一種基于細胞水平測定乳酸菌抗氧化活性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于細胞水平測定乳酸菌抗氧化活性的方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 氧化應(yīng)激是由自由基的產(chǎn)生和內(nèi)在抗氧化系統(tǒng)消減之間不平衡導(dǎo)致的，在不同的 生理病理條件下起著重要作用，能夠破壞蛋白，導(dǎo)致DNA突變，氧化細胞膜磷脂以及低密度 脂蛋白的改性。過量的活性氧（Reactive Oxygen Species，R0S)能導(dǎo)致細胞內(nèi)的破壞，然 后進一步導(dǎo)致慢性疾病的發(fā)生：如動脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎、糖尿病、神經(jīng)變、心血管疾病以及 癌癥等。為了對抗氧化作用，人體通過自身合成抗氧化物質(zhì)和從食物中攝取抗氧化物質(zhì)，共 同建立生物抗氧化屏障。然而，在一些情況下這種抵御系統(tǒng)仍不能保護自身免于氧化應(yīng)激 的損傷，因此，增加抗氧化能力以此來保持健康仍需要不斷探索。
[0003] 聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織定義益生菌為一類活的微生物，當攝入足夠數(shù)量的時候能 夠傳達健康保健作用。目前，由于其能夠降低ROS的生成而對人體起到健康保健作用，已被 廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中并且被列入Generally Recognized as Safe (GRAS)。從這個角度來 看，發(fā)展有效的方法反應(yīng)乳酸菌的抗氧化作用，從而有效的測定其清除ROS的能力，能夠用 于形成新的益生菌產(chǎn)品或者添加劑從而起到抵御自由基和相關(guān)疾病的作用。
[0004] 目前對乳酸菌抗氧化活性的檢測主要采用分光光度計測定乳酸菌DPPH、羥自由基 清除率，還原能力，抑制脂質(zhì)過氧化能力來進行，這些常規(guī)的化學方法有幾個缺點：1.耗時 長，在樣品處理完成后，每個樣品仍需l-12h的反應(yīng)時間；2.用樣量多，每次需要用的樣品 量至少ImL ;3.重復(fù)性差，由于樣品在空氣中暴露時間長，樣品重復(fù)測量值間的變化較大； 4.實用性弱，操作繁瑣，每次只能夠測定少數(shù)菌群，不能夠批量測定；5.效果差，通常只適 用于幾種單一化學物質(zhì)抗氧化活性的比較，難以評價整個物質(zhì)的抗氧化效果，對于乳酸菌 來說并不適用；6.準確度低，沒有考慮到抗氧化成分在細胞內(nèi)的生物利用率，吸收和代謝 等情況，因此不能反應(yīng)細胞內(nèi)的生理條件。雖然動物模型和人體試驗可以更準確的反應(yīng)抗 氧化能力，但是這種試驗花費較高而且很費時間，關(guān)鍵是未來使用實驗動物將會更加困難。 因此這些常規(guī)測定乳酸菌抗氧化活性的方法已遠遠不能滿足種類繁多的乳酸菌科學研宄 的需要，盡管乳酸菌的抗氧化機理還沒有完全闡明，但是他們是活的微生物組織不同于純 化學物質(zhì)，他們清除腸道內(nèi)的氧化物質(zhì)或組織氧化物質(zhì)的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)腸道菌群，提高上皮細 胞的屏障，以及減少腸道炎癥的機理已經(jīng)建立。因此，考慮到乳酸菌復(fù)雜的抗氧化機理，必 須建立一種快速準確反應(yīng)乳酸菌體內(nèi)抗氧化能力的方法。本發(fā)明旨在提供一種能夠快速測 定乳酸菌抗氧化能力，反應(yīng)其菌體總抗氧化能力的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的為提供一種基于細胞水平的測定乳酸菌抗氧化能力的方法，結(jié)合細 胞-乳酸菌-熒光探針，通過全波頻熒光掃描酶標儀測定乳酸菌抑制熒光物質(zhì)形成的能力 來反映乳酸菌抗氧化能力。
[0006] 本發(fā)明技術(shù)方案主要包括以下步驟：
[0007] (1)培養(yǎng)細胞，所述細胞的酯酶能分解本身無熒光的2'，7'_二氯熒光黃雙乙酸鹽 (DCFH-DA)，形成DCFH，DCFH極易被氧自由基或活性氧氧化成強熒光的二氯熒光素（DCF)。
[0008] (2)建立不同濃度槲皮素抑制熒光物質(zhì)形成能力的標準曲線：用含DCFH-DA的 不同濃度槲皮素溶液預(yù)處理步驟⑴所得細胞，加入2, 2-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽 (ABAP)刺激DCFH氧化成強熒光的二氯熒光素（DCF)，在熒光酶標儀中進行掃描得到不同 時間的熒光值；以細胞培養(yǎng)基代替槲皮素溶液作為對照，以不加 ABAP的作為空白，扣除 空白后，槲皮素相比對照，熒光值對時間的積分面積所減少的比例為細胞抗氧化能力值 (CellularAntioxidant Activity，CAA)，以CAA值對槲皮素濃度作出不同濃度槲皮素抑制 熒光物質(zhì)形成能力的標準曲線。
[0009] (3)乳酸菌抗氧化能力的測定：將乳酸菌活化制備成菌懸液后，代替步驟（2)中使 用的槲皮素溶液，測定并計算CAA值；對照標準曲線，將CAA值轉(zhuǎn)化為槲皮素濃度值，以每 mL菌懸液的CAA值相當于槲皮素的微摩爾當量來表示乳酸菌的抗氧化能力。
[0010] 本發(fā)明所述乳酸菌包括：鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus)、嗜酸乳桿 菌（Lactobacillus acidophilus)、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)、干酪乳桿菌 (Lactobacillus casei)、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermenti)等常見食品用乳酸菌種 屬。
[0011] 步驟（1)所述細胞可是人肝癌細胞（Human hepatocellular carcinoma，HepG2)、 人結(jié)腸癌細胞Caco-2、人臍靜脈內(nèi)皮細胞EA. hy926或大鼠巨噬細胞RAW264. 7。將細胞培 養(yǎng)傳代至2-20代。
[0012] 步驟（3)所述懸液菌還可以替換為菌的代謝物，例如無細胞提取物和發(fā)酵上清液 等。
[0013] 在本發(fā)明的一種實施方式中，步驟（2)所述標準曲線的建立，采用以下步驟：
[0014] ①精確稱取懈皮素[4H-1-Benzopyran_4-0ne，2_ (3, 4-dihydroxyphenyl) _3, 5, 7-trihydroxy-Flavone]，用95%乙醇配制母液，并用不含抗生素和胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基 稀釋成2,4,8,16, 32,64 μ M的梯度濃度反應(yīng)液，得到槲皮素溶液；
[0015] ②在96孔板上以6Χ IO4個/孔的密度接種100 μ L含!fepG2細胞的DEME培養(yǎng) 基，培養(yǎng)24h后去除培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液清洗每個接種孔；然后每孔加入100 μ L的含 有25 μΜ的雙氯熒光黃乙酸乙酯的槲皮素溶液，在37°C、5% 0)2條件下繼續(xù)培養(yǎng)Ih ;取出 96孔板，用100 μ L磷酸鹽緩沖液清洗每個孔后，加入100 μ L溶解在Hank平衡鹽溶液的 600 μ M的2, 2-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽，將96孔板放入熒光酶標儀中進行掃描，保持恒溫 37°C，在波長538nm處激發(fā)，每5min在波長485nm處釋放測定，測定Ih內(nèi)熒光值的變化情 況；
[0016] ③以槲皮素預(yù)處理細胞的為槲皮素組，以DMEM培養(yǎng)基代替槲皮素溶液作為對照 組，以不加 ABAP的作為空白組，扣除空白后，槲皮素相比對照，熒光值對時間的積分面積所 減
[0017] 少的比例為細胞抗氧化能力值（Cellular Antioxidant Activity，CAA)，CAA計算 公式：
[0018] CAA (%) = {1-( / SA/ I CA)} X 100 %
[0019] 其中J SA表示槲皮素組的熒光值對時間曲線的積分面積，J CA表示對照組的熒 光值對時間曲線的積分面積；
[0020] ④以CAA值對槲皮素濃度作出不同濃度槲皮素抑制熒光物質(zhì)形成能力的標準曲 線。
[0021] 在本發(fā)明的一種實施方式中，步驟（3)乳酸菌的活化的方法是以1% (v/v)的接種 量將甘油管凍存的乳酸菌接種到MRS培養(yǎng)基中，在37°C條件下培養(yǎng)20h后再以同樣的接種 量轉(zhuǎn)接一次。
[0022] 在本發(fā)明的一種實施方式中，步驟（3)菌株活化后，以1 %接種量接種于MRS液體 培養(yǎng)基，37°C靜置培養(yǎng)20h，離心收集菌體，收集的菌體經(jīng)磷酸鹽緩沖液洗滌3次，重懸于磷 酸鹽緩沖液中，調(diào)整菌濃，備用。
[0023] 細胞酯酶分解本身無熒光的指示劑混合物2'，7'二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA) 形成的DCFH極易被氧自由基或活性氧氧化成熒光物二氯熒光素（DCF)，2, 2異丁基脒二鹽 酸鹽（ABAP)分散在細胞中并自發(fā)分解形成過氧化自由基R00*，可以刺激DCFH產(chǎn)生具有熒 光信號的DCF。乳酸菌菌體可在細胞膜外部結(jié)合氧自由基而阻止其進入細胞，或者在細胞膜 內(nèi)部與R0S*和R00*結(jié)合而阻斷DCFH氧化成DCF的過程，從而減少DCF的形成，使得熒光 酶標儀讀出來的熒光信號降低，表現(xiàn)為乳酸菌導(dǎo)致的熒光值面積降低。
[0024] 本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果如下：
[0025] 1更加接近機體內(nèi)的生理狀況。由于該方法建立在細胞水平上，充分考慮到了抗氧 化成分在細胞內(nèi)的生物利用率、吸收和代謝等情況；
[0026] 2需時短。不需要進行動物實驗和人體試驗，在樣品處理完成后，每個樣品僅需 lh，花費時間遠低于動物實驗和人體試驗所耗時間；
[0027] 3用樣量少。每次需要用的樣品量僅為100uL，不到常規(guī)方法的1/10 ;
[0028] 4重復(fù)性好。由于樣品測量快速，在空氣中暴露時間短，樣品重復(fù)測量值間的變化 較小，重復(fù)性好；
[0029] 5實用性強。能夠批量地對多株菌株同時進行測定，非常適用于種類繁多的乳酸菌 不同菌株抗氧化能力的比較研宄。
[0030] 本發(fā)明是一種基于細胞水平能夠快速準確測定乳酸菌抗氧化能力的方法，通過這 種技術(shù)可快速、高效地對不同種屬的乳酸菌抗氧化能力進行研宄，對乳酸菌抗氧化性研宄 具有重要的意義。
【附圖說明】
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