一種中國大鯢趾骨切片的制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種中國大鯢趾骨切片的制備方法及應(yīng)用，采用大鯢趾骨第二關(guān)節(jié)作為切片材料，通過取樣、硬化、脫鈣、切片、染色、脫水透明，制得一種中國大鯢趾骨切片，本發(fā)明采用大鯢趾骨第二關(guān)節(jié)作為切片材料，與第一和第三關(guān)節(jié)相比，該部分長度較長，而且粗細較為均勻，易于固定和觀察切面輪廓。在染色方法上面，根據(jù)以往各種染色方法步驟的特點，本研究特異性的采用了不同的步驟組合，使組織顯色更清晰，增加無水乙醇浸泡和二甲苯，提高了顯色的結(jié)果。
【專利說明】—種中國大鯢趾骨切片的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域，具體涉及一種中國大鯢趾骨切片的制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]年齡鑒定是研究動物種群生態(tài)學(xué)的重要基礎(chǔ)，動物的個體生長、種群的補充和死亡計算，都需要有精確的年齡數(shù)據(jù)。動物年齡鑒定具有較長的研究歷史。骨齡學(xué)鑒定方法是基于動物骨骼切片上可數(shù)的生長線(lines of arrested growth,LAGs)進行的年齡結(jié)構(gòu)分析。早在18世紀，科學(xué)家就開始利用魚類的骨質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定魚類年齡。利用其硬骨組織上的輪紋鑒定年齡是最為傳統(tǒng)和常用的方法。骨質(zhì)結(jié)構(gòu)上年輪鑒定是基于以下理論:夏季魚類大量攝取營養(yǎng)物質(zhì)，生長十分迅速，而在冬季魚類由于缺少食物，其生長速度就緩慢下來，甚至停滯。這種生長規(guī)律具體反映在骨質(zhì)結(jié)構(gòu)上，即春夏季魚類生長十分迅速，在骨質(zhì)上形成許多同心圈，而且呈現(xiàn)較為寬松狀況，稱為“疏帶”，而到了秋冬季節(jié)，生長緩慢甚至停滯，則在骨質(zhì)上形成較窄的同心圈，稱為“密帶”，疏帶和密帶結(jié)合起來構(gòu)成生長帶，這樣，每年就形成一個生長輪帶，也就是一個年齡帶或者一個年輪。鑒定年輪時，以秋冬季形成的密帶和翌年春夏季形成的疏帶之間的分界線為年齡標志。
[0003]中國大鯢的年齡鑒定到目前還未見報道，查閱其它兩棲類的年齡鑒定發(fā)現(xiàn)有用各年齡頭體長的相關(guān)性得出鑒定年齡的形態(tài)學(xué)標準，但多是利用骨骼進行的，然而對于無尾兩棲類和有尾兩棲類其方法也不完全通用，結(jié)果有差異。大鯢作為一種重要的保護性經(jīng)濟動物，關(guān)于其生物學(xué)特征已有較多研究，但是關(guān)于其年齡鑒定仍屬于空白。年齡作為種群研究的重要基礎(chǔ)之一，它對于一個物種最長壽命、死亡率、生長特點、性成熟等種群生態(tài)研究具有重要的意義，尤其在大鯢野生種群下降，人工養(yǎng)殖種群迅速增加的情況下，如何準確且盡量無損傷的鑒定大鯢年齡，為大鯢種群生物學(xué)研究提供基礎(chǔ)資料，是非常重要且有意義的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供了一種中國大鯢趾骨切片的制備方法，該方法準確、穩(wěn)定易于操作。比較起傳統(tǒng)的石蠟切片方法，冷凍切片方法步驟簡單，所用的時間短。
[0005]本發(fā)明的另一個目的在于提供了一種中國大鯢趾骨切片的制備方法的應(yīng)用。利用本發(fā)明所述方法制得的切片，染色清晰，骨齡條帶清楚，年齡判定準確。
[0006]為了達到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施:
[0007]一種中國大鯢趾骨切片的制備方法，步驟如下:
[0008](I)取樣:將中國大鯢趾骨置于波恩氏液(Bouin’ s)在常溫(20_25°C)中固定12h-72h。
[0009]所述的波恩氏液配方為:苦味酸75ml,無水甲醒25ml和冰醋酸3ml混合搖勻。
[0010](2)硬化:將固定的樣本放在80% (V/V)的乙醇中硬化10?15h。[0011](3)脫鈣:將處理好的樣本放在3% (W/V)的硝酸溶液中脫鈣18?26h。再自來水流水沖洗2?4h去酸。最后再用30% (W/V)蔗糖浸泡5h-10h，主要是為了使組織沉降而變
得更均一。
[0012](4)切片:取趾骨第二關(guān)節(jié)用OTC組織包埋劑(opt1-mum cutting temperaturecompound,聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物)冷凍包埋至完全凍結(jié)，然后放在冷凍切片機載物臺上固定，將固定好的樣品切成15?25 μ m的厚度，粘貼到載玻片上進行貼片固定，置于37°C烘箱內(nèi)烘烤2h使其充分貼片。
[0013](5)染色:將切好的片子，用蘇木精染色5min后，用0.8% (V/V)鹽酸乙醇浸泡IOsec,自來水沖洗2min,再用伊紅染色3min,自來水沖洗I?2min。
[0014](6)脫水透明:將染色的片子依次在50% (V/V)和85% (V/V)的酒精中浸泡lOsec，然后在95% (V/V)的乙醇浸泡3min,接著無水乙醇浸泡3min, 二甲苯3min,既得一種中國大鯢趾骨切片。
[0015]以上所述的制備方法，步驟(3)中脫鈣時，對于幼齡大鯢，其骨骼鈣化程度較低，所以脫鈣時間短，而對年齡大的樣本則要增加脫鈣時間，因此脫鈣時間為18?26h不等，以針刺骨骼發(fā)現(xiàn)其軟化即可。
[0016]一種中國大鯢趾骨切片的制備方法的應(yīng)用，具體如下:
[0017]將制備好的切片置于顯微鏡下觀察，依據(jù)片子上的年輪標志數(shù)目鑒定年齡。由成骨細胞的細胞核形成的“環(huán)形”代表年輪，這樣的年輪標志數(shù)目代表年齡數(shù)。
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
[0019]本發(fā)明用固定液對中國大鯢趾骨進行固定，經(jīng)過預(yù)處理、脫鈣等步驟，選擇趾骨第二關(guān)節(jié)為材料，利用冷凍切片技術(shù)結(jié)合蘇木精伊紅染色對中國大鯢趾骨進行切片觀察，發(fā)現(xiàn)有類似年輪特征，并且“年輪”與其實際年齡相符，同時利用該方法在對未知年齡的大鯢進行年齡鑒定時也得到了證實。同時，本發(fā)明所述方法是非致死的，也可用于活體的大鯢年齡鑒定。
[0020]染色時利用鹽酸乙醇浸泡對組織片起分化作用。鹽酸在水中電離出氫離子，能使組織片電荷發(fā)生改變，使組織片過多吸附的染料，從組織中脫離，使不應(yīng)著色的顏色脫凈，應(yīng)著色的色彩變得更加清晰適中。
[0021]本研究采用大鯢趾骨第二關(guān)節(jié)作為切片材料，與第一和第三關(guān)節(jié)相比，該部分長度較長，而且粗細較為均勻，易于固定和觀察切面輪廓。在染色方法上面，根據(jù)以往各種染色方法步驟的特點，本研究特異性的采用了不同的步驟組合，比如利用0.8% (V/V)鹽酸乙醇浸泡蘇木精染色后的切片，使組織顯色更清晰，增加無水乙醇浸泡和二甲苯透明，都提高了顯色的結(jié)果。
[0022]比較起傳統(tǒng)的石蠟切片方法，冷凍切片方法步驟簡單，所用的時間短，從包埋到切片僅需要約Ih即可，而傳統(tǒng)方法中僅包埋到切片就需要3h ;其次，冷凍切片的方法所使用的包埋劑為OTC組織包埋劑，包埋方便且后續(xù)不需要再對其進行處理，而傳統(tǒng)的石蠟切片要用石蠟作為包埋劑，不僅要注意石蠟融化的時間和溫度，而且在包埋切片后還要再進行脫蠟的步驟；同時，相比石蠟切片，冷凍切片所需要的試劑和材料也少，而且在實驗過程中，對已知和未知年齡段大鯢的分析結(jié)果都可以看到清楚的骨齡。說明該方法有很高的操作性和重復(fù)性。【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為不同年齡大鯢骨骼切片結(jié)果示意圖。
[0024]其中同心圈表示的年齡環(huán)。上圖為4齡大鯢的切片結(jié)果，下圖為10齡大鯢的切片結(jié)果。
【具體實施方式】
[0025]本發(fā)明實施例所用實驗樣品，如未特別說明，均為已自然死亡的動物樣本，所用試劑均為生化公司購得。
[0026]實施例1:
[0027]一種中國大鯢趾骨切片的制備方法，其步驟如下:
[0028]I材料和方法
[0029]1.1用具和試劑
[0030]手術(shù)剪、鑷子、燒杯、玻片、冷凍切片機(Leica，德國)、冷凍切片包埋劑0TC(Leica，德國)，染色杯。
[0031]3%硝酸溶液，蘇木精染液，伊紅染液，0.8%鹽酸乙醇溶液。
[0032]1.2 方法
[0033]1.2.1以大鯢趾骨第二關(guān)節(jié)為研究對象制成切片，觀察大鯢年齡結(jié)果。
[0034]1.2.2取已知年齡大鯢樣本利用該方法進行年齡鑒定。
[0035]具體步驟如下:
[0036](I)取樣:將4齡中國大鯢趾骨樣本在常溫中置于波恩氏液(Bouin’s)中固定24h。波恩氏液配方為苦味酸75ml，無水甲醛25ml和冰醋酸3ml混合搖勻。
[0037](2)硬化:將固定的樣本放在80% (V/V)的乙醇中硬化12h。
[0038](3)脫鈣:將處理好的樣本放在3% (W/V)的硝酸溶液中脫鈣，脫鈣18h。再自來水流水沖洗3h去酸，最后再分別用30% (W/V)的蔗糖脫水5h。
[0039](4)切片:取趾骨第二關(guān)節(jié)用OTC組織包埋劑(opt1-mum cutting temperaturecompound,聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物)冷凍包埋30min，在冷凍切片機上將固定好的樣品切成25 μ m的厚度，后置于37°C烘箱內(nèi)烘烤2h使其充分貼片。
[0040](5)染色:將切好的片子，用蘇木精染色5min后，用0.8%(V/V)鹽酸乙醇浸泡IOsec后，自來水沖洗2min，再用伊紅染色3min，自來水沖洗Imin即可。
[0041]0.8% (V/V)鹽酸乙醇配法為:1ml濃鹽酸與99ml75%乙醇混勻即可。
[0042](6)脫水透明:將染色的片子依次在50% (V/V)和85% (V/V)的酒精中浸泡lOsec，然后在95% (V/V)的乙醇浸泡3min,接著無水乙醇浸泡3min, 二甲苯3min,既得4齡大鯛的趾骨切片。
[0043]實施例2:
[0044]—種中國大鯢趾骨切片的制備方法，其步驟如下:
[0045]I材料和方法
[0046]1.1用具和試劑
[0047]手術(shù)剪、鑷子、燒杯、玻片、冷凍切片機(Leica，德國)、冷凍切片包埋劑0TC(Leica，德國)，染色杯。
[0048]3%硝酸溶液，蘇木精染液，伊紅染液，0.8%鹽酸乙醇溶液。
[0049]1.2 方法
[0050]1.2.1以大鯢趾骨為研究對象制成切片,觀察大鯢年齡結(jié)果。
[0051]1.2.2取未知年齡大鯢樣本利用該方法進行年齡鑒定。
[0052]具體步驟如下:
[0053](I)取樣:將未知年齡大鯢趾骨在常溫中置于波恩氏液(Bouin’s)中固定72h。
[0054]波恩氏液配方為:苦味酸75ml，無水甲醛25ml和冰醋酸3ml混合搖勻。
[0055](2)硬化:將固定的樣本放在80% (V/V)的乙醇中硬化12h。
[0056](3)脫鈣:將處理好的樣本放在3% (W/V)的硝酸溶液中脫鈣，脫鈣26h。再自來水再自來水流水沖洗3h去酸，最后再分別用30% (W/V)的蔗糖脫水5h。
[0057](4)切片:取趾骨第二關(guān)節(jié)用OTC組織包埋劑(opt1-mum cutting temperaturecompound,聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物)冷凍包埋30min，在冷凍切片機上將固定好的樣品切成15 μ m的厚度，后置于37°C烘箱內(nèi)烘烤2h使其充分貼片。
[0058](5)染色:將切好的片子，用蘇木精染色5min后，用0.8%(V/V)鹽酸乙醇浸泡IOsec后，自來水沖洗2min，再用伊紅染色3min，自來水沖洗Imin即可。
[0059](6)脫水透明:將染色的片子依次在50% (V/V)和85% (V/V)的酒精中浸泡lOsec，然后在95% (V/V)的乙醇浸泡3min,接著無水乙醇浸泡3min, 二甲苯3min,既得大鯛的趾骨切片。
[0060]實施例3:
[0061]一種中國大鯢趾骨切片的制備方法的應(yīng)用，其步驟如下:
[0062]將實施例1和2中制備好的切片置于顯微鏡下觀察，依據(jù)片子上的年輪標志數(shù)目鑒定年齡。
[0063]從圖1中可以看出，利用本發(fā)明所述方法可以明顯看出在大鯢骨骼中存在一組同心圈，同心圈呈由蘇木精染色后顯示的藍黑色，輪廓明顯但會存在不完全閉合現(xiàn)象，圈內(nèi)相間部分呈現(xiàn)由伊紅和蘇木精共同顯示的深藍粉色。同心圈清晰可辨，也就是所謂的“骨齡”。利用本發(fā)明所述方法鑒定出已知年齡的骨齡與實際相同為4齡；而未知年齡的大鯢骨齡為10齡。
【權(quán)利要求】
1.一種中國大鯢趾骨切片的制備方法，步驟如下: (1)取樣:將中國大鯢趾骨置于波恩氏液在常溫中固定12h?72h； (2)硬化:將固定的樣本放在80%的乙醇中硬化IOh?15h； (3)脫鈣:將處理好的樣本放在3%的硝酸溶液中脫鈣18?26h，再自來水流水沖洗2?4h去酸,最后再用30%鹿糖浸泡5?IOh ； (4)切片:取趾骨第二關(guān)節(jié)用OTC組織包埋劑冷凍包埋至完全凍結(jié)，然后放在冷凍切片機載物臺上固定，將固定好的樣品切成15?25Mm的厚度，粘貼到載玻片上進行貼片固定，置于37 °C烘箱內(nèi)烘烤2h使其充分貼片； (5)染色:將切好的片子，用蘇木精染色5min后，用0.8%鹽酸乙醇浸泡lOsec，自來水沖洗2min，再用伊紅染色3min，自來水沖洗f 2min ； (6)脫水透明:將染色的片子依次在50%和85%的酒精中浸泡lOsec，然后在95%的乙醇浸泡3min,接著無水乙醇浸泡3min, 二甲苯3min,既得一種中國大鯛趾骨切片。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述波恩氏液配方為:苦味酸75ml，無水甲醒25ml和冰醋酸3ml混合搖勻。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，脫鈣時間的確定是以針刺骨骼發(fā)現(xiàn)其軟化即可。
4.權(quán)利要求1所述制備方法制得的切片在鑒定大鯢年齡中的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N1/30GK103884560SQ201410141842
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年4月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月10日
【發(fā)明者】孟彥, 劉小召, 肖漢兵, 田海峰, 胡喬木 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所