具有對表達(dá)dc-sign的細(xì)胞改善的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的慢病毒載體粒子的制作方法
【專利說明】具有對表達(dá)DC-SIGN的細(xì)胞改善的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的慢病毒載體 粒子
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年3月30日提交的美國專利申請?zhí)?3/436,472(現(xiàn)為2012年 12月4日公布的美國專利號8, 323, 662);以及2012年6月29日提交的美國臨時(shí)專利申請 號61/666, 103、2012年12月3日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?1/732, 756和2013年3月 15日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?1/789, 575的優(yōu)先權(quán)，所有這些專利均以引用方式整體 并入本文。
[0003] 以電子方式提交的材料的援引并入
[0004] 以引用方式整體并入的是與此同時(shí)提交并標(biāo)識如下的計(jì)算機(jī)可讀氨基酸/核苷 酸序列表：一份246, 173字節(jié)的ASCII (文本）文件，名稱為"46417A_SeqListing. txt"，創(chuàng) 建日期為2013年3月29日。
技術(shù)領(lǐng)域
[0005] 本公開涉及可用于生成改良的假型化慢病毒載體粒子的材料和方法。
【背景技術(shù)】
[0006] 樹突細(xì)胞（DC)是用于引發(fā)和控制免疫反應(yīng)的基本抗原呈遞細(xì)胞。DC可捕獲和加 工抗原，從外周迀移到淋巴器官，并以主要組織相容性復(fù)合體（MHC)限制性方式將抗原呈 遞至靜息T細(xì)胞。這些細(xì)胞來源于骨髓（BM)并且顯示出樹枝狀形態(tài)和高迀移率。DC作為 特化的抗原呈遞細(xì)胞（APC)這一發(fā)現(xiàn)已促進(jìn)了在基于DC的免疫/接種策略方面的嘗試，所 述策略涉及靶向用于展示特異性抗原的DC。已開發(fā)了基于重組病毒的載體，作為將編碼指 定抗原的基因直接遞送至宿主細(xì)胞的機(jī)理。通過誘導(dǎo)所需的適應(yīng)性免疫反應(yīng)，所表達(dá)的基 因產(chǎn)物提供了治療有益效果。
[0007] 實(shí)現(xiàn)安全且有效的系統(tǒng)所面臨的挑戰(zhàn)包括設(shè)計(jì)有效靶向所需宿主細(xì)胞組的載體、 提供合適的遞送系統(tǒng)、以及表達(dá)引起有效免疫反應(yīng)的所需抗原以便其可廣泛地用于指定的 受試人群。
[0008] 本文所公開的辛德畢斯病毒（Sindbis virus)和其他甲病毒的包膜糖蛋白并入病 毒粒子膜的脂質(zhì)雙層中。通常，病毒膜（包膜）包含由單一前體蛋白的裂解產(chǎn)生的兩種糖 蛋白異源二聚體El和E2的三聚體的多個(gè)拷貝。從其N端至C端，前體蛋白包含E3、E2、6K 和El蛋白。小的E3糖蛋白充當(dāng)E2蛋白易位到膜中的信號序列，并通過弗林蛋白酶或一些 其他Ca2+依賴性絲氨酸蛋白酶從E2裂解。6K蛋白充當(dāng)El蛋白易位到膜中的信號序列，并 且隨后從前體蛋白裂解。WO 2008/011636和US 2011/0064763公開了慢病毒包裝系統(tǒng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，表現(xiàn)出以下兩種特性的慢病毒載體粒子具有出人意料改善的對 表達(dá)DC-SIGN的細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率：(a)用高度甘露糖化的甲病毒糖蛋白假型化和（b)包含 Vpx蛋白。這些粒子比只具有這兩種特性之一的慢病毒載體粒子明顯更有效地感染表達(dá) DC-SIGN的細(xì)胞，尤其是樹突細(xì)胞。在特定的情況下，提供了包含Vpx蛋白和含有目標(biāo)序列 (例如，編碼抗原的多核苷酸）的慢病毒基因組的高度甘露糖化假型化慢病毒載體粒子。 [0010] 生成假型化慢病毒載體粒子的方法
[0011] 本公開的一個(gè)方面提供生成假型化慢病毒載體粒子的方法，該方法包括：(a)在 包含甘露糖苷酶抑制劑（優(yōu)選甘露糖苷酶I抑制劑）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)病毒包裝細(xì)胞，該病 毒包裝細(xì)胞包含：（1)含有編碼外源性抗原的多核苷酸的慢病毒載體基因組，（2)編碼優(yōu)先 地結(jié)合表達(dá)DC-SIGN的細(xì)胞的甲病毒糖蛋白的多核苷酸，以及（3)編碼SAMHDl抑制劑的多 核苷酸；以及（b)分離優(yōu)先地結(jié)合表達(dá)DC-SIGN的細(xì)胞的假型化慢病毒載體粒子。
[0012] 本公開的另一個(gè)方面提供生成假型化慢病毒載體粒子的方法，該方法包括：(a) 在包含kifunensine的培養(yǎng)基中培養(yǎng)病毒包裝細(xì)胞，該病毒包裝細(xì)胞包含：（1)含有編碼外 源性抗原的多核苷酸的慢病毒載體基因組，（2)編碼優(yōu)先地結(jié)合表達(dá)DC-SIGN的樹突細(xì)胞 的辛德畢斯E2糖蛋白的多核苷酸，以及（3)編碼保持SAMHDl抑制活性的Vpx蛋白或Vpr 蛋白的多核苷酸；以及（b)分離優(yōu)先地結(jié)合表達(dá)DC-SIGN的樹突細(xì)胞的假型化慢病毒載體 粒子。在一些實(shí)施方案中，E2糖蛋白與SEQ ID N0:30[SIN-Varl]具有90%同一性。在 一些實(shí)施方案中，（i)E2糖蛋白的殘基160不存在或?yàn)榉枪劝彼岬陌被幔╥i)E2糖蛋白 變體的殘基70、76或159中的一個(gè)或多個(gè)為非堿性殘基，并且（iii)E2糖蛋白變體不是與 辛德畢斯病毒E3糖蛋白的融合蛋白的一部分。在一些實(shí)施方案中，E2糖蛋白為SEQ ID NO:30[SIN-Var1]。
[0013] 在本文所述的一些或任何實(shí)施方案中，Vpx蛋白包含與SIVmac Vpx(SEQ ID N0:44)具有至少80%同一性的氨基酸序列。
[0014] 在本文所述的一些或任何實(shí)施方案中，Vpx蛋白包含與SIVmac Vpx(SEQ ID N0:44)、SIVsm Vpx(SEQ ID N0:45)、SIVrcm Vpx(SEQ ID N0:46)或 HIV-2Vpx(SEQ ID N0:47)具有至少90%同一性的氨基酸序列。
[0015] 在本文所述的一些或任何實(shí)施方案中，Vpr蛋白包含與SIVdeb Vpr(SEQ ID NO: 48)或SIVmus Vpr (SEQ ID NO: 49)具有至少90%同一性的氨基酸序列。
[0016] 在本文所述的一些或任何實(shí)施方案中，抗原為腫瘤特異性抗原或病毒特異性抗 原。在本文所述的一些或任何實(shí)施方案中，腫瘤特異性抗原選自NY-ESO-1、MAGE(例如， MAGE-A3 和 MAGE-A1)、MART-I/ 黑色素-A(Melan-A)、BAGE、RAGE、gplOO、gp75、mda-7、酪氨 酸酶、酪氨酸酶相關(guān)蛋白（例如，TRP2)、腎細(xì)胞癌抗原、5T4、SM22-a、碳酸酐酶I、碳酸酐酶 IX(也稱為G250)、HIF-I a、HIF-2 a、VEGF、前列腺特異性膜抗原（PSMA)、前列腺特異性抗 原（PSA)、前列腺酸性磷酸鹽、前列腺六跨膜表皮抗原（STEAP)、NKX3. 1、端粒酶、存活素、間 皮素、突變r(jià)as、bcr/abl重排、Her2/neu、突變p53、野生型p53、細(xì)胞色素 P4501B1、N-乙酰 氨基葡糖轉(zhuǎn)移酶-V、人乳頭瘤病毒蛋白E6、人乳頭瘤病毒蛋白E7、癌胚抗原、梅克爾細(xì)胞病 毒T抗原癌蛋白和甲胎蛋白。在本文所述的一些或任何實(shí)施方案中，病毒特異性抗原為HIV 抗原、SIV抗原、腺病毒抗原、腸病毒抗原、冠狀病毒抗原、杯狀病毒抗原、犬瘟熱病毒抗原、 埃博拉病毒抗原、黃病毒抗原、肝炎病毒抗原、皰瘆病毒抗原、感染性腹膜炎病毒抗原、流感 病毒抗原、白血病病毒抗原、馬爾堡病毒（Marburg virus)抗原、正粘病毒抗原、乳頭狀瘤病 毒抗原、副流感病毒抗原、副粘病毒抗原、細(xì)小病毒抗原、瘟病毒抗原、微小核糖核酸病毒抗 原、脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原、痘病毒抗原、多瘤病毒抗原、狂犬病毒抗原、呼腸孤病毒抗原、逆 轉(zhuǎn)錄病毒抗原或輪狀病毒抗原。
[0017] 在本文所述的一些或任何實(shí)施方案中，慢病毒載體基因組還包含編碼第二抗原的 核苷酸序列。在本文所述的一些或任何實(shí)施方案中，第一和第二抗原作為在這兩種抗原之 間包含自裂解A2肽的融合蛋白而表達(dá)。在本文所述的一些或任何實(shí)施方案中，自裂解A2 肽包含SEQ ID NO: 56或SEQ ID NO: 57的氨基酸序列。在本文所述的一些或任何實(shí)施方案 中，第一抗原為MAGE-A3并且第二抗原為NY-ESO-I。
[0018] 在本文所述的一些或任何實(shí)施方案中，kifunensine以約0. 01 μ g/ml至約Img/ ml的濃度存在于培養(yǎng)基中。在本文所述的一些或任何實(shí)施方案中，kifunensine以約 0. 1 μ g/ml至約1 μ g/ml的濃度存在于培養(yǎng)基中。在本文所述的一些或任何實(shí)施方案中， kifunensine以約0. 25 μ g/ml至約2 μ g/ml的濃度存在于培養(yǎng)基中。
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