮭特異性引物的基因組位置比對圖，序列右側(cè)數(shù)字表示該 序列在相應(yīng)物種肌紅蛋白基因上的位置，序列下方柱狀圖顯示序列保守性，箭頭指示引物 方向（5'至3'）；
[0038] 圖2為本發(fā)明中虹鱒特異性引物的基因組位置比對圖，序列右側(cè)數(shù)字表示該序列 在相應(yīng)物種肌紅蛋白基因上的位置，序列下方柱狀圖顯示序列保守性，箭頭指示引物方向 (5,至3，）；
[0039] 圖3為本發(fā)明中通用引物的基因組位置比對圖，序列右側(cè)數(shù)字表示該序列在相應(yīng) 物種肌紅蛋白基因上的位置，序列下方柱狀圖顯示序列保守性，箭頭指示引物方向（5'至 3，）；
[0040] 圖4為本發(fā)明的檢測流程示意圖；
[0041] 圖5為本發(fā)明檢測大西洋鮭樣品的循環(huán)伏安信號，細(xì)實線表示大西洋鮭引物擴(kuò)增 產(chǎn)物檢測信號，粗虛線表示虹鱒引物擴(kuò)增產(chǎn)物檢測信號，點線表示通用引物擴(kuò)增產(chǎn)物檢測 信號；
[0042] 圖6為本發(fā)明檢測虹鱒樣品的循環(huán)伏安信號，細(xì)實線表示大西洋鮭引物擴(kuò)增產(chǎn)物 檢測信號，粗虛線表示虹鱒引物擴(kuò)增產(chǎn)物檢測信號，點線表示通用引物擴(kuò)增產(chǎn)物檢測信號。
【具體實施方式】
[0043]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文 字能夠據(jù)以實施。
[0044] 應(yīng)當(dāng)理解，本文所使用的諸如"具有"、"包含"以及"包括"術(shù)語并不配出一個或多 個其它元件或其組合的存在或添加。
[0045] 本發(fā)明提供一種基于生物傳感原理的檢測技術(shù)，使用物種特異性引物對待測樣品 基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，同時向擴(kuò)增產(chǎn)物兩端分別引入電化學(xué)活性標(biāo)記和錨定標(biāo)記，然后利用 錨定標(biāo)記將擴(kuò)增產(chǎn)物捕獲在電極表面，檢測電極表面的電化學(xué)活性，從而準(zhǔn)確判定樣品的 物種來源。
[0046] 本發(fā)明中，大西洋鮭特異性引物、虹鱒特異性引物、大西洋鮭和虹鱒通用引物的擴(kuò) 增靶標(biāo)均位于核基因組肌紅蛋白基因的外顯子區(qū)。在同一物種中，基因的外顯子區(qū)域保守 程度較高，因而適用于作為物種鑒定的依據(jù)。從NCBI下載大西洋鮭和虹鱒基因組參考序列， 對其基因區(qū)進(jìn)行序列相似性BLAST比對，獲取差異最顯著的1%基因列表，從中選擇研究較 為深入、注釋清晰的基因，最終確定肌紅蛋白基因為靶基因。在兩個物種肌紅蛋白基因外顯 子區(qū)的差異序列處分別設(shè)計大西洋鮭特異性引物和虹鱒特異性引物，在保守區(qū)設(shè)計大西洋 鮭和虹鱒通用引物，將引物序列在大西洋鮭和虹鱒基因組內(nèi)進(jìn)行BLAST比對，證實不存在非 特異性擴(kuò)增。各引物序列及其基因組位置如圖1-3所示。
[0047] 本發(fā)明中，正向引物帶有電化學(xué)活性標(biāo)記，反向引物帶有錨定標(biāo)記，標(biāo)記均位于引 物5 '端，不影響PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR擴(kuò)增成功的DNA片段將在兩端分別帶有電化學(xué)活性標(biāo)記 和錨定標(biāo)記，能夠被偶聯(lián)有錨定受體的電極表面所捕獲，并產(chǎn)生電化學(xué)信號。而未成功擴(kuò)增 的正向引物和模板DNA將被洗脫，無法留在電極表面，帶有錨定標(biāo)記的反向引物雖然也能競 爭性結(jié)合在電極表面，但不帶有電化學(xué)活性標(biāo)記，因而無法產(chǎn)生電化學(xué)信號。檢測流程和原 理如圖4所示。
[0048]本發(fā)明中，大西洋鮭和虹鱒通用引物的作用是充當(dāng)正對照，指示所有實驗流程操 作成功，若通用引物檢測電極無信號，提示應(yīng)排查DNA是否降解、DNA提取是否成功、PCR反應(yīng) 是否成功等操作問題。
[0049] 本發(fā)明提供一種用于鑒別大西洋鮭和虹鱒的生物傳感檢測方法，包括如下步驟：
[0050] 驟一、提取待檢測樣品的基因組DNA，利用大西洋鮭特異性引物對，以所述待檢測 樣品的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到待檢測樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物I，且大西洋鮭特異 性引物對各自分別于堿基序列的上游帶有電化學(xué)活性標(biāo)記分子和錨定標(biāo)記分子；
[0051] 步驟二、將步驟一中得到的所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加于修飾有錨定受體的電極表面進(jìn) 行反應(yīng)，所述錨定標(biāo)記分子可被所述錨定受體捕獲，以使帶有錨定標(biāo)記分子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 被電極表面捕獲;和
[0052]步驟三、檢測所述電化學(xué)活性標(biāo)記分子的電化學(xué)信號，若存在所述電化學(xué)標(biāo)記分 子的電化學(xué)信號，則所述待檢測樣品來自于大西洋鮭。
[0053]在本發(fā)明的其中一個實施例中，作為優(yōu)選，該用于鑒別大西洋鮭和虹鱒的生物傳 感檢測方法，還包括：
[0054]步驟四、以步驟一中得到的所述待檢測樣品的基因組DNA為模板，利用虹鱒特異性 引物對，以所述待檢測樣品的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到待檢測樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物Π，其中，所述虹鱒特異性引物對也各自分別于堿基序列的上游帶有電化學(xué)活性標(biāo)記分 子和錨定標(biāo)記分子；
[0055] 步驟五、將步驟四中得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Π 加入到一新的所述修飾有錨定受體的 電極表面進(jìn)行反應(yīng)；
[0056] 步驟六、檢測所述電化學(xué)活性標(biāo)記分子的電化學(xué)信號，若存在所述電化學(xué)標(biāo)記分 子的電化學(xué)信號，則所述待檢測樣品來自于虹鱒；
[0057] 若在步驟六中未檢測到所述電化學(xué)活性標(biāo)記分子的電化學(xué)信號，而在步驟三中檢 測到所述電化學(xué)活性分子標(biāo)記的電化學(xué)信號，則所述待檢測樣品來自于大西洋鮭。
[0058] 故此，在本發(fā)明的其中一個實施例中，作為優(yōu)選，所述大西洋鮭特異引物對為如 SEQIDN0:1和SEQIDN0 :2所示的堿基序列。
[0059]在本發(fā)明的其中一個實施例中，作為優(yōu)選，虹鱒特異性引物對為如SEQ ID N0:3和 SEQ ID NO:4所不的喊基序列。
[0060] 在本發(fā)明的其中一個實施例中，作為優(yōu)選，該用于鑒別大西洋鮭和虹鱒的生物傳 感檢測方法，還包括：
[0061] 步驟七、以步驟一中得到的所述待檢測樣品的基因組DNA為模板，利用如SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所示的堿基序列的通用引物對，以所述待檢測樣品的基因組DNA為模板 進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到待檢測樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物ΙΠ，其中，所述通用引物對也各自分別于堿基 序列的上游帶有電化學(xué)活性標(biāo)記分子和錨定標(biāo)記分子；
[0062] 步驟八、將步驟七中得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物m加到另一所述修飾有錨定受體的電極 表面進(jìn)行反應(yīng)；
[0063] 步驟九、檢測所述電化學(xué)活性標(biāo)記分子的電化學(xué)信號，若存在所述電化學(xué)標(biāo)記分 子的電化學(xué)信號，則表明反應(yīng)體系正常，鑒別結(jié)果可信，若未檢測到所述電化學(xué)活性標(biāo)記分 子的電化學(xué)信號，則表明反應(yīng)體系異常，鑒別結(jié)果不可信。
[0064]在本發(fā)明的其中一個實施例中，作為優(yōu)選，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加到修飾有錨定受體的電 極表面進(jìn)行反應(yīng)的步驟包括：
[0065] 1)將獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，滴加到修飾的電極表面中，于溫度37°C下反應(yīng)30min進(jìn) 行錨定反應(yīng)；
[0066] 2)對電極表面未結(jié)合的分子進(jìn)行洗脫，洗脫條件為利用pH 7.0的Tris-EDTA緩沖 液洗脫3次，每次洗脫5min;
[0067] 3)以鉑絲為對電極，以Ag/AgCl為參比電極，pH 7.0磷酸緩沖液為支持電解質(zhì)，初 始電位設(shè)為OmV，折回電位設(shè)為+600mV，掃描速度設(shè)為50mV/s，測定工作電極的循環(huán)伏安曲 線。
[0068] 在本發(fā)明的其中一個實施例中，作為優(yōu)選，所述PCR反應(yīng)的條件為:退火溫度60°C， 延伸時間90s，循環(huán)次數(shù)25次。
[0069] 在本發(fā)明的其中一個實施例中，作為優(yōu)選，步驟二中，所述待檢測樣品組織為魚鰭 或魚肉。
[0070] 在本發(fā)明的其中一個實施例中，作為優(yōu)選，所述電化學(xué)活性標(biāo)記分子為二茂鐵，所 述錨定標(biāo)記分子為生物素。
[0071] 在本發(fā)明的其中一個實施例中，作為優(yōu)選，檢測到所述電化學(xué)活性標(biāo)記分子的電 化學(xué)信號指檢測到呈現(xiàn)所述電化學(xué)活性標(biāo)記分子的氧化還原峰。
[0072] 各引物序列如下：
[0077] SEQ ID NO:5：CAGTGGAGGCTGACTACAACAA
[0078] SEQ ID NO:6：GATGCCTGCGAACTTAGGGAA
[0079] 實施例1
[0080] 1.基因組DNA提取
[0081] 取鰭條或肌肉組織約lOOmg，使用海洋動物基因組DNA提取試劑盒（天根DP324- 03)，按照說明書步驟提取基因組DNA，溶于100yL滅菌去離子水，紫外分光光度計測定濃度。
[0082] 2.PCR 擴(kuò)增
[0083] 定制合成堿基序列如SEQIDN0:1-6所示引物（上海生工），其中SEQIDN0:1、3、5 引物5'端帶有二茂鐵修飾，SEQ ID N0:2、4、6引物5'端帶有生物素修飾。
[0084] 在3個PCR管中分別擴(kuò)增大西洋鮭特異性引物(SEQ ID N0:1-2)，虹鱒特異性引物 (SEQ ID N0:3-4)，通用引物（SEQ ID N0:5-6)，PCR反應(yīng)體系如下： 去離子水 12.7 μL_ 1..0Χ 1?} DMA. Polymerase 緩沖液 2:0 μ L MgCb (25mM) .1 ·2 μΙ_
[0085] dNTP (2mM) 2.0 pL Ta.q DNA Polymerase (5ιι/μL_) 0.1 pL 引物（上下游各10 μΜ) 1.0 μL 基因組DNA模板 1.0 μ!_
[0086] PCR程序為 94 °C 1 min 94 QC 30 S 60°C 30 S
[0087] 72 °C 90S 返回第2步，25個循環(huán) 72 °C 10 min 4°C 反應(yīng)終止
[0088] 3.電極表面修飾
[0089] 使用Au2〇3粉末對金電極進(jìn)行拋光，超聲波清洗5min，浸入納米金溶液(Sigma，梓檬 酸鈉還原氯金酸法制備，粒徑30nm)，+1.55V電位下沉積15min，靜置5min，滅菌去離子水清 洗。
[0090]電極表面浸入含lOmMa-硫辛酸的乙醇溶液活化20min，移入濃度為100g/L的EDC/ NHS混合液活化羧基，向電極表面滴加0.2g/L的親和素50yL，偶聯(lián)30min，去離子水洗脫未結(jié) 合親和素。超凈臺風(fēng)干后可4°C長期保存，12個月內(nèi)均可用于檢測。短期保存可置于室溫pH 7.0磷酸緩沖液中。
[0091 ]將3管PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，分別滴加在3支修飾電極表面，37°C溫育30min。
[0092] 將DNA修飾電極浸入pH 7. OTris-EDTA緩沖液，洗脫5min，換新的緩沖液重復(fù)2次。 [0093] 4.電化學(xué)信號檢測
[0094]采用三電極測試系統(tǒng)，以DNA修飾電極為工作電極，鉬絲(直徑1mm)為對電極，Ag/ AgCl為參比電極，20mL pH 7.0磷酸緩沖溶液為支持電解質(zhì)，分別測定3支電極的循環(huán)伏安 曲線，初始電位設(shè)為OmV，折回電位設(shè)為+600mV，掃描速度設(shè)為50mV/s，記錄3個循環(huán)中的第3 個。
[0095] 大西洋鮭樣品檢測結(jié)果如圖5所示，黑色細(xì)實線表示大西洋鮭引物擴(kuò)增產(chǎn)物修飾 電極信號，紅色粗虛線表示虹鱒引物擴(kuò)增產(chǎn)物修飾電極信號，藍(lán)色點線表示通用引物擴(kuò)增 產(chǎn)物修飾電極信號，大西洋鮭引物和通用引物電極均呈現(xiàn)明顯的氧化還原峰，而虹鱒引物 電極無氧化還原峰。
[0096] 虹鱒樣品檢測結(jié)果如圖6所示，黑色細(xì)實線表示大西洋鮭引物擴(kuò)增產(chǎn)物修飾電極 信號，紅色粗虛線表示虹鱒引物擴(kuò)增產(chǎn)物修飾電極信號，藍(lán)色點線表示通用引物擴(kuò)增產(chǎn)物 修飾電極信號，虹鱒引物和通用引物電極均呈現(xiàn)明顯的氧化還原峰，而大西洋鮭引物電極 無氧化還原峰。
[0097] 這里說明的模塊數(shù)量和處理規(guī)模是用來簡化本發(fā)明的說明的。對本發(fā)明的用于鑒 別大西洋鮭和虹鱒的生物傳感檢測方法的應(yīng)用、修改和變化對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯 而易見的。
[0098] 盡管本發(fā)明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列 運用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地 實現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限 于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的圖例。
【主權(quán)項】
1. 一種用于鑒別大西洋鮭和虹鱒的生物傳感檢測方法，其特征在于，包括如下步驟： 步驟一、提取待檢測樣品的基因組DNA，利用大西洋鮭特異性引物對，以所述待檢測樣 品的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到待檢測樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物I，且大西洋鮭特異性 引物對各自分別于堿基序列的上游帶有電化學(xué)活性標(biāo)記分子和錨定標(biāo)記分子； 步驟二、將步驟一中得到的所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加于修飾有錨定受體的電極表面進(jìn)行反 應(yīng)，所述錨定標(biāo)記分子可被所述錨定受體捕獲，以使帶有錨定標(biāo)記分子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物被電 極表面捕獲;和 步驟三、檢測所述電化學(xué)活性標(biāo)記分子的電化學(xué)信號，若存在所述電化學(xué)標(biāo)記分子的 電化學(xué)信號，則所述待檢測樣品來自于大西洋鮭。2. 如權(quán)利要求1所述的用于鑒別大西洋鮭和虹鱒的生物傳感檢測方法，其特征在于，所 述大西洋鮭特異引物對為如SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所示的堿基序列。3. 如權(quán)利要求1所述的用于鑒別大西洋鮭和虹鱒的生物傳感檢測方法，其特征在于，還 包括： 步驟四、以步驟一中得到的所述待檢測樣品的基因組DNA為模板，利用虹鱒特異性引物 對，以所述待檢測樣品的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到待檢測樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 Π ，其中，所述虹鱒特異性引物對也各自分別于堿基序列的上游帶有電化學(xué)活性標(biāo)記分子 和錨定標(biāo)記分子； 步驟五、將步驟四中得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Π 加入到一新的所述修飾有錨定受體的電極 表面進(jìn)行反應(yīng)； 步驟六、檢測所述電化學(xué)活性標(biāo)記分子的電化學(xué)信號，若存在所述電化學(xué)標(biāo)記分子的 電化學(xué)信號，則所述待檢測樣品來自于虹鱒； 若在步驟六中未檢測到所述電化學(xué)活性標(biāo)記分子的電化學(xué)信號，而在步驟三中檢測到 所述電化學(xué)活性分子標(biāo)記的電化學(xué)信號，則所述待檢測樣品來自于大西洋鮭。4. 如權(quán)利要求3所述的用于鑒別大西洋鮭和虹鱒的生物傳感檢測方法，其特征在于，虹 鱒特異性引物對為如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的堿基序列。5. 如權(quán)利要求1所述的用于鑒別大西洋鮭和虹鱒的生物傳感檢測方法，其特征在于，還 包括： 步驟七、以步驟一中得到的所述待檢測樣品的基因組DNA為模板，利用如SEQ ID N0:5 和SEQ ID N0:6所不的喊基序列的通用引物對，以所述待檢測樣品的基因組DNA為_旲板進(jìn)tx PCR反應(yīng)，得到待檢測樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物m，其中，所述通用引物對也各自分別于堿基序列 的上游帶有電化學(xué)活性標(biāo)記分子和錨定標(biāo)記分子； 步驟八、將步驟七中得到的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物m加到另一所述修飾有錨定受體的電極表面 進(jìn)行反應(yīng)； 步驟九、檢測所述電化學(xué)活性標(biāo)記分子的電化學(xué)信號，若存在所述電化學(xué)標(biāo)記分子的 電化學(xué)信號，則表明反應(yīng)體系正常，鑒別結(jié)果可信，若未檢測到所述電化學(xué)活性標(biāo)記分子的 電化學(xué)信號，則表明反應(yīng)體系異常，鑒別結(jié)果不可信。6. 如權(quán)利要求1、3或5任一所述的用于鑒別大西洋鮭和虹鱒的生物傳感檢測方法，其特 征在于，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加到修飾有錨定受體的電極表面進(jìn)行反應(yīng)的步驟包括： 1)將獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，滴加到修飾的電極表面中，于溫度37°C下反應(yīng)30min進(jìn)行錨 定反應(yīng)； 2) 對電極表面未結(jié)合的分子進(jìn)行洗脫，洗脫條件為利用pH 7.0的Tris-EDTA緩沖液洗 脫3次，每次洗脫5min; 3) 以鉑絲為對電極，以Ag/AgCl為參比電極，pH 7.0磷酸緩沖液為支持電解質(zhì)，初始電 位設(shè)為OmV，折回電位設(shè)為+600mV，掃描速度設(shè)為50mV/s，測定工作電極的循環(huán)伏安曲線。7. 如權(quán)利要求1、3或5任一所述的用于鑒別大西洋鮭和虹鱒的生物傳感檢測方法，其特 征在于，所述PCR反應(yīng)的條件為:退火溫度60°C，延伸時間90s，循環(huán)次數(shù)25次。8. 如權(quán)利要求1所述的用于鑒別大西洋鮭和虹鱒的生物傳感檢測方法，其特征在于，步 驟二中，所述待檢測樣品組織為魚鰭或魚肉。9. 如權(quán)利要求1所述的用于鑒別大西洋鮭和虹鱒的生物傳感檢測方法，其特征在于，所 述電化學(xué)活性標(biāo)記分子為二茂鐵，所述錨定標(biāo)記分子為生物素。10. 如權(quán)利要求1所述的用于鑒別大西洋鮭和虹鱒的生物傳感檢測方法，其特征在于， 檢測到所述電化學(xué)活性標(biāo)記分子的電化學(xué)信號指檢測到呈現(xiàn)所述電化學(xué)活性標(biāo)記分子的 氧化還原峰。
【文檔編號】G01N27/48GK106018523SQ201610605038
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月27日
【發(fā)明人】趙紫霞, 張瀚元, 徐桂彩
【申請人】中國水產(chǎn)科學(xué)研究院