專利名稱：選擇性電融合至少兩個(gè)具有細(xì)胞樣膜的融合配偶體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于對具有細(xì)胞樣膜的至少兩個(gè)融合配偶體進(jìn)行選擇性電融合的方法。
背景技術(shù)：
電融合業(yè)已發(fā)展成為極其有效的融合哺乳動物細(xì)胞的方法，這主要是因?yàn)樗臏睾蜅l件，它能得到大量有生活力的融合產(chǎn)物[例如，參見White，K.L.1995，哺乳動物細(xì)胞的電融合，分子生物學(xué)方法，48，283-293]。對磷脂雙層膜施加電場，當(dāng)所施加的勢能達(dá)到或超過膜的裂解勢能時(shí)，會誘導(dǎo)孔的形成。因此，業(yè)已將電滲透技術(shù)用于多種生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，如通過電融合產(chǎn)生雜交瘤和新的細(xì)胞系[例如，參見Zimmermann，U.等，1985，電融合新型雜交技術(shù)，優(yōu)勢生物技術(shù)進(jìn)展479-150；Neil，G.A.等，1993，電融合，酶學(xué)方法，220，174-196；Glassy，M.1988，產(chǎn)品綜述通過電融合產(chǎn)生雜交瘤，自然，333，579-580]，體外受精[例如，參見Ogura，A.等，1995，精子細(xì)胞作為雄配子，繁殖受精發(fā)育，7，155-159]，克隆實(shí)驗(yàn)[例如，參見VanStekelenburg-Hamers，A.E.P.等，1993，在牛的體外成熟的/體外受精的胚胎中進(jìn)行核轉(zhuǎn)移和電融合培養(yǎng)基和電融合參數(shù)的作用，分子繁殖發(fā)育，36，307-312]，為了導(dǎo)入細(xì)胞臨時(shí)的溶質(zhì)而進(jìn)行的細(xì)胞電穿孔[例如，參見電穿孔用于操縱細(xì)胞和組織的一般現(xiàn)象，細(xì)胞生物化學(xué)雜志，51426-435；Li，H.等，1997，通過電穿孔轉(zhuǎn)染大鼠腦細(xì)胞，神經(jīng)科學(xué)方法雜志，75，29-32；Lundqvist，J.A.等，1998，通過超微電極改變單個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞器的生物化學(xué)狀態(tài)，美國科學(xué)院院報(bào)，95，10356-10360]，和用于增加包括蛋白在內(nèi)的膜相關(guān)大分子的電插入[例如，參見Mouneimne，Y.等，1989，將異種-血型糖蛋白電插入到紅血細(xì)胞膜中，生物化學(xué)生物物理學(xué)研究通訊，159，24-40]。體內(nèi)電融合的應(yīng)用包括將來自人HL60細(xì)胞的淋球菌結(jié)合受體整合到兔角膜上皮組織上，作為人專一性病原體的活的模型[例如，參見Heller，R.，1990，通過體內(nèi)細(xì)胞組織電融合將人細(xì)胞結(jié)合到完整的動物組織中轉(zhuǎn)移人膜表面成分，生物化學(xué)生物物理學(xué)學(xué)報(bào)，185-188]。
電場誘導(dǎo)的融合被廣泛應(yīng)用于懸浮的細(xì)胞群體的生物學(xué)研究。首先通過施加低幅度、高頻率交流電場通過介電泳讓細(xì)胞接觸，然后通過一個(gè)強(qiáng)而短促的直流脈沖使一部分細(xì)胞融合。與大量細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模的電融合可用于產(chǎn)生并篩選新的細(xì)胞系，但不能用于以高的精確度融合單細(xì)胞。這會導(dǎo)致來自相同細(xì)胞系的細(xì)胞之間的不希望的融合，以及來自不同細(xì)胞系的細(xì)胞之間的希望的融合。另外，大規(guī)模電融合不能夠控制要融合在一起的細(xì)胞的數(shù)量，這會導(dǎo)致不希望有的雙核至多核融合產(chǎn)物的出現(xiàn)。
發(fā)明概述通常需要選擇性地和可操縱地改變單細(xì)胞的生物化學(xué)和遺傳學(xué)特性。為了解決這種挑戰(zhàn)并克服大規(guī)模融合的缺陷，本發(fā)明人業(yè)已開發(fā)了一次將一對細(xì)胞融合在一起的技術(shù)?？刹倏v地將單細(xì)胞融合在一起的能力代表了這樣一種技術(shù)，通過這種技術(shù)可以精確地操縱特定細(xì)胞的長期遺傳學(xué)性質(zhì)和表型，并提供了產(chǎn)生雜合的和克隆的細(xì)胞的組合文庫的新的克隆。通過與有效的測定和成像技術(shù)結(jié)合，可以詳細(xì)研究單細(xì)胞的遺傳學(xué)和生物化學(xué)性質(zhì)。
細(xì)胞特性的改變還可以通過將合成的磷脂小泡與所需要的小泡成分和膜的組成與靶細(xì)胞融合在一起而實(shí)現(xiàn)。該技術(shù)可用于改變單細(xì)胞的成分和膜特性。例如，可以將在脂質(zhì)體中重建的膜蛋白導(dǎo)入細(xì)胞質(zhì)膜中。這種選擇性地轉(zhuǎn)移單細(xì)胞的膜組成的能力預(yù)期具有生物學(xué)用途，如導(dǎo)入表面受體，以便篩選潛在的配體和相關(guān)的藥用化合物。
因此，本發(fā)明提供了一種用于選擇性電融合諸如細(xì)胞和脂質(zhì)體的細(xì)胞結(jié)構(gòu)的新的方法。該方法具有以下優(yōu)點(diǎn)細(xì)胞選擇，以高的空間分辨率融合粘接細(xì)胞結(jié)構(gòu)，提供了產(chǎn)生復(fù)雜的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的可能性。由于電融合是一種溫和的方法，這種小型化的形式可用于，例如，在單細(xì)胞水平上進(jìn)行克隆，并用于體外受精。特別是對于克隆實(shí)驗(yàn)來說，大規(guī)模電融合的缺陷通過本發(fā)明的技術(shù)得到克服，因?yàn)樗梢匀婵刂迫诤线^程以及有關(guān)需要產(chǎn)生的體細(xì)胞的性質(zhì)的任何疑問。另外，該方法優(yōu)選與微機(jī)芯片技術(shù)結(jié)合，可用于產(chǎn)生克隆細(xì)胞或雜合細(xì)胞的篩選文庫。
通過以下說明和所附權(quán)利要求書可以了解本發(fā)明的特征。
附圖簡述下面的說明書和實(shí)施例是結(jié)合附圖進(jìn)行的，其中

圖1是表示實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的示意圖。將來自懸浮液的細(xì)胞1、2添加到安裝在聚碳酸酯支架上的顯微鏡蓋玻片3上。所述細(xì)胞要么通過光學(xué)捕獲(MOPA激光4)預(yù)先排列在一起或者通過高精度顯微操作器7操縱的微電極5，6簡單地將其推到一起。為了進(jìn)行熒光成像和光學(xué)捕獲，將兩個(gè)共線性激光束送入顯微鏡目鏡9中；用氬離子激光10(黑色，細(xì)箭頭)激發(fā)熒光素，并將MOPA二極激光4(黑色粗箭頭)用于光學(xué)捕獲。將所得到的熒光和明視野圖象引導(dǎo)至CCD照相機(jī)11中。
圖2A-C表示用微電極對脂質(zhì)體和特定細(xì)胞的排列，而圖2D-E表示與細(xì)胞接觸的6個(gè)含有熒光素(10μM)的脂質(zhì)體。如圖2G所示，沒有檢測到所得到背景熒光，這說明可以將藥物選擇性地輸送到表面(脂質(zhì)體的電滲透)或內(nèi)部(細(xì)胞和脂質(zhì)體之間的電融合)。
圖3A-D表示細(xì)胞-細(xì)胞融合過程。圖3A表示在介電泳(0.3-3kV/厘米，2MHz)期間的PC12細(xì)胞。圖3B表示通過最后的融合脈沖(每一次有6個(gè)持續(xù)1毫秒的脈沖，3kV/厘米)啟動的融合，這種融合表現(xiàn)為細(xì)胞之間的較寬的和較平的接觸區(qū)。圖3C(在融合脈沖之后大約1分鐘)和圖3D(在融合脈沖之后大約2分鐘)表示隨后細(xì)胞之間融合區(qū)的變寬，表明完全的融合。
圖4A-C表示在磷脂酰膽堿(PC)脂質(zhì)體(左)與COS7細(xì)胞(右)電融合(8kV/厘米4毫秒)之前(圖4A)、期間(圖4B)和之后(圖4C)拍攝的明視野圖象。圖4D-E表示NG-108細(xì)胞(用蛋白酶處理30分鐘)與含有整合的γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶(γ-GT)的PC脂質(zhì)體之間的融合。在圖4E中，可以看出微電極是如何從細(xì)胞上輕輕拔出來的以及脂質(zhì)體(與微電極連接)被拉伸但沒有與細(xì)胞分離。
圖5表示本發(fā)明方法的臨床應(yīng)用的一個(gè)例子，其中，將大腦中的單細(xì)胞或多細(xì)胞電融合，以便整合其他融合配偶體的成分。所述融合配偶體是通過空心電極輸送的。所述電極是用立體有規(guī)裝置定位的，在附圖中通過Cartesian坐標(biāo)系統(tǒng)和立體有規(guī)顯微定位器表示。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種用于選擇性電融合至少兩種具有兩種細(xì)胞樣膜的融合配偶體的方法，包括以下步驟A)使融合配偶體彼此接觸，和B)對所述配偶體施加足于實(shí)現(xiàn)融合的強(qiáng)度的電場并將電場高度聚焦在融合配偶體上。
所述具有細(xì)胞樣膜的至少兩個(gè)融合配偶體優(yōu)選具有細(xì)胞或亞細(xì)胞尺寸的結(jié)構(gòu)?！凹?xì)胞或亞細(xì)胞尺寸的結(jié)構(gòu)”這一說法特別涉及生物學(xué)結(jié)構(gòu)，如獨(dú)立的細(xì)胞和較小的結(jié)構(gòu)，但還涉及相似的人工結(jié)構(gòu)。因此，融合配偶體可以彼此是獨(dú)立的，單細(xì)胞，脂質(zhì)體，蛋白脂質(zhì)體，合成小泡，植物原生質(zhì)體，卵細(xì)胞，精細(xì)胞或精原細(xì)胞以及無核卵細(xì)胞。
如上文所述，讓融合配偶體彼此接觸。這意味著將其放置成使融合配偶體的外表面接觸，或者將融合配偶體放在彼此間隔很小的距離上。
在大多數(shù)情況下，本發(fā)明的方法可用于融合兩個(gè)融合配偶體，下面稱之為融合配偶體I和融合配偶體II，不過，還可以融合一個(gè)以上的融合配偶體。在某些場合下，特別感興趣的是融合兩個(gè)以上的配偶體，例如，產(chǎn)生具有兩個(gè)以上細(xì)胞核的多核細(xì)胞，或者用于當(dāng)一個(gè)配偶體的體積遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于另一個(gè)的體積的場合。這種用途的一個(gè)例子是當(dāng)希望將小泡中所包含的物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞中時(shí)的情況。在這種情況下，融合配偶體I是細(xì)胞，而融合配偶體II是若干個(gè)較小的小泡。
另外，可以重復(fù)本發(fā)明的方法一次或若干次，以便將一個(gè)新的融合配偶體融合到兩個(gè)已經(jīng)融合的融合配偶體上，在制備克隆細(xì)胞和雜合細(xì)胞的組合文庫時(shí)這一點(diǎn)是特別重要的。
當(dāng)融合配偶體I是細(xì)胞而融合配偶體II是單個(gè)脂質(zhì)體時(shí)，它們的融合既可以將脂質(zhì)體的內(nèi)含物導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)部，又可以將來自脂質(zhì)體膜的脂類和膜蛋白添加到細(xì)胞表面上。這種細(xì)胞-脂質(zhì)體融合代表了操縱單細(xì)胞的膜內(nèi)含物和表面特性的一種新方法。
為了將諸如細(xì)胞、脂質(zhì)體或另一種相似結(jié)構(gòu)的融合配偶體I與諸如細(xì)胞、脂質(zhì)體或類似結(jié)構(gòu)的融合配偶體II融合，必須讓這兩個(gè)融合配偶體彼此接近，即彼此接觸。兩個(gè)融合配偶體在融合之前彼此接近這一事實(shí)，使得能夠避免介電泳，而介電泳通常被用于在細(xì)胞之間產(chǎn)生密切接觸。不過，介電泳可用于成功地與本發(fā)明組合，以便在施加直流電場融合脈沖之前產(chǎn)生并建立密切的細(xì)胞-細(xì)胞接觸。從機(jī)械角度講，融合配偶體之間的密切接觸可以用任何合適方式實(shí)現(xiàn)。為了對齊而對兩個(gè)融合配偶體所做的單一的操作都有利于這種對齊，例如，使用高度聚焦的激光束光學(xué)捕獲可以根據(jù)需要操作并移動單細(xì)胞，以及其他生物學(xué)結(jié)構(gòu)，包括較小體積的細(xì)胞器[這方面的內(nèi)容以前已經(jīng)公開，例如，參見Jaroszeski，M.J.等，1994，機(jī)械促進(jìn)的細(xì)胞-細(xì)胞電融合，生物物理學(xué)雜志，67，1574-1582；Uchida，M.等，1995，通過光學(xué)捕獲進(jìn)行完整細(xì)胞操作，當(dāng)代生物學(xué)，5，380-382；Chiu，D.T.等，1998，通過毛細(xì)電泳檢測單一的分泌小泡，科學(xué)，2791190-1193]。如下文所述，當(dāng)把電極用于定位融合配偶體時(shí)，可以通過用電極頂端移動融合配偶體調(diào)整其位置而將兩個(gè)融合配偶體對齊。為了移動電極，優(yōu)選使用一臺顯微鏡，至少一個(gè)顯微定位器和/或一個(gè)立體有規(guī)裝置。為了進(jìn)一步方便兩個(gè)融合配偶體的定位，優(yōu)選在實(shí)施步驟A之前將融合配偶體中的一個(gè)固定，當(dāng)使用電極時(shí)，例如，這一目的可以通過將融合配偶體的至少一個(gè)可逆地粘接在至少一個(gè)微電極上而實(shí)現(xiàn)的。在某些場合下，使用介電泳在融合之前對兩個(gè)對齊的細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理可能是有利的。這一目的是通過將所述電極與一個(gè)交流電場掃描功能發(fā)生器連接而實(shí)現(xiàn)的。
所述電場可以根據(jù)所使用的電極和其他實(shí)驗(yàn)參數(shù)通過使用低電壓或高電壓脈沖發(fā)生器而獲得。該電壓發(fā)生器被用于產(chǎn)生足于導(dǎo)致兩個(gè)融合配偶體融合的強(qiáng)度的電場，大約為0.1-10kV/厘米，持續(xù)10微秒至數(shù)秒。在融合配偶體的膜上測定的電壓應(yīng)當(dāng)為數(shù)毫伏至數(shù)伏，優(yōu)選大約1.5伏。對于多電壓脈沖方法來說，我們發(fā)現(xiàn)大約1Hz的脈沖重復(fù)是合適的，不過，其他的重復(fù)頻率也很有效。對于較長的脈沖持續(xù)時(shí)間來說相應(yīng)的應(yīng)當(dāng)使用較低頻率的脈沖頻率。在任何情況下，脈沖的長度和強(qiáng)度取決于被融合的配偶體的大小。融合脈沖優(yōu)選具有矩形波形，但其他波形同樣有效，包括各種交流電場脈沖方法。對于介電泳來說，掃描功能發(fā)生器優(yōu)選產(chǎn)生一個(gè)交流電場，正弦波形，電場強(qiáng)度為100伏/厘米-5Kv/厘米，100Hz-2MHz。
在步驟B中所使用的用于實(shí)現(xiàn)融合的電場應(yīng)當(dāng)是高度聚焦的，以避免影響任何周圍的結(jié)構(gòu)，并獲得本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。為了將電場聚焦，優(yōu)選通過使用靠近兩個(gè)融合配偶體放置的一個(gè)或兩個(gè)微電極提供電場，即距離細(xì)胞膜0-10微米，優(yōu)選0-5微米。在使用單電極的情況下，該電極優(yōu)選是偏向陽性的(陽極)，并針對接地細(xì)胞制劑工作。根據(jù)本發(fā)明，所述微電極優(yōu)選為細(xì)胞與亞細(xì)胞大小的電極。電極末端的外部尺寸優(yōu)選位于接近融合配偶體處，距離數(shù)納米至大約100微米，更優(yōu)選大約5-30微米，最優(yōu)選大約20微米。電極可以由固體導(dǎo)電材料制成，或者可以是空心的，以便輸送所選擇的融合配偶體或化學(xué)制劑。電極可以由不同的材料制成。一種特殊類型的電極是空心的，并且是由融合的二氧化硅毛細(xì)管制成，這種類型的電極通常被用于毛細(xì)電泳和氣相層析分離。這些毛細(xì)管的內(nèi)部直徑通常為1-100微米，而外徑5-400微米，長度為數(shù)毫米至1米。對于細(xì)胞融合用途來說，用電解質(zhì)填充所述電極，優(yōu)選用生理緩沖液填充。當(dāng)在毛細(xì)管上施加足于誘導(dǎo)細(xì)胞融合的勢能時(shí)，在毛細(xì)管中會誘導(dǎo)電內(nèi)滲堆積流動，它與泊肅葉流(Pouiseille flow，毛細(xì)管內(nèi)的重力流)結(jié)合可用于將材料有效轉(zhuǎn)移到融合配偶體中。所述空心小孔融合二氧化硅毛細(xì)管還具有其他優(yōu)點(diǎn)，即添加到其入口末端的成分可以根據(jù)其電荷與摩擦牽引比例分離。該系統(tǒng)的這一特征可用于，例如，研究各種分離成分對細(xì)胞融合的影響。
另外，在步驟B之前優(yōu)選將兩個(gè)融合配偶體放置在電泳和緩沖液中。
為了促進(jìn)融合，優(yōu)選在實(shí)施步驟A之前對至少一個(gè)融合配偶體進(jìn)行預(yù)先電穿孔。
當(dāng)融合配偶體中的一個(gè)(或兩個(gè))是細(xì)胞時(shí)，例如，它可以是細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)或組織的一部分，以便研究細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，例如，特定細(xì)胞的生物化學(xué)特性的改變可能對整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的表型具有重大影響。
在圖1中示出了適合于實(shí)施本發(fā)明方法的裝置。在該圖中兩個(gè)融合配偶體1，2都是細(xì)胞，要被融合的細(xì)胞是從懸浮液中添加到聚碳酸酯支架上的蓋玻片3上的。
所述細(xì)胞是通過光學(xué)捕獲(MOPA激光4)預(yù)先對齊的或者通過受高精度顯微器7控制的微電極5，6簡單地將其推到一起。所述微電極優(yōu)選是碳纖維電極，最優(yōu)選碳纖維超微電極(直徑為5微米)或空心玻璃纖維電極。
用電壓發(fā)生器8提供所需要的電場。
為了進(jìn)行熒光成像和光學(xué)捕獲，用來自氬離子激光10的488納米光束(來自氬離子激光的光束用黑色細(xì)箭頭表示)激發(fā)熒光素，并用來自MOPA二極激光4的992納米的光束(來自氬離子激光的光束用黑色粗箭頭表示)進(jìn)行光學(xué)捕獲。
將所得到的熒光和明視野圖象引導(dǎo)到CCD相機(jī)11中。
該裝置還包括一個(gè)鏡片12，一個(gè)雙色分光裝置13，一個(gè)多色分光裝置14，鏡頭15，旋轉(zhuǎn)盤16和一個(gè)濾光器17。
本發(fā)明的方法適用于操縱單細(xì)胞或諸如細(xì)胞器的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的遺傳學(xué)特性和生物化學(xué)表面特性。特別適合的并且感興趣的是體外受精。還可將其用于若干其他用途中，如克隆，雜交瘤的產(chǎn)生，細(xì)胞膜組成的操縱和確定體積的物質(zhì)向細(xì)胞中的輸送(特別是將具有藥物活性的物質(zhì)輸送到細(xì)胞中)。
本發(fā)明的方法還適用于在單一類型細(xì)胞上患有生物化學(xué)缺陷的患者或動物體內(nèi)進(jìn)行電融合。
很多遺傳獲得的或非遺傳獲得的疾病會導(dǎo)致代謝紊亂。例如，由于Nigro-striatal途徑上的神經(jīng)原的退化所導(dǎo)致的帕金森病會導(dǎo)致在分離的細(xì)胞群體中產(chǎn)生多巴胺的生物化學(xué)基質(zhì)的失調(diào)。這會導(dǎo)致運(yùn)動行為的缺陷。帕金森病的標(biāo)準(zhǔn)治療是口服L-DOPA，它是多巴胺的前體。另外，可將具有能產(chǎn)生多巴胺的神經(jīng)原細(xì)胞的嫁接組織移植到患者大腦內(nèi)。將細(xì)胞內(nèi)藥物或基因服用到合適的大腦結(jié)構(gòu)中可以通過類似于上述實(shí)施例所述的電融合方法完成，并將其用作一種治療方法。
其他疾病是小群體細(xì)胞的失調(diào)，包括許多內(nèi)臟器官疾病，還包括腫瘤。
也有報(bào)導(dǎo)說用遺傳工程病毒進(jìn)行基因輸送對腦腫瘤進(jìn)行實(shí)驗(yàn)治療取得了成功。不過，用病毒作為輸送系統(tǒng)的局限性在于，它可能會造成由病毒突變產(chǎn)生的潛在危害。使用類似于在下面實(shí)施例中所披露的電融合方法進(jìn)行基因輸送(例如，“自殺基因”細(xì)胞因子脫氨酶或胸苷激酶)能消除將病毒輸送系統(tǒng)用于癌癥治療中的必要性。
在很多情況下，局部使用(直接用于有疾病的細(xì)胞類型)藥物或基因(基因治療)預(yù)計(jì)效果要遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于腹膜內(nèi)、口腔、靜脈內(nèi)、或任何其他常用類型的藥物服用技術(shù)?；铙w內(nèi)細(xì)胞類藥物和基因服用可以使用類似于下面的實(shí)施例中所披露的電融合方法實(shí)現(xiàn)。由于電極的尺寸極小，在加上與所施加的低電壓結(jié)合預(yù)計(jì)對組織的損傷非常小。另外，電極的定位以及隨后基因或藥物的輸送是非常精確的。在大腦中這一點(diǎn)是非常重要的。業(yè)已證實(shí)比這里所使用的電穿孔電極大100倍的微透析探針可能在移植24小時(shí)之后對組織造成很小的創(chuàng)傷并且在移植24小時(shí)之后對局部代謝造成很小的破壞。
為了解決通過電穿孔在活體內(nèi)向細(xì)胞和器官轉(zhuǎn)移的問題，優(yōu)選使用空心電極。通過施加一個(gè)流體經(jīng)過電極的中央的細(xì)小的通道簡單地將需要電融合到細(xì)胞中的融合配偶體電簡單地投放進(jìn)去，所述流體是通過注射泵或蠕動泵或任何其他類型的溶液泵送系統(tǒng)輸送的，包括電泳。
一種特別感興趣的可能性是使用存在于生物耐受性材料中的由電池操縱的灌注/電穿孔置入物，以便連續(xù)提供具有融合配偶體的溶質(zhì)，以便電融合到細(xì)胞或組織中。由于所需要的勢能是如此之低，以至于可以使用數(shù)伏至20伏的emf’s的電池。這種電池操縱的電穿孔裝置可以做的很小，實(shí)際上可將其包括在芯片上，只占若干平方毫米。
在圖5中示出了體內(nèi)裝置的一個(gè)例子。通過一個(gè)立體有規(guī)裝置將空心電極20定位于靠近大腦中的細(xì)胞21中。細(xì)胞21是融合配偶體之一。另一個(gè)融合配偶體是含有具有藥物活性的物質(zhì)，如DNA、蛋白、RNA或藥物的脂質(zhì)體。通過將第二種融合配偶體注射到電極21中用脂質(zhì)體灌注所述細(xì)胞，所述注射是使用附圖中所示的注射器22進(jìn)行的或者使用某些其他合適的裝置。
在下面的實(shí)施例中將對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。本實(shí)施例只是用來說明本發(fā)明的，不應(yīng)當(dāng)以任何方式將其視為是對本發(fā)明范圍的限定。
實(shí)施例在實(shí)施例中，使用以下方法和材料。
顯微操作和融合將通過高度聚焦的激光束光學(xué)捕獲用于對齊融合配偶體。使用該方法，溶液中的融合配偶體之一(細(xì)胞或脂質(zhì)體)通過IR激光束誘導(dǎo)，并使其與另一個(gè)融合配偶體接觸，該配偶體是生長在基質(zhì)上附著細(xì)胞或是使用上述在圖1中所示的裝置通過光學(xué)捕獲將細(xì)胞放在基質(zhì)上。為了使細(xì)胞或脂質(zhì)體接近用于融合的細(xì)胞目標(biāo)，本發(fā)明人還使用將其可逆地吸附在碳纖維微電極頂端。在利用這種特殊方法進(jìn)行細(xì)胞-脂質(zhì)體融合時(shí)，通過大體上平行于目標(biāo)平面推動電極頂端使其通過脂質(zhì)體將與細(xì)胞同時(shí)固定在聚L-賴氨酸包被的玻璃表面上的脂質(zhì)體從該表面上分離下來。然后將脂質(zhì)體輕輕粘接在電極頂端，并可通過顯微操縱器將其重新定位于接近細(xì)胞結(jié)構(gòu)處，該操縱器可以沿三維方向移動0.2微米的距離。這一過程如圖2A-C所示，其中，直徑大約5微米的脂質(zhì)體向靶細(xì)胞移動了大約90微米，而圖2D-G表示如何利用這種簡單的方法產(chǎn)生復(fù)雜的細(xì)胞-脂質(zhì)體形式。圖2A-C中的脂質(zhì)體首先被固定在聚L-賴氨酸包衣的硼硅蓋玻片上，并添加存在于懸浮液中的細(xì)胞。該技術(shù)相對光學(xué)捕獲的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，可以對小泡施加更大的力。相同的方法可用于對齊兩個(gè)細(xì)胞，唯一的不同是沒有必要使用聚L-賴氨酸包衣的蓋玻片，因?yàn)閼腋∫褐械募?xì)胞由于重力的作用只是簡單地附著在表面。
為了進(jìn)行電融合，使用一對相同的外徑5微米的碳纖維微電極。圖1表示所述電極相對預(yù)先排列好用來融合的一對細(xì)胞的幾何排列。對于細(xì)胞-細(xì)胞、和細(xì)胞-脂質(zhì)體融合來說，使用低電壓脈沖發(fā)生器施加高度聚焦的電場。這種裝置的優(yōu)點(diǎn)是，電極具有細(xì)胞至亞細(xì)胞的體積，使得單細(xì)胞能夠融合在生長在基質(zhì)上的復(fù)雜的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)中。與此同時(shí)，高度聚焦的電場降低了不希望出現(xiàn)的周圍細(xì)胞的融合或電穿孔的危險(xiǎn)性。
實(shí)驗(yàn)方法光學(xué)捕獲、顯微術(shù)和熒光成像光學(xué)捕獲和熒光成像系統(tǒng)安裝在室內(nèi)。光學(xué)捕獲是通過空間過濾器(由單一模式的MOPA激光二極管)(型號SDL-5762-A6，SDL公司)(900型，Newport)發(fā)送輸出而產(chǎn)生的，以便該輸出隨后從近紅外鏡上反射出去。反射的激光通過一個(gè)雙色鏡，由放置在一臺顯微鏡(NikonDiaphot或Leica DM IRB)上的多色鏡(Chroma技術(shù)公司)上反射出去，然后通過一個(gè)高倍目鏡孔形成折射限制的焦點(diǎn)(分別為100X，NA1.4Nikon和100倍，NA1.3Leica)。通過經(jīng)一個(gè)鏡頭和一個(gè)旋轉(zhuǎn)片發(fā)射488納米的氬離子激光輸出(Spectra Physics2025-05)實(shí)現(xiàn)激光激發(fā)。該旋轉(zhuǎn)片的目的是分散激光光線，以便實(shí)現(xiàn)對熒光成像的均勻的照明。來自所述旋轉(zhuǎn)片的分散了的激光光線通過一個(gè)鏡頭集中，并從一個(gè)雙色鏡上反射出去(Chroma技術(shù)公司)。反射的光線被送入顯微鏡，再通過一個(gè)多色鏡反射出去。熒光和明視野成像是通過3-芯片顏色CCD相機(jī)(Hamamatsu)或硅強(qiáng)化定向相機(jī)(Hamamatsu)完成的，并通過Super AHS記錄儀(松下)記錄，或者通過一個(gè)框架采錄器直接下載到硬盤上。
電融合裝置為了進(jìn)行電融合實(shí)驗(yàn)，使用真空潤滑將細(xì)胞培養(yǎng)皿安裝在圓形聚碳酸酯支架上，并轉(zhuǎn)移到一臺倒置顯微鏡的平臺上。通過高精度顯微操作器(Narishige MWH-3)將外徑為5微米的兩個(gè)碳纖維微電極(Axon儀器公司，ProCFE)定位于靠近相應(yīng)融合配偶體的每一側(cè)。兩個(gè)碳纖維電極的頂端(陰極和陽極)相對目鏡平面呈0-20度和160-180度的角度。使用脈沖發(fā)生器(Digitimer Stimulator DS9A)或國產(chǎn)的裝置通過多次1毫秒的脈沖融合細(xì)胞。來自脈沖發(fā)生器的電壓輸出使用高電阻電極和夾鉗形放大器進(jìn)行校正。電融合緩沖液是用30％-50％的MilliQ水稀釋過的0.3摩爾/千克Hanks Hepes溶液(137mM氯化鈉，5.4mM氯化鉀，0.41mM硫酸鎂，0.4mM氯化鎂，1.26mM氯化鈣，0.64mM磷酸二氫鉀，3.0mM碳酸氫鉀，5.5mM D-葡萄糖，20mM Hepes，用氫氧化鈉將pH調(diào)整到7.4)或0.2摩爾/千克Hepes鹽緩沖液(35mM氯化鈉，5mM氯化鉀，10mM葡萄糖，2mM氯化鎂，2mM氯化鈣和10mMHepes)。對于PC12細(xì)胞來說分別使用300L3和75L3標(biāo)準(zhǔn)等滲和低滲融合介質(zhì)(Foung，S.等，免疫方法雜志，134，35-42)。對于NG-108和Cos7細(xì)胞-細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)來說，將5％PEG4000添加到融合介質(zhì)中，而在細(xì)胞-脂質(zhì)體融合中，添加1.25％DMSO。
細(xì)胞培養(yǎng)按照標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)Jurkat、ANG108、COS7、和PC12細(xì)胞。用2毫克/毫升蛋白酶(源于米曲霉)在培養(yǎng)箱中處理NG108和Cos7細(xì)胞5-30分鐘(37℃濕度為90％，空氣中含有5％的二氧化碳)。
制備熒光素膠囊化的單層小泡和熒光標(biāo)記的蛋白脂質(zhì)體用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)方法大量獲得來自溶解在氯仿中的L-α-磷脂酰膽堿的脂質(zhì)體(來自鮮蛋黃，Sigma St.Louis，MO)[例如，披露于Moscho，A等，1996，快速制備大量單層小泡，美國科學(xué)院院報(bào)9311443-11445]。通過與2.3mM熒光素異硫氰酸酯(LITC)反應(yīng)制備熒光標(biāo)記的γ-GT。通過讓γ-GT-FITC溶液經(jīng)過截?cái)喾肿恿繛?000D的Econopac10DG柱(BioRad實(shí)驗(yàn)室，CA)除去未反應(yīng)的FITC。然后小小泡形成過程中將標(biāo)記過的γ-GT整合到小泡中。
制備聚-L-賴氨酸包衣的蓋玻片用70％乙醇/水溶液(v/v)洗滌蓋玻片(硼硅玻璃，直徑28毫米，厚度0.13-0.17毫米，Kebo，瑞典)，然后用MilliQ水洗滌。將該玻璃放入聚-L-賴氨酸(Sigma-Aldrich歐洲)/MQ-水溶液(0.1％w/v)中。用真空潤滑油將蓋玻片安裝到圓形聚碳酸酯支架上。添加1毫升脂質(zhì)體溶液。在30分鐘之后，有足夠數(shù)量的脂質(zhì)體被固定，并且可以更換外面的溶液和添加細(xì)胞。
用微電極操縱脂質(zhì)體和細(xì)胞為了將脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移到聚-L-賴氨酸包衣的硼硅玻璃表面的不同部位，使用由高精度顯微操縱器操縱的碳纖維微電極(Narishige，日本，0.2微米分辨度)，通過簡單地采用組合的推/刮運(yùn)動將小泡從所述表面上松開。在小泡離開所述表面之后，它們可以粘附在電極頂端，并可以長距離轉(zhuǎn)移并且被送到接近細(xì)胞目標(biāo)處。為了確定脂質(zhì)體內(nèi)含物的大量損失是否是由于這種操作的后果，用熒光素(10mM)啟動脂質(zhì)體，并粘接到蓋玻片上，進(jìn)行充分洗滌，以便熒光背景明顯減弱。比較轉(zhuǎn)移小泡之前和之后小泡內(nèi)的熒光強(qiáng)度沒有發(fā)現(xiàn)內(nèi)含物的明顯減少的跡象(數(shù)據(jù)未顯示)。
化合物和材料Hepes(大于99％)、氯化鈉、氯化鉀、和氫氧化鈉(均為超級純度)、氯化鈣、氯化鎂、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、PEG4000和碳酸氫鈉都是從Merck公司購買的。D-葡萄糖(AnalaR)是從BDH Poole有限公司購買的，而熒光素(GC-級)、γ-GT、蛋白酶(XXIII型，源于米曲霉)、熒光素(鈉鹽)和DMSO是從Sigma-Aldrich，瑞典購買的。熒光素異硫氰酸酯是從分子探針，歐洲購買的。使用Milli-Q系統(tǒng)的去離子水(Millipore)。
實(shí)施例1-細(xì)胞-細(xì)胞融合在該實(shí)施例中，通過光學(xué)捕獲使兩個(gè)PC12細(xì)胞(直徑大約為8和10微米)接觸，并固定在蓋玻片上，然后使其融合，如圖3A-D所示。圖3A表示在介電泳期間的PC12細(xì)胞(0.3-3千伏/厘米，2MHz)。圖3B表示通過最后的融合脈沖啟動融合(6次脈沖，每次持續(xù)1毫秒，3000伏/厘米)，這一過程表現(xiàn)為兩個(gè)細(xì)胞之間較寬的和較平的接觸區(qū)。圖3C(融合脈沖之后大約1分鐘)和圖3D(融合脈沖之后大約2分鐘)表示所述細(xì)胞之間融合區(qū)的隨后變寬，證實(shí)了完全融合。
為了證實(shí)用該技術(shù)所獲得的高空間分辨率，對在網(wǎng)絡(luò)中的單個(gè)NG108細(xì)胞進(jìn)行融合(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。除了PC12細(xì)胞和NG108細(xì)胞之外，還成功地融合了Jurkat細(xì)胞和Cos7細(xì)胞(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。以類似的融合方法成功地產(chǎn)生了PC12細(xì)胞和NG108細(xì)胞的雜合細(xì)胞(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。
由于細(xì)胞骨骼的存在，融合細(xì)胞需要更長時(shí)間來識別它的膜，并變得比脂質(zhì)體更圓一些。例如，采用相同實(shí)驗(yàn)裝置的典型的脂質(zhì)體-脂質(zhì)體融合是在毫秒時(shí)間內(nèi)完成的(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。對于某些具有較大的細(xì)胞骨骼結(jié)構(gòu)的細(xì)胞來說，膜的識別可能需要數(shù)分鐘時(shí)間。不過，以最初的細(xì)胞質(zhì)連續(xù)性為特征的融合仍然是在1秒鐘內(nèi)進(jìn)行的。經(jīng)常出現(xiàn)的是在0.2摩爾/千克緩沖液中預(yù)先電穿孔的細(xì)胞的融合比保持在等滲的0.3mM/千克緩沖液中的細(xì)胞的融合更快一些。在等滲介質(zhì)中進(jìn)行的從最初的細(xì)胞質(zhì)連續(xù)性至細(xì)胞完全融合的融合過程需要若干小時(shí)。這與早先有關(guān)融合介質(zhì)對膜融合過程的影響的說法吻合，如胞吐作用[例如，參見Weber，J.等，1992，通過激光微束和光學(xué)捕獲操作細(xì)胞、細(xì)胞器和基因組，細(xì)胞學(xué)國際綜述，1331-41]和細(xì)胞-細(xì)胞融合[例如，參見Zimmerberg，J.等，1980，微摩爾鈣離子刺激脂類小泡與含有鈣結(jié)合蛋白的平面雙層的融合，科學(xué)，210，906-908；Scmitt，J.J.等，1989，通過在強(qiáng)低滲溶液中電融合提高雜交瘤的產(chǎn)量，生物化學(xué)生物物理學(xué)學(xué)報(bào)，983，42-50；Scmitt，J.J.等，1989，滲透壓處理過的細(xì)胞的電融合，Naturwissenschaften，76，122-123]。最近有人懷疑通過低滲透融合介質(zhì)所獲得的電融合的增強(qiáng)是由于血影蛋白變性所引起的[例如，參見Zimmermann，U.等，1990，通過低滲透壓電融合使小鼠-人細(xì)胞系有效雜交，免疫學(xué)方法雜志，134，43-50；Chernomordik，L.V.等，1991，血影蛋白網(wǎng)絡(luò)和非滲透力控制電融合紅細(xì)胞血影中融合產(chǎn)物形態(tài)的證據(jù)，生物物理學(xué)雜志，60，1026，1037]。
在所有NG-108和Cos7融合實(shí)驗(yàn)中，用蛋白酶處理細(xì)胞(5-30分鐘)，而對于NG-108細(xì)胞來說，細(xì)胞融合介質(zhì)含有5％(w/v)PEG4000[例如，參見Sowers，A.E.1995，在紅細(xì)胞膜融合期間膜骨骼對表面形狀改變的約束通過使用滲透和介電泳微力作為探針?biāo)@得的證據(jù)，生物物理學(xué)雜志，69，2507-2516]。相應(yīng)細(xì)胞系的對不同預(yù)處理的要求和融合條件與以前的有關(guān)細(xì)胞融合的發(fā)現(xiàn)吻合。業(yè)已證實(shí)，電融合的細(xì)胞在生物學(xué)上是完整的，并且能繼續(xù)生長。同樣在我們的融合方法中，細(xì)胞被粘著在表面，并且在融合后5-24小時(shí)檢查時(shí)在繼續(xù)生長。
實(shí)施例2-細(xì)胞-脂質(zhì)體融合以前的細(xì)胞融合的證據(jù)業(yè)已證實(shí)，除了其他表型的哺乳動物細(xì)胞之外，合成的小泡以及植物原生質(zhì)體可以哺乳動物細(xì)胞融合。通過用諸如PEG的某種化學(xué)處理業(yè)已使合成的小泡與細(xì)胞融合[例如，參見Stoicheva，N.G.等，1994，在有聚乙二醇的條件下電誘導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞融合，膜生物學(xué)雜志，140177-182]或通過使用HVJ-糖蛋白-重構(gòu)脂質(zhì)體[參見Seibicke，S.等，1988，脂質(zhì)體小泡與腹水腫瘤細(xì)胞及其脂類耗竭變體的融合，用放射性和熒光標(biāo)記過的小泡進(jìn)行研究，生物化學(xué)生物物理學(xué)學(xué)報(bào)，944，487-496]。業(yè)已將合成的脂膜結(jié)合到細(xì)胞的脂膜中，通過使脂包衣的玻璃微量移液管和細(xì)胞膜實(shí)現(xiàn)微量注射[例如，參見Laffafian，I.等，1998，通過脂類協(xié)助的顯微注射將材料導(dǎo)入小細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和膜中，生物物理學(xué)雜志，75，2558-2563]。包括合成小泡的融合方法可用于通過混合成分的方式將細(xì)胞所臨時(shí)擁有的分子轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞中以及用于將膜脂和諸如蛋白的膜相關(guān)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞膜中。
圖4A-E是證實(shí)本發(fā)明的單一小泡-細(xì)胞融合的兩個(gè)序列的圖象。在第-個(gè)序列中(圖4A-C)，一個(gè)直徑大約為5微米的磷脂酰膽堿小泡與一個(gè)直徑大約為12微米的Cos-7細(xì)胞融合，而在第二個(gè)序列中(圖4D-E)，一個(gè)直徑大約為3微米的具有重構(gòu)的γ-GT的磷脂酰膽堿小泡與一個(gè)直徑大約為20微米的NG-108細(xì)胞(用蛋白酶處理30分鐘)融合。這證實(shí)了將脂質(zhì)體結(jié)合的蛋白導(dǎo)入細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的能力。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，小泡與細(xì)胞的融合要比兩個(gè)相同類型細(xì)胞之間的融合更難于實(shí)現(xiàn)。發(fā)現(xiàn)添加DMSO(大約2％)至0.3摩爾/千克融合介質(zhì)和使用0.2mM/千克融合介質(zhì)都能促進(jìn)融合。業(yè)已證實(shí)DMSO能促進(jìn)通過電穿孔攝入DNA并提供融合的產(chǎn)量，而已知使用低滲透壓介質(zhì)能提高細(xì)胞的融合產(chǎn)量(參見上文)。在該附圖中所顯示的實(shí)施例中，融合是在HEPES-緩沖的鹽溶液中進(jìn)行的，并將1.25％二甲基亞砜和20％MQ-水添加到外部緩沖液中能促進(jìn)小泡-細(xì)胞電融合。
實(shí)施例3-使用單開孔融合硅毛細(xì)管進(jìn)行細(xì)胞融合融合實(shí)驗(yàn)是用NG108細(xì)胞進(jìn)行的，按照標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)并鋪平板到1號圓形蓋玻片上，安裝到圓形聚碳酸酯支架上，并轉(zhuǎn)移到導(dǎo)致顯微鏡平臺上。在所有實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞層是用白金絲接種的。通過光學(xué)捕獲將細(xì)胞對齊以便融合。高壓動力源(Bertand，Hicksville，NY，美國)以1-30千伏的正電勢工作，并同時(shí)使用用電解質(zhì)填充的融合硅毛細(xì)管作電極(長度30厘米，內(nèi)徑30毫米，外徑375毫米)。該實(shí)驗(yàn)裝置的其他部分與圖1所示相同。通過用旋轉(zhuǎn)砂紙片將融合硅電極的頂端打磨至外徑大約為50毫米。用Hanks緩沖的鹽溶液填充所述毛細(xì)管和緩沖容器(它通過一個(gè)白金絲將毛細(xì)管的入口端與高壓動力源連接)。用高精度顯微操縱器將磨尖了的毛細(xì)管頂端(輸出末端)定位于靠近一個(gè)融合配偶體，通常距離小于10微米。通過施加5-15千伏的脈沖0.1-5秒實(shí)現(xiàn)兩個(gè)對齊的NG108-15細(xì)胞的融合。
業(yè)已證實(shí)，本發(fā)明的方法能夠在復(fù)雜的系統(tǒng)中高效融合兩個(gè)細(xì)胞。這一點(diǎn)在用于體內(nèi)融合細(xì)胞和其他融合配偶體時(shí)特別重要。
權(quán)利要求
1.一種用于對具有細(xì)胞樣膜的至少兩個(gè)融合配偶體進(jìn)行選擇性電融合的方法，包括以下步驟A)讓融合配偶體彼此接觸，B)施加足于實(shí)現(xiàn)融合的強(qiáng)度的電場，并將電場高度聚焦在融合配偶體上。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中，僅將一個(gè)小到足于能選擇性地融合兩個(gè)融合配偶體的電極用于提供步驟B中的電場。
3.如權(quán)利要求1的方法，其中，將兩個(gè)小到足于能選擇性地融合兩個(gè)融合配偶體的電極用于提供步驟B中的電場。
4.如權(quán)利要求1或2的方法，其中，用一個(gè)安裝在微型芯片上的一個(gè)電極提供步驟B中的電場。
5.如權(quán)利要求1或3的方法，其中，用一個(gè)安裝在微型芯片上的若干電極提供步驟B中的電場。
6.如權(quán)利要求4或5的方法，其中，所述電極被安裝在為了組合合成融合產(chǎn)物而設(shè)計(jì)的合適的微型芯片上。
7.如權(quán)利要求2-6中任一項(xiàng)的方法，其中，至少有一個(gè)微電極是空心的，并小到足于選擇性地融合兩個(gè)融合配偶體。
8.如權(quán)利要求2-7中的方法，其中，至少有一個(gè)微電極是空心的、用電解質(zhì)填充的，并且小到足于能選擇性地融合兩個(gè)融合配偶體，將其用于提供步驟B中的電場，并且所述微電極還被用于通過電內(nèi)滲、電泳、或通過泊肅葉流輸送融合配偶體或化學(xué)制劑。
9.如權(quán)利要求2-8中的方法，其中，所述電極的外徑小到足于能選擇性地融合所述至少兩個(gè)融合配偶體，而不會影響附近的結(jié)構(gòu)、如細(xì)胞、脂質(zhì)體和蛋白脂質(zhì)體。
10.如權(quán)利要求9的方法，其中，所述電極的外徑為1-100微米。
11.如權(quán)利要求2-10中任一項(xiàng)的方法，其中，所述電極是利用顯微鏡、至少一個(gè)微定位器和/或一個(gè)立體有規(guī)裝置定位的。
12.如權(quán)利要求2-11中任一項(xiàng)的方法，其中，至少有一個(gè)電極被用于將至少一種融合配偶體輸送到融合部位。
13.如權(quán)利要求2-12中任一項(xiàng)的方法，其中，所述步驟A是利用所述電極完成的。
14.如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法，其中，所述步驟A是利用光學(xué)捕獲完成的。
15.如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法，其中，所述步驟A是利用微量移液管完成的。
16.如權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的方法，其中，至少一個(gè)融合配偶體是細(xì)胞，而另一個(gè)融合配偶體獨(dú)立選自下列一組單細(xì)胞、脂質(zhì)體、蛋白脂質(zhì)體、合成小泡、卵細(xì)胞、無核卵細(xì)胞、處于任何發(fā)育階段的精細(xì)胞和植物原生質(zhì)體。
17.如權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的方法，其中，至少一個(gè)融合配偶體是由選自下列一組的多種結(jié)構(gòu)組成的單細(xì)胞、脂質(zhì)體、蛋白脂質(zhì)體、合成小泡、卵細(xì)胞、無核卵細(xì)胞、處于任何發(fā)育階段的精細(xì)胞和植物原生質(zhì)體。
18.如權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的方法，其中，在步驟B之前所述融合配偶體是在緩沖液中提供的。
19.如權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的方法，其中，在步驟A之前至少有一個(gè)融合配偶體被固定。
20.如權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的方法，其中，有一個(gè)融合配偶體是細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的一部分。
21.如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)的方法，其中，在步驟A之前至少有一個(gè)融合配偶體已經(jīng)在緩沖液中被電穿孔。
22.如權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)的方法，其中，在步驟A之前至少有一個(gè)融合配偶體已經(jīng)在緩沖液中受到過介電泳電場的處理。
23.如權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)的方法，其中，至少有一個(gè)融合配偶體通過能促進(jìn)細(xì)胞-細(xì)胞密切接觸的融合劑或其他制劑處理過。
24.權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的方法用于體外受精的用途。
25.權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的方法用于克隆的用途。
26.權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的方法用于產(chǎn)生雜交瘤的用途。
27.權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的方法用于操縱細(xì)胞膜的組成的用途。
28.權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的方法用于將確定體積的物質(zhì)輸送到細(xì)胞中的用途。
29.權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的方法用于將藥物活性物質(zhì)輸送到細(xì)胞中的用途。
30.權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的方法用于治療腫瘤的用途。
31.權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的方法用于治療慢性神經(jīng)變性疾病，如帕金森病和阿爾采默氏病的用途。
全文摘要
披露了一種用于對具有細(xì)胞樣膜和細(xì)胞或亞細(xì)胞尺寸的至少兩個(gè)融合配偶體進(jìn)行選擇性電融合的方法,包括以下步驟:A)讓融合配偶體彼此接觸,和B)施加足于實(shí)現(xiàn)融合的強(qiáng)度的電場,并將電場高度聚焦在融合配偶體上。融合配偶體分別選自下列一組:單細(xì)胞、脂質(zhì)體、蛋白脂質(zhì)體、合成小泡、卵細(xì)胞、無核卵細(xì)胞、處于任何發(fā)育階段的精細(xì)胞和植物原生質(zhì)體。
文檔編號A61P25/00GK1367826SQ0081112
公開日2002年9月4日 申請日期2000年7月13日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月30日
發(fā)明者O·奧爾瓦, P·艾利松, D·T·丘, A·莫守, R·N·扎雷 申請人:塞勒克特里康股份公司