專利名稱：新的半乳凝素9突變體蛋白質(zhì)及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到新型半乳凝素9突變體(突變體)蛋白質(zhì)及其用途。本發(fā)明特別涉及到連接區(qū)域被改變的半乳凝素9以及利用該半乳凝素9的生物化學(xué)、臨床檢查、醫(yī)療以及藥物應(yīng)用技術(shù)。
背景技術(shù)：
特定的糖鏈和與之結(jié)合的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出在哺乳動(dòng)物的生物體內(nèi)伴隨生理現(xiàn)象以及進(jìn)化·成長的現(xiàn)象，以及在各種各樣疾病等中起到多種多樣作用和功能的證據(jù)正在被人們發(fā)現(xiàn)。人們發(fā)現(xiàn)在生物體中存在著特異識(shí)別帶有β-半乳糖苷結(jié)構(gòu)的糖鏈的動(dòng)物凝集素，作為這樣的凝集素類的半乳凝素，目前至少有14種基因被鑒定。半乳凝素家族根據(jù)其結(jié)構(gòu)分為三個(gè)亞類、即原型(prototype)、嵌合型(chimera)、以及串聯(lián)重復(fù)型(tandem repeat)、它們在生物體內(nèi)的功能幾乎不清楚。特別是有關(guān)具有兩個(gè)糖鏈識(shí)別結(jié)構(gòu)域的串聯(lián)重復(fù)型半乳凝素，由于研究的歷史短，作為它的靶的生物體內(nèi)糖鏈(受體)還不清楚，所以其功能沒有闡明。可是，根據(jù)對識(shí)別細(xì)胞表面的復(fù)雜的糖鏈的蛋白質(zhì)進(jìn)行探索發(fā)現(xiàn)等的經(jīng)過，預(yù)想半乳凝素具有與細(xì)胞的粘附、細(xì)胞間的信息傳遞、細(xì)胞的活化等有關(guān)的功能，而引人注目。另外除了這樣的功能之外，預(yù)想還具有其它重要的各種各樣功能的那樣的研究成果也正在獲得。
作為串聯(lián)重復(fù)型半乳凝素之一的半乳凝素9在人中，最初是作為霍奇金病患者的自身抗原(autoantigen)被鑒定的(非專利文獻(xiàn)1和2)，人們想像它是否在免疫細(xì)胞間的相互作用中起著重要的作用。小鼠的半乳凝素9可以通過使用以被認(rèn)為在半乳凝素類的糖鏈識(shí)別結(jié)構(gòu)域中保守性高的序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的簡并引物的5′-RACE PCR，從小鼠腎臟的cDNA文庫克隆(非專利文獻(xiàn)3)。人們發(fā)現(xiàn)用抗原刺激的人T細(xì)胞在體內(nèi)和體外產(chǎn)生作為嗜酸性細(xì)胞趨化因子的ecalectin，而且該ecalectin與目前已知的其它嗜酸性細(xì)胞趨化因子類雖然結(jié)構(gòu)上不同，但也可以歸屬于半乳凝素家族，具有對帶有β-半乳糖苷結(jié)構(gòu)的糖鏈的結(jié)合親和性。從來自于人T細(xì)胞的白血病細(xì)胞株得到的mRNA成功地克隆了ecalectin，結(jié)果確認(rèn)ecalectin是半乳凝素9的變異體之一，半乳凝素9與ecalectin是同一物質(zhì)(非專利文獻(xiàn)4)。
作為野生型半乳凝素9，現(xiàn)在已報(bào)告了L型半乳凝素9(galectin-9long isoform or long type galectin-9Gal-9L)、M型半乳凝素9(galectin-9 medium isoform or medium type galectin-9Gal-9M)以及S型半乳凝素9(galectin-9 short isoform or short typegalectin-9Gal-9S)。無論那一種半乳凝素9都由兩個(gè)糖鏈識(shí)別部位(糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域，carbohydrate recognition domainCRD)和連接兩個(gè)部位的連接肽區(qū)構(gòu)成，已知L型半乳凝素9含有最長的連接肽區(qū)，通過該連接肽區(qū)，N端結(jié)構(gòu)域(NCRD)和C端結(jié)構(gòu)域(CCRD)被連接在一起，而S型半乳凝素9含有最短的連接肽區(qū)，M型半乳凝素9含有介于兩者之間長度的連接肽區(qū)，發(fā)現(xiàn)通常存在于比前二者更廣的生物體內(nèi)組織或細(xì)胞中。另外在由人細(xì)胞或組織克隆的半乳凝素9基因之間也可以看到表示遺傳多態(tài)現(xiàn)象的存在的證據(jù)。
野生型半乳凝素9由二個(gè)糖識(shí)別部位(CRD)和連接兩個(gè)部位的連接區(qū)構(gòu)成，以大腸桿菌作為宿主生產(chǎn)的重組體半乳凝素9表明通過對腫瘤細(xì)胞的直接作用(誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞間粘附和凋亡的活性)和借助于免疫系統(tǒng)的作用，抑制癌轉(zhuǎn)移和誘導(dǎo)萎縮。另外半乳凝素9不作用于非活化淋巴細(xì)胞，而誘導(dǎo)活化T細(xì)胞、特別是誘導(dǎo)成為過度免疫反應(yīng)原因的CD4陽性T細(xì)胞的凋亡也已闡明。另外也闡明了對與風(fēng)濕病中關(guān)節(jié)變形等有關(guān)的滑膜細(xì)胞具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)凋亡能力。
非專利文獻(xiàn)1Sahin，U.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92，11810-11813(1995)
非專利文獻(xiàn)2Tureci，O.et al.，J.Biol.Chem.，272(10)，6416-6422(1997)非專利文獻(xiàn)3Wada，J.et al.，J.Biol.Chem.，272(9)，6078-6086(1997)非專利文獻(xiàn)4Matsumoto，R.et al.，J.Biol.Chem.，273(27)，16976-16984(1998)發(fā)明內(nèi)容通過利用這樣的半乳凝素9的多方面的作用，預(yù)期可治療癌、難治的自身免疫疾患(包括風(fēng)濕病)、變態(tài)性疾患等。然而重組體半乳凝素9由于連接兩個(gè)CRD的連接區(qū)對蛋白水解酶敏感性高，非常容易被酶消化，喪失上述活性。
本發(fā)明者等進(jìn)行了專心研究，結(jié)果通過對一方面保持半乳凝素9具有的糖鏈識(shí)別活性，一方面對蛋白水解酶表現(xiàn)出更穩(wěn)定的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行探索，改變半乳凝素9的連接兩個(gè)CRD的連接區(qū)，成功地獲得了避免對上述那樣的活性帶來壞影響，穩(wěn)定性提高的改變分子，完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供以下內(nèi)容。
(1)蛋白質(zhì)或其鹽，其特征是半乳凝素9或與其具有基本上同等活性的蛋白質(zhì)的連接肽或其附近的區(qū)域被改變。
(2)上述(1)所述的蛋白質(zhì)或其鹽，其特征是由在半乳凝素9或基本上具有與半乳凝素9同等活性的蛋白質(zhì)的連接肽或其附近區(qū)域的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1個(gè)或1個(gè)以上的氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成，與半乳凝素9比較，至少對于連接肽的分解敏感性被改變。
(3)上述(1)或(2)所述的蛋白質(zhì)或其鹽，其特征是基本上具有與半乳凝素9同等活性的蛋白質(zhì)與半乳凝素9的氨基酸序列至少具有70％以上同源性。
(4)上述(1)～(3)中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)或其鹽，其特征是(1)具有半乳凝素9的N末端側(cè)的糖鏈識(shí)別區(qū)域(NCRD)或與該區(qū)域具有基本上同等活性的多肽與(2)具有半乳凝素9的C末端側(cè)的糖鏈識(shí)別區(qū)域(CCRD)或與該區(qū)域具有基本上同等活性的多肽借助于(3)在半乳凝素9的連接肽的氨基酸序列中缺失、取代或添加的1個(gè)或1個(gè)以上的氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的改變連接肽連接。
(5)上述(1)～(4)任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)或其鹽，其特征是(1)具有序列3所示的氨基酸序列的多肽或與它具有基本上同等活性，且具有與序列3所示的氨基酸序列至少70％以上同源性的氨基酸序列的多肽或具有在序列3所示的氨基酸序列中至少缺失、取代或添加1～8個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列的多肽和(2)具有序列4所示的氨基酸序列的多肽或與它具有基本上同等活性，且具有與序列4所示的氨基酸序列至少70％以上同源性的氨基酸序列的多肽或具有在序列3所示的氨基酸序列中至少缺失、取代或添加1～21個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列的多肽借助于(3)在序列7～9中任一個(gè)序列表示的氨基酸序列中缺失(但是，序列7中的1～32以及1～44的缺失、和序列8中1～12的缺失除外)、取代或添加1個(gè)或1個(gè)以上的氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的改變連接肽連接。
(6)一種核酸，其特征是具有編碼上述(1)～(5)任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)的堿基序列。
(7)上述(6)所述的核酸，其特征是聚核苷酸。
(8)上述(6)或(7)所述的核酸，其特征是DNA或RNA。
(9)一種重組載體，其特征是含有上述(6)～(8)任一項(xiàng)所述的核酸。
(10)上述(9)所述的重組載體，其特征是除了含有上述(6)～(8)任一項(xiàng)所述的核酸外，還含有編碼標(biāo)記蛋白質(zhì)和/或肽的堿基序列。
(11)一種轉(zhuǎn)化體，其特征是含有上述(6)～(8)任一項(xiàng)所述的核酸或上述(9)或(10)所述的重組載體。
(12)上述(11)所述的轉(zhuǎn)化體，其特征是轉(zhuǎn)化體宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
(13)一種藥物，其特征是作為有效成分含有從上述(1)～(5)中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)、上述(6)～(8)中任一項(xiàng)所述的核酸、上述(9)或(10)所述的重組載體和上述(11)或12所述的轉(zhuǎn)化體中選擇的成分。
(14)上述(13)所述的藥物，其特征是免疫調(diào)節(jié)劑。
(15)上述(13)所述的藥物，其特征是抗腫瘤藥。
(16)上述(15)所述的藥物，其特征是抗來自于包含腦腫瘤(多形性惡性膠質(zhì)瘤等)、脊髓腫瘤、上顎洞癌、胰液腺癌、齒肉癌、舌癌、口唇癌、上咽癌、中咽癌、下咽癌、喉頭癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、肺癌、胸膜腫瘤、癌性腹膜炎、癌性胸膜炎、食道癌、胃癌、大腸癌、膽管癌、膽囊癌、胰臟癌、肝癌、腎臟癌、膀胱癌、前列腺癌、陰莖癌、精巢腫瘤、腎上腺癌、子宮頸癌、子宮體癌、陰道癌、外陰癌、卵巢癌、纖毛上皮瘤、惡性骨腫瘤、軟部肉瘤、乳癌、皮膚癌、惡性黑色素瘤、基底細(xì)胞瘤、白血病、伴隨骨髓化性的骨髓纖維癥、惡性淋巴瘤、惡性淋巴肉芽腫病、漿細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等癌和肉瘤的腫瘤的抗腫瘤藥。
(17)上述(13)所述的藥物，其特征是該藥物是針對下面疾患或疾病、或病的癥狀的藥物(A)炎癥性疾患，來自于在各臟器中發(fā)生的各種急性和慢性炎癥、變態(tài)性和自身免疫性炎癥、感染癥等中的疾?。?B)急性和慢性疾患，來自于包括支氣管炎、支氣管肺炎、間質(zhì)性肺炎、肺炎、細(xì)支氣管炎、急性縱隔炎的肺的疾患、包括心外膜炎、心內(nèi)膜炎、心肌炎、口內(nèi)炎、口角炎、扁桃炎、咽炎、喉頭炎、食道炎、腹膜炎、急性胃炎、慢性胃炎、急性腸炎、蟲垂炎、缺血性大腸炎、藥物性大腸炎、直腸炎在內(nèi)的肺以外的其它臟器的疾患、包括A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、重癥肝炎、急性和慢性肝炎以及肝硬變、膽囊炎、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、急性和慢性腎炎、膜性腎炎、絲球體腎炎、IgA腎癥、各種膀胱炎、腦髓炎、乳腺炎、皮炎、表層角膜炎、干性角結(jié)膜炎、中耳炎和鼻炎、副鼻腔炎和鼻茸、牙肉炎、牙周炎、牙周圍炎在內(nèi)的炎癥等疾病；(C)來自于神經(jīng)性炎癥(例如、神經(jīng)性胃炎、神經(jīng)性膀胱炎等)、癌或伴隨炎癥疼痛的疾?。?D)變態(tài)性炎癥疾患，全身性過敏性、支氣管哮喘、過敏性肺炎、花粉癥、變態(tài)性鼻炎、變態(tài)性結(jié)膜炎、免疫復(fù)合體引起的變態(tài)性疾患、血管神經(jīng)性浮腫等在內(nèi)的疾?。?E)自身免疫性的炎癥(自身免疫疾患)，來自于全身性(慢性關(guān)節(jié)風(fēng)濕病、全身性紅斑狼瘡、結(jié)節(jié)性多發(fā)性動(dòng)脈炎、強(qiáng)皮癥、多發(fā)性肌炎·皮膚肌炎、肖格倫綜合征(Sjogren syndrome)、貝切特病(Behcet’s syndrome)等)、神經(jīng)系(多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力癥、HAM(HTLV-1脊髓癥)、肌萎縮性側(cè)索硬化癥等)、內(nèi)分泌性(巴澤多病、橋本病、1型糖尿病等)、血液(特發(fā)性血小板減少性紫斑病、自身免疫性溶血性貧血、再生不良性貧血等)、呼吸器(結(jié)節(jié)病、肺纖維癥等)、消化管(潰瘍性大腸炎、克羅恩病等)、肝臟(自身免疫性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變、原發(fā)性硬化性膽管炎、自身免疫性膽管炎等)、腎·尿路系(抗嗜中性白細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)抗體相關(guān)腎炎、血管炎、肺腎綜合征(Goodpasture)、抗絲球體基底膜抗體病等)等疾??；(F)感染癥，由于病原體傷害生物體的細(xì)胞·組織·臟器產(chǎn)生的疾患、或起因于給人帶來感染癥的病原體的疾患，病原體來自于1)細(xì)菌(包括螺旋體、衣原體、立克次體)、2)病毒、3)真菌、4)植物(藻類)、5)原蟲、6)寄生蟲(吸蟲、條蟲、線蟲)、7)節(jié)足動(dòng)物，包括細(xì)菌性感染癥(霍亂、瘟疫、大腸桿菌感染癥等)、螺旋體感染癥(鉤端螺旋體病等)、衣原體感染癥(鸚鵡病等)、立克次體感染癥(斑疹傷寒、破傷風(fēng)等)、病毒性感染癥(帶狀皰疹、病毒性出血熱、狂犬病等)、真菌癥(念珠菌病、隱球菌病、曲霉菌病等)、原蟲性疾患(阿米巴性痢疾、瘧疾、弓形體病等)、寄生蟲(吸蟲癥、線蟲癥等)、此外還包括支原體感染癥(支原體肺炎等)、分支桿菌感染癥(結(jié)核、非定型抗酸菌癥等)疾??；(G)皮膚科領(lǐng)域的疾患，i)皮膚感染癥、包括變態(tài)性炎癥和自身免疫性炎癥等在內(nèi)的皮炎癥，干癬、水皰癥、膿皰癥、角化、角化異常癥等具有特有炎癥的皮膚疾患、ii)來自于由于美容皮膚科相關(guān)的損傷或老化，與a)黑色素代謝調(diào)節(jié)(美白)、b)毛發(fā)成長(生發(fā))的調(diào)節(jié)、c)膠原產(chǎn)生調(diào)節(jié)有關(guān)的皮膚科領(lǐng)域的疾患(包括老化)；(H)生活習(xí)慣病，來自于包括高脂血癥、動(dòng)脈硬化癥、高血壓、糖尿病等在內(nèi)的疾??；(I)有關(guān)正常細(xì)菌叢的維持的異常；(J)來自于包括淀粉樣變性、阿爾茨海默病、骨質(zhì)疏松癥、骨折等在內(nèi)的疾?。?K)腦、神經(jīng)領(lǐng)域中的炎癥反應(yīng)，例如伴隨著腦梗塞、心肌梗塞等缺血性病變的進(jìn)展出現(xiàn)的炎癥、綜合失調(diào)癥；(L)痛風(fēng)；(M)骨質(zhì)疏松癥；或(N)間質(zhì)性肺炎。
(18)分析或檢查試劑，特征是作為有效成分含有選自于上述(1)～(5)中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)、上述(6)～(8)中任一項(xiàng)所述的核酸、上述(9)或(10)所述的重組載體以及上述(11)或(12)所述的轉(zhuǎn)化體的成分。
發(fā)明的效果就半乳凝素9得到的半乳凝素9突變體由于與野生型比較對蛋白水解酶穩(wěn)定，可在半乳凝素9具有的生物體內(nèi)功能的闡明中利用，可在對半乳凝素9在腫瘤化細(xì)胞的調(diào)控、免疫調(diào)節(jié)、以及變態(tài)性和炎癥的控制等各種各樣的生物體反應(yīng)的調(diào)控·調(diào)節(jié)中起到的功能·活性進(jìn)行的研究中使用。另外，該半乳凝素9突變體及其相關(guān)物質(zhì)有望用作臨床應(yīng)用、分子生物學(xué)應(yīng)用、生物化學(xué)應(yīng)用、醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的試藥和活性劑。
本發(fā)明的另外的目的、特征、優(yōu)點(diǎn)以及其它觀點(diǎn)通過以下敘述同行人就都明白了。然而，包括以下的記載以及具體的實(shí)施例等記載在內(nèi)的本件說明書的記載是表示本發(fā)明的理想方式，希望理解為只是為了說明給出的。在本說明書公布的本發(fā)明的意圖以及范圍內(nèi)進(jìn)行的各種變化和/或改變(或修飾)通過以下記載以及本說明書的其它部分的知識(shí)對于業(yè)內(nèi)人士容易明白。本說明書中引用的所有專利文獻(xiàn)和參考文獻(xiàn)是為了說明的目的引用，這些文獻(xiàn)作為本說明書的一部分，其內(nèi)容應(yīng)當(dāng)解釋為包括在說明書中。


圖1表示半乳凝素9突變體(G9NC(null))表達(dá)載體的構(gòu)建方法。
圖2表示半乳凝素9突變體(G9NC(null))表達(dá)物以及純化處理物的電泳照片。
圖3表示比較野生型半乳凝素9(G9(M))和半乳凝素9突變體(G9NC(null))之間對蛋白水解酶的耐性的結(jié)果。對于純化標(biāo)準(zhǔn)品，存在的大腸桿菌蛋白水解酶的耐性進(jìn)行了研究。圖表示電泳照片。
圖4表示比較野生型半乳凝素9(G9(S))和半乳凝素9突變體(G9NC(null))之間對蛋白水解酶的耐性的結(jié)果。研究了對基質(zhì)金屬蛋白水解酶-3(MMP-3)的耐性。圖表示電泳照片。
圖5表示比較野生型半乳凝素9(G9(S))和半乳凝素9突變體(G9NC(null))之間對蛋白水解酶的耐性的結(jié)果。研究了對彈性蛋白酶(彈性蛋白酶)的耐性。圖表示電泳照片。
圖6表示在野生型半乳凝素9(G9(S))和半乳凝素9突變體(G9NC(null))之間對生物活性進(jìn)行比較的結(jié)果。研究了對MOLT-4細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)活性(DNA梯形成)。圖表示電泳照片。
圖7表示在野生型半乳凝素9(G9(S))和半乳凝素9突變體(G9NC(null))之間對生物活性進(jìn)行比較的結(jié)果。研究了對外周血嗜酸細(xì)胞的ECA活性。
圖8表示對半乳凝素9EST克隆進(jìn)行BLAST序列檢索，對來自不同源的各克隆序列進(jìn)行比較的結(jié)果。通過檢索，各克隆表現(xiàn)出97-99％的同源性(同一性)。在5，88，135，238，281位置表現(xiàn)出變異。
圖9表示酵母多糖誘發(fā)胸膜炎，但就單獨(dú)半乳凝素9突變體(h-gal9NC(null))來說，不誘發(fā)炎癥。
圖10表示對半乳凝素9突變體(h-gal9NC(null))在酵母多糖誘導(dǎo)胸膜炎模型中的效果進(jìn)行研究的結(jié)果。
圖11表示對半乳凝素9突變體(Gal-9＝G9NC(null))在PMA誘導(dǎo)皮炎(類固醇敏感性模型)中的效果進(jìn)行研究的結(jié)果。
圖12表示對半乳凝素9突變體(Gal-9＝G9NC(null))在花生四烯酸誘導(dǎo)皮炎(類固醇非敏感性模型)中的效果進(jìn)行研究的結(jié)果。
圖13表示對半乳凝素9突變體(Gal-9＝G9NC(null))在辣椒辣素誘導(dǎo)皮炎模型中的效果進(jìn)行研究的結(jié)果。
圖14表示對半乳凝素9突變體(Gal-9＝G9NC(null))在DNFB誘導(dǎo)接觸皮炎模型中的效果進(jìn)行研究的結(jié)果。
圖15表示對半乳凝素9突變體(Gal-9＝G9NC(null))在DNFB誘導(dǎo)接觸皮炎模型中的效果進(jìn)行研究的結(jié)果。
圖16表示對半乳凝素9突變體(Gal-9＝G9NC(null))在FITC誘導(dǎo)特應(yīng)性皮炎模型中的效果進(jìn)行研究的結(jié)果。
圖17表示對半乳凝素9突變體(Gal-9＝G9NC(null))對于蕁麻疹模型的效果進(jìn)行研究的結(jié)果。
圖18表示對半乳凝素9突變體(Gal-9＝G9NC(null))對于蕁麻疹模型的效果進(jìn)行研究的結(jié)果。
圖19表示對半乳凝素9突變體(h-gal9NC(null))對于關(guān)節(jié)炎模型的效果進(jìn)行研究的結(jié)果。
圖20表示半乳凝素9突變體在皮下移植模型中的抑制腫瘤細(xì)胞增殖效果、即表示抗腫瘤活性(抗癌效果)測定的結(jié)果。上段為對照組，下段為半乳凝素9突變體注入組(直至5周什么樣的腫瘤都沒可見)。
圖21是半乳凝素9突變體在皮下移植模型中的抑制腫瘤細(xì)胞增殖效果、即表示抗腫瘤活性(抗癌效果)測定的結(jié)果，給出了組織病理解析的組織照片。表示給予LLC+半乳凝素9突變體(Gal9)(下段)時(shí)5周的皮膚。肉眼看為白色調(diào)。
圖22表示半乳凝素9突變體(穩(wěn)定化半乳凝素9)在培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞(Meth A細(xì)胞，24h)中誘導(dǎo)凋亡(細(xì)胞損傷活性)的結(jié)果。
圖23表示半乳凝素9突變體(穩(wěn)定化半乳凝素9)在培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞(B16/F10細(xì)胞，24h)中誘導(dǎo)凋亡(細(xì)胞損傷活性)的結(jié)果。
圖24是動(dòng)物的存活曲線，表示在由Meth A細(xì)胞引起的癌性腹膜炎模型中，半乳凝素9突變體具有抗腫瘤效果。
圖25表示在由Meth A細(xì)胞引起的癌性腹膜炎模型中，未給予半乳凝素9突變體(Gal9)組(上段)給予組(下段)中小鼠的狀態(tài)的照片。
圖26為動(dòng)物的生存曲線，表示在由B16/F10細(xì)胞引起的癌性腹膜炎模型中半乳凝素9突變體具有抗腫瘤效果。
圖27對比半乳凝素9突變體(Gal-9)給予組と非給予組中由B16/F10細(xì)胞(黑素瘤)引起的癌性腹膜炎模型小鼠的狀態(tài)，內(nèi)臟組織(第14天)的照片。
圖28表示研究半乳凝素9突變體(穩(wěn)定化半乳凝素9)影響免疫細(xì)胞的結(jié)果。是B16/F10腹腔內(nèi)浸潤細(xì)胞(24h)的解析結(jié)果。
圖29表示使用半乳凝素9突變體(穩(wěn)定化半乳凝素9)進(jìn)行的抑制粘附實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。是B16/F10細(xì)胞(1h)的解析結(jié)果。圖中、Collagentype I表示I型膠原、Collagen type IV表示IV型膠原、Laminin表示層粘連蛋白、Fibronectin表示纖連蛋白、Vitronectin表示玻連蛋白。
圖30表示對半乳凝素9突變體(Gal-9)和地塞米松(Dex.)在壁虱抗原誘發(fā)哮喘模型中的作用效果進(jìn)行測定的結(jié)果。
圖31表示對半乳凝素9突變體(Gal-9)和地塞米松(Dex.)在壁虱抗原誘發(fā)哮喘模型中的作用效果進(jìn)行測定的結(jié)果。給出了存在于BALF中的各細(xì)胞數(shù)。
圖32表示對半乳凝素9突變體(Gal-9)在壁虱抗原誘發(fā)哮喘模型中的作用效果進(jìn)行測定的結(jié)果(支氣管周圍組織的照片)。
圖33表示對半乳凝素9突變體(Gal-9)和地塞米松(Dex.)在OVA誘發(fā)哮喘模型(小鼠)中的作用效果進(jìn)行測定的結(jié)果。
圖34表示對半乳凝素9突變體(Gal-9)和地塞米松(Dex.)在OVA誘發(fā)哮喘模型(小鼠)中的作用效果進(jìn)行測定的結(jié)果。給出了存在于BALF中的各細(xì)胞數(shù)。
圖35表示對半乳凝素9突變體(Gal-9)影響OVA誘發(fā)哮喘模型(豚鼠)中的即時(shí)型哮喘(IAR)·延遲型哮喘(LAR)的作用。
圖36表示對半乳凝素9突變體(Gal-9)在OVA誘發(fā)哮喘模型(豚鼠)中的作用效果進(jìn)行測定的結(jié)果。給出了存在于BALF中的各細(xì)胞數(shù)。。
圖37表示對半乳凝素9突變體(Gal-9)在自身免疫性溶血性貧血模型(小鼠)中的作用效果進(jìn)行測定的結(jié)果(血細(xì)胞比容(％))。
圖38表示對半乳凝素9突變體(Gal-9)和地塞米松(Dex.)在阿蒂斯(Arthus)反應(yīng)(血管炎)模型(小鼠)中的作用效果進(jìn)行測定的結(jié)果。
圖39表示對半乳凝素9突變體(Gal-9)和地塞米松(Dex.)在ARDS模型(小鼠)中的作用效果進(jìn)行測定的結(jié)果。
圖40表示對半乳凝素9突變體(Gal-9)和地塞米松(Dex.)在ARDS模型(小鼠)中的作用效果進(jìn)行測定的結(jié)果。給出了存在于BALF中的各細(xì)胞數(shù)。
圖41表示對半乳凝素9突變體(Gal-9)在辣椒辣素誘導(dǎo)炎癥模型中的作用效果進(jìn)行測定的結(jié)果。
圖42表示對半乳凝素9突變體(Gal-9)影響破骨細(xì)胞形成的效果進(jìn)行試驗(yàn)的結(jié)果。表明有抑制效果。
圖43表示對通過半乳凝素9突變體(gal-9)刺激產(chǎn)生的單細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)(M-CSF存在下)進(jìn)行試驗(yàn)的結(jié)果。
圖44表示對通過半乳凝素9突變體(gal-9)刺激對人成骨細(xì)胞增殖影響的效果進(jìn)行試驗(yàn)的結(jié)果。
圖45表示對通過半乳凝素9突變體(Galectin-9)刺激(8hr)影響人成骨細(xì)胞分化標(biāo)志的表達(dá)的效果進(jìn)行試驗(yàn)的結(jié)果。
圖46表示存活率，對半乳凝素9突變體對間質(zhì)性肺炎模型的作用進(jìn)行試驗(yàn)的結(jié)果。
圖47表示對半乳凝素9突變體對間質(zhì)性肺炎模型的作用進(jìn)行試驗(yàn)的結(jié)果。給出了存活14天例的肺組織(HE染色、照片)。
圖48是動(dòng)物的生存曲線，表示在LLC細(xì)胞(凋亡(+))導(dǎo)致的癌性腹膜炎模型中，半乳凝素9突變體具有抗腫瘤效果。
圖49表示使用B16/F10細(xì)胞，研究半乳凝素9突變體對癌轉(zhuǎn)移模型的作用的結(jié)果(模型動(dòng)物的肺外觀)。
圖50表示使用B16/F10細(xì)胞，研究半乳凝素9突變體(G9NC(null))對癌轉(zhuǎn)移模型的作用的結(jié)果(對肺的結(jié)節(jié)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)的結(jié)果)。
圖51表示對半乳凝素9突變體(gal-9)(靜脈內(nèi)(i.v.)注射)在角叉菜膠誘發(fā)炎癥模型中的作用效果進(jìn)行測定的結(jié)果。
圖52為了比較給出了對作為陽性對照的地塞米松(Dex.)在角叉菜膠誘發(fā)炎癥模型中的作用效果進(jìn)行測定的結(jié)果。
圖53表示使用免疫組織染色對半乳凝素在風(fēng)濕病(RA)關(guān)節(jié)滑膜中的表達(dá)進(jìn)行研究的結(jié)果。
圖54表示對半乳凝素對風(fēng)濕病(RA)滑膜細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)活性進(jìn)行研究的光學(xué)顯微鏡觀察的結(jié)果。
圖55表示用PI法對半乳凝素對風(fēng)濕病(RA)滑膜細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)活性進(jìn)行研究的結(jié)果。
圖56表示對半乳凝素對風(fēng)濕病(RA)滑膜細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)活性進(jìn)行研究的結(jié)果。
圖57表示對半乳凝素對風(fēng)濕病(RA)滑膜細(xì)胞增殖的抑制活性進(jìn)行研究的結(jié)果。
圖58表示對半乳凝素-9突變體在佐劑性關(guān)節(jié)炎模型中的作用(抑制由于機(jī)械刺激引起的疼痛)進(jìn)行研究的結(jié)果。
圖59為了比較給出了在佐劑性關(guān)節(jié)炎模型中的作用(抑制由于機(jī)械刺激引起的疼痛)進(jìn)行研究的結(jié)果(作為陽性對照的吲哚美辛的作用)。
圖60表示對半乳凝素-9突變體在角叉菜膠誘發(fā)急性炎癥模型中的作用(抑制機(jī)械刺激產(chǎn)生的疼痛)進(jìn)行研究的結(jié)果。
圖61為了比較給出了在角叉菜膠誘發(fā)急性炎癥模型中的作用(抑制由于機(jī)械刺激引起的疼痛)進(jìn)行研究的結(jié)果(作為陽性對照的地塞米松的作用)。
圖62表示對半乳凝素-9突變體在人關(guān)節(jié)液中的穩(wěn)定性進(jìn)行研究的結(jié)果(SDS-PAGE)。
圖63表示對半乳凝素-9突變體(穩(wěn)定化半乳凝素-9)在關(guān)節(jié)炎模型(抗體混合物引起的模型)中的作用進(jìn)行研究的結(jié)果(i.v.注入)。
圖64表示半乳凝素-9突變體(穩(wěn)定化半乳凝素-9)在關(guān)節(jié)炎模型(膠原關(guān)節(jié)炎模型)中的作用進(jìn)行研究的結(jié)果(i.p.注入)。
圖65表示半乳凝素-9突變體(穩(wěn)定化半乳凝素-9)在關(guān)節(jié)炎模型(膠原關(guān)節(jié)炎模型)中的作用進(jìn)行研究的結(jié)果(i.v.注入)。
圖66表示半乳凝素-9突變體(穩(wěn)定化半乳凝素-9)在關(guān)節(jié)炎模型中的作用進(jìn)行研究的結(jié)果(i.v.注入)。
圖67為了比較給出了對在佐劑性關(guān)節(jié)炎模型中的作用進(jìn)行研究的結(jié)果(陽性對照的吲哚美辛的作用)。
圖68表示對半乳凝素-9突變體在大鼠CIA(膠原致敏)模型中的作用進(jìn)行研究的結(jié)果(i.v.注入)。
具體實(shí)施例方式
參考到目前為止公開發(fā)表的研究和相關(guān)的專利申請，其內(nèi)容都包括在本說明書的內(nèi)容中。
所謂「半乳凝素9突變體」指的是提供對半乳凝素9的糖鏈識(shí)別部位含有的特定糖鏈特異結(jié)合的活性或與此類似的活性(本活性中包括定性的活性和/或定量的活性)的物質(zhì)。半乳凝素9對特定細(xì)胞具有凋亡誘導(dǎo)活性，而本半乳凝素9突變體可以是具有野生型半乳凝素9具有的凋亡誘導(dǎo)活性或具有與它類似的活性的突變體，也可以是半乳凝素9具有的生物活性被改變或修飾的突變體，對于某些場合更理想。所謂本發(fā)明中特別理想的半乳凝素9突變體指的是作為具有生物活性的試藥，在臨床檢查領(lǐng)域、分析領(lǐng)域、或醫(yī)學(xué)或藥物等領(lǐng)域中，表現(xiàn)出比野生型半乳凝素9更好的性質(zhì)。
半乳凝素9突變體，例如可以是半乳凝素9或基本上具有與半乳凝素9同等活性的蛋白質(zhì)的連接肽或其附近區(qū)域被改變的蛋白質(zhì)或其鹽、由在半乳凝素9或基本上具有與半乳凝素9同等活性的蛋白質(zhì)的連接肽或其附近區(qū)域的氨基酸序列中缺失、取代或添加1個(gè)或1個(gè)以上的氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成，與半乳凝素9比較，實(shí)施了至少對于連接肽的分解敏感性被改變的改變的蛋白質(zhì)或其鹽、可以是基本上具有與半乳凝素9同等活性的蛋白質(zhì)，而且與半乳凝素9的氨基酸序列具有至少70％以上的同源性、或至少75％以上的同源性、或至少80％以上的同源性、或至少85％以上的同源性、或至少90％以上的同源性、或至少95％以上的同源性的蛋白質(zhì)或其鹽、也可以是(1)半乳凝素9的N末端側(cè)的糖鏈識(shí)別領(lǐng)域(NCRD)或與其具有基本上同等活性的多肽與(2)具有半乳凝素9的C末端側(cè)的糖鏈識(shí)別區(qū)域(CCRD)或與該區(qū)域具有基本上同等活性的多肽借助于(3)半在乳凝集素9的連接肽的氨基酸序列中缺失、取代或添加的1個(gè)或1個(gè)以上的氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的改變連接肽連接的蛋白質(zhì)或其鹽等。
可是，半乳凝素9是在J.Biol.Chem.，272(10)pp.6416-6422(1997)報(bào)告中在由惡性淋巴肉芽腫病患者的脾臟制備的cDNA中發(fā)現(xiàn)了新的半乳凝素，將該半乳凝素取名為半乳凝素9，同時(shí)為了避開惡性淋巴肉芽腫病腫瘤中的序列變異，通過正常人的外周血調(diào)制的cDNA進(jìn)行了序列的再確認(rèn)，最終決定了半乳凝素9的序列，該序列表示在該文獻(xiàn)的第6418頁的FIG.1。另外關(guān)于半乳凝素9進(jìn)一步在J.Biol.Chem.，273(27)pp.16976-16984(1998)中報(bào)道了從由生產(chǎn)嗜酸性細(xì)胞趨化因子的T細(xì)胞株、STO-2制備的cDNA分離了趨化因子Ecalectin(ecalectin)，該因子雖然與先前報(bào)告的上述半乳凝素9的同源性高，可是在氨基酸序列位置中看到第5，88，135，238，281位的氨基酸不同，ecalectin序列記載在該文獻(xiàn)的第16983頁的Fig.8，而且進(jìn)一步推測ecalectin為半乳凝素9的變異體。
另外在J.Biol.Chem.，275(12)pp.8355-8360(2000)中報(bào)道了從由Jurkat T-cell制備的cDNA分離半乳凝素9，制作重組(重組)蛋白質(zhì)，由于該半乳凝素9重組蛋白質(zhì)表現(xiàn)出嗜酸性細(xì)胞趨化活性，所以平島等人決定將帶有來自于Jurkat T-cell的序列的半乳凝素9在今后研究中使用，其中在氨基酸序列位置中的第5，88，135，238，281位的氨基酸分別適用Gly，Lys，Ser，Pro，Glu，上述的松本等人(J.Biol.Chem.，273(27)pp.16976-16984(1998))報(bào)告的ecalectin雖然第5位的氨基酸在Ser和Gly這一點(diǎn)上不同，但在嗜酸性細(xì)胞趨化活性上沒有差異，另外，即使對17個(gè)登錄在EST數(shù)據(jù)庫的半乳凝素9的序列(包括部分序列)進(jìn)行查詢，認(rèn)為對于第5，88，135，238，281位的氨基酸分別適用Gly，Lys，Ser，Pro，Glu妥當(dāng)，半乳凝素9的變異被記載在該文獻(xiàn)的第8359頁的Table II(參照圖8)。圖8中，Gly(G)，Lys(K)，Ser(S)，Pro(P)，Glu(E)。
在J.Biol.Chem.，272(9)pp.6078-6086(1997)(非專利文獻(xiàn)3)中根據(jù)氨基酸序列的類似性決定了2個(gè)糖識(shí)別部位(CRD)和連接它們的連接區(qū)的26個(gè)氨基酸(對于半乳凝素9M型)(參照同文獻(xiàn)的Fig.1)。即從序列5所示的氨基酸序列看，確定C端側(cè)的糖鏈識(shí)別域(CCRD)從Met175開始。然后基于此結(jié)果，人半乳凝素9的CRD和連接區(qū)被登錄在NCBI數(shù)據(jù)庫的Accession Number NP_033665。另外在J.Biol.Chem.，273(5)pp.2954-2960(1998)中給出了半乳凝素4和6的報(bào)告，其中與CRD的連接區(qū)的設(shè)定根據(jù)氨基酸序列、基因序列決定，這些序列如同文獻(xiàn)的第2956頁的Fig.2所示，但在將該設(shè)定反映在半乳凝素9中時(shí)，所謂前者(J.Biol.Chem.，272(9)pp.6079-6086(1997))的設(shè)定在連接區(qū)和C端側(cè)的CRD中是不同的。即從序列5所示的氨基酸序列看，CCRD應(yīng)當(dāng)從Phe195開始。
本發(fā)明者等研究組根據(jù)非專利文獻(xiàn)3中的設(shè)定在將由外顯子形成的剪接邊界存在于象處于Gln148-Pro149間、Ile160-Thr161間、Ser177-Thr178間那樣的3個(gè)氨基酸區(qū)間C端側(cè)考慮在內(nèi)的同時(shí)，將有關(guān)C端側(cè)CRD的結(jié)合糖能力的研究，即在序列5所示的氨基酸序列看到，使從Thr178開始的全長CCRD表達(dá)時(shí)有結(jié)合乳糖能力，即使再削除6個(gè)氨基酸(從序列Met184開始的CCRD片段)、削除12氨基酸(從Ala190開始的CCRD片段)，仍有結(jié)合乳糖能力，如果消除22氨基酸(從Leu200開始的CCRD片段)，由于不能在大腸桿菌中表達(dá)，從序列5所示的氨基酸序列看，能夠考察到CCRD從Phe195開始的設(shè)定更嚴(yán)謹(jǐn)也一并考慮在內(nèi)，作為C端側(cè)的CRD定為序列5所示的氨基酸序列Thr178～Thr323的序列。有關(guān)半乳凝素9的N端側(cè)CRD(NCRD)，在序列5所示的氨基酸序列看到，使直至Gln148的全長NCRD表達(dá)時(shí)有結(jié)合乳糖能力，如果消除9個(gè)氨基酸(序列Met1～Ser139的NCRD片段)，雖然蛋白質(zhì)能表達(dá)，但由于結(jié)合乳糖能力消失，所以作為N端側(cè)的CRD定為序列5所示氨基酸序列中的Met1～Gln148序列。
在理想的方式中，半乳凝素9突變體是例如(1)具有在作為半乳凝素9的NCRD如序列2所示的氨基酸序列或其序列中缺失、取代或添加1個(gè)或1個(gè)以上的氨基酸的序列、或?qū)π蛄?所示的氨基酸序列具有至少70％以上的同源性、或至少75％以上的同源性、或至少80％以上的同源性、或至少85％以上的同源性、或至少90％以上的同源性、或至少95％以上的同源性的氨基酸序列，而且具有結(jié)合乳糖能力的突變體、(2)具有作為半乳凝素9的CCRD入序列3所示的氨基酸序列或在序列中缺失、取代或添加1個(gè)或1個(gè)以上氨基酸的突變體、或?qū)π蛄?所示的氨基酸序列具有至少70％以上的同源性、或至少75％以上的同源性、或至少80％以上的同源性、或至少85％以上的同源性、或至少90％以上的同源性、或至少95％以上的同源性的氨基酸序列，且具有結(jié)合乳糖能力的突變體、(3)具有作為結(jié)合上述(1)和(2)的連接區(qū)如序列9所示的氨基酸序列或在該序列中缺失、取代或添加1個(gè)或1個(gè)以上氨基酸的突變體、優(yōu)選對于基質(zhì)金屬蛋白水解酶等蛋白質(zhì)分解酶比天然的半乳凝素9穩(wěn)定的突變體。作為該連接區(qū)(3)，包括序列9所示的氨基酸序列中的氨基酸殘基缺失1個(gè)以上(例如、1～2個(gè)、優(yōu)選3～4個(gè)、更優(yōu)選5～6個(gè)、更優(yōu)選7～8個(gè)、特別優(yōu)選1～9個(gè)等)的缺失類似體、該氨基酸殘基的1個(gè)以上(例如、1～9個(gè)、優(yōu)選1～8個(gè)、更優(yōu)選1～6個(gè)、更優(yōu)選1～4個(gè)、特別優(yōu)選1～2個(gè)等)被其它殘基置換的置換類似體、附加1個(gè)以上(例如、1～60個(gè)、優(yōu)選1～40個(gè)、更優(yōu)選1～20個(gè)、更優(yōu)選1～10個(gè)、特別優(yōu)選1～5個(gè)等)的氨基酸殘基(但是，序列7和8所示的氨基酸序列中除去了序列9所示氨基酸序列后的部分表示的序列除外)的付加類似體。作為代表性的該連接區(qū)(3)，如序列9所示的氨基酸序列被HM，RIP，或任意的2氨基酸序列置換的連接區(qū)等。氨基酸的置換、缺失、或插入可以是不使多肽的生理特性或化學(xué)特性發(fā)生大變化的改變，有時(shí)可以給出理想的變化。作為該氨基酸序列中的氨基酸的置換體，可以從該氨基酸所屬的類中的其它氨基酸類選擇。例如、作為非極性(疏水性)氨基酸，如丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、色氨酸、蛋氨酸等、作為極性(中性)氨基酸，如甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺等，作為帶有正電荷的氨基酸(堿性氨基酸)，如精氨酸、賴氨酸、組氨酸等，作為帶有負(fù)電荷的氨基酸(酸性氨基酸)，如天冬氨酸、谷氨酸等。
而作為該連接區(qū)(3)，如對序列7或8所示的氨基酸序列除去序列9所示的氨基酸序列部分，用HM，RIP，或任意的2氨基酸序列置換的序列，在序列7或8所示的氨基酸序列中除去序列9所示氨基酸序列部分，剩下其中的6氨基酸，將其它的殘基削除后的序列等。另外作為該連接區(qū)(3)，也包括序列7或8所示的氨基酸序列中的氨基酸殘基(但是，除去例如序列9所示的氨基酸序列部分，或序列7的場合可以除去序列8所示的氨基酸序列部分)缺失1個(gè)以上(例如1～5個(gè)、優(yōu)選3～10個(gè)、更優(yōu)選5～15個(gè)、更優(yōu)選7～20個(gè)、特別優(yōu)選1～32個(gè)等)的缺失類似體、1個(gè)以上的該氨基酸殘基(例如1～9個(gè)、優(yōu)選1～8個(gè)、更優(yōu)選1～6個(gè)、更優(yōu)選1～4個(gè)、特別優(yōu)選1～2個(gè)等)被其它殘基置換的置換類似體、附加1個(gè)以上(例如1～60個(gè)、優(yōu)選1～40個(gè)、更優(yōu)選1～20個(gè)、更優(yōu)選1～10個(gè)、特別優(yōu)選1～5個(gè)等)的氨基酸殘基(但是，序列7和8所示的氨基酸序列中除去了序列9所示氨基酸序列后的部分表示的序列除外)的付加類似體。
如果能維持作為天然的人半乳凝素9蛋白質(zhì)的特征的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)或糖結(jié)合能力，上述那樣的變異體都包含在本發(fā)明中。另外認(rèn)為本發(fā)明的肽或多肽也可以包含具有與天然人半乳凝素9蛋白質(zhì)基本上同等的一級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象或其一部分肽或多肽，而且還可以包含具有與天然的基本上同等生物學(xué)活性的肽或多肽。還可以是天然產(chǎn)生的一種變異體。本發(fā)明的來自人的蛋白質(zhì)(或肽或多肽)例如與選自WO 02/37114 A1的序列表中SEQ ID NO1～3的氨基酸序列有60％、由于場合不同，可以具有70％更高的同源性蛋白質(zhì)，更優(yōu)選具有80％或90％以上的相同氨基酸序列的蛋白質(zhì)。所謂本發(fā)明的來自人的蛋白質(zhì)的一部分是來自該人的蛋白質(zhì)的一部分的肽(即該蛋白質(zhì)的部分肽)，只要是與本發(fā)明的半乳凝素9蛋白質(zhì)具有基本上同等活性的蛋白質(zhì)，可以為任一種蛋白質(zhì)。例如、該本發(fā)明的蛋白質(zhì)的部分肽具有該人半乳凝素9的構(gòu)成氨基酸序列中至少5個(gè)以上、優(yōu)選20個(gè)以上、更優(yōu)選50個(gè)以上、更優(yōu)選70個(gè)以上、最好優(yōu)選100個(gè)以上、有時(shí)200個(gè)以上氨基酸殘基的氨基酸序列的肽，最好是這些肽是對應(yīng)于連續(xù)的氨基酸殘基的肽，或例如就相對于該WO 02/37114 A1的序列表SEQ ID NO1～3中任一項(xiàng)表示的氨基酸序列中對應(yīng)的區(qū)域的同源性來說，具有與上述同樣的同源性的肽。
在本說明書中所謂「基本上同等」指的是蛋白質(zhì)的活性、例如、所定的傷害細(xì)胞活性、誘發(fā)凋亡活性、抗炎癥活性、抗變態(tài)性活性、免疫調(diào)節(jié)活性、糖鏈結(jié)合活性、生理活性、生物學(xué)活性基本上相同。另外該用語的意思中可以包括具有基本上同質(zhì)的活性的場合，作為基本上同質(zhì)的活性，如結(jié)合活性、傷害細(xì)胞活性、誘發(fā)凋亡活性等。所謂基本上同質(zhì)的活性表示它們的活性從性質(zhì)上講是同質(zhì)，例如在生理上、藥理學(xué)上、或生物學(xué)上同質(zhì)。例如、結(jié)合活性、傷害細(xì)胞活性、誘發(fā)凋亡活性等活性雖然最好是同等(例如、約0.001～約1000倍、優(yōu)選約0.01～約100倍、更優(yōu)選約0.1～約20倍、更優(yōu)選約0.5～約2倍)，但這些活性的程度、蛋白質(zhì)的分子量等量的要素也可以不同。
所謂「半乳凝素9突變體多肽」包括野生型半乳凝素9的天然序列的突變體、其衍生物、類似體(類似物)、片段、嵌合體、以及變異體。該多肽包括意圖能夠在宿主細(xì)胞表達(dá)，且通過設(shè)計(jì)成能夠編碼特定的半乳凝素9突變體多肽的重組產(chǎn)生的聚核苷酸序列編碼的多肽。
所謂「半乳凝素9突變體治療劑」指的是來自編碼半乳凝素9突變體的聚核苷酸(半乳凝素9突變體聚核苷酸)或半乳凝素9突變體多肽序列的分子、包含這樣的半乳凝素9突變體的聚核苷酸或多肽的突變體、變異體、類似體、嵌合體、片段等中的至少一個(gè)。所謂作為聚核苷酸的半乳凝素9突變體治療劑，一般來說是編碼半乳凝素9突變體多肽的序列，而且包括在宿主細(xì)胞中通過重組技術(shù)可表達(dá)的。另外，半乳凝素9突變體治療劑可以是半乳凝素9活性的激動(dòng)劑。其它的半乳凝素9突變體治療劑，可以包括供給半乳凝素9突變體的治療劑，具有半乳凝素9突變體有的活性，而且產(chǎn)生對與半乳凝素9活性缺乏或不足有關(guān)的疾患·疾病·異常癥狀有予防和/或治療效果的半乳凝素9活性的調(diào)節(jié)劑。作為半乳凝素9活性的調(diào)節(jié)劑，例如聚核苷酸、多肽、或低分子。
本說明書中使用的用語「診斷劑」指的是在本發(fā)明的診斷使用一種或一種以上的對該診斷行為有用的那樣的任意藥劑。這些藥劑在診斷中的使用可以包括用于決定半乳凝素9產(chǎn)生細(xì)胞的存在的方法或用于決定提示半乳凝素9結(jié)合性物質(zhì)的細(xì)胞的存在的方法的使用。作為診斷劑，例如含有選自編碼半乳凝素9突變體突變蛋白質(zhì)的DNA、穩(wěn)定化半乳凝素9突變體突變蛋白質(zhì)、以及含有該穩(wěn)定化半乳凝素9突變體突變蛋白質(zhì)的細(xì)胞或細(xì)胞勻漿液中的成分。
本說明書中使用的用語「治療劑」可以是在本發(fā)明的治療中使用的一種或一種以上的達(dá)到或?qū)_(dá)到其治療行為有用的任意藥劑。例如、治療劑是被設(shè)計(jì)為能夠表達(dá)半乳凝素9突變體多肽的聚核苷酸，該藥劑是在給予哺乳動(dòng)物后，然后能夠在細(xì)胞中表達(dá)的聚核苷酸。此時(shí)藥劑的活性形式是被表達(dá)的多肽。
半乳凝素9突變體治療劑是具有半乳凝素9突變體生物活性的治療劑、或比天然的半乳凝素9突變體更長，對特定糖鏈具有結(jié)合的活性的多肽、編碼對基質(zhì)金屬蛋白水解酶等蛋白質(zhì)分解酶比天然的半乳凝素9更穩(wěn)定的半乳凝素9突變體多肽的聚核苷酸那樣的來自半乳凝素9突變體的治療劑。該治療劑單獨(dú)、或與其它藥劑(例如、與半乳凝素9突變體的給予一起使用的，且對特定的腫瘤或自身免疫等的在其它眾所周知的治療法中使用的那樣藥物、或在哺乳動(dòng)物中容易進(jìn)行半乳凝素9突變體的表達(dá)那樣的基因遞送載體等)配合達(dá)到其治療目的。例如、該治療劑可以是包括為其它目的開發(fā)的半乳凝素9突變體治療劑，以及半乳凝素9的激動(dòng)劑、對半乳凝素9活性進(jìn)行修飾或調(diào)節(jié)的藥物，例如有機(jī)低分子化合物或物質(zhì)、肽、肽樣化合物或物質(zhì)、編碼半乳凝素9突變體多肽的聚核苷酸、半乳凝素9突變體多肽、表達(dá)對蛋白水解酶比天然的半乳凝素9更穩(wěn)定的半乳凝素9突變體的嵌合體或變異體等，且被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
本說明書中所謂的「配合治療劑」指的是一起給予時(shí)，產(chǎn)生它們各自效果的含有幾個(gè)成分或幾個(gè)藥劑的治療組成物，配合治療劑也指為了治療疾患等一起給予時(shí)產(chǎn)生相乗效果那樣的制劑。最好是通過配合治療劑中的幾個(gè)成分或幾個(gè)藥劑的各自作用得到的其它各種作用效果，為了能夠獲得更大的治療效果、例如腫瘤的消失或正常化、從自身免疫疾患回復(fù)和獲得長期生存，可以使這些成分組合。作為給予配合治療劑后得到的效果的例子，如在短期的癥狀回復(fù)和長期給予后得到的癥狀的回復(fù)的組合，或使對患者中的特定型的各個(gè)細(xì)胞的自身免疫應(yīng)答減少那樣的效果的組合。作為本發(fā)明的配合治療劑的例子，如用于給予含有編碼半乳凝素9突變體的聚核苷酸與編碼IFN類，IL-2等細(xì)胞因子類中的至少一個(gè)的聚核苷酸的基因遞送載體的配合治療劑等。其它的例子也可以使用2個(gè)基因遞送載體，例如、一個(gè)表達(dá)半乳凝素9突變體，另一個(gè)用于表達(dá)細(xì)胞因子類中至少一個(gè)。另外，為了預(yù)測給予半乳凝素9突變體在靶細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡，進(jìn)行正調(diào)節(jié)，也可以給予表達(dá)IFN類，IL-2等、或IFN-γ等的基因遞送載體。各種治療劑也可以同時(shí)供給，例如、為了提高治療效率，根據(jù)需要，可以重復(fù)給予各個(gè)藥劑中的1個(gè)或全部，也可以加入到同一藥學(xué)上容許的載體中給予。
「基因遞送載體」指的是能夠使用于多肽在細(xì)胞中表達(dá)的編碼序列遞送給細(xì)胞變得容易進(jìn)行那樣的成分。該細(xì)胞為了能夠適于體內(nèi)基因治療也可以存在于哺乳動(dòng)物的體內(nèi)，為了能夠適于體外基因治療進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理，也可以暫時(shí)從哺乳動(dòng)物中取出，使得多肽表達(dá)后再返回到哺乳動(dòng)物?；蜻f送載體可以是能夠完成向細(xì)胞遞送基因那樣的任意成分或載體，例如、可以是脂質(zhì)體、粒子、載體等。作為基因遞送載體，重組載體(例如、重組病毒載體)、核酸載體(例如、質(zhì)粒)、裸核酸分子(例如、基因)、和作為中和核酸分子上的負(fù)電荷，且將核酸分子折疊的分子能夠凝集那樣的多陽離子分子復(fù)合體化的核酸分子、與脂質(zhì)體結(jié)合的核酸(美國專利第5,166,320號(hào)說明書；第5,547,932號(hào)說明書；Wang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，847851，1987)等。該基因遞送載體可以包括象生產(chǎn)細(xì)胞那樣的特定的真核生物細(xì)胞，這些載體是能夠向宿主細(xì)胞遞送具有生物學(xué)的1個(gè)以上所期望的特性的核酸分子的載體。所期望的特性就像以下議論的那樣，例如、可以包括表達(dá)蛋白質(zhì)、酶、或抗體等那樣的所期望物質(zhì)的能力和/或提供生物學(xué)活性的能力。即、通過基因遞送載體轉(zhuǎn)運(yùn)的核酸分子不需要表達(dá)所期望的物質(zhì)，其本身就是活性的藥劑。這樣的生物學(xué)活性的一個(gè)例子是可在基因治療中看到的例子。就基因治療來說，是對某種基因進(jìn)行鈍化，阻斷該基因指示的產(chǎn)物的生產(chǎn)，整合到被遞送的核酸分子能夠特異表達(dá)的基因中?；蜻f送載體指的是為了使得1個(gè)或多個(gè)目的序列或基因表達(dá)能夠進(jìn)行指示的集合體(組件)。
基因遞送載體一般來說包含啟動(dòng)子成份，而且可以包含指示多聚腺苷化的信號(hào)。另外，基因遞送載體還可以與在轉(zhuǎn)錄時(shí)能夠運(yùn)作那樣與1個(gè)或多個(gè)目的序列或基因連接，含有作為翻譯起始序列起作用的序列。另外基因遞送載體還可以含有Neo、SV2Neo、TK、潮霉素、博萊霉素(腐草霉素)、螺旋霉素、組氨醇、DHFR等那樣可選擇標(biāo)志、1個(gè)以上的制限酶部位和翻譯終止序列。在本發(fā)明中能夠使用的場合，基因遞送載體可以包括病毒載體(Jolly，Cancer Gen.Therapy，151-64，1994)、核酸載體、裸DNA、脂質(zhì)體DNA、粘粒、細(xì)菌、特定的真核生物細(xì)胞(包含生產(chǎn)細(xì)胞；參照美國專利第6,333,195號(hào)說明書)那樣的重組載體。
所謂「生物學(xué)的活性」在表示保持特異活性的分子場合下使用。例如、具有生物活性的半乳凝素9突變體多肽對含有半乳凝素9的糖鏈識(shí)別部位的特定糖鏈特異結(jié)合的活性或與它具有基本上同等性質(zhì)的活性，且對基質(zhì)金屬蛋白水解酶等蛋白質(zhì)分解酶比天然的半乳凝素9定性和/或定量保持穩(wěn)定的能力，例如表現(xiàn)出對導(dǎo)致半乳凝素9含有的抗腫瘤活性或凋亡的凋亡途徑進(jìn)行活化的活性。
本說明書中使用的用語「核酸分子」或「聚核苷酸」指的是編碼特定氨基酸序列或編碼其互補(bǔ)鏈的RNA或DNA、以及DNA:RNA雜交體等分子。本說明書中使用的「編碼序列」指的是編碼特定氨基酸序列或編碼其互補(bǔ)鏈的RNA或DNA、以及DNA:RNA雜交體等中的任一種。聚核苷酸例如可以包括反義寡核苷酸、或核酶，另外也可以包括基因的3′或5′非翻譯區(qū)那樣的序列、基因的內(nèi)含子、不構(gòu)成基因的編碼區(qū)域的基因的其它區(qū)域。DNA或RNA可以是單鏈或雙鏈。在合成核酸或合成聚核苷酸中，也包括含有化學(xué)合成核酸序列的序列，以及為了賦予分子對變性的抵抗性預(yù)先從化學(xué)上進(jìn)行的部分改變。聚核苷酸可以通過例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增、使用互補(bǔ)的DNA或RNA的重組表達(dá)等制造，或通過化學(xué)合成生成。
本說明書中用語「表達(dá)調(diào)控序列」或「調(diào)節(jié)序列」指的是包括影響編碼多肽的基因的表達(dá)，包括影響用于轉(zhuǎn)錄和翻譯的信號(hào)表達(dá)的那樣一個(gè)或一個(gè)以上的成分，且在該領(lǐng)域可使用的序列。適于本發(fā)明的多肽表達(dá)的表達(dá)調(diào)控序列因可表達(dá)多肽的宿主系不同而有所不同。
作為本發(fā)明的「多肽」，只要是包含半乳凝素9突變體多肽，可以是任何多肽，如含有成熟蛋白質(zhì)的半乳凝素9突變體蛋白質(zhì)的任意部分，以及其縮短型、突變體、對立基因體、類似物、衍生物等。作為突變體，可以是由與關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)同一基因表達(dá)的剪接后突變體衍生的。另外只要沒有特別指示，這樣的多肽例如可以是具有對特定糖鏈具有特異結(jié)合的親和結(jié)合性或?qū)μ禺悓ο蟮慕Y(jié)合活性等該半乳凝素9蛋白質(zhì)具有的生物活性中的一個(gè)或一個(gè)以上生物活性的多肽。本「多肽」用語并不限定于特定長度的基因產(chǎn)物。不管是來自人的或來自人以外的供給源的，至于半乳凝素9的N末端側(cè)糖鏈識(shí)別部位(NCRD)以及C末端側(cè)糖鏈識(shí)別部位(CCRD)與靶蛋白質(zhì)或成熟蛋白質(zhì)同一的，或至少具有60％、優(yōu)選70％、更優(yōu)選80％、和最好優(yōu)選90％、進(jìn)一步優(yōu)選95％的同源性的多肽都包括在本多肽的這個(gè)定義內(nèi)。因此可以包括基于對立基因的突變體、以及包括氨基酸的置換、缺失、或插入在內(nèi)的基因產(chǎn)物的突變體。氨基酸的置換可以是氨基酸的保守性置換、或?qū)μ腔课弧⒘姿峄课?、乙?；课坏冗M(jìn)行改變那樣的氨基酸置換、對功能不需要的半胱氨酸殘基的位置進(jìn)行改變后，改變了折疊形式的置換、以及除去非必需氨基酸殘基那樣的置換。作為氨基酸的保守性置換一般來說是保存電荷、疏水性/親水性、和/或被置換的氨基酸的立體尺寸(大小)那樣的置換，例如、Gly/Ala、Val/Ile/Leu、Asp/Glu、Lys/Arg、Asn/GIn、Ser/Cys/Thr、和Phe/Trp/Tyr等組的成員之間的置換是保守性的置換。
所謂類似物是具有靶蛋白質(zhì)樣活性的物質(zhì)，作為肽樣物質(zhì)如含有一個(gè)或一個(gè)以上被廣泛了解的肽模仿物質(zhì)的肽等。在本定義中，包括例如含有一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸的類似物(例如、含有非天然型氨基酸等)的多肽、含有被置換的連結(jié)部的多肽、天然存在的那樣的變異和天然不存在的那樣變異的該技術(shù)領(lǐng)域中眾所周知的那樣的其它改變·修飾。
本說明書中用語「多肽」是多肽表達(dá)后被改變的多肽，例如進(jìn)行了糖基化、乙?；?、磷酸化、肉豆蔻?；?。
本說明書中用語「裸DNA」指的是為了在哺乳動(dòng)物中表達(dá)給予哺乳動(dòng)物的聚核苷酸DNA。作為聚核苷酸，例如可以是編碼序列，聚核苷酸DNA一旦DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，為了使編碼序列容易表達(dá)可以直接或間接地與表達(dá)調(diào)控序列的序列結(jié)合。所謂間接結(jié)合目的是使DNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中容易表達(dá)，為了使調(diào)節(jié)領(lǐng)域和編碼序列進(jìn)行結(jié)合，或使整合其它序列容易，借助于接頭或間隔片段將兩個(gè)聚核苷酸領(lǐng)域結(jié)合在一起。
本說明書中的「載體」指的是可以指示1或多個(gè)目的序列或基因表達(dá)的集合體(組件)。載體必須任意含有轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子/增強(qiáng)子、規(guī)定1或多個(gè)基因座的成份、以及控制對可變剪接、核RNA輸送、信使翻譯后進(jìn)行的修飾、或蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行的修飾等過程進(jìn)行指示或調(diào)控的其它基因表達(dá)的其它成份。
另外載體必須在被轉(zhuǎn)錄時(shí)，含有與一個(gè)或一個(gè)以上的目的序列或基因可操作連接、而且作為翻譯起始序列起作用的那樣序列。根據(jù)需要，載體可以含有指示多聚腺苷化的信號(hào)、Neo、TK、潮霉素、博萊霉素(腐草霉素)、組氨醇、DHFR等那樣的選擇標(biāo)志、一個(gè)或一個(gè)以上的限制性部位和翻譯終止序列。另外當(dāng)載體配置在逆病毒中時(shí)，載體必須含有包裝信號(hào)、長末端反復(fù)序列(LTR)、而如果沒有這些序列，必須含有適合使用的逆病毒的正鏈和負(fù)鏈的引物結(jié)合部位。
所謂「組織特異的啟動(dòng)子」指的是在被限定的一些組織型或細(xì)胞型中具有優(yōu)先活性那樣的啟動(dòng)子，規(guī)定轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子/增強(qiáng)子或基因座的成份、或象上述那樣控制基因表達(dá)的其它成份。作為這樣的組織特異的啟動(dòng)子的代表例，例如PEPCK啟動(dòng)子、HER2/neu啟動(dòng)子、酪蛋白啟動(dòng)子、IgG啟動(dòng)子、絨毛性胚抗原啟動(dòng)子、彈性蛋白酶啟動(dòng)子、膽色素原脫氨基酶啟動(dòng)子、胰島素啟動(dòng)子、成長激素因子啟動(dòng)子、酪氨酸羥化酶啟動(dòng)子、白蛋白啟動(dòng)子、α胎球蛋白啟動(dòng)子、乙酰膽堿受體啟動(dòng)子、醇脫氫酶啟動(dòng)子、α或β珠蛋白啟動(dòng)子、T細(xì)胞受體啟動(dòng)子、骨鈣素啟動(dòng)子等。
所謂「事件特異的啟動(dòng)子」指的是是規(guī)定轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子/增強(qiáng)子或基因座的成份、或象上述那樣控制基因表達(dá)的其它成份，而且它們的轉(zhuǎn)錄活性指的是當(dāng)對細(xì)胞性刺激應(yīng)答時(shí)進(jìn)行變化那樣的活性。作為這樣的事象特異的啟動(dòng)子的代表例，如胸腺嘧啶脫氧核苷激酶或胸苷酸合成酶啟動(dòng)子、α或β干擾素啟動(dòng)子、以及對于激素(天然激素、合成激素、或來自其它非宿主生物的任一種激素，例如昆蟲激素等)的存在進(jìn)行應(yīng)答的啟動(dòng)子等。
用語「融合蛋白質(zhì)」或「融合多肽」指的是使用能夠發(fā)生一個(gè)以上的蛋白質(zhì)或含有一個(gè)以上的蛋白質(zhì)部分的1個(gè)多肽表達(dá)那樣的載體表達(dá)產(chǎn)生的，而且使載體或連續(xù)的結(jié)合中的一個(gè)以上的異種編碼序列重組表達(dá)后得到的蛋白質(zhì)或多肽。融合蛋白質(zhì)最好是帶有保持來自構(gòu)建它使用的蛋白質(zhì)或多肽具有的至少一個(gè)生物學(xué)活性的多肽單位，最好是包括通過使不同蛋白質(zhì)的部分組合，形成信號(hào)多肽，使相乗改良的生物學(xué)活性產(chǎn)生的融合蛋白或融合多肽。作為生成的融合蛋白質(zhì)，如有表達(dá)時(shí)具有功能的多肽，有表達(dá)時(shí)沒有功能的肽。作為表達(dá)時(shí)沒有功能的肽，最好是如為了表達(dá)具有活性的多肽時(shí)起作用的肽。作為本發(fā)明中有用的融合蛋白質(zhì)的例子，如從用于治療或用于檢測或測定，以及用于進(jìn)一步分析或分離和純化的利用觀點(diǎn)考慮具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)的經(jīng)基因操作的任意半乳凝素9突變體融合多肽。
用語「嵌合」或「嵌合蛋白質(zhì)」可以認(rèn)為含有與融合蛋白質(zhì)或融合多肽等價(jià)的意思?！盖逗戏肿印箍梢允侨诤隙嚯?、或編碼融合多肽的聚核苷酸融合分子。嵌合由可連結(jié)的DNA編碼序列構(gòu)建，然后通過細(xì)胞系表達(dá)，或通過載體給予，在動(dòng)物中可以進(jìn)行體內(nèi)表達(dá)。例如、含有半乳凝素9突變體的嵌合或融合蛋白質(zhì)可以在體內(nèi)或體外通過基因治療程序給予。
本說明書中所謂「患者」指的是在活的生物中可進(jìn)行任意治療或予防治療的個(gè)體，包括真核生物或原核生物，并不限定于這些。例如、作為患者的真核生物可以是脊椎動(dòng)物或無脊椎動(dòng)物。因此，例如、患者可以是魚、鳥、蠕蟲、昆蟲、哺乳動(dòng)物、爬蟲類、兩棲類、菌類、植物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物。作為哺乳動(dòng)物，例如人。
以下對本發(fā)明的半乳凝素9突變體治療劑和/或診斷劑的一般的制造和使用法進(jìn)行說明。在1種方式中，本發(fā)明提供對起因于半乳凝素9含有的生理活性或生物活性不足或欠缺的疾患·疾病·異常狀態(tài)進(jìn)行治療的技術(shù)。作為該治療技術(shù)，例如提供半乳凝素9突變體治療劑的工程和/或給予有該疾患等的哺乳動(dòng)物有效量的半乳凝素9突變體治療劑的工程等。半乳凝素9突變體由于能夠發(fā)揮對惡性腫瘤細(xì)胞的傷害細(xì)胞活性、對惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)活性、對惡性腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤活性(抗癌活性)、活化T細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)活性、特別是CD4陽性T細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)活性、免疫調(diào)節(jié)活性、抗炎癥作用、抗變態(tài)性作用，所以預(yù)期可以作為抗腫瘤劑(抗癌劑)、抗變態(tài)性劑、免疫調(diào)節(jié)劑、自身免疫疾患用劑、抗炎癥劑和腎上腺皮質(zhì)類固醇激素替代用劑。該治療技術(shù)包括對活化T細(xì)胞顯著的自身免疫疾患進(jìn)行治療的方法。所謂「自身免疫疾患」和「自身免疫」都指的是哺乳動(dòng)物中的由于自身免疫導(dǎo)致的特征性的損傷(這是對自身成分的免疫系的應(yīng)答)。自身免疫應(yīng)答是進(jìn)展到表現(xiàn)出臨床征兆的癥狀的現(xiàn)象。嚴(yán)格來說，移植排斥并不是自身免疫反應(yīng)，而是患者有時(shí)接受對有癥狀的細(xì)胞、組織、或器官進(jìn)行置換或移植的外科手術(shù)時(shí)，接受同種移植的生物體對外來移植發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)的現(xiàn)象。在由來自種的一個(gè)成員向其它種的細(xì)胞、組織、或器官的同種移植中，在受體(recipient)中當(dāng)為了排斥被移植的細(xì)胞、組織、或器官發(fā)生充分的免疫應(yīng)答時(shí)，發(fā)生「移植排斥」。
作為通過本發(fā)明的方法和治療劑能夠治療的「腫瘤」的例子，包括惡性腫瘤，例如進(jìn)行轉(zhuǎn)移的腫瘤為惡性腫瘤，一般將惡性腫瘤分為上皮性和非上皮性的腫瘤，有時(shí)也區(qū)分為癌、肉瘤、白血病等來考慮，單稱為「癌」時(shí)，一般人大多指惡性腫瘤。在本說明書中所謂「癌」可以按照廣泛意思解釋，并不單解釋為上皮性的惡性腫瘤。在本說明書中所謂「癌」可以包含上皮性惡性腫瘤和非上皮性惡性腫瘤(既包含腫瘤形成性的腫瘤，也包含非形成性的腫瘤)，如皮膚癌(也包含黑素瘤)、乳腺癌、卵巢癌、子宮癌、睪丸惡性腫瘤、前列腺癌、膀胱癌、腎癌、甲狀腺癌、咽·喉頭癌、舌癌、上顎癌、食道癌、胃癌、大腸·直腸癌、肺·支氣管癌、肝癌(包括肝細(xì)胞癌、肝內(nèi)膽管癌)、肝外膽管·膽囊癌、胰贓癌、白血病、惡性淋巴瘤、漿細(xì)胞瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤、惡性血管瘤、惡性血管內(nèi)皮瘤、腦腫瘤(包括腦膜瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤等)等，并不限定于這些，應(yīng)當(dāng)理解為通過使用本發(fā)明的半乳凝素9突變體獲得理想結(jié)果的腫瘤，還包括該半乳凝素9突變體參與后可獲得某種生理或生物學(xué)上應(yīng)答的腫瘤。
作為通過本發(fā)明的方法和治療劑能夠治療的「自身免疫疾患」的例子，如多發(fā)性硬化癥、橋本甲狀腺炎、全身性紅斑狼瘡(SLE)、肺腎綜合征(Goodpasture)、天皰瘡、受體自身免疫、自身免疫溶血性貧血、自身免疫血小板減少性紫斑病、變形性關(guān)節(jié)癥、慢性關(guān)節(jié)炎風(fēng)濕病、抗膠原抗體和強(qiáng)皮癥(schleroderma)、復(fù)合化結(jié)合組織病、多發(fā)性肌炎、惡性貧血、特發(fā)性艾迪生病、自發(fā)性不孕癥、絲球體腎炎、水皰性類天庖瘡、腎上腺素作用性藥物耐性、慢性活性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變、自身免疫基底的內(nèi)分泌腺不全、白斑、脈管炎、心肌梗塞后遺癥(post-myocardial infarction)、心臟穿孔癥候群、蕁麻疹、特應(yīng)性皮炎、自身免疫基底的哮喘、自身免疫基底的炎癥性反應(yīng)、肉芽腫癥損傷、強(qiáng)直性(alkylizing)脊椎炎、鏈球菌感染后(poststreptococcal)的絲球體腎炎、自身免疫溶血性貧血、腦炎、對淋巴瘤的二次自身免疫反應(yīng)、變性損傷、萎縮性損傷等。作為表示受體自身免疫的自身免疫疾患，例如格雷夫斯病、重癥肌無力癥、胰島素耐性癥等。作為腎上腺素性藥物耐性的自身免疫疾患，例如哮喘和囊胞性纖維癥等。
作為本發(fā)明中的其它自身免疫疾患，例如動(dòng)物模型存在的疾患，例如肖格倫綜合征(自身免疫淚腺炎(dacryodentis)或免疫媒介唾液腺炎)、自身免疫心肌炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變(PBC)、炎癥性心臟病、水銀誘導(dǎo)性腎自身免疫、胰島素依賴性糖尿病(I型糖尿病或IDD)、胸腺切除術(shù)后自身免疫、中樞神經(jīng)系(CNS)脫髓鞘障礙、CNS狼瘡、睡眠發(fā)作、免疫媒介PNS障礙、變形性關(guān)節(jié)癥、慢性關(guān)節(jié)炎風(fēng)濕病、葡萄膜炎、髓質(zhì)囊胞性纖維癥、自身免疫溶血性疾患、自身免疫脈管炎、卵巢自身免疫疾患、強(qiáng)皮癥(scheroderma)等。作為由于中樞神經(jīng)系(CNS)脫髓障害導(dǎo)致特征性自身免疫疾患，例如多發(fā)性硬化癥(MS)等。末梢神經(jīng)系(PNS)自身免疫疾患例如格林-巴利綜合征(GBS)。
作為半乳凝素9突變體治療劑，如多肽、聚核苷酸、低分子有機(jī)化合物、肽、或肽樣化合物或物質(zhì)等。而半乳凝素9突變體治療劑也包括編碼半乳凝素9突變體多肽、半乳凝素9突變體多肽的聚核苷酸、含有該半乳凝素9突變體多肽一部分的融合多肽、編碼含有該半乳凝素9突變體多肽一部分的融合多肽的聚核苷酸、半乳凝素9突變體多肽的生物活性肽衍生物、來自于半乳凝素9突變體多肽的生物活性肽樣化合物或物質(zhì)、或具有半乳凝素9突變體活性，且模仿半乳凝素9突變體結(jié)構(gòu)的低分子有機(jī)化合物(例如、激動(dòng)劑)等。半乳凝素9突變體多肽可以是半乳凝素9突變體多肽突變體、半乳凝素9突變體多肽衍生物、變異的半乳凝素9突變體多肽、或縮短型半乳凝素9突變體多肽那樣的生物活性的半乳凝素9突變體多肽。編碼半乳凝素9突變體多肽的聚核苷酸也可以是編碼帶有半乳凝素9N端側(cè)CRD全長以及C端側(cè)CRD全長的突變體多肽的聚核苷酸序列、編碼半乳凝素9突變體多肽的生物活性部分的序列、編碼來自于半乳凝素9突變體多肽的生物活性肽的序列、編碼可溶性半乳凝素9突變體多肽的序列等。本發(fā)明另外實(shí)施方式是含有可以表達(dá)編碼半乳凝素9突變體多肽的聚核苷酸序列的基因遞送載體的組成物。
本發(fā)明中利用「基因重組技術(shù)」，構(gòu)建和獲得所定核酸(聚核苷酸)或所定肽(多肽)，另外可進(jìn)行分離·序列決定，制作重組體。作為本說明書中可使用的基因重組技術(shù)(包括重組DNA技術(shù))，如該領(lǐng)域已知的技術(shù)，例如可以通過J.Sambrook，E.F.Fritsch & T.Maniatis，″Molecular CloningA Laboratory Manual(2nd edition)″，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork(1989)；D.M.Glover et al.ed.，″DNA Cloning″，2nd ed.，Vol.1 to 4，(The Practical Approach Series)，IRL Press，OxfordUniversity Press(1995)；日本生化學(xué)會(huì)編、「續(xù)生化學(xué)實(shí)驗(yàn)講座1、基因研究法II」、東京化學(xué)同人(1986)；日本生化學(xué)會(huì)編、「新生化學(xué)實(shí)驗(yàn)講座2、核酸III(重組DNA技術(shù))」、東京化學(xué)同人(1992)；M.J.Gait(Ed)，Oligonucleotide Synthesis，IRL Press(1984)；B.D.Hames and S.J.Higgins(Ed)，Nucleic Acid Hybridization，A Practical Approach，IRL Press Ltd.，Oxford，UK(1985)；B.D.Hames and S.J.Higgins(Ed)，Transcription and TranslationA Practical Approach(Practical Approach Series)，IRL PressLtd.，Oxford，UK(1984)；B.Perbal，A Practical Guide toMolecular Cloning(2nd Edition)，John Wiley & Sons，New York(1988)；J.H.Miller and M.P.Calos(Ed)，Gene Transfer Vectorsfor Mammalian Cells，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，New York(1987)；R.J.Mayer and J.H.Walker(Ed)，Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology，AcademicPress，(1987)；R.K.Scopes et al.(Ed)，Protein PurificationPrinciples and Practice(2nd Edition，1987 & 3rd Edition，1993)，Springer-Verlag、N.Y.；D.M.Weir and C.C.Blackwell(Ed)，Handbook of Experimental Immunology，Vol.1，2，3 and 4，Blackwell Scientific Publications，Oxford，(1986)；L.A.Herzenberg et al.(Ed)，Weir′s Handbook of ExperimentalImmunology，Vol.1，2，3 and 4，Blackwell Science Ltd.(1997)；R.W.Ellis(Ed)，Vaccines new approaches to immunologicalproblems，Butterworth-Heinemann，London(1992)；R.Wu ed.，″Methods in Enzymology″，Vol.68(Recombinant DNA)，AcademicPress，New York(1980)；R.Wu et al.ed.，″Methods in Enzymology″，Vol.100(Recombinant DNA，Part B)& 101(Recombinant DNA，PartC)，Academic Press，New York(1983)；R.Wu et al.ed.，″Methodsin Enzymology″，Vol.153(Recombinant DNA，Part D)，154(Recombinant DNA，Part E)& 155(Recombinant DNA，Part F)，Academic Press，New York(1987)；J.H.Miller ed.，″Methods inEnzymology″，Vol.204，Academic Press，New York(1991)；R.Wuet al.ed.，″Methods in Enzymology″，Vol.218，Academic Press，New York(1993)；S.Weissman(ed.)，″Methods in Enzymology″，Vol.303，Academic Press，New York(1999)；J.C.Glorioso etal.(ed.)，″Methods in Enzymology″，Vol.306，Academic Press，New York(1999)等所述的方法或其中引用的文獻(xiàn)所述的方法或與它們基本上同樣的方法或改變法進(jìn)行(這些方法中的記載由于參照也包括在本說明書的內(nèi)容中)〔以下、將這些方法都稱之為「基因重組技術(shù)」)。
本說明書中，所謂「同源性」意味著在多肽序列(或氨基酸序列)或聚核苷酸序列(或堿基序列)中的2條鏈之間，構(gòu)成該鏈的各個(gè)氨基酸殘基之間或各堿基之間的相互適合關(guān)系中能夠決定是同一那樣的氨基酸或堿基的量(數(shù))，指的是兩個(gè)聚核苷酸或多肽序列之間的序列相關(guān)性的程度。同源性可以容易算出。測定兩個(gè)聚核苷酸或多肽序列之間的同源性的方法已知有很多種，「同源性」(也稱為「同一性」)的用語對于同行眾所周知(例如、Lesk，A.M.(ed.)，ComputationalMolecular Biologly，Oxford University Press，New York，(1988)；Smith，D.W.(ed.)，BiocomputingInformatics and Genome Projects，Academic Press，New York(1993)；rifin，M.& Grifin，H.G.ed.)omputer Analysis of Sequence DataPart Ii，Human Press，NewJersey，(1994)；von Heinje，G.，Sequence Analysis In MolecularBiology，Academic Press，New York，(1987)；Gribskov，M.&Devereux，J.(Ed.)，Sequence Analysis Primer，M-StocktonPress，New York，(1991)等)。測定兩個(gè)序列的同源性使用的一般方法如Martin，J.Bishop(Ed.)，Guide to Huge Computers，AcademicPress，San Diego，(1994)；Carillo，H.& Lipman，D.，SIAM J.AppliedMath.，481073(1988)等公布的方法，但并不限定于這些方法。作為用于測定同源性的理想方法，如為了獲得進(jìn)行試驗(yàn)的兩個(gè)序列間的最大的適合關(guān)系部分而設(shè)計(jì)的方法。這樣的方法如作為計(jì)算機(jī)程序建立的方法。作為測定兩個(gè)序列間同源性的理想的計(jì)算機(jī)程序法如GCG程序包(Devereux，J.et al.，Nucleic AcidsResearch，12(1)387(1984)0/BLASTP/BLASTN(Atschul，S.F.et al.，J.Mol.Biol，215403(1990))等，但并不限定于這些方法，可以使用該領(lǐng)域中眾所周知的方法。
在本說明書中，所謂「聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chainreaction)」或「PCR」一般指的是美國專利第4,683,195號(hào)說明書等所述的那樣方法，例如指用于在體外通過酶對所期望的核苷酸序列進(jìn)行擴(kuò)增的方法。一般來說，PCR法是包括使用能夠優(yōu)先與模板核酸進(jìn)行雜交的2個(gè)寡核苷酸引物，反復(fù)進(jìn)行引物延伸合成那樣的循環(huán)的方法。對于典型的PCR法中使用的引物可以使用對于模板內(nèi)部應(yīng)當(dāng)可擴(kuò)增的核苷酸序列互補(bǔ)的引物，例如，優(yōu)選使用在與應(yīng)當(dāng)擴(kuò)增的核苷酸序列的兩端互補(bǔ)、或與應(yīng)當(dāng)被擴(kuò)增的核苷酸序列鄰接的引物。作為5’端的引物要按照至少含有起始密碼子、或包含該起始密碼子、可擴(kuò)增那樣選擇，而作為3’端側(cè)的引物最好是能夠至少含有終止密碼子、或含有該終止密碼子能夠擴(kuò)增那樣地進(jìn)行選擇。引物優(yōu)選由5個(gè)以上的堿基，更優(yōu)選10個(gè)以上堿基構(gòu)成的寡核苷酸、更優(yōu)選由18～25個(gè)堿基構(gòu)成的寡核苷酸。
PCR反應(yīng)可以按照該領(lǐng)域眾所周知的方法或與這些方法基本上同樣的方法或改變法進(jìn)行，例如可以根據(jù)R.Saiki，etal.，Science，2301350，1985；R.Saiki，et al.，Science，39487，988；.A.Erilich ed.，PCR Technology，Stockton Press，989；.M.Glover et al.ed.，“DNA Clonig”，2nded.，Vol.1，(ThePractical Approach Series)，RL Press，Oxford UniversityPress(1995)；M.A.Innis et al.ed.，“PCR Protocolsa guide tomethods and applocations”，Academic Prss，New AYork1990)；M.J.McPherson，.Quirk and G.R.Tayloy(Ed.，)，CRapract9ical approach，RL Press，Oxford(1991)；M.A.Frohman etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，8998-9002(1988)等所述的方法或?qū)@些方法進(jìn)行修飾、改變的方法進(jìn)行。另外，PCR法也可以使用適用的市售的試劑盒進(jìn)行，根據(jù)試劑盒制造者或試劑盒銷售者指明的程序?qū)嵤?br> PCR反應(yīng)對于代表性的實(shí)驗(yàn)是將例如模板(例如，以mRNA為模板合成的DNA；1st strand DNA)和根據(jù)該基因設(shè)計(jì)的引物與10×反應(yīng)緩沖液(Taq DNA聚合酶附帶的)、dNTP(脫氧核苷三磷酸dATP，dGTP，dCTP dTTP的混合物)、Taq DNA聚合酶以及去離子蒸餾水混合。對于該混合物使用例如GeneAmp 2400 PCR system，erkin-Elmer/Cetus公司等自動(dòng)熱循環(huán)儀在一般的PCR循環(huán)條件下反復(fù)該循環(huán)25～60次，用于擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)可以根據(jù)相應(yīng)目的設(shè)為合適的次數(shù)。作為PCR循環(huán)的條件，例如變性90～95℃5～100秒、退火40～60℃5～150秒、延伸65～75℃30～300秒的循環(huán)，優(yōu)選變性94℃15秒、退火58℃15秒、延伸72℃45秒的循環(huán)，退火的反應(yīng)溫度以及時(shí)間可以根據(jù)相應(yīng)實(shí)驗(yàn)選擇適當(dāng)?shù)闹?，變性反?yīng)和延伸反應(yīng)的時(shí)間也可以根據(jù)預(yù)想的PCR產(chǎn)物的鏈長選擇適當(dāng)?shù)闹?。退火的反?yīng)溫度最好是根據(jù)通常引物與模板DNA的雜交的Tm值改變。延伸反應(yīng)的時(shí)間通常大約每1000bp的鏈長1分鐘程度那樣的尺度，根據(jù)場合不同也可以選擇更短的時(shí)間。
在本說明書中，所謂「寡核苷酸」可以是比較短的單鏈或雙鏈的聚核苷酸，優(yōu)選聚脫氧核苷酸，可以通過Angew.Cem.nt.Ed.Engl.，Vol.28，p.716-734(1989)所述的那樣已知方法、磷酸三酯法、磷酸二酯法、磷酸法、磷酸酰胺法、磷酸法等方法化學(xué)合成。已知通常合成可以很便利地在被修飾的固體支持體上合成，該儀器有銷售。該核苷酸可以含有一個(gè)或一個(gè)以上的修飾堿基，例如可以含有次黃苷等天然而不是普通的堿基或三甲基化的堿基等，根據(jù)場合不同也可以含有帶有標(biāo)記的堿基。
為了對所定核酸進(jìn)行鑒定，可以利用雜交技術(shù)。該雜交可以根據(jù)上述公布的「基因重組技術(shù)」的文獻(xiàn)所述的方法或基本上與它同樣的方法或改變法進(jìn)行。例如，雜交可以使含有DNA等核酸的樣品轉(zhuǎn)移到含有尼龍膜等膜載體上，根據(jù)需要實(shí)施變性處理、固定化處理、清洗處理等后，使轉(zhuǎn)移到上述載體(例如膜等)的核酸根據(jù)需要，使變性的標(biāo)記探針DNA片段在雜交用緩沖液中進(jìn)行反應(yīng)。
雜交處理通常于約35～約80℃進(jìn)行、于約50～約65℃下更合適，進(jìn)行約15分鐘～約36小時(shí)，約1～約24小時(shí)更合適，可以選擇最適條件進(jìn)行。例如，雜交處理在約55℃下進(jìn)行約18小時(shí)。作為雜交用緩沖液，可以使用選自該領(lǐng)域中通常使用的緩沖液，例如可以使用Rapid hybridization buffer(Amersham公司)等。作為轉(zhuǎn)移的載體(例如，膜等)的變性處理，通常通過于約40～約100℃、于約70～約90℃下更合適，進(jìn)行約15分鐘～約24小時(shí)焙烤，進(jìn)行約1～約4小時(shí)焙烤更合適，可以選擇最適合條件進(jìn)行。例如，對膜等載體通過于80℃下進(jìn)行約2小時(shí)焙烤進(jìn)行固定化。作為轉(zhuǎn)移的載體(例如膜等)的清洗處理，可以通過用在該領(lǐng)域中通常使用的清洗液、例如含有1MNaCl、1mMEDTA和0.1％十二烷基硫酸鈉(SDS)的50mM Tris-HCl緩沖液，pH 8.0等進(jìn)行清洗。作為含有尼龍等膜的載體，可以使用從該領(lǐng)域通常使用的載體中選擇的載體。
作為上述堿性變性液、中和液、緩沖液，可以使用從該領(lǐng)域中通常使用的緩沖液中選出來的緩沖液，作為堿性變性液，例如可以使用含有0.5MNaCl和1.5MNaCl的0.5M Tris-HCl緩沖液，pH 8.0等，作為緩沖液例如2×SSPE(0.36MNaCl、20mMNaH2PO4和2mMEDTA)等。另外在雜交處理之前，為了防止非特異性雜交反應(yīng)，根據(jù)需要，進(jìn)行了轉(zhuǎn)移的載體(例如膜等)最好是進(jìn)行預(yù)雜交處理。該預(yù)雜交處理可以通過例如浸入到預(yù)雜交溶液[50％formamide、5×Denhardt溶液(0.2％牛血清白蛋白、0.2％polyvinyl pyrrolidone)、5×SSPE、0.1％SDS、100μg/ml熱變性鮭精子DNA]等中，于約35～約50℃，優(yōu)選42℃下進(jìn)行約4～約24小時(shí)，優(yōu)選約6～約8小時(shí)反應(yīng)，該條件同行可以通過反復(fù)進(jìn)行適當(dāng)實(shí)驗(yàn)，確定更理想的條件。在雜交中使用的標(biāo)記探針DNA片段的變性可以于約70～約100℃下、優(yōu)選約100℃下，進(jìn)行約1～約60分鐘、優(yōu)選約50分鐘加熱等進(jìn)行。而雜交可以利用其眾所周知的方法或根據(jù)這些方法的方法進(jìn)行，在本說明書中，所謂嚴(yán)格的條件指的是例如，關(guān)于鈉濃度，約15～約50mM、優(yōu)選約19～約40mM、更優(yōu)選約19～約20mM，關(guān)于溫度約35～約85℃、優(yōu)選約50～約70℃、更優(yōu)選約60～約65℃的條件。
雜交完了后，對膜等載體進(jìn)行充分清洗處理，在將進(jìn)行特異雜交反應(yīng)的標(biāo)記探針DNA片段以外的標(biāo)記探針等除去后，可以進(jìn)行檢測處理。膜等載體的清洗處理可以使用從該領(lǐng)域通常使用的方法選出的方法進(jìn)行，例如可以通過用含有0.1％SDS0.5×SSC(0.15MNaCl、15mM檸檬酸)溶液等進(jìn)行清洗。
進(jìn)行雜交的核酸可以通過代表性的自動(dòng)放射自顯影進(jìn)行檢測，在檢測中也可以適當(dāng)選用該領(lǐng)域中使用的方法。將進(jìn)行檢測的相當(dāng)于信號(hào)的核酸帶懸浮于適當(dāng)?shù)木彌_液、例如SM溶液(含有100mMNaCl和10mM MgSO4的50mM Tris-HCl緩沖液，pH7.5)等，然后對該懸浮液進(jìn)行適度稀釋，對所定核酸進(jìn)行分離。純化，然后再進(jìn)行擴(kuò)增處理。在本說明書中，所謂「高同源性」是因該對象序列的長度不同而不同，例如可以是50％以上、甚至60％以上、優(yōu)選70％以上、更優(yōu)選80％以上，而對于特定場合也可以為95％以上，97％以上特別好。所謂「同效的堿基序列」例如在嚴(yán)格條件下與含有問題序列的核酸可進(jìn)行雜交的堿基序列，例如與該堿基序列中連續(xù)的5個(gè)以上的堿基序列、優(yōu)選10個(gè)以上的堿基序列、更優(yōu)選15個(gè)以上的堿基序列、更優(yōu)選20個(gè)以上的堿基序列進(jìn)行雜交，編碼與該多肽基本上同等的氨基酸序列的堿基序列。核酸也可以通過化學(xué)合成獲得。這種情況下，化學(xué)合成片段，然后通過酶將合成的片段結(jié)合起來。
通過雜交處理對從含有基因文庫或cDNA文庫等的核酸樣品中進(jìn)行篩選目的核酸的處理可以反復(fù)進(jìn)行?？梢允褂帽豢寺〉膩碜匀说腸DNA文庫、例如各種來自人的組織或培養(yǎng)細(xì)胞(特別是人的腎臟、腦、松果體、下垂體后葉、神經(jīng)細(xì)胞、網(wǎng)膜、網(wǎng)膜血管細(xì)胞、網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞、胸腺、血管、內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、血液細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、精巢、卵巢、子宮、腸、心臟、肝臟、小腸、大腸、齒肉關(guān)連細(xì)胞、皮膚關(guān)連細(xì)胞、線球體細(xì)胞、尿細(xì)管細(xì)胞、結(jié)合組織細(xì)胞等組織。細(xì)胞、以及各種腫瘤組織、癌細(xì)胞等)cDNA文庫。另外用作模板等的cDNA文庫也可以直接使用市售的來自各種組織的cDNA文庫，例如可以使用由Stratagen公司、Invitrogen公司、Clontech公司等銷售的cDNA文庫。作為典型的例子，可以使用由人組織。細(xì)胞制備的基因文庫、例如人P1 artificial chromosome基因組文庫(HumanGenome Mapping Resource Center)、人組織cDNA文庫(例如，可從Clontech公司等獲得)。使用探針可以對由各種人組織或培養(yǎng)細(xì)胞等構(gòu)建的人基因組DNA文庫或來自人的cDNA文庫進(jìn)行篩選。為了用放射性同位素等對探針等進(jìn)行標(biāo)記，可以使用市售的標(biāo)記試劑盒、例如隨機(jī)引物DNA標(biāo)記試劑盒(Boehringer Mannheim公司)等進(jìn)行。例如使用隨機(jī)引發(fā)(random-priming)試劑盒(Pharmacia LKB公司，Uppsala)等，用[α-32P]dCTP(Amersham公司)等對探針用DNA進(jìn)行標(biāo)記，可以獲得帶有放射活性的探針。
含有所定核酸的噬菌體粒子、重組質(zhì)粒、重組載體等可以通過該領(lǐng)域中通常使用的方法對所定核酸進(jìn)行純化分離，例如可以通過甘油梯度超離心分離法(Molecular Cloning，a Laboratory Manual，ed.T.Maniatis，Cold Spring Harobor Laboratory，2nd ed.78，1989)、電泳法等進(jìn)行純化。使用在該領(lǐng)域中通常使用的方法可以從噬菌體粒子等純化分離DNA，例如，將得到的噬菌體等懸浮于TM溶液(含有100mMMgSO4的50mM Tris-HCl緩沖液，pH7.8)等，用DNase I和RNase A等處理后，加20mM EDTA、50μg/ml蛋白酶K以及0.5％SDS混合液等，于約65℃，保溫約1小時(shí)后，對該溶液進(jìn)行酚提取、二乙基乙醚提取后，通過乙醇沉淀使DNA沉淀，然后將得到的DNA用70％乙醇洗凈后干燥，溶解于TE溶液(含有10mM EDTA的10mM Tris-HCl緩沖液，pH8.0)等后得到。另外作為目的DNA通過亞克隆等大量獲得也是可能的，例如亞克隆作為宿主可以使用大腸桿菌，用質(zhì)粒載體等進(jìn)行。通過這樣亞克隆得到的DNA也與上述同樣，通過離心分離、酚提取、乙醇沉淀等方法純化分離。
在本說明書中，得到的PCR產(chǎn)物等核酸(包括DNA)通常進(jìn)行1～2％瓊脂糖凝膠電泳，作為特異的帶從凝膠中切出，例如，使用geneclean kit(Bio 101)等市場銷售的提取試劑盒進(jìn)行提取。提取的DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖?，根?jù)需要進(jìn)行純化處理，或根據(jù)需要，對5’末端用T4聚核苷酸激酶等進(jìn)行磷酸化后，與pUC18等pUC系載體等適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒載體連接，轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)母惺軕B(tài)細(xì)胞。被克隆的PCR產(chǎn)物可以解析其堿基序列。對于PCR產(chǎn)物的克隆，可以使用例如p-Direct(Clontech)，pCR-ScriptTMSK(+)(Stratagene公司)、pGEM-T(Promega公司)，pAmpTM(Gibco-BRL公司)等市場銷售的質(zhì)粒載體。為了進(jìn)行宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，例如可以使用噬菌體載體，使用鈣法、銣/鈣法、鈣/錳法、TFB高效率法、FSB冷凍感受態(tài)細(xì)胞法、迅速克隆法、電穿孔等該領(lǐng)域已知的方法或基本上與該方法同樣的方法進(jìn)行(D.hanahan，J.Mol.Biol.，166557，1983等)。為了分離目的DNA，可以運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄PCR(polymerase chain reaction coupled reversetranscription；RT-PCR)、RACE(rapid amplification of cDNA ends)。RACE可以根據(jù)例如M.A.Innis et al.ed.，“PCR Protocols”(M.A.Frohman，“a guide to methods and applications”)，pp.28-38，Academic Press，New York(1990)等所述的方法進(jìn)行。
DNA，可以根據(jù)需要克隆，例如可以利用質(zhì)粒、λ噬菌體、粘粒、P1噬菌體、F因子、YAC等。最好是來自λ噬菌體的載體，例如可以利用Charon 4A、Charon 21A、λgt10、λgt11、λDASHII、λFIXII、λEMBL3、λZAPIITM(Stratagene公司)等。另外可以將得到的DNA整合到下面詳細(xì)說明那樣的適當(dāng)載體、例如質(zhì)粒pEX、pMAMneo、pKG5等載體，用下面詳細(xì)說明那樣的適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞、例如大腸桿菌、酵母、CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等表達(dá)。另外該DNA片段直接或作為附加了適當(dāng)調(diào)控序列的DNA片段整合到適當(dāng)?shù)妮d體、然后導(dǎo)入動(dòng)物后，可以做成表達(dá)所定基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。作為動(dòng)物如哺乳動(dòng)物，例如小鼠、大鼠、兔、土撥鼠、牛等。最好是將該DNA片段導(dǎo)入小鼠等動(dòng)物的受精卵，可以做成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。對于所定的基因產(chǎn)物的確認(rèn)可以使用轉(zhuǎn)化該外源基因的293T細(xì)胞、COS-1細(xì)胞等適于該基因的動(dòng)物細(xì)胞等進(jìn)行。
作為將外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物等動(dòng)物細(xì)胞的方法，可以通過該領(lǐng)域已知的方法或基本上與該方法同樣的方法進(jìn)行，例如磷酸鈣法(例如，F(xiàn).L.Graham et al.，Virology，52456，1973等)、DEAE-葡聚糖法(例如，D.warde et al.，J.Gen.Virol.，3371，1968等)、電穿孔法(例如，E.Neumann et al.，EMBO J l.841，1982等)、微注射法、脂質(zhì)體法、病毒感染法、噬菌體粒子法等。這樣一來，轉(zhuǎn)染了所定的基因的動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的基因產(chǎn)物也可以進(jìn)行基因解析。
作為整合所定基因等(本發(fā)明中得到的DNA等)的質(zhì)粒，只要是在基因工程中常用的宿主細(xì)胞(例如，大腸桿菌、枯草桿菌等原核細(xì)胞宿主、酵母、293T細(xì)胞、CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等真核細(xì)胞宿主、Sf21等昆蟲細(xì)胞宿主)中能夠表達(dá)的質(zhì)粒，什么樣的質(zhì)粒都可以。當(dāng)然也可以選用市售的試劑盒或試劑附帶的質(zhì)粒。在這樣的序列內(nèi)，也可以含有例如為了在選擇的宿主中表達(dá)而進(jìn)行適當(dāng)修飾的密碼子，或設(shè)計(jì)限制酶部位，也可以含有為了使目的基因表達(dá)容易的調(diào)控序列、促進(jìn)序列等、在結(jié)合目的基因中起作用的接頭、適配器等、以及調(diào)控抗生素抗性等、調(diào)控代謝、對篩選有用的序列(也可以含有編碼雜化蛋白或融合蛋白質(zhì)的序列)等。最好是使用適當(dāng)?shù)膯?dòng)子、例如在以大腸桿菌作為宿主的質(zhì)粒中，如使用色氨酸啟動(dòng)子(trp)、乳糖啟動(dòng)子(lac)、色氨酸。乳糖啟動(dòng)子(lac)、脂蛋白啟動(dòng)子(lpp)、λ噬菌體PL啟動(dòng)子等，在以動(dòng)物細(xì)胞作為宿主的質(zhì)粒中，可以使用SV40晚期啟動(dòng)子、MMTV LTR啟動(dòng)子、RSV LTR啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子、SRα啟動(dòng)子等，在以酵母作為宿主的質(zhì)粒中可以使用GAL1、GAL10啟動(dòng)子等。另外也可以使用CYC1、HIS3、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP、URA3LEU2、ENO、TP1、AOX1等調(diào)控系。
為了促進(jìn)編碼所期望多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄，可以在載體中插入增強(qiáng)子，作為這樣的增強(qiáng)子，如作用于啟動(dòng)子、具有促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的作用，通常約10～100bp的具有cis作用的序列(元件)。很多增強(qiáng)子是從珠蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素等哺乳動(dòng)物基因了解到的。作為代表性的，使用從真核細(xì)胞感染性病毒得到的增強(qiáng)子合適，例如位于復(fù)制起點(diǎn)的晚期區(qū)的SV40增強(qiáng)子(100-270bp)、巨細(xì)胞病毒的初期啟動(dòng)子的增強(qiáng)子、位于多糖類的復(fù)制起點(diǎn)的晚期區(qū)的增強(qiáng)子、腺病毒的增強(qiáng)子等。另外根據(jù)需要，也可以附加宿主中存在的信號(hào)序列，這些可以使用同行都非常了解的。
作為以大腸桿菌作為宿主的質(zhì)粒，例如pBR322、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pSP64、pSP65、pTZ-18R/-18U、pTZ-19R/-19U、pGEM-4、pGEM-3Z、pGEM-4Z、pGEM-5Zf(-)、pBluescript KSTM(Stratagene公司)等。作為適于在大腸桿菌中表達(dá)的質(zhì)粒載體，如pAS、pKK223(Pharmacia公司)、pMC1403、pMC931、pKC30、pRSET-B(Invitrogen公司)等。作為以動(dòng)物細(xì)胞為宿主的質(zhì)粒，例如SV40載體、多糖類。病毒載體、牛痘病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等，具體來說，如pcD、pcD-SRα、CDM8、pCEV4、pME18S、pBC12B1、pSG5(Stratagene公司)等。作為以酵母為宿主的質(zhì)粒，如Yip型載體、Yep型載體、YCp型載體等，例如pGPD-2等。作為宿主細(xì)胞，當(dāng)宿主細(xì)胞為大腸桿菌時(shí)，如來自大腸桿菌K12株的，例如作為來自NM533、XL1Blue、C600、DH1、DH5、DH11S、DH5α、DH10B、HB101、MC1061、JM109、STBL2、B834株的，如BL21(DE3)pLysS等。宿主細(xì)胞為酵母時(shí)，例如Saccharomyces cerevisiae，Schizosaccharomycesprombe，Pichia pastoris，Kluveromyces株，Candida Trichodermareesia，以及其他酵母株等。作為在酵母中的表達(dá)系，例如可以參照Hinnen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1978)751929；Itoet al.，J.Bacteriol.(1983)153163；Kurtz et al.，Mol.Cell.Biol.(1986)6142；Kunze et al.，J.Basic Microbiol.(1985)25141；Gleeson et al.，J.Gen.Microbiol.(1986)1323459；Roggenkamp et al.，Mol.Gen.Genet(1986)202302；Das et al.，J.Bacteriol.(1984)1581165；De Louvencourt et al.，J.Bacteriol.(1983)154737；Van den Berg et al.，Bio/Technology(1990)8135；Kunze et al.，J.Basic Micr Biol.(1985)25141；Cregg et al.，Mol.Cell.Biol.(1985)53376；美國專利第4,837,148號(hào)說明書，同第4,929,555號(hào)說明書；Beach and Nurse，Nature(1981)300706；Davidow et al.，Curr.Genet.(1985)10380；Gaillardin et al.，Curr.Genet.(1985)1049；Ballanceet al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.(1983)112284-289；Tilburn et al.，Gene(1983)26205-221；Yalton et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)811470-1474；Kelly and Hynes，EMBO J.，(1985)4475479；EP 244,234；WO 91/00357等所述的表達(dá)系。
宿主細(xì)胞為動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，如來自非洲中部猴成纖維細(xì)胞的COS-7細(xì)胞、COS-1細(xì)胞、CV-1細(xì)胞、來自人腎細(xì)胞的293細(xì)胞、來自人表皮細(xì)胞的A431xb、來自人大腸的205細(xì)胞、來自小鼠成纖維細(xì)胞的COP細(xì)胞、MOP細(xì)胞、WOP細(xì)胞、來自中國倉鼠細(xì)胞的CHO細(xì)胞、CHO DHFR細(xì)胞、人HeLa細(xì)胞、來自小鼠細(xì)胞的C127細(xì)胞、來自小鼠細(xì)胞的NIH 3T3細(xì)胞、小鼠L細(xì)胞、9BHK、HL60、U937、HaK、Jurkat細(xì)胞、其他被轉(zhuǎn)化后得到的細(xì)胞系、通常的二倍體、由體外一次培養(yǎng)組織誘導(dǎo)的細(xì)胞株等。哺乳動(dòng)物表達(dá)，例如可以參照Dijkema et al.，EMBOJ.(1985)4761；Gorman et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982b)796777；Boshart et al.，Cell(1985)41521；美國專利第4,399,216號(hào)說明書；Ham and Wallace，Methods inEnzymology(1979)5844；Barnes and Sato，Anal.Biochem.(1980)102255；美國專利第4,767,704號(hào)說明書；同第4,657,866號(hào)說明書；同第4,927,762號(hào)說明書；同第4,560,655號(hào)說明書；WO90/103430；WO 87/00195；美國專利第RE 30,985號(hào)說明書等記載的細(xì)胞。作為昆蟲細(xì)胞，以蠶核多角體病毒(Bombyx mori nuclearpolyhedrosis virus)、來自該病毒的病毒或其他合適的病毒作為載體，可以使用Spodoptera frugiperda(caterpillar)，Aedesaegypti(mosquito)，Aedes albopictus(mosquito)，Drosophilamelangaster(fruitfly)，蠶幼蟲或蠶培養(yǎng)細(xì)胞、例如BM-N細(xì)胞等(例如，Luckow et al.，Bio/Technology，6，47-5(1988)；Setlow，J.K.etal.(end，)，Genetic Engineering，Vol.8，pp.277-279，PlenumPublishing，1986；Maeda et al.，Nature，315，pp.592-594(1985))。有關(guān)異種基因在昆蟲中的表達(dá)例如可以參照美國專利第4,745,051號(hào)說明書；Friesen et al.(1986)，″The Regulation of BaculovirusGene Expression″，The Molecular Biology of Baculoviruses(W.Doerfler(Ed))；EP 127,839；EP 155,476；Vlak et al.，J.Gen.Virol.，(1988)69765-776；Miller et al.，Ann.Rev.Microbiol.(1988)42177；Carbonell et al.，Gene(1988)73409；Maedaet al.，Nature，(1985)315592-594；Lebacq-Verheyden et al.，Mol.Cell.Biol.(1988)83129；Smith et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1985)828404；Miyajima et al.，Gene(1987)58273；Martin et al.，DNA(1988)799等報(bào)道。另外關(guān)于多數(shù)的桿狀病毒株和突變體以及來自宿主的對應(yīng)的容許昆蟲宿主細(xì)胞，例如可以參照Luckow et al.，Bio/Technology(1988)647-55；Miller et al.，Generic Engeneering(Serlow，J.K.et al.(Ed))Vol.8(PlenumPublishing，1986)pp.277-279；Maeda et al.，Nature(1985)315592-594等報(bào)道。
利用Agrobacterium tumefaciens等，可以將植物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞使用，與適合它的載體一起，這些在該領(lǐng)域都是廣泛了解的。在本發(fā)明的基因工程手法中，可以使用在該領(lǐng)域已知或廣泛運(yùn)用的限制酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、作為用于對適于將DNA片段克隆化的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾或進(jìn)行變換的酶的DNA修飾。分解酶、DNA聚合酶、末端核苷酸基轉(zhuǎn)移酶、DNA連接酶等。作為限制酶，例如R.J.Roberts，Nucleic AcidsRes.，13r165，1985；S.Linn et al.ed.Nucleases，p.109，ColdSpring Harbor Lab.，Cold Spring Harbor，New York，1982；R.J.Roberts，D.Macelis，Nucleic Acids Res.，19Suppl.2077，1991等報(bào)道的酶。
根據(jù)本發(fā)明，用含有編碼多肽(或蛋白質(zhì))的核酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體根據(jù)需要使用適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)志，通過反復(fù)克隆，可以很多具有穩(wěn)定高表達(dá)能力的細(xì)胞株。例如，在作為宿主細(xì)胞使用動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化體中，作為選擇標(biāo)志利用dhfr基因時(shí)，通過慢慢提高M(jìn)TX濃度進(jìn)行培養(yǎng)，選擇抗性株，使編碼本發(fā)明的多肽的DNA擴(kuò)增，可以獲得能更高表達(dá)的細(xì)胞株。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體可以在可表達(dá)編碼本發(fā)明的多肽的核酸的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，使目的物生成、蓄積。該轉(zhuǎn)化體可以在該領(lǐng)域中廣泛使用的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。例如大腸桿菌、枯草桿菌等原核細(xì)胞宿主、酵母等作為宿主的轉(zhuǎn)化體最好使用液體培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中可以含有生育需要的碳源、氮源、無機(jī)物等。作為碳源，如葡萄糖、葡聚糖、可溶性淀粉、蔗糖等、作為氮源，如銨鹽類、硝酸鹽類、玉米漿、胨、酪蛋白、肉提取物、麥芽提取物、大豆粕、馬鈴薯提取液等無機(jī)或有機(jī)物質(zhì)、作為無機(jī)物，例如氯化鈣、磷酸二氫鈉、氯化鎂、碳酸鈣等。另外也可以添加酵母、維生素類、酪蛋白水解物、生長促進(jìn)因子等。另外根據(jù)需要為了更有效地使啟動(dòng)子起作用，可以添加例如3β-吲哚丙烯酸那樣的藥劑。培養(yǎng)基的pH希望約5～約8。
培養(yǎng)例如對于大腸桿菌通常于約15～約45℃下進(jìn)行約3～約75小時(shí)，根據(jù)需要，也可以加通氣或攪拌。對宿主為動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，作為培養(yǎng)基可以使用例如含有約5～約20％的胎牛血清的MEM培養(yǎng)基、PRM1604培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基等。pH優(yōu)選約6～8。培養(yǎng)通常于約30～約40℃下進(jìn)行約15～約72小時(shí)，根據(jù)需要，也可以加通氣或攪拌。表達(dá)所定基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化體可以直接利用，也可以做成該細(xì)胞勻漿液利用，也可以將所定基因的產(chǎn)物分離后使用。當(dāng)從上述培養(yǎng)細(xì)胞提取時(shí)，培養(yǎng)后可以適當(dāng)運(yùn)用用眾所周知的方法收集菌體或細(xì)胞，將它們懸浮于適當(dāng)?shù)木彌_液中，通過超聲波、溶菌酶和/或凍融等破壞菌體或細(xì)胞后，通過離心分離或過濾獲得粗提取液的方法等。在緩沖液中也可以加尿素或鹽酸胍等蛋白質(zhì)變性劑、TritonX-100(商品名)、吐溫-20(商品名)等表面活性劑。對于目的生成物向培養(yǎng)液中分泌的場合，培養(yǎng)結(jié)束后，通過這方面眾所周知的方法將菌體或細(xì)胞與上清分離開，收集上清。
上述那樣得到的培養(yǎng)上清、或提取液中含有的目的生成物可以將以往眾所周知的分離純化法適當(dāng)組合對其進(jìn)行純化，例如通過硫酸銨沉淀法等鹽析、通過交聯(lián)葡聚糖等凝膠過濾法、使用帶有例如二乙基氨乙基或羧甲基等的載體的離子交換層析法、例如，使用帶有丁基、辛基、苯基等疏水性基團(tuán)的載體等的疏水性層析法、色素凝膠層析法、電泳法、透析、超濾、親和層析法、高效液相層析法等進(jìn)行純化獲得。理想的是可以通過聚丙烯凝膠電泳、固定了配體等的親和層析等進(jìn)行純化分離處理。例如作為配位體，如包括進(jìn)行特異識(shí)別的單克隆抗體的抗體或其片段、凝集素、糖、結(jié)合對的一方等。例如免疫親和層析、明膠-瓊脂糖親和層析、肝素-瓊脂糖層析等。
得到的本發(fā)明的多肽(或蛋白質(zhì))可以再通過化學(xué)的手法對其含有的氨基酸殘基進(jìn)行修飾，或使用肽酶，例如胃蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、肽鏈內(nèi)切酶、肽鏈外切酶等酶進(jìn)行修飾，或進(jìn)行部分分解后做成其衍生物等。本發(fā)明的多肽，C末端可以是羧基(COOH)或羧化物(COO-)，也可以是酰胺(-CONH2)或酯(COOR)。其中作為酯中的R，除了可以使用甲基、乙基、n-丙基、異丙基或n-丁基等C3-8烷基、例如環(huán)戊基、環(huán)己基等C1-6環(huán)烷基、例如苯、α-萘等C6-12芳香基、例如芐基、苯乙基等苯-C1-2烷基或α-萘甲基等α-萘-C1-2烷基等C7-14芳烷基之外，還可以使用作為口服用酯廣泛使用的三甲基乙酰氧甲基等。當(dāng)本發(fā)明的蛋白質(zhì)C末端以外含有羧基(或羧化物)時(shí)，羧基被酰胺化或酯化后的產(chǎn)物也包括在本發(fā)明的多肽中。作為此時(shí)的酯，例如可以使用上述的C末端的酯等。
另外，對于本發(fā)明的多肽(或蛋白質(zhì))，也包括在上述的多肽中，N末端的蛋氨酸殘基的氨基被保護(hù)基(例如，甲酰基、乙酰基等C1-5烷-羰基等C1-6?；?保護(hù)的產(chǎn)物，N端側(cè)在生物體內(nèi)被切斷生成的谷?；M(jìn)行焦谷氨?；漠a(chǎn)物、分子內(nèi)氨基酸的側(cè)鏈上的取代基(例如，-OH、-COOH、氨基、咪唑基、吲哚基、胍基等)用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基(例如，甲?；?、乙?；菴1-6?；?保護(hù)的產(chǎn)物、或結(jié)合了糖鏈的所謂糖蛋白等復(fù)合蛋白質(zhì)等。
另外，通過使用以本發(fā)明涉及到的基因的堿基序列作為基礎(chǔ)的基因工程常用的方法，例如在所定的多肽的氨基酸序列中適當(dāng)?shù)刂脫Q、缺失、插入、轉(zhuǎn)移或附加1個(gè)或多個(gè)以上氨基酸，可以制造導(dǎo)入了變異的適合的多肽。作為這樣的變異。變換。修飾法，例如日本生化學(xué)會(huì)編、「續(xù)生化學(xué)實(shí)驗(yàn)講座1、基因研究法II」、p105(廣瀨進(jìn))、東京化學(xué)同人(1986)；日本生化學(xué)會(huì)編、「新生化學(xué)實(shí)驗(yàn)講座2、核酸III(重組DNA技術(shù))」、p233(廣瀨進(jìn))、東京化學(xué)同人(1992)；R.Wu，L.Grossman，ed.，“Methods in Enzymology”，Vol.154，p.350&p.367，Academic Press，New York(1987)；R.Wu，L.Grossman，ed.，“Methods in Enzymology”，Vol.100，p.457 & p.468，AcademicPress，New York(1983)；J.A.Wells et al.，Gene，34315，1985；T.Grundstroem et al.，Nucleic Acids Res.，133305，1985；J.Tayloret al.，Nucleic Acids Res.，138765，1985；R.Wu ed.，“Methodsin Enzymology”，Vol.155，p.568，Academic Press，New York(1987)；A.R.Oliphant et al.，Gene，44177，1986等所述的方法。例如，利用合成寡核苷酸等的指定位置導(dǎo)入法(部位特異的突變導(dǎo)入法)(Zolleret al.，Nucleic Acids Res.，106487，1987；Carter et al.，NucleicAcids Res.，134331，1986)、盒(序列)突變導(dǎo)入法(cassettemutagenesisWells et al.，Gene，34315，1985)，限制部位選擇突變導(dǎo)入法(restriction selection mutagenesisWells et al.，Philos.Trans.R.Soc.London Ser A，317415，1986)，丙氨酸。掃描法(Cunningham & Wells，Science，2441081-1085，1989)，PCR突變導(dǎo)入法，Kunkel法，dNTP[αS]法(Eckstein)，使用亞硫酸或亞硝酸等的指導(dǎo)區(qū)域突變導(dǎo)入法等方法。
另外，當(dāng)用基因重組法進(jìn)行制造時(shí)，以融合多肽(融合蛋白質(zhì))使其表達(dá)，在生物體內(nèi)或生物體外，也可以變換。加工為基本上與所期望的多肽具有同等生物學(xué)活性的多肽。可以使用基因工程常用的融合產(chǎn)生法，這樣融合的多肽利用其融合部，通過親和層析等也可以進(jìn)行純化。作為這樣融合多肽，如可以與組氨酸盒融合的融合多肽，或與β-半乳糖苷酶(β-gal)、麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)(MBP)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、硫氧還蛋白(TRX)或Cre Recombinase融合的融合多肽。同樣，多肽可以附加異種的抗原表位的盒，通過使用與該抗原表位特異結(jié)合的抗體的免疫親和層析也可以進(jìn)行純化。在更適合的實(shí)施方式中，如聚組氨酸(poly-His)或聚組氨酸-甘氨酸(poly-His-Gly)盒，而作為抗原表位盒，例如AU5，c-Myc，CruzTag09，CruzTag22，CrzTag 41，Glu-Glu，HA，Ha.11，KT3，F(xiàn)LAG(registeredtrademark，Sigma-Aldrich)，Omni-prbe，S-probe，T7，Lex A，V5，VP16，GAL4，VSV-G等(Field et al.，Molecular and Cellular Biology，8pp.2159-2165(1988)；Evan et al.，Molecular and CellularBiology，5pp.3610-3616(1985)；Paborsky et al.，ProteinEngineering，3(6)pp.547-553(1990)；Hopp et al.，BioTechnology，6pp.1204-1210(1988)；Martin et al.，Scence，255pp.192-194(1992)；Skinner et al.，J.Bio.Chem.，266pp.15163-15166(1991)；Lutz-Freyermuth et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87pp.6393-6397(1990)等)。也可以利用使用酵母雙雜交法。
另外作為融合多肽，也可以是附加了變成可檢測蛋白質(zhì)那樣的標(biāo)志的融合多肽。在更合適的實(shí)施方式中，該可檢測標(biāo)志可以是生物素/鏈抗生物素蛋白系的Biotin Avi Tag、發(fā)熒光的物質(zhì)等。作為發(fā)該熒光的物質(zhì)，如來自オワン水母(Aequerea victorea)等發(fā)光水母的綠色熒光蛋白(green fluorescent proteinGFP)、對其進(jìn)行改變后的變異體(GFP變異體)、例如EGFP(Enhance-humanized GFP)、rsGFP(red-shift GFP)，黃色熒光蛋白(yellow fluorescentproteinYFP)，綠色熒光蛋白(green fluorescent proteinGFP)、藍(lán)色熒光蛋白(cyan fluorescent proteinCFP)，青色熒光蛋白(bluefluorescent proteinBFP)，來自ウミシイタケ(Renillareniformis)的GFP等(宮脅敦史編、實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)另冊后基因組時(shí)代的實(shí)驗(yàn)講座3-GFP和Bioimaging、羊土公司(2000年))。也可以使用特異識(shí)別上述融合蛋白的抗體(包括單克隆抗體和其片段)進(jìn)行檢測。這樣的融合多肽的表達(dá)和純化也可以使用適用于表達(dá)和純化的試劑盒，按照試劑盒制造者給出的程序?qū)嵤?br> 得到的蛋白質(zhì)(可以包括肽和多肽)，通過酶免疫測定法等已知手法使它結(jié)合于適當(dāng)?shù)妮d體或固相，可以進(jìn)行固定化。固相化蛋白質(zhì)、固相化肽可很便利地用于結(jié)合分析或物質(zhì)的篩選。
多肽或蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)的修飾·改變等可以參考例如日本生化學(xué)會(huì)編「新生化學(xué)實(shí)驗(yàn)講座I、蛋白質(zhì)VII、蛋白質(zhì)工程」東京化學(xué)同人(1993)，根據(jù)該文獻(xiàn)所述的方法或其引用的文獻(xiàn)所述的方法、或與其基本上同樣的方法進(jìn)行。在如下面所述的那樣的生物學(xué)活性中，也可以包括免疫方面活性、例如抗原性。在該修飾·改變中，可以是脫氨基化、羥基化、羧基化、磷酸化、硫酸化、甲基化等烷基化、乙?；弱；?、酯化、酰胺化、開環(huán)、閉環(huán)、糖基化、向含糖鏈種類不同方面改變、將含糖鏈數(shù)增減、脂質(zhì)結(jié)合、對D-型氨基酸殘基的置換等。這些方法都是在該領(lǐng)域已知的方法(例如、T.E.Creighton，Proteinsstructure and molecular Properties，pp.79-86 W.H.Freeman & Co.，San Francisco，USA(1983)等)。
利用本發(fā)明的半乳凝素9突變體，可以篩選對該半乳凝素9的所定生物學(xué)活性等功能(例如，細(xì)胞損傷活性、凋亡誘導(dǎo)活性、與糖皮質(zhì)激素類似的活性、抑制惡性細(xì)胞轉(zhuǎn)移的活性等)促進(jìn)的化合物(激動(dòng)劑)或抑制的化合物(拮抗劑)或它們的鹽。這也意味著可以提供該篩選試劑。因此，也可以提供有關(guān)利用在本發(fā)明中闡明的該半乳凝素9蛋白質(zhì)等多肽、其一部分肽或它們的鹽表現(xiàn)出的活性的各種各樣的物質(zhì)，對本發(fā)明中該半乳凝素9蛋白質(zhì)、其一部分肽或它們的鹽等表現(xiàn)出的活性等所定功能促進(jìn)的化合物(激動(dòng)劑)或抑制的化合物(拮抗劑)或它們的鹽的篩選方法。
在該篩選中，例如(i)使適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)樣品與半乳凝素9突變體蛋白質(zhì)、其一部分肽或它們的鹽(也包括表達(dá)該蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體)等接觸的場合與(ii)在本發(fā)明的蛋白質(zhì)、其一部分肽或它們的鹽等中不存在問題的試驗(yàn)樣品場合進(jìn)行比較。具體來說，在上述篩選中，測定、比較該生物學(xué)活性(例如，與各個(gè)半乳凝素9蛋白質(zhì)和生物體成分之間的相互作用有關(guān)的活性等)。
在該篩選系中也可以存在為了便于測定的適當(dāng)?shù)臋z測用底物。作為該底物，只要是在測定中可有效利用的，無論什么樣的都可以。例如，選用已知的眾所周知的底物，最好是使用合成的化合物等。底物可以直接使用，但最好是使用用熒光素等熒光、酶或放射性物質(zhì)標(biāo)記的底物。
作為試驗(yàn)樣品，例如蛋白質(zhì)、肽、非肽性化合物、合成化合物、發(fā)酵產(chǎn)物、植物提取物、動(dòng)物等組織提取物、細(xì)胞提取物等。在試驗(yàn)樣品中使用的試驗(yàn)化合物的例子中最好含有抗凝集素抗體、酶抑制劑、細(xì)胞因子、各種具有抑制活性的化合物、特別是合成化合物等。這些化合物可以是新的化合物，也可以是眾所周知的化合物。該篩選可以根據(jù)通常的結(jié)合活性或酶活性的測定法實(shí)施，例如可以參考該領(lǐng)域中眾所周知的方法等進(jìn)行。另外，可以使用各種標(biāo)記、緩沖液系以及其它適當(dāng)?shù)脑噭?，可以按照在此說明的操作進(jìn)行。使用的肽等可以用活化劑進(jìn)行處理，也可以預(yù)先將其前體或潛在型的前體變換為活性型的前體。測定通常在Tris-HCl緩沖液、磷酸鹽緩沖液等對反應(yīng)沒有壞影響的那樣緩沖液等中，例如在pH約4～約10(優(yōu)選pH約6～約8)中進(jìn)行。當(dāng)分別進(jìn)行篩選時(shí)，在各個(gè)方法中的通常條件、操作法中除了考慮同行通常技術(shù)外，可以構(gòu)建與本發(fā)明的該半乳凝素9蛋白質(zhì)或與其基本上具有同等活性的多肽或肽有關(guān)的測定系。有關(guān)這些一般的技術(shù)手段的詳細(xì)敘述可以參照綜述、出版的書等[例如、Methods inEnzymology Academic Press公司(USA)發(fā)行等]。另外，凋亡誘導(dǎo)活性測定法等可以參考田沼靖一監(jiān)修、「細(xì)胞工程另冊實(shí)驗(yàn)程序系列、凋亡實(shí)驗(yàn)程序」株式會(huì)社秀潤社、1995年1月20日(第1版第2次印刷)等，也可以使用市售測定試劑盒。
使用本發(fā)明的篩選方法或篩選試劑盒得到的化合物或其鹽是從上述的試驗(yàn)化合物，例如肽、蛋白質(zhì)、非肽性化合物、合成化合物、發(fā)酵產(chǎn)物、細(xì)胞提取物、植物提取物、動(dòng)物組織提取物等選擇的化合物，是促進(jìn)或抑制本發(fā)明的蛋白質(zhì)等的功能的化合物。作為該化合物的鹽，如藥學(xué)上容許的鹽等。例如，與無機(jī)堿基的鹽、與有機(jī)堿基的鹽、與無機(jī)酸的鹽、與有機(jī)酸的鹽、與堿性或酸性氨基酸的鹽等。作為與無機(jī)堿基的鹽的合適例子，如鈉鹽、鉀鹽等堿金屬鹽、鈣鹽、鎂鹽等堿土金屬鹽、以及鋁鹽、銨鹽等。作為與有機(jī)堿基的鹽的合適例子，如與三甲基胺、三乙基胺、吡啶、甲基吡啶、2，6-二堿基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、環(huán)己基胺、二環(huán)己基胺、N，N’-二芐基乙二胺等的鹽。作為與無機(jī)酸的鹽的合適例子，如與鹽酸、溴氫酸、硫酸、磷酸等的鹽。作為與有機(jī)酸的鹽的合適的例子，例如與甲酸、醋酸、丙酸、延胡索酸、草酸、酒石酸、馬來酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸、甲磺酸、苯磺酸、苯甲酸等的鹽。而作為與堿性氨基酸的鹽的合適例子，如與精氨酸、賴氨酸、組氨酸等的鹽，作為與酸性氨基酸的鹽的合適的例子，如與天冬氨酸、谷氨酸等的鹽。
當(dāng)將本發(fā)明的活性成分[例如(a)該半乳凝素9突變體多肽、其一部分的肽或它們的鹽、與其相關(guān)的肽等、(b)編碼該半乳凝素突變體9或相關(guān)多肽的DNA等的核酸等、(c)控制該半乳凝素9的問題活性的化合物(該半乳凝素9蛋白質(zhì)的毒害細(xì)胞活性、凋亡誘導(dǎo)活性、對正常細(xì)胞沒有壞的影響，促進(jìn)或抑制·阻礙起著所定功效的活性等現(xiàn)象、或促進(jìn)或抑制·阻礙組織或蛋白質(zhì)的變質(zhì)·過剩生產(chǎn)或分解現(xiàn)象達(dá)到生物學(xué)活性的化合物)或其鹽、(d)使用本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的活性物質(zhì)等]作為藥物使用時(shí)，通常可以單獨(dú)或與藥理上容許的各種制劑輔助劑混合后，作為藥物組成物或藥物制備物等給予。最好是以適合經(jīng)口給藥、局部給藥、或非經(jīng)口給藥等使用的制劑制備物的形態(tài)給藥，根據(jù)目的也可以通過任一種給藥方式(也包括吸入法、或直腸給藥)給藥。
另外，本發(fā)明的活性成分也可以配合各種藥物、例如抗腫瘤劑(抗癌劑)、腫瘤轉(zhuǎn)移抑制劑、血栓形成抑制劑、關(guān)節(jié)破壞治療劑、鎮(zhèn)痛劑、消炎劑和/或免疫抑制劑使用，這些制劑只要是具有有利的作用可以無限制地使用，例如可以從該領(lǐng)域中已知的制劑中選擇。
而作為非經(jīng)口給藥方式，可以包括局部、經(jīng)皮、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、皮內(nèi)或腹腔內(nèi)給藥，也可以直接向患部給藥，對于某些場合也適合。理想的是向包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物經(jīng)口、或非經(jīng)口(例如，細(xì)胞內(nèi)、組織內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、腹腔內(nèi)、胸腔內(nèi)、脊髓腔內(nèi)、點(diǎn)滴法、注腸、經(jīng)直腸、點(diǎn)耳、點(diǎn)眼或點(diǎn)鼻、齒、向皮膚或粘膜涂布等)給藥。作為具體的制劑制備物的形態(tài)，如溶液制劑、分散制劑、半固體制劑、粉粒體制劑、成型制劑、浸出制劑等，例如片劑、包被片劑、加糖衣制劑、丸劑、口含片、硬膠囊劑、軟膠囊劑、微膠囊劑、埋入劑、粉末劑、散劑、顆粒劑、細(xì)粒劑、注射劑、液劑、酏劑、乳劑、灌注劑、糖漿、水劑、乳劑、懸濁劑、擦劑、洗劑、氣霧劑、噴霧劑、吸入劑、噴霧劑、軟膏制劑、硬膏制劑、貼附劑、浴劑、濕潤劑、膏劑、油劑、栓劑(例如直腸栓劑)、酊劑、皮膚用水劑、點(diǎn)眼劑、點(diǎn)鼻劑、點(diǎn)耳劑、涂布劑、輸液劑、用于注射用液劑等的粉末劑、冷凍干燥制劑、凝膠制備品等。
藥物用的組成物可以根據(jù)通常的方法進(jìn)行制劑化。例如，根據(jù)適當(dāng)?shù)男枰?，可以單?dú)或組合使用生理學(xué)上認(rèn)可的載體，作為藥物容許的載體、佐劑、賦形劑、輔形劑、稀釋劑、香味劑、香料、甜味劑、媒介物、防腐劑、穩(wěn)定劑、結(jié)合劑、pH調(diào)節(jié)劑、緩沖劑、表面活性劑、基劑、溶劑、填充劑、增量劑、溶解輔助劑、可溶化劑、等滲劑、乳化劑、懸濁化劑、分散劑、增粘劑、凝膠化劑、硬化劑、吸收劑、粘接劑、彈性劑、可塑劑、崩解劑、噴射劑、保存劑、抗氧化劑、遮光劑、保濕劑、緩和劑、防止帶電劑、無痛化劑等，通過將它們一起與本發(fā)明的蛋白質(zhì)混合，可以制造成一般認(rèn)可的制劑實(shí)施中要求的單位用量形態(tài)。
作為適于非經(jīng)口使用的制劑，活性成分與水或其它的藥學(xué)上容許的溶劑的無菌溶液、或懸濁液劑等、例如注射劑等。一般來說，水、鹽水、葡萄糖水溶液、其它相關(guān)的糖的溶液、乙醇、丙二醇、聚乙二醇等乙二醇類可作為理想的注射劑用的液體載體。制備注射劑時(shí)，使用蒸餾水、林格液、生理鹽水那樣的載體、適當(dāng)?shù)姆稚┗驖窕瘎┖蛻覞峄旱龋迷擃I(lǐng)域已知的方法制備成象溶液、懸濁液、乳劑那樣可以注射的形式。
作為注射用的水性液，如包括生理鹽水、葡萄糖或其它的輔助藥(例如，D-山梨糖醇、D-甘露糖醇、氯化鈉等)等滲液等，也可以與藥理上容許的適當(dāng)溶解輔助劑、例如醇(例如乙醇等)、聚醇(例如，丙二醇、聚乙二醇等)、非離子性表面活性劑(例如，聚山梨酯80TM，HCO-50等)并用。作為油性液，如芝麻油、大豆油等，也可以與作為溶解輔助劑的苯甲酸芐酯、芐酯醇等并用。另外，也可以與緩沖劑(例如，磷酸鹽緩沖液、醋酸鈉緩沖液等)或用于浸透壓調(diào)節(jié)的試劑、無痛化劑(例如，殺藻胺、鹽酸普魯卡因等)、穩(wěn)定劑(例如，人血清白蛋白、聚乙二醇等)、保存劑(例如，芐醇、酚等)、抗壞血酸等抗氧化劑、吸收促進(jìn)劑等配合。制備的注射液通常被填充到適當(dāng)?shù)陌碴称恐小?br> 對于非經(jīng)口給藥，可以加或不加表面活性劑以及其它藥學(xué)上容許的助劑，做成水、乙醇或油那樣的無菌的藥學(xué)上容許的液體中的溶液或懸濁液形式的制劑。作為制劑中使用的油性載色劑或溶劑，如天然的、合成的或半合成的單、或雙、或三甘油酯類、天然的、合成的或半合成的油脂類或脂肪酸類，例如，花生油、玉米油、大豆油、芝麻油等植物油。例如，該注射劑可以按照含有0.1～10重量％程度的本發(fā)明化合物那樣制備。
作為適用于局部、例如口腔或直腸使用的制劑，例如洗口劑、磨齒劑、口腔噴霧劑、吸入劑、軟膏劑、牙科填充劑、牙科包被劑、牙科膏劑、栓劑等。作為洗口劑、其它牙科用劑，可以使用藥理上容許的載體，通過慣用的方法制備。作為口腔噴霧劑、吸入劑，使本發(fā)明化合物本身或與藥理上容許的非活性載體一起溶解于濕霧劑或噴霧器用的溶液，或做成吸入用微粉末給予牙齒等。軟膏劑，可以添加通常使用的基劑、例如軟膏基劑(白色凡士林、石蠟、橄欖油、聚乙烯二醇400、聚乙烯二醇軟膏等)等，通過慣用的方法制備。
向牙、皮膚局部涂布用的藥品可以在適當(dāng)滅菌的水或非水賦形劑的溶液或懸濁液中配制、作為添加劑，如亞硫酸氫鈉或乙二胺四乙酸二鈉那樣的緩沖劑；含有醋酸或硝酸苯汞、氯化烷基二甲基芐基銨或雙氯苯雙胍己烷那樣的滅菌和抗真菌劑的防腐劑和羥丙基甲基纖維素(ヒプロメルロ-ズ)那樣的增稠劑。
栓劑使用在該領(lǐng)域中眾所周知的載體、最好是非刺激性的適當(dāng)?shù)妮o形劑、例如聚乙二醇類、羊毛脂、可可脂、脂肪酸甘油三酯等載體，最好是在常溫下雖然是固體，但在腸道的溫度下為液體，在直腸內(nèi)放出融解的藥物的載體等，通過慣用的方法制備，通常按照含有0.1～95重量％程度的本發(fā)明化合物那樣制備。由于使用的賦形劑和濃度不同，藥品可以懸浮于或溶解于賦形劑中。象局部麻醉劑、防腐劑以及緩沖劑那樣的輔助藥可以溶解于賦形劑中。適于作為經(jīng)口使用的制劑，如片劑、丸劑、膠囊、粉末劑、顆粒劑、口含片那樣的固形組成物，或液劑、糖漿、懸濁劑那樣的液狀組成物等。制備制劑時(shí)，使用在該領(lǐng)域中已知的制劑輔助劑等。片劑和丸劑還可制造成被糖衣包被。調(diào)劑單位方式為膠囊時(shí)，可以在上述類型的材料中再含有油脂那樣的液狀載體。
另外，活性成分為蛋白質(zhì)或多肽時(shí)，由于聚乙二醇(PEG)在哺乳動(dòng)物中毒性極低，所有與它結(jié)合特別有用。而與PEG結(jié)合，有時(shí)可以有效地減少異種性化合物的免疫原性以及抗原性。該化合物也可以加入到微膠囊裝置中給予。象PEG那樣的聚合物可以簡單地附著于在氨基末端的氨基酸的α-氨基、賴氨酸側(cè)鏈的ε-氨基、天冬氨酸或谷氨酸的側(cè)鏈的羧基、羧基末端的氨基酸的α-羧基、或某種天冬酰胺、絲氨酸或蘇氨酸殘基的糖基鏈被活化的衍生物上。
已知有很多適于與蛋白質(zhì)直接反應(yīng)的活化形式的PEG。作為對與蛋白質(zhì)的氨基反應(yīng)有用的PEG試劑，如羧酸、碳酸衍生物的活性酯、特別是解離基為N-羥基琥珀酰亞胺、p-硝基苯酚、咪唑、或1-羥基-2-硝基苯-4-硫酸。同樣，含有氨基肼或酰肼基的PEG在通過蛋白質(zhì)中的過碘化酸氧化生成的醛反應(yīng)中有用。
本發(fā)明的診斷和治療為了能夠適于也許哺乳動(dòng)物表現(xiàn)出的特定的自身免疫等疾患·疾病、包括癌等惡性腫瘤在內(nèi)的腫瘤、變態(tài)性疾患、炎癥等，通過對該哺乳動(dòng)物進(jìn)行診斷開始實(shí)施的。為了監(jiān)測治療進(jìn)行以及例如為了判斷是否要對正在進(jìn)行的治療中的給予量或給予次數(shù)那樣的參數(shù)進(jìn)行改變，作為治療程序診斷可以在治療期間繼續(xù)進(jìn)行。作為有助于決定有關(guān)半乳凝素9突變體治療藥給予的適當(dāng)性那樣的診斷手法，如哺乳動(dòng)物中半乳凝素9表達(dá)水平的分析、和從自身免疫的部位分離的淋巴細(xì)胞等細(xì)胞與靠近自身免疫部位的淋巴細(xì)胞等細(xì)胞之間的這些細(xì)胞水平的比較等。要治療的哺乳動(dòng)物的自身免疫疾患等疾患·疾病、包括癌等惡性腫瘤在內(nèi)的腫瘤、變態(tài)性疾患、炎癥等通過檢測細(xì)胞內(nèi)的半乳凝素9抗原可以進(jìn)行監(jiān)測。這樣的監(jiān)測包括使來自哺乳動(dòng)物的樣品與半乳凝素9特異的抗體接觸，然后檢測與樣品結(jié)合的抗體。
基因治療用載體是用于遞送為了在哺乳動(dòng)物中表達(dá)要被遞送到哺乳動(dòng)物的本發(fā)明的治療藥的包括編碼序列(例如、半乳凝素9突變體編碼序列)在內(nèi)的構(gòu)建物(construct)的載體，或用于遞送半乳凝素9突變體的全部或部分，也包括用于遞送的核酸序列的該構(gòu)建物的載體，可以通過局部或全身的任一種方法給予。這些構(gòu)建物可以在體內(nèi)或體外，利用通過病毒載體的途徑或非病毒載體形式的途徑遞送。為了表達(dá)這樣的編碼序列，可以通過使用內(nèi)源性的哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子或異種啟動(dòng)子誘導(dǎo)來進(jìn)行。編碼序列在體內(nèi)的表達(dá)可以是構(gòu)建形式表達(dá)，或可調(diào)節(jié)地進(jìn)行的任一種表達(dá)方式。當(dāng)半乳凝素9突變體在哺乳動(dòng)物被表達(dá)時(shí)，可以以可溶性的半乳凝素9突變體表達(dá)，有時(shí)也可以以前體型半乳凝素9突變體形式表達(dá)。在這兩種表達(dá)形式中或其中的任一種形式中，它們可以是例如整個(gè)的半乳凝素9突變體、或半乳凝素9突變體的生物學(xué)的活性部分、變異體、衍生物、或融合體等。
本發(fā)明提供可以表達(dá)所要的半乳凝素9突變體的核酸序列的基因遞送載體。作為基因遞送載體，優(yōu)選病毒載體，更優(yōu)選逆病毒、腺病毒、腺隨伴病毒(AAV)、皰疹病毒、或甲病毒等病毒載體等。作為病毒載體，如星狀病毒、冠狀病毒、正粘病毒、乳多泡病毒、副粘病毒、細(xì)小病毒、細(xì)小核糖核酸病毒、痘病毒、披膜病毒等病毒載體。關(guān)于該基因遞送載體，一般可參照D.Jolly，Cancer Gene Therapy，1(1)51-64(1994)；O.Kimura et al.，Human Gene Therapy，5845-852(1994)；S.Connelly et al.，Human Gene Therapy，6185-193(1995)；M.G.Kaplitt et al.，Nature Genetics，8148-153(1994)等。
逆病毒載體在該領(lǐng)域都熟知的，例如、包括B型、C型、和D型逆病毒、xenotropic逆病毒(例如、NZB-X1，NZB-X2，NZB9.1(R.R.O′Neill，J.Virol.，53100-106(1985)參照)等)、polytropic逆病毒(例如、MCF，MCF-MLV(M.Kelly，J.Virol.，45291-298(1983)參照)等)、泡沫病毒、慢病毒等(參照R.L.Weiss et al.(Eds.)，RNA Tumor Viruses，Second Edition，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，1985)在內(nèi)的任意逆病毒基因治療載體在本發(fā)明中都可以使用。
基因治療逆病毒載體的一部分可以是來自不同逆病毒的部分。例如、逆載體的LTR可以是來自大白鼠肉瘤病毒的，tRNA結(jié)合部位可以是來自羅斯肉瘤病毒的，包裝信號(hào)可以是來自大白鼠白血病病毒的，第二鏈合成起源可以是來自鳥白血癥病毒的。這些重組逆病毒載體通過將它們導(dǎo)入適當(dāng)?shù)陌b細(xì)胞株，可用于能形成可轉(zhuǎn)化的逆病毒載體粒子(參照美國專利第5,591,624號(hào)說明書)。逆病毒載體可以通過逆病毒粒子內(nèi)帶有的稱之為整合酶的具有的將目的DNA部位特異地整合到宿主細(xì)胞的DNA中的能力的重組酶進(jìn)行構(gòu)建。作為重組病毒載體，最好是復(fù)制能力缺損重組病毒。
作為適合使用上述逆病毒載體的包裝細(xì)胞株，如該領(lǐng)域熟知的細(xì)胞株，而且容易制備(參照美國專利第6,013,517號(hào)說明書，WO92/05266)。該包裝細(xì)胞株可以在用于產(chǎn)生重組載體粒子的生產(chǎn)細(xì)胞株(載體細(xì)胞株，vector cell lineVCL)中使用。包裝細(xì)胞株最好是能夠在人血清中不進(jìn)行活化，由人的親細(xì)胞(例如、HT1080細(xì)胞)或水貂的親細(xì)胞株制作。
作為逆病毒基因治療載體構(gòu)建中理想的逆病毒，如鳥白血癥病毒、牛白血病病毒、大白鼠白血病病毒、水貂細(xì)胞灶形成病毒、大白鼠肉瘤病毒、網(wǎng)狀細(xì)胞內(nèi)皮癥病毒、羅斯肉瘤病毒等。作為大白鼠白血病病毒特別優(yōu)選的，例如、4070A和1504A(Hartley & Rowe，J.Virol0.，1919-25(1976))、Abelson(ATCC No.VR-999)、Friend(ATCC No.VR-245)、Graffi，Gross(ATCC No.VR-590)、Kirsten、Harvey肉瘤病毒和Rauscher(ATCC No.VR-998)、以及莫洛尼小鼠白血病病毒(ATCC No.VR-190)等。
這樣的逆病毒可以從美國典型培養(yǎng)物保藏所(ATCC，Rockville，Maryland，USA)那樣的保藏機(jī)構(gòu)或保存機(jī)構(gòu)獲得，或使用通?？衫玫募夹g(shù)由已知的供給源分離。
作為在本發(fā)明可使用的眾所周知的逆病毒基因治療載體的例子，如GB 2200651，EP 0415731，EP 00345242，WO 89/02468，WO 89/05349，WO 89/09271，WO 90/02806，WO 90/07936，WO 94/03662，WO 93/25698，WO 93/25234，WO 93/11230，WO 93/10218，WO 93/10218，WO 91/02805、美國專利第5,219,740號(hào)說明書、同第4,405,712號(hào)說明書、同第4,861,719號(hào)說明書、同第4,980,289號(hào)說明書、同第4,777,127號(hào)說明書、同第5,591,624號(hào)說明書、Vile，Cancer Res，533860-3864(1993)，Vile，Cancer Res，53962-967(1993)，Ra，Cancer Res，5383-88(1993)，Takamiya，J Neurosci Res，33493-503(1992)，Baba，J Neurosurg，79729-735(1993)，Mann，Cell 33153(1983)，Cane，Proc Natl Acad Sci USA，816349(1984)，Miller，HumanGene Therapy，15-14(1990)等記載的例子。
人的腺病毒基因治療載體在該領(lǐng)域中也是眾所周知的，可在本發(fā)明中使用，例如可以參照Berkne，Biotechniques，6616(1988)；Rosenfeld，Science，252431(1991)；WO 93/07283；WO 93/06223；WO 93/07282等。作為可在本發(fā)明中使用的已知的腺病毒基因治療載體例子，如上述參考文獻(xiàn)所述的，例如、WO 94/12649；WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984；WO 95/00655；WO 95/27071；WO 95/29993；WO 95/34671；WO 96/05320；WO 94/08026；WO 94/11506；WO 93/06223；WO 94/24299；WO 95/14102；WO 95/24297；WO 95/02697；WO 94/28152；WO 94/24299；WO 95/09241；WO 95/25807；WO 95/05835；WO 94/18922；WO 95/09654等所述的例子。另外，就像Curiel，HumanGene Therapy，3147-154(1992)所述那樣，也可以給予連接在滅活的腺病毒的DNA。
另外作為本發(fā)明的基因遞送載體，如腺病毒隨伴病毒(AAV)載體。這樣的載體中用于本發(fā)明的理想例子，如象WO 93/09239公布的那樣源于AAV-2的載體。作為最理想的AAV載體，是含有2個(gè)AAV的逆末端反復(fù)序列的載體。該載體天然的D序列由于核苷酸置換被改變，其結(jié)果應(yīng)當(dāng)至少還維持著5個(gè)天然型核苷酸和直至18個(gè)天然型核苷酸(優(yōu)選至少10個(gè)天然型核苷酸和直至18個(gè)天然型核苷酸、最優(yōu)選10個(gè)天然型核苷酸)，D序列剩下的核苷酸缺失，或被非天然型的核苷酸置換。AAV逆末端反復(fù)領(lǐng)域的天然型D序列是在各AAV逆末端反復(fù)序列中含有20個(gè)連續(xù)核苷酸的序列(即在各末端存在一個(gè)序列)，該序列與HP形成無關(guān)。非天然型置換的核苷酸可以是與在同一部位天然型的D序列中發(fā)現(xiàn)的核苷酸不同的任意的核苷酸。作為其它的可使用的AAV載體的例子，如pWP-19、pWN-1等(Nahreini，Gene，124257-262(1993))。作為這樣的AAV載體的其它例子，如psub201等(Samulski，J.Virol.，613096(1987))。作為其它的AAV載體例子，如Double-D ITR載體等。制作Double-D ITR的方法如美國專利第5,478,745號(hào)說明書公布的方法。此外，AAV載體如美國專利第4,797,368號(hào)說明書、同第5,139,941號(hào)說明書、同第5,474,935號(hào)說明書、WO 94/288157號(hào)等公布的載體。作為可在本發(fā)明利用的另外的AAV載體例子，如SSV9AFABTKneo，該載體含有AFP0增強(qiáng)子和白蛋白啟動(dòng)子，而且傾向于在肝臟中優(yōu)先表達(dá)。其結(jié)構(gòu)和制作方法如Su，Human Gene Therapy，7463-470(1996)公布的方法。作為其它的AAV基因治療載體，如美國專利第5,354,678號(hào)說明書、同第5,173,414號(hào)說明書、同第5,139,941號(hào)說明書、同第5,252,479號(hào)說明書等記載的載體。
本發(fā)明的基因治療載體可以是皰疹載體。作為主要的皰疹載體的理想例子，如含有編碼胸腺嘧啶脫氧核苷激酶多肽序列的單純皰疹病毒載體(例如、美國專利第5,288,641號(hào)說明書和EP 0176170公布的載體)。作為單純皰疹病毒載體的例子如WO 95/04139等公布的HFEM/ICP6-LacZ，Geller，Sclence，2411667-1669(1988)、WO90/09441、WO 92/07945等記載的pHSVlac，F(xiàn)ink，Human Gene Therapy，311-19(1992)記載的HSV Us3pgC-lacZ、EP 0453242 A記載的HSV7134，2RH 105和GAL4、以保藏號(hào)ATCC VR-977和ATCC VR-260寄托于ATCC的載體等。
在本發(fā)明中也可以使用甲病毒基因治療載體。作為理想的甲病毒載體，如新培斯病毒載體、披膜病毒、Semliki Forest病毒(ATCCVR-607；ATCC VR-1247)、Middleberg病毒(ATCC VR-370)、Ross River病毒(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(ATCC VR 923；ATCC VR-1250；ATCC VR-1249；ATCC VR-532)、美國專利第5,091,309號(hào)、同第5,217,879號(hào)、和WO 92/10578記載的載體等。另外作為可使用的甲病毒載體，如美國專利第5,091,309號(hào)說明書、同第5,217,879號(hào)說明書、同第5,843,723號(hào)說明書、同第6,376,236號(hào)說明書、WO 94/21792、WO 92/10578、WO 95/07994等記載的載體。這樣的甲病毒可以從ATCC(Rockville，Maryland，USA)那樣的保藏機(jī)構(gòu)或保存機(jī)構(gòu)獲得，或使用通?？衫玫募夹g(shù)從已知的供給源分離。最好是能夠使用細(xì)胞傷害性可降低的甲病毒載體(參照美國專利第6,391,632號(hào)說明書)。
DNA載體系(例如、真核生物級(jí)聯(lián)式表達(dá)系(eukarytic layeredexpression system)等)在用于表達(dá)本發(fā)明的半乳凝素9突變體的核酸中是有用的。有關(guān)真核生物級(jí)聯(lián)式表達(dá)系的詳細(xì)情況可以參照WO95/07994。作為本發(fā)明的真核生物級(jí)聯(lián)式表達(dá)系最好是來自甲病毒載體的，優(yōu)選來自新培斯病毒載體的表達(dá)系。
作為適合本發(fā)明使用的其它病毒載體，如來自脊髓灰質(zhì)炎病毒(例如、ATCC VR-58，Evans，Nature，339385(1989)，Sabin，J.Biol.Standardization，1115(1973)等記載的病毒等)；鼻病毒(例如、ATCC VR-1110和Arnold，J.Cell Biochem，L401-405(1990)記載的病毒等)；痘病毒(例如、金絲雀痘病毒等)或痘苗病毒(例如、ATCC VR-111，ATCC VR-2010等、Fisher-Hoch，Proc Natl Acad SciUSA，86317(1989)，F(xiàn)lexner，Ann NY Acad Sci，56986(1989)，F(xiàn)lexner，Vaccine，817(1990)、美國專利第4,603,112號(hào)說明書以及同第4,769,330號(hào)說明書、和WO 89/01973中記載的病痘毒等)；SV40病毒(例如、ATCC VR-305和Mulligan，Nature，277108(1979)和Madzak，J.Gen.Vir，731533(1992)中記載的病毒等)；流感病毒(例如、ATCC VR-797等)、使用美國專利第5,166,057號(hào)說明書、Enami，Proc Natl Acad Sci USA，873802-3805(1990)，Enami &Palese，J Virol，652711-2713(1991)，Luytjes，Cell，59110(1989)，McMicheal.，N E J Med，30913(1983)，Yap，Nature，273238(1978)、以及Nature，277108(1979)等中記載的那樣的逆遺傳學(xué)技術(shù)制作的重組流感病毒；EP 0386882、Ruchschacher，J.Vir.，662731(1992)等記載的人免疫不全癥病毒；麻疹病毒(例如、ATCCVR-67，VR-1247以及EP 0440219記載的病毒等)；奧拉病毒(例如、ATCC VR-368等)；Bebaru病毒(例如、ATCC VR-600和ATCC VR-1240等)；Cabassou病毒(例如、ATCC VR-922等)；奇昆貢亞病毒(例如、ATCC VR-64，ATCC VR-1241等)；Fort Morgan病毒(例如、ATCCVR-924等)；Getah病毒(例如、ATCC VR-369，ATCC VR-1243等)；Kyzylagach病毒(例如、ATCC VR-927等)；馬亞羅病毒(例如、ATCCVR-66等)；穆茨布病毒(例如、ATCC VR-580，ATCC VR-1244等)；恩杜姆病毒(例如、ATCC VR-371等)；Pixuna病毒(例如、ATCC VR-372，ATCC VR-1245等)；Tonate病毒(例如、ATCCVR-925等)；Triniti病毒(例如、ATCC VR-469等)；Una病毒(例如、ATCC VR-374等)；Whataroa病毒(例如、ATCC VR-926等)；Y-62-33病毒(例如、ATCC VR-375等)；O′Nyong病毒、東部腦炎病毒(例如、ATCC VR-65，ATCC VR-1242等)；西部腦炎病毒(例如、ATCC VR-70，ATCC VR-125L，ATCC VR-622，ATCC VR-1252等)；冠狀病毒(例如、ATCC VR-740，Hamre，Proc Soc Exp Biol Med，121190(1966)記載的病毒)的載體等。
將本發(fā)明的組成物向細(xì)胞遞送不限定于上述的病毒載體。也可以使用其它的遞送方法和媒體，作為這樣的方法和媒體，例如核酸表達(dá)載體、只與滅活的腺病毒連結(jié)的多陽離子性復(fù)合體DNA(例如參照Curiel，Hum Gene Ther，3147-154(1992))、配位體連結(jié)DNA(例如參照Wu，J Biol Chem，6416985-16987(1989))、真核生物細(xì)胞遞送載體細(xì)胞(例如、參照美國專利第6,013,517號(hào)說明書、同第6,015,686號(hào)說明書等)、光聚合的水凝膠物質(zhì)沉淀物、象美國專利第5,149,655號(hào)說明書記載的那樣的攜帶型基因?qū)肓Ｗ訕尅O92/11033記載的電離放射線法、核電荷中和法、或與細(xì)胞膜的融合法等。另外作為手法如Philip，Mol Cell Biol，142411-2418(1994)，Woffendin，Proc Na0000tl Acad Sci USA，911581-585(1994)記載的方法等。
也可以使用粒子媒介基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，序列被插入到用于高水平表達(dá)的含有慣用的調(diào)控序列的通常載體，然后與被連接在合成基因轉(zhuǎn)移分子(例如、細(xì)胞靶配位體(例如、Wu et al.，J.Biol.Chem.，2624429-4432(1987)記載的那樣的脫唾液酸類黏蛋白、Hucked，BiochemPharmacol，40253-263(1990)記載那樣的胰島素、Plank，Bioconjugate Chem，3533-539(1992)記載的那樣的半乳糖、乳糖、或鐵傳遞蛋白等)的聚賴氨酸、魚精蛋白、和白蛋白那樣的聚合性DNA結(jié)合陽離子溫育。
也可以使用裸DNA，例如、作為裸DNA的導(dǎo)入方法如WO 90/11092和美國專利第5,580,859號(hào)說明書記載的方法等。收率使用生物降解性乳膠珠可以改善。DNA包被乳膠珠，該珠被胞飲后可有效地輸送到細(xì)胞內(nèi)。該方法使疏水性增大，由此通過使包裹小泡破裂和使DNA釋放到細(xì)胞質(zhì)那樣的珠處理可以進(jìn)一步改善。
作為基因遞送載體可以起作用的那樣脂質(zhì)體如美國專利第5,422,120號(hào)說明書、WO 95/13796，WO 94/23697，WO 91/144445和EP 524，968記載的。在非病毒的遞送法中，編碼半乳凝素9突變體多肽的核酸序列可以被插入到用于高水平表達(dá)的通常含有調(diào)控序列的慣用的載體，然后與合成基因?qū)敕肿訙赜Ｗ鳛樵摵铣苫驅(qū)敕肿?，例如與細(xì)胞靶的配位體(例如、脫唾液酸血清類粘蛋白、胰島素、半乳糖、乳糖、鐵傳遞蛋白等)連接的聚合性DNA結(jié)合陽離子。作為聚合性DNA結(jié)合陽離子，例如、聚賴氨酸、魚精蛋白、白蛋白等。作為其它的遞送系，例如可以使用用于將含有多種組織特異的或普遍活性的啟動(dòng)子調(diào)控下的基因的DNA膠囊化的脂質(zhì)體。作為適合使用的非病毒的遞送法，如機(jī)械遞送系(例如、Woffendin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91(24)11581-11585(1994)記載的手法)。
另外編碼序列和這樣的表達(dá)產(chǎn)物可以通過光聚合的水凝膠物質(zhì)的沉淀遞送。作為可用于遞送編碼序列的基因遞送的其它方法，例如、使用美國專利第5,149,655號(hào)00說明書記載的攜帶型基因?qū)肓Ｗ訕尩姆椒?、WO 92/11033記載那樣的為了對導(dǎo)入的基因進(jìn)行活化使用電離放射線的方法等。
作為脂質(zhì)體和多陽離子性基因遞送載體的例子，如美國專利第5,422,120號(hào)說明書和同第4,762,915說明書、WO 95/13796，WO94/23697，WO 91/14445，EP 0524968，Stryer，Biochemistry，236-240(1975)，W.H.Freeman et al.，Biochem Biophys Acta，6001(1980)，Bayer，Biochem Biophys Acta，550464(1979)，Rivnay，Meth Enzymol，149119(1987)，Wang，Proc Natl Acad Sci USA，847851(1987)，Plant，Anal 0Biochem，176420(1989)等記載的載體。
本發(fā)明公布了對陷于包含包括癌等惡性腫瘤在內(nèi)的腫瘤、變態(tài)性疾患、炎癥、免疫異常、活化淋巴細(xì)胞(特別是活化T細(xì)胞，也可包括活化B細(xì)胞)的自身免疫疾患等疾患和疾病的哺乳動(dòng)物通過給予半乳凝素9突變體或來自半乳凝素9突變體的治療劑(例如、作為治療活性成分含有半乳凝素9突變體多肽或用于在哺乳動(dòng)物中表達(dá)的編碼半乳凝素9突變體多肽的聚核苷酸等的組成物)進(jìn)行治療的方法。作為可以通過本發(fā)明的方法和組成物治療的自身免疫疾患，如任意的自身免疫疾患或移植排斥(例如、包括本說明書中列舉的自身免疫疾患，但不限定于這些)。
半乳凝素9突變體例如可以以通過重組技術(shù)表達(dá)的多肽、或半乳凝素9突變體多肽的突變體、其衍生物、或它的融合蛋白質(zhì)形式給予，可以通過局部或全身任一種方式遞送給哺乳動(dòng)物。編碼半乳凝素9突變體、半乳凝素9突變體的衍生物或突變體、或半乳凝素9突變體融合體的核酸(DNA、RNA等)在基因治療程序中可以以包含用于在哺乳動(dòng)物中表達(dá)的調(diào)節(jié)區(qū)的裸質(zhì)粒DNA形式，或通過用于在哺乳動(dòng)物中表達(dá)的病毒載體給予。用于表達(dá)的半乳凝素9突變體多肽的遞送可以使用使遞送變得容易的那樣的藥學(xué)上容許的載體完成。對有自身免疫疾患的哺乳動(dòng)物用來自半乳凝素9突變體的治療劑進(jìn)行治療后，可以使自身免疫疾患改善或緩解，或使起因于自身免疫的臨床癥狀消失。
本發(fā)明不受本發(fā)明公開的治療劑怎樣起作用的理論限定，而是應(yīng)當(dāng)由引起自己識(shí)別，然后傷害自身免疫的活化T細(xì)胞等決定。通過表達(dá)半乳凝素9突變體，或是使半乳凝素9突變體表達(dá)，或給予來自半乳凝素9突變體治療劑，有問題的活化淋巴細(xì)胞受到可利用的半乳凝素9突變體的影響，優(yōu)先成為靶子，進(jìn)行凋亡。半乳凝素9突變體多肽或來自半乳凝素9突變體治療劑可以投到表現(xiàn)出自身免疫的區(qū)域(例如、進(jìn)行治療的表現(xiàn)出特定自身免疫疾患特征那樣的局部區(qū)域)。由此，給予的半乳凝素9突變體以及其它治療劑與在該區(qū)域的細(xì)胞表達(dá)的具有靶標(biāo)的活化T細(xì)胞等之間的接觸被最適化。因此，該區(qū)域的細(xì)胞成了借助于基因遞送載體的幫助被投到該區(qū)域的編碼半乳凝素9突變體多肽的聚核苷酸表達(dá)時(shí)的良好的候補(bǔ)。由此對本發(fā)明進(jìn)行各種變更、運(yùn)用，按照能夠使半乳凝素9突變體多肽表達(dá)那樣進(jìn)行操作，可以在處于被活化T細(xì)胞等攻擊下的細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。對于移植排斥的場合，例如與能夠結(jié)合很多細(xì)胞型的在細(xì)胞表面上遍在表達(dá)的蛋白質(zhì)的分子結(jié)合部融合的半乳凝素9突變體多肽。該結(jié)合部分，例如可以是肝素，而結(jié)合的細(xì)胞表面上的分子也可以是葡糖胺聚糖。另外該結(jié)合部分也可以是對任意選擇的細(xì)胞表面抗原特異的單鏈抗體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
關(guān)于本發(fā)明，對于包括癌等惡性腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的腫瘤細(xì)胞獲得細(xì)胞傷害作用，或獲得抗變態(tài)性作用，或獲得抗炎癥作用，或使免疫異常正?；瑢τ诨罨馨图?xì)胞(特別是也可以包括活化T細(xì)胞)誘導(dǎo)凋亡的場合都應(yīng)當(dāng)與上述自身免疫的場合同樣理解。
本說明書中使用的「給藥」或「進(jìn)行給藥」指的是將治療劑或治療劑的配合物遞送到哺乳動(dòng)物的過程。給藥過程可以因治療劑(單個(gè)或多個(gè)的治療劑)和所期望的效果不同進(jìn)行改變。給藥可以通過例如非經(jīng)口的遞送或經(jīng)口的遞送等適合治療劑的任意手段完成。作為非經(jīng)口的遞送，例如向皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)遞送、向器官組織的注射、通過粘膜、肺、局部的或通過導(dǎo)管遞送等。經(jīng)口的手段是經(jīng)由口給藥的手段，例如、可以使用片劑或其它經(jīng)由胃腸的遞送手段(包括可飲用的液體)等進(jìn)行。作為經(jīng)由粘膜的遞送，例如鼻腔內(nèi)遞送等。作為經(jīng)由肺的遞送，可以使藥劑吸入。給藥一般來說也可以通過使用藥學(xué)上容許的載體(例如、緩沖液、多肽、肽、云芝多糖綴合物、脂質(zhì)體、脂等)遞送進(jìn)行?；蛑委煶绦虬ㄗ鳛橹委焺┱J(rèn)為可以給予在哺乳動(dòng)物以轉(zhuǎn)錄物或多肽形式表達(dá)時(shí)能夠達(dá)到治療目的聚核苷酸的場合，也可適用于非經(jīng)口的遞送手段和經(jīng)口的遞送手段中任一種手段。這樣的給藥手段可以按照適合治療的疾患情況進(jìn)行選擇。例如，疾患為器官基底的場合，遞送可以是局部遞送，例如，疾患為全身的場合，遞送可以是全身的。所謂聯(lián)合用藥指的是在對某患者的治療中再給予一種或一種以上的治療劑。治療劑可以使用同樣的藥學(xué)的載體給予，或也可以使用不同的載體給予。這些載體可以通過同樣的或不同的給予手段給予。藥劑可以是同型的藥劑，或不同型的藥劑，例如、作為不同型，如聚核苷酸、多肽、或低分子的藥劑。給藥時(shí)間可以是恰好同一時(shí)間，1種治療劑也可以在另外的藥劑之前或之后給藥。因此聯(lián)合用藥可以同時(shí)，也可以連續(xù)進(jìn)行。用于將治療劑做成所定的組合的正確程序可以在考慮藥劑和按照其它考慮已治療的狀態(tài)后決定。
所謂用語「體內(nèi)給藥」指的是為了在哺乳動(dòng)物中表達(dá)，將編碼多肽的聚核苷酸投給患者(例如、哺乳動(dòng)物)。特別是作為直接的體內(nèi)給藥，如細(xì)胞不從哺乳動(dòng)物取出，而是通過編碼序列轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞。因此作為直接的體內(nèi)給藥，為了在患者細(xì)胞中發(fā)生表達(dá)，可以直接將編碼目的多肽的DNA直接注射到陷于自身免疫疾患煩惱的區(qū)域。
用語「體外給藥」指的是將細(xì)胞從患者(例如、哺乳動(dòng)物)中取出后，對細(xì)胞(例如、來自于處于自身免疫攻擊下的細(xì)胞集団的細(xì)胞)進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理。轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞被返回到哺乳動(dòng)物。體外給藥是將細(xì)胞從哺乳動(dòng)物取出，根據(jù)需要，選擇要轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(即受到自身免疫機(jī)構(gòu)攻擊下的細(xì)胞)，要將被選擇的細(xì)胞做成不能復(fù)制，將選擇的細(xì)胞用編碼要表達(dá)的基因(即半乳凝素9突變體)的聚核苷酸(為了使表達(dá)容易進(jìn)行也可含有調(diào)節(jié)區(qū)域)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，為了使半乳凝素9突變體表達(dá)，通過將被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞返回到患者達(dá)到。
作為治療的有效量，指的是產(chǎn)生所期望的治療結(jié)果那樣的量。例如、當(dāng)所期望的治療效果是自身免疫治愈時(shí)，所謂的治療的有效量指的是容易達(dá)到治愈的那樣的量。所謂治療上有用的量可以是例如、在包括數(shù)日或數(shù)周間給藥那樣的投藥程序中投給的那樣的量。治療效果，例如在自身免疫疾患的癥狀出現(xiàn)期間，可以使哺乳動(dòng)物的自身免疫應(yīng)答的影響降低時(shí)在哺乳動(dòng)物中用于獲得這樣效果的藥劑的有效量指的是造成自身免疫的癥狀減少那樣的量。
用語「藥學(xué)上容許的載體」指的是用于給予治療劑(例如、多肽、聚核苷酸、低分子、肽性物質(zhì)、肽等)載體，載體本身不誘導(dǎo)接受組成物的個(gè)體產(chǎn)生有害的抗體，而且不能產(chǎn)生有問題那樣的毒性，可以給予的那樣的任意的藥學(xué)上容許的載體。在本發(fā)明的另外方式中，提供與藥學(xué)上容許的載體或稀釋劑組合，含有上述那樣的重組病毒載體的藥學(xué)的組成物。這樣的藥學(xué)的組成物可以是液體溶液形式的組成物，或制備成在給予前可懸浮于溶液的固體形式(例如、冷凍干燥的產(chǎn)品)。另外，該組成物也可以使用適合于給予表面，或注射，或經(jīng)口給予，或經(jīng)直腸給予的載體或稀釋劑進(jìn)行制備。作為藥學(xué)上容許的載體或稀釋劑，在使用的給予量和濃度下對接受者(recipient)基本上是無毒的。作為用于可注射的溶液的載體或稀釋劑的代表例子，如水、等滲生理食鹽水溶液(理想的是在生理pH下具有緩沖的溶液、例如、磷酸緩沖生理鹽水、Tris緩沖生理鹽水等)、甘露醇、葡萄糖、甘油糖、乙醇、多肽或蛋白質(zhì)(例如、人血清白蛋白)等。載體或重組病毒可以加入到含有10mg/ml甘露醇、1mg/ml HSA、20mM Tris(pH7.2)、和150mM NaCl的藥學(xué)的組成物后進(jìn)行遞送。此時(shí)重組載體約為1g物質(zhì)，高分子物質(zhì)不到1％，總物質(zhì)量(包括水)在1/100,000以下。該組成物至少了在20℃下穩(wěn)定6個(gè)月間。
本發(fā)明的藥學(xué)的組成物可以含有刺激細(xì)胞分裂的因子，因此可以含有整合重組逆病毒載體，刺激組合的因子。重組病毒的保存法可以參照美國專利第5,792,643號(hào)說明書記載的保存法。
用于實(shí)施本發(fā)明提供的治療法的所有治療劑可以加入到含有治療藥用的藥學(xué)上容許的載體的適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)組成物。用于治療藥的藥學(xué)載體可以是同樣的，也可以因各個(gè)治療藥不同而不一樣。作為合適的載體，可以是大的、而且代謝緩慢的巨大分子(例如、蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、粒子中的不活性病毒等)。這樣的載體對于同行眾所周知。
作為藥學(xué)上容許的鹽，例如無機(jī)酸鹽(例如鹽酸鹽、溴氫酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等)；有機(jī)酸鹽(例如醋酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽等))，這些鹽可以加入到該組成物后使用。有關(guān)藥學(xué)上容許的賦形劑可以參照例如Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.，USA，1991)。作為治療組成物中的藥學(xué)上容許的載體，例如水、生理鹽水、甘油糖、乙醇等液體。作為助劑，例如濕潤劑、乳化劑等，也可以將pH緩沖物質(zhì)等加入到這樣的載體中。代表性的治療組成物可以制備成可以注射的任一種液體溶液或懸浮物；在注射前制備成可以使用液體載體適合做成液體或懸浮物的固體形態(tài)載體。在藥學(xué)上容許的載體的定義內(nèi)也包含脂質(zhì)體。
還可以提供與藥學(xué)上容許的載體或稀釋劑組合，包含有重組逆病毒或一個(gè)上述的載體構(gòu)建物的病毒的藥學(xué)組成物。該組成物可以制備成液體溶液或在給予前可懸浮于溶液的固體形式(例如、冷凍干燥的產(chǎn)品)中任一種。另外，該組成物也可以使用適合于給予表面，或注射，或經(jīng)口給予，或經(jīng)直腸給予的載體或稀釋劑進(jìn)行制備。
作為藥學(xué)上容許的載體或稀釋劑，在使用的給予量和濃度下對接受者(recipient)基本上是無毒的。作為用于可注射的溶液的載體或稀釋劑的代表例子，如水、等滲生理食鹽水溶液(理想的是在生理pH下有緩沖作用的溶液、例如、磷酸緩沖生理鹽水、Tris緩沖生理鹽水等)、甘露醇、葡萄糖、甘油糖、乙醇、多肽或蛋白質(zhì)(例如人血清白蛋白)等。載體或重組病毒可以加入到含有10mg/ml甘露醇、1mg/mlHSA、20mM Tris(pH7.2)、和150mM NaCl的藥學(xué)組成物后進(jìn)行遞送。此時(shí)重組載體約為1g物質(zhì)，高分子物質(zhì)不到1％，總物質(zhì)量(包括水)在1/100,000以下。該組成物至少了在20℃下穩(wěn)定6個(gè)月間。
藥學(xué)上容許的載體或稀釋劑為了能夠做成液體溶液或給藥前能夠懸浮于溶液的固體方式(例如、冷凍干燥的方式)中的任一種方式的組成物，可以與基因遞送載體組合。2個(gè)以上的基因遞送載體可以借助于代表性的傳統(tǒng)的直接途徑例如頰/舌下、直腸、經(jīng)口、經(jīng)鼻、局部(例如、經(jīng)皮和眼等)、陰道、肺、動(dòng)脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)、皮下、眼內(nèi)、鼻腔內(nèi)、或靜脈內(nèi))，或間接給藥。
本發(fā)明的治療藥可以任意地含有例如用于在哺乳動(dòng)物中表達(dá)的聚核苷酸，該治療藥可以根據(jù)該領(lǐng)域中眾所周知的方法，制作成腸溶性片劑和膠囊劑等制劑。這些可以參照以下的專利例如、美國專利第4,853,230號(hào)說明書、EP 225,189、AU 9,224,296、AU 9,230,801、和WO 92144,52等。這樣的膠囊可以經(jīng)口給予，以腸為靶。經(jīng)口給藥后1～4日，通過使用抗該蛋白質(zhì)的抗體等測定血漿和血液決定例如多肽的表達(dá)是否在進(jìn)行，或例如是否發(fā)生由核酶或反義寡核苷酸引起的表達(dá)被抑制。
基因遞送載體可以象例如美國專利第4,411,648號(hào)說明書、同第5,222,936號(hào)說明書、同第5,286,254號(hào)說明書、WO 94/05369等記載的那樣，通過例如注射、粒子槍、局部給藥、非經(jīng)口給藥、吸入、或離子導(dǎo)入遞送等導(dǎo)入哺乳動(dòng)物。
治療組成物或治療劑也可以與能夠改善包括癌等惡性腫瘤在內(nèi)的腫瘤、變態(tài)性癥、炎癥、免疫異常、自身免疫疾患那樣的其它治療劑、或能夠增強(qiáng)給予半乳凝素9突變體治療劑獲得的治療上利益那樣的其它治療劑一起給予。例如、在為了治療變態(tài)性反應(yīng)給予時(shí)，為了能夠在存在于粘膜、鼻、支氣管、肺等組織的細(xì)胞中表達(dá)，可以給予半乳凝素9突變體聚核苷酸的氣霧，為了更有利，例如在變態(tài)性反應(yīng)平息之前的期間，每日數(shù)次、通過鼻用噴霧或氣霧噴霧反復(fù)給藥。
基因遞送載體可以直接給到哺乳動(dòng)物的單一部位或多個(gè)部位，例如可以通過直接注射給予?；蜻f送載體也可以使用通過體外轉(zhuǎn)化導(dǎo)入的靶細(xì)胞給予。本發(fā)明還提供適合基因遞送載體給予的藥學(xué)組成物(包括例如各種賦形劑)。
可以將半乳凝素9突變體多肽、其突變體、衍生物、類似物、變異體、或指示嵌合表達(dá)的載體構(gòu)建物直接給予包括癌等惡性腫瘤在內(nèi)的腫瘤部位、表現(xiàn)出變態(tài)性的部位、炎癥部位、表現(xiàn)出免疫異常的部位、表現(xiàn)出自身免疫的部位(例如、胰臟、腎臟、肝臟、關(guān)節(jié)、腦、脊髓液、皮膚、或身體其它區(qū)域或器官)。為了直接給予載體構(gòu)建物，在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以使用各種各樣的方法。例如、如果已鑒定有在某區(qū)域起作用的動(dòng)脈的話，為了直接將載體遞送到該部位，可以注射到這樣的動(dòng)脈中。同樣通過使用例如含有載體構(gòu)建物的局所用藥劑組成物，可以將載體構(gòu)建物直接給到皮膚表面。
在直接給藥中，可以將半乳凝素9突變體治療劑和含有其它的抗自身免疫藥劑的配合治療劑一起給予。聯(lián)合用藥可以同時(shí)進(jìn)行，例如，通過在同一載體中放置編碼藥劑的聚核苷酸，不管是聚核苷酸、多肽、其它的藥物，將藥劑加入到同一藥劑組成物中，或可以在幾乎同一時(shí)間，幾乎同一位置將藥劑加入到可以注射的其它的藥劑組成物中然后給予可以完成聯(lián)合用藥。不同時(shí)進(jìn)行聯(lián)合用藥時(shí)(例如，給予藥物前體激活劑后，給予藥物前體那樣的場合)、第2個(gè)藥劑為了適合治療目的，可以通過直接注射給藥。因此，象例如給予藥物前體那樣的場合，藥物前體應(yīng)當(dāng)給到與藥物前體激活劑同一部位。因此作為聯(lián)合用藥程序，可以含有用于達(dá)到治療目的的給藥組合。另外，聯(lián)合用藥根據(jù)需要，可以包括之后給藥(例如，反復(fù)進(jìn)行體內(nèi)直接注射給予半乳凝素9突變體治療那樣的方式)。
本發(fā)明中，取出的細(xì)胞應(yīng)當(dāng)理解為能夠返回到同一動(dòng)物或另外的同種異系的動(dòng)物或哺乳動(dòng)物的細(xì)胞。這樣的場合，一般來說，組織適合性最好是符合該動(dòng)物(并非限定于此，例如參照Yamamoto et al.，AIDS Research and Human Retroviruses，7911-922(1991)；Yamamoto et al.，Journal of Virology，67601-605(1993))。
可以從患者的各個(gè)部位取出細(xì)胞。另外在本發(fā)明的其它的實(shí)施方式中，可以將載體構(gòu)建物導(dǎo)入到例如來自皮膚的細(xì)胞(皮膚成纖維細(xì)胞等)或來自血液的細(xì)胞(例如、外周血白細(xì)胞等)?？梢詮难禾禺惾〕鏊谕?、細(xì)胞的特定級(jí)分(例如、T細(xì)胞部分集合或干細(xì)胞等)(參照例如、WO 91/16116)。然后利用任意的上述技術(shù)使取出細(xì)胞與載體構(gòu)建物接觸，然后將該細(xì)胞返回到溫血?jiǎng)游?最好是表現(xiàn)出自身免疫的區(qū)域付近或付近內(nèi))。
例如一旦對哺乳動(dòng)物等患者進(jìn)行診斷，進(jìn)行包括給予半乳凝素9突變體治療劑，或按照適于治療的特定疾患·疾病(例如、腫瘤、變態(tài)性、自身免疫疾患等)的手法和用量將該治療劑給予哺乳動(dòng)物，以及為了決定有無必要連續(xù)給予治療劑或修正給予進(jìn)行監(jiān)測哺乳動(dòng)物等在內(nèi)的本發(fā)明的實(shí)施。本發(fā)明中所謂實(shí)施包括對治療的疾患進(jìn)行鑒定，決定可適用于靶基因治療的有希望細(xì)胞型或身體區(qū)域。構(gòu)建半乳凝素9突變體聚核苷酸(含有用于在哺乳動(dòng)物中表達(dá)的調(diào)節(jié)區(qū)域的質(zhì)粒、或含有用于表達(dá)的病毒載體)，取出一些哺乳動(dòng)物細(xì)胞，再用編碼半乳凝素9突變體的聚核苷酸進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理，然后為了使半乳凝素9突變體表達(dá)，加入到哺乳動(dòng)物中。或者，聚核苷酸例如為了在疾患清楚的區(qū)域中進(jìn)行表達(dá)可以投給哺乳動(dòng)物。
因此，例如對于惡性腫瘤細(xì)胞的場合，通過在體內(nèi)或體外使用半乳凝素9突變體可以對患部組織或臟器等腫瘤細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理。另外，例如對于慢性關(guān)節(jié)炎風(fēng)濕病的場合，可以在體外使用半乳凝素9突變體對由關(guān)節(jié)液得到的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
例如在多發(fā)性硬化癥治療中，可以向受到影響的腦區(qū)域注射半乳凝素9突變體，也可以使半乳凝素9突變體在處于自身免疫反應(yīng)型的活化T細(xì)胞等攻擊的細(xì)胞中容易表達(dá)。另外一個(gè)例子，對于多發(fā)性硬化癥的場合，半乳凝素9突變體DNA可以局部注射于哺乳動(dòng)物腦中，也可以取出來自脊髓液的細(xì)胞，將它用半乳凝素9突變體DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理，返回到脊髓區(qū)域。作為另外的例子，為了治療具有肖格倫綜合征的哺乳動(dòng)物，作為該疾病的靶器官，也可以選擇適于通過注射給予半乳凝素9突變體多肽的方式。另外對于患有肖格倫綜合征的哺乳動(dòng)物，也可以對罹患器官(例如、腎臟等)進(jìn)行鑒定，直接將半乳凝素9突變體DNA給到該器官，也可以取出來自器官的細(xì)胞，進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理，然后返回到身體使半乳凝素9突變體在哺乳動(dòng)物的這些細(xì)胞中表達(dá)。
例如予防移植排斥時(shí)，接受移植的動(dòng)物由于象對外來細(xì)胞、外來組織、或外來器官進(jìn)行攻擊那樣捕殺活化患者細(xì)胞，所以可以局部或全身給予半乳凝素9突變體治療劑，為了能夠暫時(shí)對患者身體內(nèi)器官進(jìn)行保護(hù)，在移植開始前也可以使半乳凝素9突變體多肽在器官外表面上的細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。接受移植的人的免疫系在順應(yīng)外來細(xì)胞、外來組織、或外來器官之前期間，連續(xù)給予半乳凝素9突變體治療劑大概是很有必要的。
預(yù)期半乳凝素9突變體治療劑具有類似于天然半乳凝素9的作用。為了引起凋亡反應(yīng)可以使用半乳凝素9突變體治療劑。因此，在臨床醫(yī)療中，為了達(dá)到凋亡，應(yīng)當(dāng)可以從化學(xué)計(jì)量上知道需要表達(dá)或給予哺乳動(dòng)物的半乳凝素9突變體量。就本發(fā)明的其它方式來說，本說明書中公開的載體構(gòu)建物當(dāng)然也可以指示來自非載體的基因的表達(dá)。例如，與適于與半乳凝素9突變體一起給予的藥物前體系可以起到用于基因治療的安全機(jī)構(gòu)的作用，也可以用作并用治療劑。
也可以使藥物前體激活劑與半乳凝素9突變體一起在載體中表達(dá)，確保安全機(jī)構(gòu)。如果決定該活化系應(yīng)當(dāng)被停止，給予藥物前體，使該藥物前體激活劑活化。通過這樣治療，可以賦予臨床醫(yī)治基因治療期間的調(diào)控手段。藥物前體激活劑/藥物前體系可用于哺乳動(dòng)物(例如、自身免疫由于半乳凝素9突變體表達(dá)惡化的那樣場合)中轉(zhuǎn)染細(xì)胞的鈍化。藥物前體激活劑/藥物前體系為了能夠使用通過該系提供的藥物前體活化的細(xì)胞傷害作用，可以進(jìn)行組合治療，或在治療劑中并用給予使用。
包括與藥物前體激活劑和藥物前體一起給予編碼半乳凝素9突變體多肽的聚核苷酸的治療可以是免疫調(diào)節(jié)性的治療。所謂免疫調(diào)節(jié)性指的是引起性質(zhì)或效力與因子不存在下發(fā)生的免疫應(yīng)答不同的免疫應(yīng)答的因子的使用，該因子可以是與免疫應(yīng)答有關(guān)的一個(gè)以上細(xì)胞制造的，也可以外源添加到細(xì)胞的因子。應(yīng)答的性質(zhì)或效力可以通過同行眾所周知的各種分析(例如、測定細(xì)胞增殖(例如、3H胸腺嘧啶脫氧核苷的攙入)的體外分析和體外細(xì)胞傷害分析(包括例如測定51Cr的釋放))進(jìn)行測定(參照Warner et al.，AIDS Res.and HumanRetroviruses，7645-655(1991))。作為免疫調(diào)節(jié)因子，是在體內(nèi)和體外都具有活性的因子。這樣的因子的代表例如細(xì)胞因子(例如、白介素2，4，6，12和15)、α干擾素、β干擾素、γ干擾素、GM-CSF、G-CSF、和腫瘤壞死因子(TNF)等。作為其它的免疫調(diào)節(jié)因子，例如CD3，ICAM-1，ICAM-2，LFA-1，LFA-3，MHC類I分子，MHC類II分子、β2-巨球蛋白、伴侶、其類似物等。而且當(dāng)基因遞送載體不表達(dá)作為細(xì)胞因子的免疫調(diào)節(jié)輔因子時(shí)，該細(xì)胞因子可以包含在上述的組成物中，與上述的組成物同時(shí)或延后給予。需要時(shí)，在這樣的實(shí)施方式中，免疫調(diào)節(jié)補(bǔ)因子最好是根據(jù)該領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)的程序和給藥量給予。例如、α干擾素在2～4個(gè)月間可以按照100～500萬單位/日給藥量給予，而IL-2可以在2～12周間，按照1～3次/日、10,000～100,000單位/kg體重的給藥量給予。γ干擾素例如為了通過給予半乳凝素9突變體達(dá)到更有效的治療，為了在活化T細(xì)胞中對問題基因的表達(dá)進(jìn)行正調(diào)節(jié)，可以按照2～12周間、2～3次/周、150,000～1,500,000單位的給藥量給予。
在并用治療劑中，藥物前體激活劑也可以由該激活劑的載體表達(dá)，也可以由與半乳凝素9突變體多肽同樣的載體進(jìn)行表達(dá)。可以將任一種載體系(單一載體或2個(gè)載體)通過體內(nèi)或體外手段給予。在自身免疫治療中，例如，藥物前體激活劑的添加可以更進(jìn)一步促進(jìn)支持由半乳凝素9突變體達(dá)到的效果的免疫調(diào)節(jié)效果，而藥物前體添加可以對轉(zhuǎn)染細(xì)胞的殺傷再進(jìn)行活化。
伴侶分子可以在聚核苷酸治療藥給予前、給予同時(shí)，或給予后給予，而伴侶分子可以是例如熱休克蛋白質(zhì)(例如、hsp70)。在哺乳動(dòng)物中表達(dá)的聚核苷酸可以再與例如用于確實(shí)只在所期望靶細(xì)胞進(jìn)行聚核苷酸表達(dá)目的的誘導(dǎo)啟動(dòng)子(例如、組織特異的啟動(dòng)子)連接。為了將聚核苷酸有效地遞送到組織的目的，聚核苷酸可以與適合于向該組織的細(xì)胞基因組整合的核苷酸序列鄰接。
對于本發(fā)明的這一方式和許多方式，對人進(jìn)行治療的有效性最初可以在所定的自身免疫疾患動(dòng)物模型中進(jìn)行試驗(yàn)。作為這樣的現(xiàn)存動(dòng)物模型，包括例如肖格倫綜合征(自身免疫淚腺炎或免疫媒介唾液腺炎)、自身免疫心肌炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變(PBC)、炎癥性心疾患、水銀誘導(dǎo)性腎臟自身免疫、胰島素依賴性糖尿病(I型糖尿病或IDD)、胸腺摘出后自身免疫、中樞神經(jīng)系(CNS)脫髓損傷、CNS狼瘡、發(fā)作性睡眠、重癥肌無力癥(MG)、突眼性甲狀腺腫、免疫媒介PNS損傷、變形性關(guān)節(jié)癥、慢性關(guān)節(jié)風(fēng)濕病、葡萄膜炎、髓質(zhì)囊胞性纖維癥、自身免疫溶血性疾患、自身免疫脈管炎、卵巢自身免疫疾患、和人強(qiáng)皮癥(schleroderma)等在內(nèi)的自身免疫疾患動(dòng)物模型。
可以將多個(gè)基因遞送載體給予動(dòng)物或植物。在理想的實(shí)施方式中，動(dòng)物為溫血?jiǎng)游铮詈檬菑男∈?、雞、牛、豬、寵物(例如、貓和狗)、馬、和人中選擇。至于多肽治療藥(例如、半乳凝素9突變體或其它細(xì)胞因子)，給藥量可以是約5～50μg/kg哺乳動(dòng)物體重、或約50μg/kg～約5mg/kg、或約100～500μg/kg哺乳動(dòng)物體重和約200～約250μg/kg的范圍。
關(guān)于多肽治療藥(例如編碼天然或變異體的半乳凝素9突變體多肽的聚核苷酸等)在以組織為靶的給藥中，根據(jù)聚核苷酸在患者(例如、哺乳動(dòng)物)中的表達(dá)，可以象下面那樣給予含有編碼序列或非編碼序列的可表達(dá)構(gòu)建物的載體在局部給藥的基因治療程序中，可以在約100ng～約200mg DNA、或約500ng～約50mg DNA、或約1μg～約2mg DNA、或約5μg DNA～約500μg DNA范圍內(nèi)給藥，而在基因治療程序中的局部給藥中間，可以在約20μg～約100μg范圍給藥，例如每次注射或給藥，按照約500μg的用量給藥。期望更多表達(dá)時(shí)，遍及組織的更廣的區(qū)域，按照連續(xù)給藥程序再給予更多的量的DNA或同樣量的DNA，例如可以向腫瘤部位附近不同的或緊連的組織部分給予一些，這樣給藥對于帶來陽性的治療結(jié)果很有必要。
有關(guān)低分子治療藥的給予，可以根據(jù)低分子的效力改變給藥量。如果是非常強(qiáng)的抑制劑，其給藥量如用哺乳動(dòng)物每公斤的量表示的話，例如、在約1μg/kg～約500mg/kg、或約100μg/kg～約5mg/kg、或約1μg/kg～約50μg/kg、或例如約10μg/kg的范圍非常充分。就肽和類肽的給藥來說，效力因給藥量而有所變化，可以是約1μg/kg～約500mg/kg哺乳動(dòng)物體重、和約100μg/kg～約5mg/kg、和約1μg/kg～約50μg/kg的范圍。而通常的用量可以是約10μg/kg。
本發(fā)明的活性成分可以在很寬范圍選擇該成分的給藥量給藥，該給藥量和給藥次數(shù)等可以根據(jù)治療患者的性別、年齡、體重、一般的健康狀態(tài)、飲食、給藥時(shí)間、給藥方法、排泄速度、藥物的組合、患者此時(shí)進(jìn)行治療的病狀的程度考慮這些因素或其它要因之后決定。
在進(jìn)行藥物品制造時(shí)，其添加劑等和制備法等可以參考例如日本藥局方解說書編集委員會(huì)編、第十四改正日本藥局方解說書、平成13年6月27日發(fā)行、株式會(huì)社廣川書店；一番ケ瀬尚他編醫(yī)藥品的開發(fā)12卷(制劑素劑〔I〕)、平成2年10月15日發(fā)行、株式會(huì)社廣川書店；同、醫(yī)藥品的開發(fā)12卷(制劑素材〔II〕)平成2年10月28日發(fā)行、株式會(huì)社廣川書店等記載，從這些記載中根據(jù)需要適當(dāng)選擇運(yùn)用。
本發(fā)明的活性成分包括本說明書中說明的(a)半乳凝素9突變體以及與其具有基本上均等的生物活性的多肽等、(b)編碼半乳凝素9突變體以及與其具有基本上均等的生物活性的多肽的聚核苷酸、(c)利用半乳凝素9突變體技術(shù)發(fā)現(xiàn)的因子等、(d)半乳凝素9突變體以及與其具有基本上均等的生物活性的多肽基因遞送載體等，這些成分在利用人半乳凝素9對正常細(xì)胞不表現(xiàn)出傷害活性，而對腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)傷害細(xì)胞活性的性狀、對腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡，但對正常細(xì)胞不誘導(dǎo)凋亡的性狀、抑制惡性細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性的性狀、誘導(dǎo)被活化的免疫細(xì)胞、特別是活化的CD4陽性T細(xì)胞的凋亡的活性(與此相反，靜息T細(xì)胞、特別是CD4陽性T細(xì)胞(協(xié)助者T細(xì)胞)的凋亡誘導(dǎo)稱之為不誘導(dǎo)凋亡的性狀)等上是有用的，有望作為利用與抗腫瘤劑、抗變態(tài)性劑、免疫調(diào)節(jié)劑、自身免疫疾患用劑、抗炎癥劑、腎上腺皮質(zhì)類固醇激素同樣活性的藥劑。
根據(jù)使用本發(fā)明的活性成分、例如半乳凝素9突變體(特別是G9NC(null))確認(rèn)的生物活性效果，認(rèn)為半乳凝素9以及半乳凝素9突變體(特別是G9NC(null))對于如下給出的那樣病的癥狀和疾患表現(xiàn)出有用的生物活性。
在炎癥性疾患中有各臟器中發(fā)生的各種急性和慢性炎癥、變態(tài)性和自身免疫性的炎癥、感染癥等。
作為急性和慢性疾患，包括例如肺炎中支氣管炎、支氣管肺炎、間質(zhì)性肺炎、肺臟炎、細(xì)支氣管炎和急性縱隔炎等，以及其它的的臟器的炎癥，例如心外膜炎、心內(nèi)膜炎、心肌炎、口內(nèi)炎、口角炎、扁桃炎、咽炎、喉頭炎、食道炎、腹膜炎、急性胃炎、慢性胃炎、急性腸炎、蟲垂炎、缺血性大腸炎、藥物性大腸炎、直腸炎、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、重癥肝炎、慢性肝炎等各種急性和慢性肝炎和肝硬變、膽囊炎、急性胰炎、慢性胰炎、還有急性和慢性腎炎、膜性腎炎、絲球體腎炎、IgA腎癥等和各種各樣的膀胱炎、腦髓炎、乳腺炎、皮炎、表層角膜炎、干性角結(jié)膜炎、各種中耳炎和鼻炎、副鼻腔炎和鼻茸等、牙肉炎、牙周炎、牙周圍炎等各種各樣的炎癥。
另外，在神經(jīng)性炎癥(例如神經(jīng)性胃炎、神經(jīng)性膀胱炎等)中也看到了效果。例如，通過實(shí)施例8確認(rèn)，半乳凝素9在辣椒辣素誘導(dǎo)神經(jīng)性皮炎癥模型中對模型的炎癥反應(yīng)具有強(qiáng)的抑制效果。辣椒辣素是通過刺激末梢神經(jīng)引起神經(jīng)性炎癥和疼痛的物質(zhì)。辣椒辣素具有刺激儲(chǔ)藏在作為知覺神經(jīng)C纖維末端的神經(jīng)肽的物質(zhì)P釋放的作用。物質(zhì)P具有使組胺從肥大細(xì)胞釋放的作用，結(jié)果血管被擴(kuò)張，出現(xiàn)浮腫。另外，由于釋放的組胺作用，知覺神經(jīng)受到刺激，物質(zhì)P由C纖維末端釋放，作用于其周圍的肥大細(xì)胞，出現(xiàn)再使組胺釋放的增強(qiáng)循環(huán)。半乳凝素具有抑制該病態(tài)形成的作用。
再者辣椒辣素與感覺神經(jīng)末梢的疼痛受容傳感器的辣椒辣素受體(香草素受體)結(jié)合，引起疼痛。疼痛是由于化學(xué)刺激(酸等)、熱刺激(開水等)或過度的機(jī)械刺激(創(chuàng)傷等)感覺神經(jīng)末梢被活化引起的，辣椒辣素受體也參與由于這樣的刺激引起的疼痛。這表明半乳凝素9抑制由辣椒辣素受體導(dǎo)致的神經(jīng)末梢的活化，預(yù)期有可能具有使伴隨癌或炎癥引起的疼痛減輕等鎮(zhèn)痛作用。
變態(tài)性炎癥疾患如全身性過敏性、支氣管哮喘、過敏性肺炎、花粉癥、變態(tài)性鼻炎、變態(tài)性結(jié)膜炎、免疫復(fù)合體引起的變態(tài)性疾患、血管神經(jīng)性浮腫等。
另外自身免疫性的炎癥(自身免疫疾患)中有全身性(慢性關(guān)節(jié)風(fēng)濕病、全身性紅斑狼瘡、結(jié)節(jié)性多發(fā)性動(dòng)脈炎、強(qiáng)皮癥、多發(fā)性肌炎·皮膚肌炎、肖格倫綜合征、貝切特病等)、神經(jīng)系(多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力癥、HAM(HTLV-1脊髓癥)、肌萎縮性側(cè)索硬化癥等)、內(nèi)分泌性(巴澤多病、橋本病、1型糖尿病等)、血液(特發(fā)性血小板減少性紫斑病、自身免疫性溶血性貧血、再生不良性貧血等)、呼吸器(結(jié)節(jié)病、肺纖維癥等)、消化管(潰瘍性大腸炎、克羅恩病等)、肝臟(自身免疫性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變、原發(fā)性硬化性膽管炎、自身免疫性膽管炎等)、腎·尿路系(抗嗜中性白細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)抗體關(guān)聯(lián)腎炎、血管炎、Goodpasture綜合征、抗絲球體基底膜抗體病等)等。
感染癥是病原體由于生物體的細(xì)胞·組織·臟器產(chǎn)生的疾患的總稱。關(guān)于感染癥可以參考監(jiān)修町并陸生、編集秦順一、坂本穆彥、「標(biāo)準(zhǔn)病理學(xué)(第2版)」、醫(yī)學(xué)書院、2002年3月15日發(fā)行。引起人感染癥的病原體有1)細(xì)菌(包括螺旋體、衣原體、立克次體)、2)病毒、3)真菌、4)植物(藻類)、5)原蟲、6)寄生蟲(吸蟲、條蟲、線蟲)、7)節(jié)足動(dòng)物。各病原體引起的主要的疾患如細(xì)菌性感染癥(霍亂、瘟疫、大腸桿菌感染癥等)、螺旋體感染癥(鉤端螺旋體病等)、衣原體感染癥(鸚鵡病等)、立克次體感染癥(斑疹傷寒、破傷風(fēng)等)、病毒性感染癥(帶狀皰疹、病毒性出血熱、狂犬病等)、真菌癥(念珠菌病、隱球菌病、曲霉菌病等)、原蟲性疾患(阿米巴性痢疾、瘧疾、弓形體病等)、寄生蟲(吸蟲癥、線蟲癥等)、以及支原體感染癥(支原體肺炎等)、分支桿菌感染癥(結(jié)核、非定型抗酸菌癥等)。
至于癌和肉瘤，如腦腫瘤(多形形惡性膠質(zhì)腫等)、脊髓腫瘤、上顎洞癌、胰液腺癌、齒肉癌、舌癌、口唇癌、上咽癌、中咽癌、下咽癌、喉頭癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、肺癌、胸膜腫瘤、癌性腹膜炎、癌性胸膜炎、食道癌、胃癌、大腸癌、膽管癌、膽囊癌、胰臟癌、肝癌、腎臟癌、膀胱癌、前立腺癌、陰莖癌、精巢腫瘤、腎上腺癌、子宮頸癌、子宮體癌、陰道癌、外陰癌、卵巢癌、纖毛上皮腫、惡性骨腫瘤、軟部肉瘤、乳癌、皮膚癌、惡性黑色素瘤、基底細(xì)胞瘤、白血病、伴隨骨髓化性的骨髓纖維癥、惡性淋巴瘤、惡性淋巴肉芽腫病、漿細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等。
也適用皮膚科領(lǐng)域，例如1)在皮膚疾患中存在著包括感染癥、變態(tài)性炎癥和自身免疫性炎癥在內(nèi)的炎癥和干癬、水皰癥、膿皰癥、角化、角化異常癥等特有的炎癥。另外2)與美容皮膚科關(guān)系，a)黑色素代謝調(diào)節(jié)(美白)···半乳凝素9基因?qū)牒谒亓黾?xì)胞，由黑色調(diào)向白色變化。皮膚基底細(xì)胞層有半乳凝素9陽性細(xì)胞。
b)毛發(fā)成長(生發(fā))的調(diào)節(jié)···毛根部有半乳凝素9表達(dá)，隨時(shí)期而變。半乳凝素9基因?qū)胄∈蟮拿l(fā)的成長與突變體半乳凝素9基因?qū)胄∈笙啾确浅：谩?br> c)膠原產(chǎn)生調(diào)節(jié)等···成纖維細(xì)胞通過各種刺激有半乳凝素9表達(dá)、纖維結(jié)締組織有半乳凝素9陽性的部分。
至于生活習(xí)慣病如高脂血癥、動(dòng)脈硬化癥、高血壓、糖尿病等。已闡明與生活習(xí)慣病動(dòng)脈硬化癥的病態(tài)形成有關(guān)的細(xì)胞之一泡沫細(xì)胞中存在著gal9陽性細(xì)胞和陰性細(xì)胞。因此，表明gal9與動(dòng)脈硬化癥的病態(tài)有關(guān)，不可否認(rèn)通過控制它，治療或予防成為可能。至于高血壓，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ透哐獕喊l(fā)癥時(shí)由于半乳凝素9在尿細(xì)管或絲球體中的表達(dá)增強(qiáng)，所以有時(shí)對半乳凝素9表達(dá)進(jìn)行控制，通過給予半乳凝素9能夠治療的可能性增大。
另外，也適用于正常細(xì)菌叢的維持，例如、gal9在腸管上皮正常強(qiáng)烈表達(dá)，另外對于給予惡玉細(xì)菌叢時(shí)，半乳凝素9在腸管上皮和巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞中的表達(dá)增強(qiáng)。由此明顯表示出半乳凝素9與消化管中正常細(xì)菌叢的維持有關(guān)。
另外，在可適用于淀粉樣變性，例如在確認(rèn)淀粉樣變性的部分的巨噬細(xì)胞中，有表現(xiàn)出半乳凝素9表達(dá)的巨噬細(xì)胞存在。存在著通過半乳凝素9可以控制淀粉樣沉積的可能性。
認(rèn)為對阿爾茨海默病、骨質(zhì)疏松癥、骨折等也有用，例如、在阿爾茨海默病患者的腦中變性的神經(jīng)細(xì)胞表現(xiàn)出半乳凝素9陽性特征。因此存在可用于治療和診斷的可能性。另外在骨質(zhì)疏松癥中，認(rèn)為半乳凝素9有抑制骨吸收，促進(jìn)骨形成的可能性。這樣的作用從骨代謝方面考慮，認(rèn)為是理想的藥劑。
另外在腦、神經(jīng)領(lǐng)域中也有用，例如、腦梗塞、心肌梗塞等缺血性病變的進(jìn)展伴隨著炎癥細(xì)胞的濕潤，引起超氧化物產(chǎn)生等進(jìn)一步惡化。預(yù)期半乳凝素9和半乳凝素9突變體可控制這樣的炎癥。作為炎癥、免疫系的變化為原因的脫骨髓性疾患，例如多發(fā)性硬化癥等。作為變性疾患，如肌萎縮性側(cè)索硬化癥、帕金森病等。另外綜合失調(diào)癥可以說原因是某種炎癥性的變化。即EPA(二十碳五烯酸)可用于腦中炎癥反應(yīng)的控制和神經(jīng)細(xì)胞膜的形成。在綜合失調(diào)癥患者中，有細(xì)胞膜中的EPA和其它的必需脂肪酸表現(xiàn)出枯竭的研究例。
預(yù)期半乳凝素9和半乳凝素9突變體對痛風(fēng)也有用。預(yù)期半乳凝素9和半乳凝素9突變體對于對尿酸結(jié)晶的組織沉著的疼痛的強(qiáng)急性炎癥也能進(jìn)行控制。
哮喘是引起可逆性呼吸道阻塞(哮喘發(fā)作)的呼吸器疾患，指的是對抗原特異的(變態(tài)原)或非特異的(感染、冷氣等)刺激，呼吸道反應(yīng)性亢進(jìn)的狀態(tài)。近年證明對于哮喘的呼吸道在不發(fā)作的穩(wěn)定期存在以嗜酸性細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、和肥大細(xì)胞為主體的炎癥，現(xiàn)在，認(rèn)為是哮喘本身慢性的支氣管炎。另外、很多的小兒哮喘與特應(yīng)性起因(IgE產(chǎn)生)的關(guān)聯(lián)雖然強(qiáng)(特應(yīng)型哮喘)、在成人哮喘中約半數(shù)被確認(rèn)不能證明與IgE有關(guān)(非特應(yīng)型哮喘)。哮喘予防·管理指導(dǎo)原則(1998年厚生省研究班)已出臺(tái)，哮喘治療可以分為急性發(fā)作和慢性呼吸道炎癥兩種。作為發(fā)作治療藥，支氣管擴(kuò)張藥(β2刺激藥、氨茶堿)可用作第一選擇藥，在中等癥以上的發(fā)作中用這些藥劑不充分，要進(jìn)行類固醇藥的大量全身給藥。類固醇藥副作用大、特別是消化性潰瘍、高血壓、高血糖、精神癥狀等重大，如果長期使用，感染癥、腎上腺抑制、骨質(zhì)疏松癥等逐漸成為問題。另外伴隨著合併癥的場合類固醇的使用伴隨著危險(xiǎn)。期盼副作用少、具有與類固醇同等效果的藥劑的開發(fā)。作為長期的管理藥，在慢性呼吸道炎癥的治療中抗炎癥藥為主體，其中推薦吸入類固醇藥的使用。長期大量使用該類固醇藥時(shí)，腎上腺抑制、骨質(zhì)疏松癥、呼吸道感染等副作用出現(xiàn)的可能性不能否定。另外、吸入藥要求正確吸入手技，與內(nèi)服藥比較，在順應(yīng)性這點(diǎn)差。就中等癥以上的哮喘來說，除了吸入類固醇藥之外，推薦吸入β2刺激藥、白三烯拮抗藥或并用緩釋性茶堿藥。如果是重癥例，不得已只能全身給予類固醇。期盼開發(fā)取代這樣藥劑的藥劑。
已知在哮喘的病態(tài)形成中，對T淋巴細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞的肺組織以及呼吸道的浸潤起著重要的作用。另外半乳凝素9具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能，誘導(dǎo)活化T細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞的凋亡。按照這樣的思路，根據(jù)本發(fā)明中使用半乳凝素9突變體等的研究，顯然半乳凝素9和半乳凝素9突變體具有改善(抑制)哮喘中呼吸道炎癥的活性。
而半乳凝素9和半乳凝素9突變體具有增強(qiáng)成骨細(xì)胞增殖和分化以及抑制破骨細(xì)胞分化的活性，認(rèn)為對于骨質(zhì)疏松癥的予防和/或治療、類固醇長期給藥中成為問題的副作用之一骨生長抑制也有效。
半乳凝素9和半乳凝素9突變體在對淋巴細(xì)胞的作用中與類固醇不同，表現(xiàn)出活化淋巴細(xì)胞特異的抑制作用，與類固醇相比，預(yù)期副作用、例如、免疫抑制少。另外，還具有抑制類固醇中不存在的粘附分子的功能以及抑制神經(jīng)性炎癥的作用，有望作為哮喘治療、例如發(fā)作治療藥。另外認(rèn)為可減輕類固醇的副作用。
實(shí)施例以下給出實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行具體說明，該實(shí)施例只是為了對本發(fā)明進(jìn)行說明，用于其具體方式的參考提供的。這些實(shí)施例是為了說明本發(fā)明的特定的具體方式的例子，并不表示限定或限制本申請書公開的發(fā)明范圍。本發(fā)明應(yīng)當(dāng)理解為源于本說明書的思想的各種各樣的可實(shí)施方式。
所有的實(shí)施例除了另外詳細(xì)記載的以外，使用的標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)實(shí)施的或可以實(shí)施的例子，這些對于同行眾所周知、慣用的技術(shù)。而在以下的實(shí)施例中，沒有特別指出時(shí)，具體的操作和處理?xiàng)l件等，DNA克隆根據(jù)J.Sambrook，E.F.Fritsch & T.Maniatis，″MolecularCloning″，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，N.Y.(1989)和D.M.Glover et al.ed.，″DNA Cloning″，2nd ed.，Vol.1 to 4，(The Practical Approach Series)，IRL Press，Oxford University Press(1995)；使用PCR法を時(shí)根據(jù)H.A.Erliched.，PCR Technology，Stockton Press，1989；D.M.Glover et al.ed.，″DNA Cloninh″，2nd ed.，Vol.1，(The Practical ApproachSeries)，IRL Press，Oxford University Press(1995)和M.A.Innis et al.ed.，″PCR Protocols″，Academic Press，New York(1990)所述的方法進(jìn)行，而使用市售的試劑或試劑盒時(shí)使用附帶的指示書(protocols)和添付的藥品等。
實(shí)施例1(A)半乳凝素9突變體表達(dá)載的構(gòu)建在制作表達(dá)載體時(shí)，使用(1)由Jurkat細(xì)胞的poly(A)+RNA級(jí)分制備的cDNA(2)pET-11a載體(STRATAGENE)(3)PCR用引物G9NCRD1CGTCCTCATATGGCCTTCAGCGGTTCCCAG序列10G9NCRD6CGACCGCATATGCTGGAAGCTGATGTAGGACAG序列11G9CCRD5CGTCCTCATATGACTCCCGCCATCCCACCTATG序列12G9CCRD6CGACCGGGATCCCTATGTCTGCACATGGGTCAG序列13Jurkat細(xì)胞(來自T細(xì)胞的細(xì)胞)由美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)獲得。細(xì)胞系于添加了10％FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基(Sigma、圣路易斯、美國)中在5％CO2的條件下維持在37℃。從Jurkat細(xì)胞提取總RNA象下面那樣進(jìn)行。即將使用含有10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞進(jìn)行離心、收集。用10mlPBS將細(xì)胞清洗2次。向清洗后的細(xì)胞沉淀按照每2×108個(gè)細(xì)胞加15mlISOGEN(商品名日本人)，按照指南(日本人)提取總RNA。從總RNA純化poly(A)+RNA和cDNA合成象下面那樣進(jìn)行。即，將從Jurkat細(xì)胞提取的總RNA按照終濃度為1mg/ml濃度那樣溶解于DEPC處理水中。使用PolyATtract mRNA Isolation System(商品名Promega)，根據(jù)指南從總RNA純化poly(A)+RNA。將純化的poly(A)+RNA按照終濃度為5μg/20μl溶解于DEPC處理水中。
使用First-Strand cDNA合成試劑盒(商品名AmershamBiosciences)，按照指南由5μg的poly(A)+RNA合成cDNA(對于引物使用Not I-d(T)18)。
接下來，按照圖1所示順序，在pET-11a載體NdeI-BamHI位點(diǎn)插入半乳凝素9的N-末端側(cè)糖鏈結(jié)合結(jié)構(gòu)域(N-terminalcarbohydrate recognition domain，NCRD)和C-末端側(cè)糖鏈結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CCRD)，制作缺少連接肽的改變型半乳凝素9(G9NC(null))的表達(dá)載體。首先從半乳凝素9cDNA分別取得(1)對應(yīng)于人半乳凝素9的C-末端側(cè)CRD的cDNA和(2)對應(yīng)于人半乳凝素9的N-末端側(cè)CRD的cDNA。即使用PCR用引物G9CCRD5+G9CCRD6從cDNA擴(kuò)增對應(yīng)于人半乳凝素9的C-末端側(cè)CRD的cDNA(G9CCRD)。將G9CCRD用制限酶(NdeI+BamHI)切后，插入到用同樣制限酶處理的pET-11a載體，得到pET-G9CCRD。PCR使用KOD DNA聚合酶試劑盒(TOYOBO CodeNo.KOD-101)進(jìn)行。使PCR反應(yīng)混合物(dNTP mix，25mM MgCl2，10×Buffer，KOD DNA聚合酶(0.05u)，引物和模板cDNA)在以下那樣的PCR的循環(huán)條件下進(jìn)行反應(yīng)94℃處理2分鐘后，進(jìn)行25次循環(huán)(98℃下15秒、然后65℃下2秒、而后74℃下處理30秒)，最后于4℃下停止反應(yīng)。被PCR擴(kuò)增的片段向載體的插入使用Ligation highkit(TOYOBO Code No.LGK-101)進(jìn)行。反應(yīng)按照插入片段載體的摩爾比為約5∶1進(jìn)行混合，加其總DNA溶液(體積)量的1/2(體積)量的試劑Ligation high混合后進(jìn)行。通過于16℃反應(yīng)16小時(shí)(O/N)進(jìn)行插入。
另外使用PCR用引物G9NCRD1+G9NCRD6從該半乳凝素9cDNA擴(kuò)增對應(yīng)于人半乳凝素9的N-末端側(cè)CRD的cDNA(G9NCRD)。將G9NCRD用制限酶(NdeI)切斷后，將得到的片段用同樣的制限酶(NdeI)處理，再插入到脫磷酸化的pET-G9CCRD中得到pET-G9NC(null)。PCR擴(kuò)增以及向載體的整合與上述同樣進(jìn)行。pET-G9NC(null)編碼具有將人的M型半乳凝素9的第149位Pro開始至第177位Ser的29個(gè)氨基酸序列置換為His-Met序列的氨基酸序列的多肽。即是具有序列1所示的堿基序列，編碼具有序列2所示的氨基酸序列的多肽。
(B)半乳凝素9突變體重組蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化將上述工程(A)得到的表達(dá)用質(zhì)粒載體pET-G9NC(null)導(dǎo)入大腸桿菌(BL21(DE3))。導(dǎo)入通過電穿孔法進(jìn)行。即將感受態(tài)BL21(DE3)和質(zhì)粒載體水溶液混合，通過使用1.8kV電壓的電穿孔法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
重組蛋白質(zhì)的表達(dá)通過將大腸桿菌于含有2％(w/v)葡萄糖和100μg/ml氨芐青霉素的2×YT培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)600nm的吸光度達(dá)到0.7時(shí)，添加0.1M異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(最終濃度0.1mM)，誘導(dǎo)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)來進(jìn)行。于20℃培養(yǎng)18小時(shí)后，通過離心收集菌體，懸浮于10mM Tris-HCl(pH 7.5)，0.5M NaCl，1mM DTT，1mM PMSF中。將懸浮液進(jìn)行10分鐘超聲波處理后，加10％(w/v)Triton X-100(最終濃度1％)，于4℃下攪拌30分鐘。于15,000×g下離心30分鐘，將得到的上清液中的重組蛋白質(zhì)通過使用乳糖-瓊脂糖的親和層析進(jìn)行純化。
結(jié)果純度高的標(biāo)準(zhǔn)品以比較高的收率獲得。得到的重組蛋白質(zhì)的電泳結(jié)果如圖2所示。SDS-PAGE條件如下Gel，Acrylamide-BIS(12％gel)，電泳用緩沖液，25mM Tris-192mM甘氨酸-0.1％SDS，泳動(dòng)條件，180V，45min.，染色，CBB，60℃/30min.電泳樣品吸附于Strata CleanTMResin(Stratagene)，用1×樣品緩沖液(62.5mMTris-HCl，Ph6.8，2％(w/v)SDS，5％(W/V)2-ME，Glycerol)調(diào)整到0.2mg/ml，98℃/3min.熱處理后以每條帶約2μg的蛋白質(zhì)量進(jìn)行電泳。
純化的G9NC(null)于4℃下可以穩(wěn)定保存90天以上。而野生型的半乳凝素9(M-type、G9(M))在同一保存條件下在2周以內(nèi)大部分被分解(參照圖3)。該分解被認(rèn)為是由于純化半乳凝素標(biāo)準(zhǔn)品中含有來自大腸桿菌的蛋白水解酶引起的。
實(shí)施例2比較野生型的半乳凝素9(S-type、G9(S)帶有最短連接肽的同種型)和G9NC(null)對存在于人組織中的蛋白水解酶的敏感性。向溶解于PBS的半乳凝素中加1/100(重量比)的基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3)或彈性蛋白酶，于37℃下保溫。任一場合下G9(S)大部分都在1～2小時(shí)被分解，而相反G9NC(null)在2小時(shí)后還完全沒有被分解(參照圖4和5)。
實(shí)施例3為了研究寄予半乳凝素9生物活性的變異導(dǎo)入的效果，研究了對MOLT-4細(xì)胞(來自人Tcell leukemia的細(xì)胞株)的凋亡誘導(dǎo)活性和對外周血嗜酸性細(xì)胞的趨化活性(eosinophil chemoattractantactivity、ECA activity)。
(a)細(xì)胞培養(yǎng)物MOLT-4(T細(xì)胞)由ATCC獲得。所有細(xì)胞系都在添加了10％FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基(Sigma、圣路易斯、美國)中維持在5％CO2的條件、37℃下。為了抑制Gal-9的活性，在培養(yǎng)用培養(yǎng)基中添加30mM的乳糖。作為對照使用同濃度的蔗糖。
(b)凋亡分析(1)利用PI進(jìn)行細(xì)胞周期(apoptosis)解析(PI法)將被凋亡誘導(dǎo)處理的細(xì)胞于4℃、1000rpm下進(jìn)行5分鐘離心處理后，將細(xì)胞團(tuán)再懸浮于PBS(300μl)，一邊渦旋、一邊向細(xì)胞懸浮液慢慢添加100％冷乙醇(700μl)，使終濃度變?yōu)?0％乙醇。于4℃下進(jìn)行30分鐘溫育處理，對細(xì)胞進(jìn)行固定，然后加PBS(1ml)，于4℃、1000rpm下進(jìn)行5分鐘離心處理后，將細(xì)胞團(tuán)再懸浮于PBS(440μl)。將細(xì)胞與2.5mg/ml的核酸酶A(10μl，終濃度50μg/ml，Sigma，圣路易斯、密蘇里州、美國)一起于37℃下進(jìn)行30分鐘溫育處理，然后與2.5mg/ml的碘化丙錠(4μl；PI，終濃度20μg/ml，Sigma)一起于4℃、暗中進(jìn)行10分鐘溫育處理。通過尼龍篩除去變成集塊的細(xì)胞后，于PBS中對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，通過流式細(xì)胞儀(Sandstrom，aK.etal.，J Immunol Methods，24055(2000)以及Zhang L.et al.，CancerLett，142129(1999))對染色細(xì)胞進(jìn)行解析。
(2)TUNEL(TdT-mediated標(biāo)記dUTP nick end labeling)法對于通過DNA的片段化產(chǎn)生的末端，用在DNA末端附加核苷酸的酶(TdT末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶)整合標(biāo)記的核苷酸(dUTP-biotin或FITC-dUTP等)后，對作為凋亡的顯著特征的細(xì)胞核DNA的片段進(jìn)行檢測。在實(shí)驗(yàn)中，使用MEBSTAIN Apoptosis Kit Direct(MBL、名古屋、日本)。根據(jù)試劑盒銷售商的指示，象下述那樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。即，將進(jìn)行了凋亡誘導(dǎo)的細(xì)胞(約2×105個(gè)/樣品)用含有0.2％FSA的PBS洗，然后加4％多聚甲醛(0.1MnaH2PL4，pH7.4中)，于4℃下進(jìn)行30分鐘固定化后，用含有0.2％FSA的PBS洗。向細(xì)胞團(tuán)加70％冷乙醇后于-20℃下進(jìn)行30分鐘溫育處理，使透過性亢進(jìn)。用含有0.2％FSA的PBS洗后，向細(xì)胞團(tuán)加TdT反應(yīng)液(TdT、FITC-dUTP以及TdT緩沖液的混合物)，攪拌后，于37℃下進(jìn)行1小時(shí)溫育處理，用含有0.2％FSA的PBS洗后，再懸浮于含有0.2％FSA的PBS中，對染色細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行解析。
(c)T細(xì)胞解析用按照各個(gè)孔每孔3μg/ml的抗CD3抗體(Immunotech，Marseille、法國)的TBS液(pH8.0)對24孔板于4℃下溫育過夜處理后，除去抗CD3抗體，用PBS洗滌孔，得到用抗CD3抗體包被的孔板。
使用HISTOPAQUE(登錄商標(biāo)、SIGMA)從加肝素的血液中分離單核白細(xì)胞細(xì)胞。然后，使用C4陽性分離試劑盒(Cd4-positiveisolation kit；DYNAL，Oslo，挪威)以及Dynabeads(登錄商標(biāo))M-450 CD8(DYNAL，Oslo，挪威)，按照試劑盒制造銷售商所述那樣分別分離CD4陽性T細(xì)胞以及CD8陽性T細(xì)胞。為了對T細(xì)胞進(jìn)行活化，將CD4陽性T細(xì)胞或CD8陽性T細(xì)胞于含有10％FCS的RPMI-1640中調(diào)整為1×106個(gè)/ml的細(xì)胞，在37℃下在用抗CD3抗體包被的板上于5％CO2培養(yǎng)箱中溫育處理20～24小時(shí)，然后與重組體半乳凝素9(野生型G9(S)或突變體G9NC(null))一起于37℃下在5％CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行溫育處理。然后，象上述(b)那樣，進(jìn)行凋亡·分析。即，將細(xì)胞于37℃下與50μg/ml的PI(Sigma)一起在暗處進(jìn)行溫育處理。將染色細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀(Sandstrom，K.et al.，J ImmunolMethods，24055(2000)以及Zhang L.et al.，Cancer Lett，142129(1999))進(jìn)行解析。
對于非活化(靜息)T細(xì)胞與與重組體半乳凝素9(野生型G9(S)或突變體G9NC(null))一起于37℃下在5％CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行溫育處理后，與上述同樣進(jìn)行凋亡·分析。
(d)結(jié)果將伴隨凋亡出現(xiàn)的DNA片段化通過瓊脂糖凝膠電泳和FACS進(jìn)行研究，結(jié)果表明無論使用那一種方法，G9NC(null)都保持與G9(S)同等或在其以上的凋亡誘導(dǎo)活性(圖6，表1)。通過Chamber法研究ECA活性，結(jié)果表明G9NC(null)與G9(S)比較，表現(xiàn)出更高的活性(圖7)。
表1

表1表示在野生型半乳凝素9(G9(S))和半乳凝素9突變體(G9NC(null))之間，對生物活性進(jìn)行比較的結(jié)果，是對MOLT-4細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)活性(FACS分析)進(jìn)行研究的結(jié)果。
實(shí)施例4
〔1.半乳凝素-9在風(fēng)濕病(RA)關(guān)節(jié)滑膜中的表達(dá)〕〔方法〕患者組織使用滿足美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)分類基準(zhǔn)的RA患者滑膜組織標(biāo)本。患者的組織標(biāo)本的免疫組織染色用以下的方法進(jìn)行。標(biāo)本切片的制備象下面那樣進(jìn)行。(1)脫石蠟二甲苯3次(各10分鐘)，100％乙醇·90％乙醇·75％乙醇(各2分鐘)。(2)微波(MW)處理用時(shí)制備10mM檸檬酸緩沖液(pH6.0)。預(yù)先進(jìn)行MW照射，將切片浸入沸騰的緩沖液中，進(jìn)行MW照射(500w電子范圍的場合，5分鐘×3次，計(jì)15分鐘)。于室溫放置20分鐘，慢慢冷卻。(3)內(nèi)源性過氧化物酶的鈍化用時(shí)制備0.3％過氧化氫·甲醇，浸30分鐘。PBS清洗5分鐘×3次。用巴斯德移液管加4滴5％BSA進(jìn)行封閉。濕潤箱1小時(shí)室溫。
由標(biāo)本切片的上方用巴斯德移液管加6滴一次抗體或控制抗體。濕潤箱過夜4℃。翌日，PBS清洗，5分鐘×3次。加6滴過氧化物酶標(biāo)識(shí)二次抗體(DACO Envision+)。濕潤箱，1小時(shí)，室溫。PBS洗凈5分鐘×3次。
用DAB(3，3′-diaminobenzidine-tetrahydrochloride)試劑進(jìn)行發(fā)色用時(shí)制備DAB試劑。浸入切片，發(fā)色3分鐘。立刻用水管水停止發(fā)色反應(yīng)。核染色，邁耶蘇木精，20秒。立刻流水洗凈，15分鐘。脫水，透徹，封入。75％乙醇·90％乙醇·100％乙醇(各2分鐘)，二甲苯3次(各3分鐘)。
〔結(jié)果〕結(jié)果如圖53所示。確認(rèn)半乳凝素-9有選擇地在滑膜細(xì)胞和淋巴濾胞周圍的細(xì)胞群和濾胞內(nèi)的樹枝狀血管的內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)。就OA(變形關(guān)節(jié)癥)來說，幾乎沒有看到半乳凝素-9陽性細(xì)胞(參照圖53)。半乳凝素9是可被RA滑膜組織增殖的原形的滑膜細(xì)胞和淋巴系細(xì)胞以及新生血管強(qiáng)烈誘導(dǎo)的分子。另外，在滑膜細(xì)胞和血管周圍細(xì)胞中檢測出半乳凝素-1，在整個(gè)RA滑膜構(gòu)成細(xì)胞檢測出半乳凝素-3。
〔2.半乳凝素-9誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞凋亡的活性〕〔方法〕對于半乳凝素-9對成為關(guān)節(jié)破壞原因的滑膜細(xì)胞的作用進(jìn)行研究?；ぴ跓o菌下采取風(fēng)濕病患者的滑膜組織，對細(xì)胞進(jìn)行分離、培養(yǎng)。1～2次傳代后用于實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)的組織是67歲女性、右膝RA。播種滑膜細(xì)胞后、培養(yǎng)過夜(overnight)。確認(rèn)粘附后，按照最終濃度0，0.03，0.1，0.3，1.0μM添加rhGal-9(hG9NC(null)，rhGal-9S，rhGal-9M)。72小時(shí)培養(yǎng)后于光學(xué)顯微鏡下觀察，再回收細(xì)胞，通過PI法測定凋亡(apoptosis)誘導(dǎo)活性。凋亡誘導(dǎo)活性的測定與實(shí)施例3同樣實(shí)施。
〔結(jié)果〕光學(xué)顯微鏡觀察的結(jié)果如圖54所示。通過PI法進(jìn)行的凋亡誘導(dǎo)活性的測定結(jié)果如圖55所示。
半乳凝素-9突變體(Gal-9(NC-Null))比天然型半乳凝素-9(Gal-9(M)，Gal-9(S))的凋亡誘導(dǎo)活性更強(qiáng)。在所有的重組體中確認(rèn)凋亡誘導(dǎo)活性依賴于濃度。該凋亡誘導(dǎo)活性可被乳糖(30mM)抑制，但不受蔗糖(30mM)的影響。
〔3.半乳凝素對滑膜細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)活性和增殖的抑制活性的比較〕〔方法〕對于人半乳凝素(Gal-1，Gal-3，Gal-8(M)，Gal-9NC(null))對滑膜細(xì)胞的作用進(jìn)行了研究。
對于半乳凝素-9對成為關(guān)節(jié)破壞原因的滑膜細(xì)胞的作用進(jìn)行了研究。
滑膜在無菌下采取風(fēng)濕病患者的滑膜組織，對細(xì)胞進(jìn)行分離、培養(yǎng)。1～2次傳代后用于實(shí)驗(yàn)。確認(rèn)過夜播種的滑膜細(xì)胞粘附后，按照最終濃度0，0.03，0.1，0.3，1.0μM添加rhGal-9(hG9NC(null)，rhGal-9S，rhGal-9M)。24小時(shí)培養(yǎng)后回收細(xì)胞，通過PI法測定凋亡誘導(dǎo)活性。抑制滑膜細(xì)胞增殖的效果按照人半乳凝素最終濃度為0，0.03，0.1，0.3，1.0μM那樣添加到96孔板的各個(gè)孔中，培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)后用PBS清洗板內(nèi)，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-F(同仁化學(xué)、cat.no.343-07743)，用熒光板式讀取儀測發(fā)出強(qiáng)熒光(λex＝490nm、λem＝515nm)的活細(xì)胞數(shù)。
〔結(jié)果〕凋亡誘導(dǎo)活性測定的結(jié)果如圖56所示，抑制滑膜細(xì)胞增殖的活性的測定結(jié)果如圖57(圖中、hGalectin 1表示重組人半乳凝素1，hGalectin 3表示重組人半乳凝素3，hGalectin 8(M)表示重組人半乳凝素8M，hGalectin 9表示hGal-9NC null)所示。抑制滑膜細(xì)胞的增殖在風(fēng)濕病治療中非常重要。
半乳凝素-9突變體(hGal-9NC null)由于誘導(dǎo)增殖的滑膜細(xì)胞的凋亡，抑制滑膜細(xì)胞的增殖，所以作為抗風(fēng)濕病藥是有用的。其它的半乳凝素沒有看到這樣的作用。
研究了半乳凝素9突變體h-G9NC(null)在各種炎癥疾患、即急性·慢性、變態(tài)性、免疫系疾患的小鼠模型中的效果。
該結(jié)果表明半乳凝素9突變體對各種炎癥具有抑制或增強(qiáng)作用以及對各種細(xì)胞因子產(chǎn)生具有調(diào)控作用，所以可以控制炎癥反應(yīng)。對該實(shí)施例進(jìn)行了記載。
在以下的實(shí)施例〔實(shí)施例5～12中，G9NC(null)〔gal9NC(null)、h-gal9NC(null)、hG9NC(null)或h-G9NC(null)人·null·半乳凝素9(human null galectin-9)〕是Galpharma(株)(香川縣、日本)研究所制造的產(chǎn)品。地塞米松(dexamethasone；dexamethasone21-phosphate disodium salt，Sigma-Aldrich公司，MO，美國)可從供貨商購入。
實(shí)施例5〔酵母多糖誘導(dǎo)胸膜炎模型〕首先將小鼠用二乙基二乙醚(和光純藥)麻醉，將G9NC(null)〔或h-gal9NC(null)〕100μg、酵母多糖(SigmaAldrich公司)100μg、地塞米松(SigmaAldrich公司)30mg/kg單獨(dú)或混合后注射到小鼠的胸腔內(nèi)。對照使用PBS。4小時(shí)后，向小鼠腹腔內(nèi)注射0.2至0.3ml用PBS稀釋10倍的戊巴比妥注射液(商品名戊巴比妥、大日本制藥株式會(huì)社)，麻醉后，開腹由腹部大動(dòng)脈采血，作為血液樣品。然后，脫血后使其安樂死，用PBS(1ml)將胸腔內(nèi)清洗2次，回收作為胸腔洗凈液樣品。
血液樣品于常溫靜置后，經(jīng)5000rpm離心10min，回收上清作為血清樣品，冷凍干燥保存。胸腔洗凈液樣品于特克液中對總細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)后，將一部分加到cytospin，進(jìn)行風(fēng)干，用Diff-Quik(國際試劑株式會(huì)社)或May-Gruewald氏染色液(武藤化學(xué)株式會(huì)社)和吉姆薩液(Merck，日本)進(jìn)行染色、鏡檢、對總細(xì)胞數(shù)200個(gè)中的中性白細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、其它的肥大細(xì)胞等進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果如圖9和圖10所示。
實(shí)施例6〔PMA誘導(dǎo)皮炎模型〕豆蔻酸佛波乙酯(phorbol 12-myristate 13-acetate；PMA，SigmaAldrich公司，MO，美國)從供貨商購入。為了投給動(dòng)物，在全部的實(shí)驗(yàn)中作為載體(vehicle)使用PBS(-)，將化合物懸浮于該溶液后進(jìn)行(以下的實(shí)施例中也同樣)。
Balb/c小鼠(7周齡)由SLC(靜岡，日本)購入。為了做到使動(dòng)物能夠自由地?cái)z取適當(dāng)餌料和水，保持在12小時(shí)晝夜節(jié)奏的標(biāo)準(zhǔn)條件下。所有的動(dòng)物按照國際的指導(dǎo)原則和國內(nèi)法通過人工進(jìn)行管理(以下的實(shí)施例中也同樣)。
象下面那樣誘導(dǎo)小鼠耳浮腫。
1將5mg的豆蔻酸佛波乙酯(PMA)溶解于30ml的丙酮中，用于各小鼠(BALB/c，♀，7～8周齡，SPF，SLC社)的右耳的內(nèi)側(cè)和外側(cè)的表面。作為對照將丙酮用于左耳上。在PMA使用的30分鐘前i.p.(0.345ml/head)注入G9NC(null)、地塞米松、或載體。在PMA注射后0，2，4，8和24小時(shí)，使用校正厚度計(jì)(Mitsutoyo，東京，日本)在乙醚麻醉下測定耳的厚度。
耳浮腫用(R-L)-(R0-L0)表示。其中R0和L0分別表示實(shí)驗(yàn)開始時(shí)(0h)的右耳厚度和左耳厚度，R和L分別表示各個(gè)時(shí)點(diǎn)的厚度值。
數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理如下進(jìn)行。沒有特別指出時(shí)，數(shù)據(jù)用平均值±SEM表示。數(shù)據(jù)組的統(tǒng)計(jì)上的差異使用one-way ANOVA進(jìn)行解析，而組之間的差異使用市售的統(tǒng)計(jì)軟件(GraphPad Software，Inc.，San Diego，USA)通過Bonferroni post-test評(píng)價(jià)。P值＜0.05統(tǒng)計(jì)學(xué)上認(rèn)為有意義。詳細(xì)如圖所示(在以下的實(shí)施例中也同樣)。結(jié)果如圖11所示。
實(shí)施例7〔花生四烯酸誘導(dǎo)皮炎模型〕花生四烯酸(AA，SigmaAldrich公司，MO，美國)從供貨商購入。其它同實(shí)施例6。
象下面那樣誘導(dǎo)小鼠耳浮腫。
將750mg的花生四烯酸(AA)溶解于30ml的丙酮中，用于各小鼠(BALB/c，♀，7～8周齡，SPF，SLC社)的右耳的內(nèi)側(cè)和外側(cè)的表面。作為對照將丙酮用于左耳上。在AA使用的30分鐘前進(jìn)行i.p.(0.345ml/head)注射G9NC(null)、地塞米松、或載體。在AA注射后第0，1，3和第6小時(shí)，使用校正厚度計(jì)(calibrated thickness gauge；Mitsutoyo、東京、日本)在乙醚麻醉下測定耳的厚度。用(R-L)-(R0-L0)表示耳浮腫。其中R0和L0分別表示實(shí)驗(yàn)開始時(shí)(0h)的右耳厚度和左耳厚度，R和L分別表示各個(gè)時(shí)點(diǎn)的厚度值。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理與實(shí)施例6同樣進(jìn)行。結(jié)果如圖12所示。
實(shí)施例8〔辣椒辣素誘導(dǎo)皮炎模型〕cyproheptadine(Sigma Aldrich公司，MO，美國)和辣椒辣素(capsaicin，Nakarai社，東京，日本)從各供貨商購入。其它同實(shí)施例6象下面那樣誘導(dǎo)小鼠耳浮腫。
將500mg的辣椒辣素溶解于30ml的丙酮/橄欖油(容量比＝4/1)中，用于各小鼠(BALB/c，♀，7～8周齡，SPF，SLC社)的右耳的內(nèi)側(cè)和外側(cè)的表面。作為對照將丙酮/橄欖油(容量比＝4/1)用于左耳上。在辣椒辣素使用的30分鐘前i.p.(0.345ml/head)注射G9NC(null)、地塞米松、cyproheptadine或載體。在辣椒辣素注射后第0，0.5，1和2小時(shí)，使用校正厚度計(jì)(calibrated thickness gauge；Mitsutoyo、東京、日本)在乙醚麻醉下測定耳的厚度。用(R-L)-(R0-L0)表示耳浮腫。其中R0和L0分別表示實(shí)驗(yàn)開始時(shí)(0h)的右耳厚度和左耳厚度，R和L表示各個(gè)時(shí)點(diǎn)的厚度值。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理與實(shí)施例6同樣進(jìn)行。結(jié)果如圖13所示實(shí)施例9〔DNFB誘導(dǎo)接觸皮炎模型〕2，4-二硝基-1-氟苯(dinitro-fluoro-benzene(DNFB)，SigmaAldrich公司，MO，美國)從供貨商購入。其它同實(shí)施例6。
象下面那樣誘導(dǎo)小鼠耳浮腫。在7日前(day-7)或6日前(day-6)將含有0.5％的2，4-二硝基-1-氟苯(DNFB)丙酮/橄欖油(容量比＝4/1)液(30ml)適用于各小鼠的剃去毛的腹部，致敏后作為延遲型過敏癥(DTH)誘發(fā)的浮腫模型。在實(shí)驗(yàn)開始日(day 0)將含有0.3％DNFB的丙酮/橄欖油(容量比＝4/1)液(30ml)局部適用于各小鼠的右耳的內(nèi)側(cè)以及外側(cè)的表面，進(jìn)行誘發(fā)。作為對照將丙酮/橄欖油適用于左耳。從DNFB誘發(fā)的7日前(day-7)至實(shí)驗(yàn)開始日(day 0)，以及DNFB誘發(fā)24小時(shí)后或48小時(shí)后i.p.(0.345ml/head)注射G9NC(null)、地塞米松、或載體。DNFB誘發(fā)后、0，24，48及第72小時(shí)使用校正厚度計(jì)(calibrated thickness gauge；Mitsutoyo、東京、日本)在乙醚麻醉下測定耳的厚度。用(R-L)-(R0-L0)表示耳浮腫。其中R0和L0分別表示實(shí)驗(yàn)開始時(shí)(0h)的右耳厚度和左耳厚度，R和L表示各個(gè)時(shí)點(diǎn)的厚度值。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理與實(shí)施例6同樣進(jìn)行。結(jié)果如圖14和15所示。
實(shí)施例10〔FITC誘導(dǎo)特應(yīng)性皮炎模型〕異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate(FITC)，SigmaAldrich公司，MO，美國)從供貨商購入。其它同實(shí)施例6。
象下面那樣誘導(dǎo)小鼠耳浮腫。在7日前(day-7)或6日前(day-6)將含有0.5％的異硫氰酸熒光素(FITC)的丙酮/鄰苯二甲酸二丁酯(容量比＝1/1)溶液(400ml)適用于各小鼠的剃去毛的腹部，致敏后作為FITC誘發(fā)的浮腫模型。在實(shí)驗(yàn)開始日(day 0)將丙酮/鄰苯二甲酸二丁酯(容量比＝1/1)溶液(30ml)局所適用于各小鼠的右耳的內(nèi)側(cè)以及外側(cè)的表面，進(jìn)行誘發(fā)。作為對照將丙酮/鄰苯二甲酸二丁酯適用于左耳。
從FITC誘發(fā)的30分鐘前，以及FITC誘發(fā)24小時(shí)后或48小時(shí)后i.p.(0.345ml/head)注射G9NC(null)、地塞米松、或載體。FITC誘發(fā)后、0，24，48及第72小時(shí)使用校正厚度計(jì)(calibratedthickness gauge；Mitsutoyo、東京、日本)在乙醚麻醉下測定耳的厚度。用(R-L)-(R0-L0)表示耳浮腫。其中R0和L0分別表示實(shí)驗(yàn)開始時(shí)(0h)的右耳厚度和左耳厚度，R和L表示各個(gè)時(shí)點(diǎn)的厚度值。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理與實(shí)施例6同樣進(jìn)行。結(jié)果如圖16所示。
實(shí)施例11〔蕁麻疹模型〕抗DNP IgE(anti-DNP IgE(SPE7)，SigmaAldrich公司，MO，美國)和2，4-二硝基-1-氟苯(dinitro-fluoro-benzene(DNFB)，SigmaAldrich公司，MO，美國)從各供貨商購入。其它同實(shí)施例6。
象下面那樣誘導(dǎo)小鼠耳浮腫。在1日前(day-7)將含有抗DNP IgE(5mg/小鼠)的PBS(-)液進(jìn)行i.v.注射，致敏，做成2相性皮膚反應(yīng)模型。在實(shí)驗(yàn)開始日(day 0)將含有0.15％DNFB的丙酮/橄欖油(容量比＝4/1)液(30ml)適用于各小鼠的右耳的內(nèi)側(cè)以及外側(cè)的表面，進(jìn)行誘發(fā)。作為對照將丙酮/橄欖油適用于左耳。
從DNFB誘發(fā)的30分鐘前，i.p.(0.345ml/head)注射G9NC(null)、地塞米松、或載體。DNFB誘發(fā)后、在第0，1，2，4，8和第24小時(shí)使用校正厚度計(jì)(calibrated thickness gauge；Mitsutoyo、東京、日本)在乙醚麻醉下測定耳的厚度。耳浮腫用(R-L)-(R0-L0)表示。其中R0和L0分別表示實(shí)驗(yàn)開始時(shí)(0h)的右耳厚度和左耳厚度，R和L表示各個(gè)時(shí)點(diǎn)的厚度值。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理與實(shí)施例6同樣進(jìn)行。結(jié)果如圖17和18所示。
實(shí)施例12〔關(guān)節(jié)炎模型〕使用DBA/1J雌性小鼠(7周齡)，將關(guān)節(jié)炎激發(fā)用單克隆抗體混合物(Chondrex社、No.62100)按照2mg/0.5mL/只注入動(dòng)物的尾靜脈。注入3日后向動(dòng)物的腹腔內(nèi)注射預(yù)先混合了5μg/0.2mL的LPS(SIGMA，L6511)和各濃度的h-Gal9NC(null)的樣品100μL。注射樣品后，1日1次左右測定前后肢的關(guān)節(jié)腫脹，進(jìn)行打分。結(jié)果を圖19所示。
研究h-G9NC(null)在作為急性炎癥模型的代表性的酵母多糖誘導(dǎo)胸膜炎模型(實(shí)施例5)和LPS誘導(dǎo)腹膜炎模型中的效果。在酵母多糖誘導(dǎo)胸膜炎模型中，通過腹腔內(nèi)注射h-G9NC(null)100μg，看到了胸膜炎被抑制的效果。而如果單獨(dú)h-G9NC(null)特別是對小鼠沒有影響。另外h-G9NC(null)對角叉菜膠、fMLP誘導(dǎo)胸膜炎模型也有影響。
另外在LPS誘導(dǎo)腹膜炎模型中，由于h-G9NC(null)的作用，在炎癥時(shí)誘導(dǎo)的血清中細(xì)胞因子(IFN-γ和IL-4、IL-12、IL-10等)產(chǎn)生中確認(rèn)有變化。例如、同時(shí)將LPS和h-G9N注入小鼠腹腔后，6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)后從小鼠眼窩采血，測定該血清中的IFN-γ值時(shí)，確認(rèn)在LPS單獨(dú)給予組在炎癥時(shí)被誘導(dǎo)的IFN-γ暫時(shí)性的上升，在同時(shí)給予h-G9NC(null)組，IFN-γ的上升(誘導(dǎo))被抑制依賴于h-G9NC(null)的給藥量。由此表明h-G9NC(null)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子產(chǎn)生，因此可以進(jìn)行炎癥的調(diào)節(jié)。
另外在類固醇敏感性(PMA誘導(dǎo))和類固醇非敏感性(花生四烯酸誘導(dǎo))炎癥模型(實(shí)施例6和7)和辣椒辣素誘導(dǎo)炎癥模型(實(shí)施例8)中也看到了h-G9NC(null)的抑制效果。
作為變態(tài)性炎癥，研究了h-G9NC(null)在DNFB誘導(dǎo)接觸皮炎模型、FITC誘導(dǎo)特應(yīng)性皮炎模型、抗DNP單克隆IgE抗體致敏蕁麻疹模型中的效果。例如在實(shí)施例9的DNFB誘導(dǎo)接觸皮炎模型中，腹腔內(nèi)注射h-G9NC(null)，通過以耳殼浮腫作為指標(biāo)的皮膚反應(yīng)研究效果。結(jié)果看到使用h-G9NC(null)的1、10、100μg量的抑制效果，另外沒有看到由于給予地塞米松產(chǎn)生的顯著的體重減少。在實(shí)施例10的FITC誘導(dǎo)特應(yīng)性皮炎模型中，通過腹腔內(nèi)注射h-G9NC(null)，在激發(fā)相中看到了h-G9NC(null)的效果。另外當(dāng)向?qū)嵤├?1的抗DNP單克隆IgE抗體致敏蕁麻疹模型小鼠分別腹腔內(nèi)注射h-G9NC(null)的1、10、100μg時(shí)，由抗原涂布(DNFB)導(dǎo)致的二層性皮膚反應(yīng)被抑制。
作為自身免疫疾患模型之一，記錄了抗體混合物h-G9NC(null)對誘發(fā)關(guān)節(jié)炎的實(shí)施例。h-G9NC(null)對佐劑性關(guān)節(jié)炎、膠原關(guān)節(jié)模型等也有影響。例如、在實(shí)施例12中的h-G9NC(null)1μg中也看到了抑制。
實(shí)施例13半乳凝素9突變體在腫瘤細(xì)胞中的凋亡(細(xì)胞損傷活性)誘導(dǎo))〔實(shí)驗(yàn)方法〕將懸浮于RPMI(SIGMA)10％FBS(JRH)的各細(xì)胞以3×103個(gè)/90μL加入到96孔板(FALCON)，培養(yǎng)24小時(shí)(37℃、5％CO2)后、添加(10μl)最終濃度為0.03～1μM的半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))，培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)后、向孔添加10μL WST-1試劑(Roche，1 644 807)，于37℃、5％CO2條件下反應(yīng)2～4小時(shí)后，使用板式測讀儀測定450～600的吸光度，各腫瘤細(xì)胞中的凋亡(細(xì)胞損傷活性)誘導(dǎo)評(píng)價(jià)通過Viability(％)＝[(檢體的吸光度-Blank/(陰性對照的吸光度-Blank))×100進(jìn)行。
表2給出了使用的腫瘤細(xì)胞。
表2表半乳凝素9突變體在腫瘤細(xì)胞中的凋亡(細(xì)胞損傷性)誘導(dǎo)數(shù)據(jù)

表2中，「Cell name」表示細(xì)胞名，「Animal」表示該腫瘤細(xì)胞來自的動(dòng)物種類，「1μM killing 」表示添加1μM半乳凝素9突變體時(shí)的killing(％)，「Tissue」表示該細(xì)胞來自的組織·器官部位。
〔結(jié)果〕半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))在培養(yǎng)細(xì)胞中引起的凋亡(細(xì)胞損傷活性)誘導(dǎo)測定的結(jié)果如表2所示。由該結(jié)果可判斷半乳凝素9突變體對1)血球系腫瘤是有效果的2)惡性黑色種和纖維肉腫等非上皮性惡性腫瘤也有效3)胃癌、胰臟癌、肺癌等上皮性惡性腫瘤也有效。
實(shí)施例14〔半乳凝素9突變體在皮下移植模型中的抗腫瘤活性(抗癌效果)〕〔實(shí)驗(yàn)方法〕作為靶腫瘤細(xì)胞使用LLC細(xì)胞。將培養(yǎng)的細(xì)胞(1×106個(gè)/100μL)與半乳凝素9突變體(h-G9NC(null)，100μg/100μL)或生理鹽水100μL于37℃反應(yīng)1小時(shí)后，皮下注射到C57BL6小鼠的背中。測定腫瘤徑(長軸、短軸)。
然后切下移植5周后的給藥皮膚部位(腫瘤)，在緩沖為10％中性的甲醛溶液中對組織病理檢查用樣品進(jìn)行固定后，將石蠟包埋組織做成切片，用HE試劑染色。
〔結(jié)果〕圖20給出了半乳凝素9突變體在皮下移植模型中的抑制腫瘤細(xì)胞增殖效果、即抗腫瘤活性(抗癌效果)測定的結(jié)果。另外在圖21中還給出了通過組織病理解析研究抗腫瘤活性(抗癌效果)的結(jié)果。圖中，Gal9(n)和Gal9表示半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))，而5W表示5周。
如果在半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))存在下對LLC進(jìn)行培養(yǎng)，在相差顯微鏡下觀察到明顯的癌細(xì)胞的形態(tài)變化。此時(shí)，半乳凝素9突變體依賴于用量誘導(dǎo)LLC的活細(xì)胞數(shù)減少(MTT assay)、DNA合成能降低(3H-Thymidine攙入能)、培養(yǎng)上清中的LDH放出量亢進(jìn)。由半乳凝素9突變體產(chǎn)生的這些抗腫瘤效果在人肺癌細(xì)胞株H226(扁平上皮癌)、A549(腺癌)、H69(小細(xì)胞癌)中同樣被確認(rèn)。另外，在半乳凝素9突變體存在下，LLC的Annexin V表達(dá)量有意義增加。
另一方面，如果將LLC在半乳凝素9突變體共存下接種于同系統(tǒng)小鼠C57BL6的皮下，不生長腫瘤，在接種后5周時(shí)，看到與對照組有明顯差別。小鼠存活率在半乳凝素9突變體存在下有意義改善了。判明半乳凝素9突變體誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤效果。
在通過將人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H69細(xì)胞靜脈注入裸鼠導(dǎo)致的肺癌多臟器轉(zhuǎn)移模型中，通過半乳凝素9突變體的腹腔注射也確認(rèn)抑制轉(zhuǎn)移效果。
實(shí)施例15〔半乳凝素9突變體對于培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的凋亡(細(xì)胞損傷活性)誘導(dǎo)〕〔實(shí)驗(yàn)方法〕(1)Meth A細(xì)胞的凋亡將懸浮于RPMI(SIGMA)10％FBS(JRH)的Meth A以4×104個(gè)/90μl加入到96孔板(FALCON)，同時(shí)添加1～30μg/ml(10μl)半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))，培養(yǎng)24小時(shí)(37℃、5％CO2)。24小時(shí)后，將細(xì)胞用PBS(-)200μl清洗一次，懸浮于Annexin vBinding Buffer(BD PharMingen)，添加Annexin V-PE(BD PharMingen)和7-Amino-actinomycin D，暗中于室溫下反應(yīng)15分鐘，通過FACScalibur(Becton，Dickinson)進(jìn)行解析。
(2)B16/F10細(xì)胞的凋亡將以1×104個(gè)/90μl懸浮于RPMI(SIGMA)10％FBS(JRH)的B16/F10加到96孔板(FALCON)中，培養(yǎng)24小時(shí)(37℃、5％CO2)后，添加(10μl)半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))使最終濃度達(dá)到1～30μg/ml，培養(yǎng)24小時(shí)。24小時(shí)后，將細(xì)胞用PBS(-)200μl清洗1次，用0.05％Trypsin EDTA(GIBCO)處理后，用培養(yǎng)液清洗一次，再用PBS(-)清洗。然后懸浮于Annexin V Binding Buffer(BDPharMingen)中，添加A nnexin V-PE(BD PharMingen)和7-Amino-actinomycin，暗中于室溫下反應(yīng)15分鐘，用FACS calibur(Becton，Dickinson)進(jìn)行解析。
〔結(jié)果〕結(jié)果如圖22和圖23所示。圖22是使用半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))誘導(dǎo)Meth A細(xì)胞凋亡的解析結(jié)果。圖23是使用半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))誘導(dǎo)B16/F10細(xì)胞凋亡的解析結(jié)果。
實(shí)施例16〔半乳凝素9突變體在癌性腹膜炎模型中的抗腫瘤活性(抗癌效果)〕〔實(shí)驗(yàn)方法〕(1)Meth A細(xì)胞將用PBS(-)調(diào)制的細(xì)胞(5×105個(gè)/100μL)接種在BALB/c小鼠(SLC，6周齡雌性、n＝3)的腹腔。
腹腔內(nèi)接種細(xì)胞后連續(xù)18天注射半乳凝素9突變體(h-G9NC(null)，100μg/300μL)。在開始注射時(shí)期，分為1)MethA細(xì)胞剛接種后、2)3日后、3)7日后、4)10日后4組(n＝10)，比較存活率。
(2)B16/F10細(xì)胞將細(xì)胞(5×105個(gè)/100μL)接種到C57/BL6小鼠(SLC，6周齡雌性)的腹腔內(nèi)。接種后立刻將各濃度的半乳凝素9突變體(h-G9NC(null)，10、30、100μg/300μL)注入腹腔內(nèi)，連續(xù)注入14天。比較存活率。接種后14日觀察臟器。
〔結(jié)果〕結(jié)果如圖24～27和48所示。圖24為存活曲線，表示在通過MethA細(xì)胞做成的癌性腹膜炎模型中半乳凝素9突變體具有抗腫瘤效果。圖25表示顯示未給予半乳凝素9突變體(Gal9)組(上段)和給予組(下段)中小鼠狀態(tài)的照片。圖26為生存曲線，表示在通過B16/F10細(xì)胞做成的癌性腹膜炎模型中半乳凝素9突變體具有抗腫瘤效果。圖27表示比較給予和未給予半乳凝素9突變體(Gal-9)組中通過B16/F10細(xì)胞做成的癌性腹膜炎模型小鼠的狀態(tài)，給出了內(nèi)臟組織照片。圖48表示在腹腔內(nèi)(i.p.)接種了LLC細(xì)胞(1×106個(gè))的小鼠中，每日i.p.注入半乳凝素9突變體(h-G9NC(null)，100μg/小鼠)或載體(vehicle)的結(jié)果(從Day 0開始連日注入、各組7只小鼠)。在小鼠癌性腹膜炎模型(MethA、B16/F10細(xì)胞、LLC細(xì)胞)中確認(rèn)注射G9NC(null)(i.p.)(癌細(xì)胞接種時(shí)同時(shí)注射和癌細(xì)胞接種后注射)產(chǎn)生延長壽命效果。
Meth A細(xì)胞、LLC細(xì)胞是通過半乳凝素9突變體誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞。而B16/F10細(xì)胞不能被半乳凝素9突變體誘導(dǎo)凋亡。
就B16/F10細(xì)胞來說，已闡明半乳凝素9突變體抑制癌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)合依賴于濃度。而在由B16/F10細(xì)胞做出的癌性腹膜炎模型中，就G9NC(null)注入組與對照組相比，腹腔液中的NK，NKT細(xì)胞增加。B16/F10黑素瘤細(xì)胞雖然是對由穩(wěn)定化半乳凝素9引起的凋亡具有耐性，但可確認(rèn)存活率改善和抑制黑素瘤細(xì)胞向腹壁的粘附。半乳凝素9突變體在癌性腹膜炎模型中的抗腫瘤效果也表明腫瘤細(xì)胞向細(xì)胞外基質(zhì)的抑制粘附即炎癥細(xì)胞的浸潤抑制效果、NK、NKT細(xì)胞等擔(dān)當(dāng)免疫細(xì)胞的參與。
實(shí)施例17〔B16/F10腹腔內(nèi)浸潤細(xì)胞的解析〕〔實(shí)驗(yàn)方法〕在將以5×105個(gè)/200μl懸浮于PBS(-)的B16/F10移植到C57/BL6小鼠(SCL)的腹腔的同時(shí)，按照30μg/300μl向腹腔注入半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))，24小時(shí)后采取腹腔細(xì)胞，懸浮于PBS(-)。在純化抗小鼠CD16/CD32(2.4G2)(BD PharMingen)中于4℃下反應(yīng)5分鐘后，用各個(gè)抗體[PE抗小鼠CD122(TM-β-1)(BDPharMingen)、FITC抗小鼠TCRβ-chain(H57-597)(BDPharMingen)、PE抗小鼠CD11b(M1/70)(BD PharMingen)、APC-標(biāo)識(shí)抗小鼠CD11c(HL3)(BD PharMingen)、APC抗小鼠CD8a(BDPharMingen)、FITC抗小鼠CD4(BD PharMingen)]于4℃下反應(yīng)30分鐘，通過FACS calibur(Becton，Dickinson)進(jìn)行解析。
〔結(jié)果〕結(jié)果如圖28所示。與注入PBS組相比，就注入半乳凝素9突變體組(30μg)來說，在腹腔洗凈液中證實(shí)NK/NKT細(xì)胞等參與免疫的細(xì)胞的動(dòng)員。
實(shí)施例18〔半乳凝素9突變體抑制B16/F10細(xì)胞粘附的活性〕〔實(shí)驗(yàn)方法〕將最終濃度為1～30μg/ml的半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))按照每孔10μl預(yù)先加到用I型膠原、IV型膠原(collagentype I，IV)，板蛋白(laminin)，纖維結(jié)合素(fibronectin)，?；Y(jié)合素(vitronectin)包被的6孔板(CHEMICON)，在該板按照4×104個(gè)/well(90μl)接種用RPMI(SIGMA)0.02％BSA(Wako)懸浮的B16/F10，溫育1小時(shí)(37℃、5％CO2)。1小時(shí)后去除上清，用PBS(-)200μl清洗2次后，加入90μl RPMI 0.02％BSA和10μl WST-1(Roche)，溫育2～3小時(shí)。最后使用板式測讀儀測定450～600的吸光度，按照粘附率(Adherence，％)＝[(檢體的吸光度-Blank/(陰性對照的吸光度-Blank))×100進(jìn)行計(jì)算。
〔結(jié)果〕結(jié)果如圖29所示。B16/F10細(xì)胞與各細(xì)胞外基質(zhì)(I型膠原、IV型膠原、板蛋白、纖維結(jié)合素、?；Y(jié)合素)的結(jié)合受到半乳凝素9突變體(圖中記為穩(wěn)定化半乳凝素)抑制。證實(shí)該抑制作用與半乳凝素9突變體的濃度有關(guān)。
然后研究了半乳凝素9突變體對炎癥的生物活性。研究了半乳凝素9突變體對作為炎癥分類于I型的炎癥支氣管哮喘、分類于II型的炎癥自身免疫性溶血性貧血、分類于III型的炎癥阿蒂斯(Arthus)反應(yīng)(血管炎)的活性。
實(shí)施例19〔壁虱抗原誘發(fā)哮喘模型(Der f-induced AHR model)〕〔實(shí)驗(yàn)方法〕地塞米松(地塞米松21-磷酸二鈉鹽、Sigma，MO，美國)，氯醋甲膽堿(methacholine(MCh)，Sigma，MO，USA)和變態(tài)性誘發(fā)性提取物混合壁虱抗原(Allergenic Extract mixed Insects MITEコナヒヨウヒ壁虱(D.Farinae，Der f))可從此處給出的供貨商獲得。為了投給動(dòng)物，在全部的實(shí)驗(yàn)中作為載體(vehicle)使用PBS(-)，將化合物懸浮于該溶液后進(jìn)行。
Balb/c小鼠(7周齡)由SLC(靜岡，日本)購入。為了做到使動(dòng)物能夠自由地?cái)z取適當(dāng)餌料和水，以每12小時(shí)為晝夜節(jié)奏的標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)飼養(yǎng)。所有的動(dòng)物按照國際的指導(dǎo)原則和國內(nèi)法通過人工進(jìn)行管理。
小鼠中的哮喘性過敏反應(yīng)(Asthmatic Hypersensitive ResponseAHR)的誘導(dǎo)如下進(jìn)行。
為了在小鼠的呼吸道組織誘發(fā)對氯醋甲膽堿和嗜酸性細(xì)胞浸潤的呼吸道過敏性，對雄小鼠致敏后，作為變態(tài)原使用上述壁虱抗原(Der f)進(jìn)行誘發(fā)處理。濃度為Der f(0.5mg/ml)，通過按照每次0.05ml，于第0日、第7日以及第20日投到鼻腔內(nèi)(i.n.)，免疫小鼠，然后使用噴霧器用做成1％氣霧的Der f處理30分鐘，激發(fā)過敏性。對照組的動(dòng)物于第0日、第7日和第20日經(jīng)由鼻腔內(nèi)(i.n.)接受投給的通常PBS(0.05ml)，然后使用噴霧器再用PBS處理30分鐘。
為了研究半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))和地塞米松的作用效果，在用Der f誘發(fā)前和Der f誘發(fā)后，分別向小鼠腹腔內(nèi)(i.p.)注入半乳凝素9突變體(h-G9NC(null)100μg/410μl(in PBS)/只、或地塞米松3mg/200μl(in PBS)/kg(體重)。
作為樣品，從各動(dòng)物采取支氣管肺胞洗凈液(bronchoalveolarlavage fluidBAL fluid)。通過無拘束呼吸功能解析裝置(unrestrained whole body plethysmograph；PULMOS-I；M.I.P.S，大阪，日本)測定具有無拘束的意識(shí)的小鼠的全肺氣流量。為了求比每分鐘的氣流量、換氣量、呼吸的頻率、以及比呼吸道阻力(specificairway resistancesRAW)，使用收容小鼠的箱子和對照用箱子之間的壓差。呼吸道阻力為無量綱的參數(shù)，是呼吸循環(huán)中的小鼠的全肺呼吸量的函數(shù)。通過做成氣霧的PBS(作為基礎(chǔ)測定值)或MCh(6-25mg/ml)再對小鼠處理2分鐘，進(jìn)行測定，求噴霧療法處理后100次的呼吸的平均值。用Turk′s液對懸浮的細(xì)胞數(shù)(cells/ml)進(jìn)行染色，用血球計(jì)(hemocytometer)再進(jìn)行測定，得到cytospin調(diào)制物，使用Giemsa-May-Grunwald溶液賦予形態(tài)特征，測定細(xì)胞的差異。對各載玻片上的200-500個(gè)白細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
〔結(jié)果〕結(jié)果如圖30、31和32所示。圖中各個(gè)值表示7只動(dòng)物的平均±S.E.。統(tǒng)計(jì)上的差異使用one-way ANOVA進(jìn)行解析。而組之間的差異使用Dunnett′s Multiple Comparison Test進(jìn)行評(píng)價(jià)(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)。圖30表明通過給予h-G9NC(null)〔Gal-9〕，呼吸道過敏性的亢進(jìn)改善了。圖31表明通過給予h-G9NC(null)〔Gal-9〕可抑制對BALF中嗜酸性細(xì)胞浸潤。圖32表明通過給予h-G9NC(null)〔Gal-9〕可抑制支氣管周圍的炎癥細(xì)胞浸潤。因此表明使用半乳凝素9，由于可抑制炎癥細(xì)胞對呼吸道的浸潤，所以呼吸道過敏性改善了。
實(shí)施例20〔OVA誘發(fā)哮喘模型(OVA-induced AHR model)〕〔實(shí)驗(yàn)方法〕作為動(dòng)物使用小鼠和豚鼠。卵白白蛋白(Ovalbumin(OVA)，Sigma，MO，美國)、甲吡酮(metopyrone，Sigma，MO，美國)、甲哌卡因(mepyramine，Sigma，MO，美國)可以由此處給出的供貨商買到。其它的化合物可以象實(shí)施例19那樣獲得。為了給予動(dòng)物，在全部實(shí)驗(yàn)中作為載體(vehicle)使用PBS(-)，將化合物懸浮于該溶液中給予動(dòng)物。Balb/c小鼠(7周齡)從SLC(靜岡，日本)購入，而豚鼠(5周齡)由Kudou Co.Ltd(熊本，日本)購入，象實(shí)施例19那樣進(jìn)行飼養(yǎng)。
AHR在小鼠中的誘導(dǎo)如下進(jìn)行。
為了在小鼠的呼吸道組織誘發(fā)對氯醋甲膽堿和嗜酸性細(xì)胞浸潤的呼吸道過敏性，對雄小鼠進(jìn)行致敏后，將上述OVA作為變態(tài)原使用，進(jìn)行誘發(fā)處理。用與硫酸鋁鉀形成復(fù)合體的OVA(0.5mg/ml)，再按照每次0.2ml，于第0日和第14日，通過腹腔內(nèi)(i.p.)注射對小鼠進(jìn)行免疫。于第14日、第18日和第22日用經(jīng)普通食鹽水稀釋的戊巴比妥(5.0mg/ml)的0.2-0.3ml麻醉小鼠。OVA致敏組的所有動(dòng)物于第14日、第18日和第22日經(jīng)由鼻腔內(nèi)(i.n.)給予0.05ml普通食鹽水中的2.0mg/ml的OVA。對照組的動(dòng)物于第0日和第14日，經(jīng)由腹腔內(nèi)(i.p.)注入加入了硫酸鋁鉀的通常PBS，然后于第14日、第18日和第22日經(jīng)由鼻腔內(nèi)(i.n.)注入通常的PBS(0.05ml)。
為了研究半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))以及地塞米松的作用效果，于OVA誘發(fā)前和OVA誘發(fā)后第0，7，14，15，16，17，18，19，20，21，以及第22，將半乳凝素9突變體(h-G9NC(null)100μg/410μl(in PBS)/只、或地塞米松3mg/200μl(in PBS)/kg(體重)分別注入小鼠腹腔內(nèi)(i.p.)。
作為樣品，從各動(dòng)物采取BAL液。通過氣壓式呼吸功能解析裝置(whole body barometric plethysmograph；Buxco Electronics，Inc.，Sharon，CT)測定具有無拘束的意識(shí)的小鼠的全肺氣流量。通過該裝置，以作為增高的間歇(Pause(Penh))已知的呼吸圖形的變化進(jìn)行測定，該參數(shù)與呼吸道阻力相關(guān)，在進(jìn)行監(jiān)測呼吸道阻力中使用。通過做成氣霧的PBS(作為基礎(chǔ)測定值)或MCh(6-25mg/ml)再對小鼠處理2分鐘，進(jìn)行測定，求噴霧療法處理后100次的呼吸的平均值。用Turk′s液對懸浮的細(xì)胞數(shù)(cells/ml)進(jìn)行染色，用血球計(jì)(hemocytometer)再進(jìn)行測定，得到cytospin調(diào)制物，使用Giemsa-May-Grunwald溶液賦予形態(tài)特征，測定細(xì)胞的差異。對各載玻片上的200-500個(gè)白細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
AHR在豚鼠中的誘導(dǎo)如下進(jìn)行。
為了在小鼠的呼吸道組織誘發(fā)對抗原和嗜酸性細(xì)胞浸潤的呼吸道過敏性，對雄小鼠進(jìn)行致敏后，將上述OVA作為變態(tài)原使用，進(jìn)行誘發(fā)處理。使用Omron超音波式噴霧器(Omron NE-U17 nebulizer，立石電氣(株)、東京、日本)，于第0～第7日，對豚鼠用1％OVA的食鹽水液的氣霧進(jìn)行10分鐘致敏。為了避免過敏性休克，所有動(dòng)物在致敏處理30分鐘前和誘發(fā)處理30分鐘前給予甲哌卡因(10mg/kg)。
為了研究半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))的作用效果，于OVA誘發(fā)前和OVA誘發(fā)后將半乳凝素9突變體(h-G9NC(null)1μg/4ml(PBS中)/kg注入豚鼠腹腔內(nèi)(i.p.)。
作為樣品，從各動(dòng)物采取BAL液。
在最初致敏后第3天，將動(dòng)物置于備有可從箱籠脫離的口鼻式面罩的全身式呼吸功能解析箱子(PULMOS-I；M.I.P.S，大阪，日本)，按照Agrawal′s法測定比呼吸道傳導(dǎo)率(SGaw)。氣流量與箱子容量的變化的關(guān)系(這可從箱子壓的變化計(jì)算出)可以以將箱子容量的變化對氣流量按照x-y作圖的斜率(slope)決定。可以將5次的呼吸循環(huán)中的斜率的平均用于計(jì)算Sgaw中。
在用OVA誘發(fā)前向豚鼠腹腔內(nèi)(i.p.)注射10mg/kg的甲吡酮，然后使用Omron超音波式噴霧器(Omron NE-U17 nebulizer，立石電氣(株)、東京、日本)，于2％OVA的食鹽水液的氣霧中以3l/min的流速再處理豚鼠5分鐘。然后于抗原處理1min前以及抗原處理后2，4，5，6，7，8以及第23小時(shí)監(jiān)測SGaw的變化，進(jìn)行測定，求各個(gè)時(shí)點(diǎn)后的100次呼吸的平均值。各SGaw值與免疫刺激前得到的值比較，以SGaw中的變化百分比表示。用Turk′s液對懸浮的細(xì)胞數(shù)(cells/ml)進(jìn)行染色，用血球計(jì)再進(jìn)行測定，得到cytospin調(diào)制物，使用Giemsa-May-Grunwald溶液賦予形態(tài)特征，測定細(xì)胞的差異。對各載玻片上的500個(gè)白細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
〔結(jié)果〕圖33和34給出了小鼠中的結(jié)果、而圖35和36表示小鼠中的結(jié)果。圖中、各個(gè)值表示7只(圖33)、5～7只(圖34)、7或8只(圖35和圖36)動(dòng)物的平均±S.E。統(tǒng)計(jì)上的差異使用one-way ANOVA進(jìn)行解析。而組之間的差異使用Dunnett′s Multiple Comparison Test進(jìn)行評(píng)價(jià)(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)。
圖33表示半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))具有改善呼吸道過敏性的作用。圖34表示半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))抑制BALF中的嗜酸性細(xì)胞的浸潤。
圖35表示半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))對即時(shí)型哮喘(IAR)·延遲型哮喘(IAR)的作用。結(jié)果在給予半乳凝素9突變體組，IAR和LAR無論那一個(gè)與對照組比較，都看到有意義的差。即看到抑制效果。
圖36表示半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))對呼吸道內(nèi)炎癥性細(xì)胞浸潤的作用。結(jié)果在給予半乳凝素9突變體組，與對照組比較，對于總細(xì)胞數(shù)以及嗜酸性細(xì)胞都看到有意義差。在其它細(xì)胞中也看到浸潤抑制傾向。
半乳凝素9突變體通過按照1mg/只的用量在抗原致敏和激發(fā)前進(jìn)行腹腔內(nèi)注入，表明有可能抑制被動(dòng)致敏豚鼠的抗原激發(fā)即時(shí)型·延遲型哮喘反應(yīng)和呼吸道內(nèi)細(xì)胞浸潤。
實(shí)施例21〔自身免疫性溶血性貧血(RαMRC Ab-induced AIHA model)〕〔實(shí)驗(yàn)方法〕環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide(CY)，Sigma，MO，美國)、硫唑嘌呤(azathioprine(AZ)，Sigma，MO，美國)、氨甲蝶呤(methotrexate(MTX)，Sigma，MO，美國)兔的抗小鼠赤血球抗體(RαMRC Ab)可以從此處提供的供貨商買到。其它的化合物象實(shí)施例19那樣獲得。為了給予動(dòng)物，在全部實(shí)驗(yàn)中作為載體(vehicle，V)使用PBS(-)，將化合物懸浮于該溶液后給予動(dòng)物。Balb/c小鼠(7周齡)由SLC(靜岡，日本)購入，象實(shí)施例19那樣飼育。
小鼠中的自身免疫性溶血性貧血(AIHA)的誘導(dǎo)象下面那樣進(jìn)行。
將兔的αMRBC自身抗體注入小鼠靜脈內(nèi)(i.v.)，誘導(dǎo)溶血性貧血。在兔的αMRBC自身抗體注射30分鐘前和該自身抗體注射后1～4日內(nèi)，將半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))、地塞米松、其它藥物、或載體(vehicle)注入腹腔內(nèi)(i.p.，0.345ml/head))。
將血液樣品采取到經(jīng)肝素處理的微量血細(xì)胞比容毛細(xì)管中，用離心機(jī)于12,000rpm離心5分鐘?？措x心后直接包裝的RBCs的百分比決定血細(xì)胞比容。
統(tǒng)計(jì)學(xué)上的解析如下進(jìn)行。
沒有特別指出時(shí)，數(shù)據(jù)用平均值±SEM表示。數(shù)據(jù)組的統(tǒng)計(jì)上的差異使用one-way ANOVA進(jìn)行解析。而組之間的差異使用市售的統(tǒng)計(jì)軟件(GraphPad Software，Inc.，San Diego，USA)通過Dunnett′sMultiple Comparison Test進(jìn)一步評(píng)價(jià)。P值＜0.05被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義。
〔結(jié)果〕結(jié)果如圖37所示。在半乳凝素9突變體組中，確認(rèn)有抑制發(fā)癥傾向。圖中各個(gè)值表示5～6只的動(dòng)物的平均值±SEM(*p＜0.05，**p＜0.01)。
實(shí)施例22〔Arthus反應(yīng)(血管炎)〕〔實(shí)驗(yàn)方法〕研究了半乳凝素9突變體對免疫復(fù)合體誘發(fā)2相皮膚反應(yīng)(Arthus反應(yīng))的作用效果。
抗OVA IgG由供貨商購入。其它的化合物象實(shí)施例20那樣獲得。為了給予動(dòng)物，在全部實(shí)驗(yàn)中作為載體(vehicle，V)使用PBS(-)，將化合物懸浮于該溶液后給予動(dòng)物。Balb/c小鼠(7周齡)由SLC(靜岡，日本)購入，象實(shí)施例19那樣飼育。
小鼠中耳殼浮腫的誘導(dǎo)如下進(jìn)行。
對2相皮膚反應(yīng)模型的小鼠的右耳皮內(nèi)注射(i.d.)抗OVA IgG(50μg/小鼠)，進(jìn)行致敏，然后立刻靜脈內(nèi)注入(i.v.)200μl的1％OVA的PBS。
在OVA注射30分鐘前和OVA注射后5小時(shí)，向腹腔內(nèi)(i.p.，0.345ml/head))注射半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))、地塞米松、或載體(vehicle)。在OVA注射后0，2，4，8和24小時(shí)，使用校正厚度計(jì)(Mitsutoyo，東京，日本)在乙醚麻醉下測定耳的厚度。
用(R-L)-(R0-L0)表示耳殼浮腫。其中R0表示實(shí)驗(yàn)開始時(shí)(0h)的右耳厚度，而L0表示實(shí)驗(yàn)開始時(shí)(0h)的左耳厚度，R表示各個(gè)時(shí)點(diǎn)得到的右耳厚度，而L表示左耳的厚度。
統(tǒng)計(jì)上的解析如下進(jìn)行。
沒有特別指出時(shí)，數(shù)據(jù)用平均值±SEM表示。數(shù)據(jù)組的統(tǒng)計(jì)上的差異使用one-way ANOVA進(jìn)行解析。而組之間的差異使用市售的統(tǒng)計(jì)軟件(GraphPad Software，Inc.，San Diego，USA)通過Dunnett′sMultiple Comparison Test進(jìn)一步評(píng)價(jià)。P值＜0.05被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義。
〔結(jié)果〕結(jié)果如圖38所示。在半乳凝素9突變體組中，確認(rèn)有抑制發(fā)癥傾向。圖中各個(gè)值表示5～6只的動(dòng)物的平均值±SEM(*p＜0.05，**p＜0.01)。
實(shí)施例23〔ARDS模型(LPS-induced ARDS model)〕〔實(shí)驗(yàn)方法〕脂多糖(lipopolysaccharide，LPS，Sigma，MO，USA)由此處提供的供貨商購入。其它的化合物象實(shí)施例19那樣獲得。為了給予動(dòng)物，在全部實(shí)驗(yàn)中作為載體(vehicle，V)使用PBS(-)，將化合物懸浮于該溶液后給予動(dòng)物。Balb/c小鼠(7周齡)由SLC(靜岡，日本)購入，象實(shí)施例19那樣飼育。
小鼠中的ARDS的誘導(dǎo)如下進(jìn)行。
為了激發(fā)小鼠的呼吸道組織呼吸困難癥和嗜中性細(xì)胞的浸潤，作為肺傷害模型使用LPS對雄小鼠進(jìn)行處置。小鼠接受經(jīng)鼻(i.n.)給予的LPS(0.6mg/ml，0.05-ml容量)。對照組經(jīng)同樣的途徑接受給予通常的PBS(0.05ml)。
為了研究半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))和地塞米松的作用效果，在LPS誘發(fā)30分鐘前和LPS誘發(fā)后6小時(shí)，分別向小鼠腹腔內(nèi)(i.p.)注入半乳凝素9突變體(h-G9NC(null)100μg/410μl(inPBS)/只或地塞米松1～10mg/200μl(in PBS)/kg(體重)。
通過氣壓式呼吸功能解析裝置(whole body barometricplethysmography；Buxco Electronics，Inc.，Sharon，CT)和無拘束呼吸功能解析裝置(unrestrained wholebody plethysmograph；PULMOS-I；M.I.P.S，大阪，日本)在LPS誘發(fā)的1小時(shí)前和24小時(shí)后對小鼠的肺功能(pen h值和換氣量)進(jìn)行解析。
對肺功能進(jìn)行解析后，由各動(dòng)物采取BAL液作為樣品。
通過無拘束呼吸功能解析裝置測定具有無拘束的意識(shí)的小鼠的全肺氣流量。為了求比每分鐘的氣流量、換氣量、呼吸的頻率、pen h值、以及比呼吸道阻力(sRAW)，使用收容小鼠的箱子和對照用箱子之間的壓差。呼吸道阻力為無量綱的參數(shù)，是呼吸循環(huán)中的小鼠的全肺呼吸量的函數(shù)。
用Turk′s液對懸浮的細(xì)胞數(shù)(cells/ml)進(jìn)行染色，用血球計(jì)再進(jìn)行測定，得到cytospin調(diào)制物，使用Giemsa-May-Grunwald溶液賦予形態(tài)特征，測定細(xì)胞的差異。對各載玻片上的200-500個(gè)白細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
統(tǒng)計(jì)上的解析如下進(jìn)行。
沒有特別指出時(shí)，數(shù)據(jù)用平均值±SEM表示。數(shù)據(jù)組的統(tǒng)計(jì)上的差異使用one-way ANOVA或two-way ANOVA進(jìn)行解析。而組之間的差異使用市售的統(tǒng)計(jì)軟件(GraphPad Software，Inc.，San Diego，USA)通過Dunnett′s Multiple Comparison Test進(jìn)一步評(píng)價(jià)。P值＜0.05被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義。
〔結(jié)果〕結(jié)果如圖39和圖40所示。圖中各個(gè)值表示5～6只的動(dòng)物的平均值±SEM。數(shù)據(jù)組的統(tǒng)計(jì)上的差異使用one-wayANOVA進(jìn)行解析。而組之間的差異使用Dunnett′s Multiple Comparison Test進(jìn)行評(píng)價(jià)(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)。圖39表示半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))對呼吸道過敏性的作用。證實(shí)有改善。圖40表示半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))抑制BALF中的中性白細(xì)胞的浸潤。
實(shí)施例24〔辣椒辣素誘導(dǎo)炎癥模型〕〔實(shí)驗(yàn)方法〕賽庚啶(cyproheptadine，Sigma，MO，USA)和辣椒辣素(capsaicin，Nakarai，Tokyo，Japan)由此處提供的供貨商購入。其它的化合物象實(shí)施例19那樣獲得。為了給予動(dòng)物，在全部實(shí)驗(yàn)中作為載體(vehicle，V)使用PBS(-)，將化合物懸浮于該溶液后給予動(dòng)物。Balb/c小鼠(7周齡)由SLC(靜岡，日本)購入，象實(shí)施例19那樣飼育。
小鼠中的耳殼浮腫的誘導(dǎo)如下進(jìn)行。
將500μg的辣椒辣素溶解于丙酮/橄欖油(4/1，30μl)，適用于各小鼠(BALB/c，♀，7-8周齡，SPF，SLC Inc.)的右耳內(nèi)側(cè)表面和外側(cè)表面。對于左耳作為對照適用丙酮/橄欖油。將半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))、地塞米松、cyproheptadine、或載體(vehicle)在給予辣椒辣素30分鐘前注入到腹腔內(nèi)(i.p.，0.345ml/head)，而在10分鐘前進(jìn)行靜脈內(nèi)注射。在注射辣椒辣素后0，0.5，1和2小時(shí)，使用校正厚度計(jì)(Mitsutoyo，東京，日本)在乙醚麻醉下測定耳的厚度。
用(R-L)-(R0-L0)表示耳殼浮腫。其中R0表示實(shí)驗(yàn)開始時(shí)(0h)的右耳厚度，而L0表示實(shí)驗(yàn)開始時(shí)(0h)的左耳厚度，R表示各個(gè)時(shí)點(diǎn)得到的右耳厚度，而L表示左耳的厚度。
統(tǒng)計(jì)上的解析如下進(jìn)行。
沒有特別指出時(shí)，數(shù)據(jù)用平均值±SEM表示。數(shù)據(jù)組的統(tǒng)計(jì)上的差異使用one-way ANOVA進(jìn)行解析。而組之間的差異使用市售的統(tǒng)計(jì)軟件(GraphPad Software，Inc.，San Diego，USA)通過BonferroniPost-Test進(jìn)一步評(píng)價(jià)。P值＜0.05被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義。
〔結(jié)果〕結(jié)果如圖41所示。在給予半乳凝素9突變體組(靜注注射)，確認(rèn)抑制發(fā)癥。圖中各個(gè)值表示5～6只的動(dòng)物的平均值±SEM。數(shù)據(jù)組的統(tǒng)計(jì)上的差異使用one-way ANOVA進(jìn)行解析。而組之間的差異通過Dunnett′s Multiple Comparison Test進(jìn)行評(píng)價(jià)(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)。預(yù)期通過半乳凝素9突變體可以抑制起因于神經(jīng)性、炎癥性的疼痛。
實(shí)施例25〔半乳凝素9突變體對骨吸收和骨形成的作用〕〔實(shí)驗(yàn)方法〕1.骨吸收(破骨細(xì)胞形成)在RANKL(50ng/ml)和M-CSF(50ng/ml)存在下，將外周血單核細(xì)胞(1×105cells)培養(yǎng)9天，比較半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))添加(0.1～10nM)組和未添加組TRAP陽性多核細(xì)胞數(shù)(破骨細(xì)胞)。h-G9NC(null)抑制TRAP陽性多核細(xì)胞(破骨細(xì)胞)的形成依賴于濃度。有時(shí)也將h-G9NC(null)簡單地記為gal-9。
得到的結(jié)果如圖42所示。
對照組(cont.)500±13.2cells/well，給予半乳凝素9突變體組(h-G9NC(null)，0.1nM)451±7.6cells/well、(h-G9NC(null)，1.0nM)151±12.5cells/well、(h-G9NC(null)，10nM)29±14.0cells/well。
2.骨形成(成骨細(xì)胞增殖)使用Tetra color-1assay通過吸光度研究h-G9NC(null)(0.1～100nM)對人成骨細(xì)胞(按照2×103/well將細(xì)胞播種到96孔板，過夜后加h-G9NC(null)刺激，于0小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)時(shí)刻觀察)增殖的影響。
得到的結(jié)果如圖44所示。半乳凝素9突變體誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的增殖依賴于濃度，其增殖受到乳糖抑制。半乳凝素9突變體誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的增殖依賴于濃度，而受到乳糖(30mM)的抑制。吸光度在對照為0.21±0.01、在h-G9NC(null)(0.1nM)為0.22±0.01、在h-G9NC(null)(1.0nM)為0.24±0.01、在h-G9NC(null)(10nM)為0.25±0.01、在h-G9NC(null)(100nM)為0.26±0.02是24小時(shí)的值，48小時(shí)后，對照為0.22±0.01、h-G9NC(null)(0.1nM)為0.23±0.01、h-G9NC(null)(1.0nM)為0.26±0.01、h-G9NC(null)(10nM)為0.27±0.01、h-G9NC(null)(100nM)為0.31±0.04。
(成骨細(xì)胞分化)使用流式細(xì)胞儀通過細(xì)胞內(nèi)ALP和骨鈣蛋白研究半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))(100nM)對人成骨細(xì)胞(按照2×103/well將細(xì)胞播種到6孔板，溫育24小時(shí)后，于1％FCS/DMEM饑餓過夜，加gal-9刺激，8小時(shí)后測定)分化的影響。
得到的結(jié)果如圖45所示。半乳凝素9突變體誘導(dǎo)成骨細(xì)胞中的骨形成標(biāo)志ALP、骨鈣蛋白的表達(dá)。ALP與無刺激相比增加了400molecules/cell、而骨鈣蛋白與無刺激相比增加了800molecules/cell。而如果向成骨細(xì)胞中添加h-G9NC(null)(10nM)，培養(yǎng)28天，與不添加組相比，ALP染色和von kossa染色被促進(jìn)。
由以上試驗(yàn)可知在半乳凝素9突變體添加后6小時(shí)，發(fā)生單核細(xì)胞的凝集。而半乳凝素9突變體抑制TRAP陽性多核細(xì)胞的形成依賴于濃度。半乳凝素9突變體誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的增殖依賴于濃度。半乳凝素9突變體誘導(dǎo)成骨細(xì)胞中的ALP、骨鈣蛋白的表達(dá)。
以上結(jié)果表明半乳凝素9突變體和天然的半乳凝素9可能對骨吸收有抑制作用，而對骨形成有促進(jìn)作用，認(rèn)為作為具有骨形成促進(jìn)作用的藥劑有可能應(yīng)用于閉經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的治療。
實(shí)施例26〔半乳凝素9突變體對間質(zhì)性肺炎模型的作用〕〔實(shí)驗(yàn)方法〕作為間質(zhì)性肺炎模型使用小鼠。將C57BL/6小鼠(♀6周齡、使用時(shí)7～8周齡、20匹)按照參考文獻(xiàn)Blood 2002；991289-98和Am J Respir Crit Care Med 2003；1681075-83進(jìn)行處理，誘導(dǎo)間質(zhì)性肺炎。使用rhIL-2(PeproTech，5μg×10匹×2組×14日＝1400μg＝1.4mg)和rmIL-18(MBL，0.2μg×10匹×2組×14日＝56μg)。
作為樣品組準(zhǔn)備對照組以及半乳凝素9突變體(Gal-9)給予組。
(1)對照組(小鼠10匹)每只小鼠，每日注射IL-2 5μg+IL-18 0.2μg，連續(xù)腹腔內(nèi)注射0～13天。作為對照，每只小鼠，每日注射PBS 200μl，連續(xù)腹腔內(nèi)注射0～13天。
(2)注射Gal-9組(小鼠10匹)每只小鼠，每日注射IL-2 5μg+IL-18 0.2μg，連續(xù)腹腔內(nèi)注射0～13天。半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))做成100μg/300μl PBS，每只小鼠，連續(xù)腹腔內(nèi)注射13天。麻醉無論那一只都通過戊巴比妥腹腔內(nèi)注射進(jìn)行。
效果判定的指標(biāo)第一為存活率，就存活至14天得到的的例子研究肺組織。
小鼠取樣如下進(jìn)行對于途中死亡例，死亡時(shí)解剖，取肺組織對于生存至day 14的生存例，乙醚麻醉→從眼窩采血→頸椎脫臼→開胸→采取肺組織。
研究了該模型的rhGal-9null腹腔內(nèi)注入的效果。將rhGal-9null給予組和未給予組各為14天的存活率作為判定效果的基準(zhǔn)，然后比較在14天的組織照片。
得到的結(jié)果如圖46和47所示。圖46表示存活率。14天的存活率在非給予組為30％(10只中3只生存)，在給予h-G9NC(null)(Gal-9)組中為90％(10只中9只生存)，看到通過給予半乳凝素9突變體(h-G9NC(null)Gal-9)改善了存活率。
圖47表示14天存活例的肺組織(HE染色、照片)。在非給予組，即使在存活例中也可看到伴隨廣泛而且強(qiáng)度的細(xì)胞浸潤產(chǎn)生的肺間質(zhì)的肥厚。在半乳凝素9突變體(h-G9NC(null)Gal-9)給予組，間質(zhì)的肥厚、細(xì)胞浸潤都為輕度，看到的是大多殘存的正常組織。由此表明在本模型中半乳凝素9(Gal-9)具有抑制發(fā)癥的效果。在本試驗(yàn)中雖然看到體重變化，但在非給予組死亡例、存活例都沒有看到有意義的體重變化。
實(shí)施例27〔對于癌轉(zhuǎn)移模型的活性〕〔實(shí)驗(yàn)方法〕使用B16/F10細(xì)胞，研究半乳凝素9突變體對癌轉(zhuǎn)移模型的作用。
將細(xì)胞(5×105個(gè)/200μL)接種在C57/BL 6小鼠(SLC，6周齡雌性)的尾靜脈。接種后立刻將半乳凝素9突變體(略記為h-G9NC(null)、「Gal-9」；100μg/300μL)或PBS(各N＝15)注入尾靜脈，連續(xù)注入11日(注射次數(shù)12次)。在接種后第12天，解剖，對肺的結(jié)節(jié)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。
圖49給出了試驗(yàn)的結(jié)果(模型動(dòng)物肺的外觀)。圖50給出了肺結(jié)節(jié)數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果。通過對半乳凝素9突變體注入組(Gal-9組)和PBS注入組(PBS組)進(jìn)行比較，確認(rèn)了半乳凝素9突變體產(chǎn)生的抑制轉(zhuǎn)移效果。通過比較肺的結(jié)節(jié)數(shù)，各組的平均結(jié)節(jié)數(shù)，半乳凝素9突變體注入組(Gal-9)為231.3±20.87、PBS注入組(PBS)為122.1±13.61，P＜0.0001，有意性被證實(shí)，確認(rèn)了半乳凝素9突變體抑制癌轉(zhuǎn)移的效果。
實(shí)施例28〔角叉菜膠誘發(fā)炎癥模型Carrageenan-induced大鼠PawEdema〕角叉菜膠(carrageenan，Izushi kaga0ku，Japan)由其供貨商購入。為了給予動(dòng)物，在全部實(shí)驗(yàn)中作為載體(vehicle，V)使用PBS(-)，將化合物懸浮于該溶液后給予動(dòng)物。雌性Lewis大鼠(5周齡)由SLC(靜岡，日本)購入，象實(shí)施例19那樣飼育。為了研究半乳凝素9突變體的作用效果，在角叉菜膠注射10分鐘前，按照30-300μg/只(inPBS)向大鼠靜脈內(nèi)(i.v.)注射半乳凝素9突變體(略記為h-G9NC(null)、「gal-9」。作為陽性對照按照3mg/kg、7mg/kg注射地賽米松(Dex.)。
〔角叉菜膠足跖浮腫〕按照Sugishita et al.(1981)方法在大鼠中進(jìn)行角叉菜膠誘發(fā)足跖浮腫試驗(yàn)，研究半乳凝素9突變體(human null galectin-9，h-G9NC(null))的抗炎癥活性。在向右后足的足底注射角叉菜膠(0.15ml；1％w/v in saline)10分鐘前靜脈內(nèi)(i.v.)注射藥劑化合物(30，100 and 300μg/只)或載體(vehiclePBS)。誘導(dǎo)浮腫后，使用水銀置換型呼吸功能解析裝置(mercury displacement plethysmography；Muromachi，Tokyo，Japan)，測定-1，2，4，6，24，48和72h的注射了角叉菜膠側(cè)的足和另外的一側(cè)足(右后足注射食鹽水液(saline))的容積。對足體積的變化以-1h和各個(gè)小時(shí)之間的差異進(jìn)行計(jì)算。對于由角叉菜膠誘導(dǎo)的浮腫以注射了角叉菜膠側(cè)的足和另外的一側(cè)足之間的差異表示。
統(tǒng)計(jì)上的解析如下進(jìn)行。
沒有特別指出時(shí)，數(shù)據(jù)用平均值±SEM表示。數(shù)據(jù)組的統(tǒng)計(jì)上的差異使用one-way ANOVA進(jìn)行解析。而組之間00的差異使用市售的統(tǒng)計(jì)軟件(GraphPad Software，Inc.，San Diego，USA)通過BonferroniPost-Test進(jìn)一步評(píng)價(jià)。P值＜0.05被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義。
〔結(jié)果〕結(jié)果如圖41所示。在給予半乳凝素9突變體組(靜注注射)，確認(rèn)抑制發(fā)癥。圖中各個(gè)值表示5～6只的動(dòng)物的平均值±SEM。數(shù)據(jù)組的統(tǒng)計(jì)上的差異使用one-way ANOVA或two-way ANOVA進(jìn)行解析。而組之間的差異使用市售的統(tǒng)計(jì)軟件(GraphPad Software，Inc.，SanDiego，USA)，通過Dunnett′s Multiple Comparison Test或Bonferroni Post-Test進(jìn)一步評(píng)價(jià)。P值＜0.05統(tǒng)計(jì)學(xué)上認(rèn)為有意義。
〔結(jié)果〕
結(jié)果如圖51(半乳凝素9突變體)和圖52(地塞米松)所示。確認(rèn)半乳凝素-9突變體即使30μg/mouse也有抑制發(fā)癥的抑制效果。
實(shí)施例291.半乳凝素-9突變體佐劑性關(guān)節(jié)炎模型中的鎮(zhèn)痛作用〔方法〕〔機(jī)械刺激引起的疼痛(通過Randall-Selitto test＝垂直加壓引起的痛覺閾值的測定)〕丁酸分枝桿菌(Mycobacterium butyricum，Difco，Detroit，MI，USA)由其供貨商購入。為了給予動(dòng)物，在全部實(shí)驗(yàn)中作為載體(vehicle，V)使用PBS(-)，將化合物懸浮于該溶液后給予動(dòng)物。雌性Lewis大鼠(5周齡)由SLC(靜岡，日本)購入，象實(shí)施例19那樣飼育。為了研究半乳凝素9突變體的作用效果，在佐劑注射的前后0至22日，按照30-300μg/只(in PBS)向大鼠靜脈內(nèi)(i.v.)注射半乳凝素9突變體(略記為h-G9NC(null)、「gal-9」。作為陽性對照按照3mg/kg注射吲哚美辛(Indo)。
〔佐劑性關(guān)節(jié)炎〕測定雌性Lewis大鼠(5周齡)的體重，在尾部做標(biāo)記，分為由9只動(dòng)物組成的組。在佐劑注射前(day 0)、記錄體重和兩個(gè)后足的足跖的容積。然后向各個(gè)大鼠的右后足注射佐劑。將沒有注射佐劑的組作為正常對照組(normal age-matched controls(sham))。分別在佐劑注射后的不同日期記錄將大鼠殺死前各組大鼠的體重和足的容積。
〔佐劑的程序〕將丁酸分枝桿菌(Mycobacterium butyricum)于乳缽中研碎，制備佐劑，與油混合，做成最終濃度10mg/ml。使用27-號(hào)針的0.5-英才針將0.2ml佐劑注射到大鼠右后足的足底。
〔因機(jī)械刺激導(dǎo)致疼痛的解析〕改變Randall和Selitto的手法，對半乳凝素9突變體(human nullgalectin-9，h-G9NC(null))是否具有減輕對來自外部的押壓的在急性炎癥組織或非炎癥組織的末梢性過敏癥的鎮(zhèn)痛活性進(jìn)行了研究。即向雌性Lewis大鼠(5周齡)的右后足s.c.注射弗氏完全佐劑(CompleteFreund′s Adjuvant)，誘發(fā)急性和慢性炎癥。在佐劑注射的前2日和角叉菜膠注射5日后，通過Randall和Selitto測試測定對來自外部的押壓的在急性炎癥組織或非炎癥組織的末梢性過敏癥，然后一直監(jiān)測到第25日(1time/week)。觀察者邊控制，邊用數(shù)字式福斯測定器(Imada，aichi，Japan)向已經(jīng)有炎癥的一側(cè)的足跖以及另一側(cè)的非炎癥足跖兩方由外慢慢加押壓(0-200g)。將痛覺閾值定義為動(dòng)物最初表現(xiàn)出感覺疼痛的前兆時(shí)的壓。所謂該前兆是指伸時(shí)和/或收縮足、發(fā)出哭聲的最初時(shí)刻表現(xiàn)出的苗頭。
統(tǒng)計(jì)上的解析象實(shí)施例28那樣進(jìn)行。即沒有特別指出時(shí)，數(shù)據(jù)用平均值(mean)±SEM表示。數(shù)據(jù)組的統(tǒng)計(jì)上的差異使用one-way ANOVA或two-way ANOVA進(jìn)行解析。而組之間的差異使用市售的統(tǒng)計(jì)軟件(GraphPad Software，Inc.，San Diego，USA)通過Dunnett′sMultiple Comparison Test或Bonferroni Post-Test進(jìn)一步評(píng)價(jià)。P值＜0.05統(tǒng)計(jì)學(xué)上被認(rèn)為是有意義。
〔結(jié)果〕結(jié)果如圖58(半乳凝素9突變體，Gal-9)和圖59(吲哚美辛)所示。圖中在分別表示各個(gè)值的點(diǎn)的動(dòng)物(圖588-9匹(n＝8-9)、圖599匹(n＝9))的平均值±SEM。統(tǒng)計(jì)上的差異使用one-way ANOVA進(jìn)行解析。而組之間的差異通過Bonferroni Post-Test進(jìn)行評(píng)價(jià)(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)。給予半乳凝素-9突變體，不止是引起炎癥(依賴于濃度)的部位，即使在不引起炎癥的部位對痛覺刺激的閾值也上升(參照圖66Left)。即半乳凝素-9突變體使全身性痛覺的閾值提高。
2.角叉菜膠誘發(fā)急性炎癥模型Carrageenan-induced PawEdema in rats〔方法〕角叉菜膠(carrageenan，Izushi kagaku，Japan)由其供貨商購入。為了給予動(dòng)物，在全部實(shí)驗(yàn)中作為載體(vehicle，V)使用PBS(-)，將化合物懸浮于該溶液后給予動(dòng)物。雌性Lewis大鼠(5周齡)由SLC(靜岡，日本)購入，象實(shí)施例19那樣飼育。為了研究半乳凝素9突變體的作用效果，在角叉菜膠注射10分鐘前，按照30-300μg/只(inPBS)向大鼠靜脈內(nèi)(i.v.)注射半乳凝素9突變體(略記為h-G9NC(null)、「gal-9」)。作為陽性對照按照3mg/kg、7mg/kg注射地賽米松(Dex.)。
〔因機(jī)械刺激導(dǎo)致疼痛的解析〕改變Randall和Selitto的手法，對半乳凝素9突變體(human nullgalectin-9，h-G9NC(null))是否具有減輕對來自外部的押壓的在急性炎癥組織或非炎癥組織的末梢性過敏癥的鎮(zhèn)痛活性進(jìn)行了研究。即向雌性Lewis大鼠(5周齡)的右后足s.c.注射角叉菜膠，誘發(fā)急性和慢性炎癥。在角叉菜膠注射的前1日和角叉菜膠注射6小時(shí)后，通過Randall和Selitto測試測定對來自外部的押壓的在急性炎癥組織或非炎癥組織的末梢性的過敏癥，然后一直監(jiān)測75h(1time/day)。觀察者邊控制，邊用數(shù)字式福斯測定器(Imada，aichi，Japan)向已經(jīng)有炎癥的一側(cè)的足跖以及另一側(cè)的非炎癥足跖兩方由外慢慢加押壓(0-200g)。將痛覺閾值定義為動(dòng)物最初表現(xiàn)出感覺疼痛的前兆時(shí)的壓力。所謂該前兆是通過指伸時(shí)和/或收縮足、發(fā)出哭聲的最初時(shí)刻表現(xiàn)出的苗頭。
統(tǒng)計(jì)上的解析象實(shí)施例28那樣進(jìn)行。即沒有特別指出時(shí)，數(shù)據(jù)用平均值(mean)±SEM表示。數(shù)據(jù)組的統(tǒng)計(jì)上的差異使用one-way ANOVA或two-way ANOVA進(jìn)行解析。而組之間的差異使用市售的統(tǒng)計(jì)軟件(GraphPad Software，Inc.，San Diego，USA)通過BonferroniPost-Test進(jìn)一步評(píng)價(jià)。P值＜0.05被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義。
〔結(jié)果〕結(jié)果如圖60(半乳凝素9突變體，gal-9)和圖61(地塞米松)所示。圖中各個(gè)值在各示的點(diǎn)表示9匹(n＝9)只的動(dòng)物的平均值+SEM。統(tǒng)計(jì)上的差異使用one-way ANOVA或two-way ANOVA進(jìn)行解析。而組之間的差異通過Bonferroni Post-Test進(jìn)行評(píng)價(jià)(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)。給予半乳凝素-9突變體，不止是引起炎癥(依賴于濃度)的部位，即使在不引起炎癥的部位對痛覺刺激的閾值也上升。即半乳凝素-9突變體使全身性痛覺的閾值提高。
實(shí)施例30〔半乳凝素-9突變體人關(guān)節(jié)液中的穩(wěn)定性〕反應(yīng)條件人風(fēng)濕病關(guān)節(jié)液標(biāo)本160μLG9NC(null)or G9(S)(5μL in PBS) 40μL即在80％關(guān)節(jié)液中，使半乳凝素-9于37℃下溫育24小時(shí)或96小時(shí)(途中于6、24、48、72小時(shí)取樣)SDS處理和Western blot樣品 4.5μLH2O 40.5μLSample buffer(4x，+2-ME) 15μLSDS-PAGE 12.5％(10μL/lane)。
結(jié)果如圖62所示。表明即使在蛋白水解酶活性高的關(guān)節(jié)液中半乳凝素-9突變體〔G9NC(null)〕也比半乳凝素-9S〔G9(S)〕穩(wěn)定。
實(shí)施例31〔關(guān)節(jié)炎模型〕1.抗體混合物激發(fā)模型半乳凝素-9突變體(i.v.注射)〔方法〕使用DBA/1J雌性小鼠(7～8周齡)，激發(fā)關(guān)節(jié)炎用單克隆抗體混合物(Chondrex公司、No.62100)按照2mg/0.5mL/只注入動(dòng)物的尾靜脈。注入3日后腹腔內(nèi)注射50μg/0.2mL的LPS(SIGMA，L6511)。再以30μg/200μL將半乳凝素-9突變體(略記為h-Gal9NC(null)、「Gal-9」)注入動(dòng)物的尾靜脈。實(shí)驗(yàn)組做成注入PBS組和注入h-Gal9NC(null)組，Day0(注入LPS日)1次注入組和從Day0連續(xù)注入組(直至Day10，注入次數(shù)11次)共計(jì)3組進(jìn)行。各組1日1次左右測定前后肢的關(guān)節(jié)的腫脹，進(jìn)行打分。
〔結(jié)果〕結(jié)果如圖63所示。注入抗體混合物后，用LPS激發(fā)關(guān)節(jié)炎。關(guān)節(jié)炎也可以通過半乳凝素9突變體的i.v.注入被抑制。而且即使注入1次也可看到發(fā)癥被抑制的效果。
2-1.CIA(膠原致敏)模型半乳凝素-9突變體(i.p.注入)〔方法〕將Bovine Collagen typeII(BCIIChondrex公司catno 2002-1)溶解于完全佐劑(CFADifco cat no 263810)，制作乳劑，向小鼠(DBA/1J 7～8周齡、雌)的尾根部皮內(nèi)注射，每次100μL(BCII0.1mg/100μL/mouse)。致敏21日后進(jìn)行加強(qiáng)注射，一周3次對四肢進(jìn)行劃痕。加強(qiáng)后立刻向腹腔內(nèi)注射半乳凝素-9突變體(略記為「Gal-9」；30μg/mouse)或PBS，以后連日注射。
參小鼠劃痕(關(guān)節(jié)炎所見)對各小鼠的四肢經(jīng)多人觀察，算出四肢的合計(jì)分?jǐn)?shù)(最高16分)，算出平均分。
①指1個(gè)腫脹 1分②指2個(gè)以上腫脹 2分③腫脹至手(足)的甲3分④劇烈腫脹、變形 4分〔結(jié)果〕結(jié)果如圖64所示。確認(rèn)半乳凝素-9突變體有抑制發(fā)癥效果。
2-2.CIA(膠原致敏)模型半乳凝素-9突變體(i.v.注入)〔方法〕將Bovine Collagen typeII(BCIIChondrex公司cat no 2002-1)溶解于預(yù)先加了Mycobacterium Tuberculosas H37Ra，desiccated.(H37 RaDifco)的imcomplete Freund′sAdjuvant(IFADifco)，制作乳劑，向小鼠(DBA/1J 7～8周齡、雌)的尾根部皮內(nèi)注射，每次100μL(BCII 0.2mg/H37 Ra 0.2mg/100μL/mouse)。致敏21日后進(jìn)行加強(qiáng)注射，一周3次對四肢進(jìn)行劃痕。小鼠劃痕(關(guān)節(jié)炎所見)經(jīng)多人對各小鼠的四肢觀察，算出四肢的合計(jì)分?jǐn)?shù)(最高16分)，算出平均分?jǐn)?shù)。
加強(qiáng)后、立刻向尾靜脈內(nèi)注射半乳凝素-9突變體(略記為「Gal-9」と；30μg/mouse N＝15)或PBS(N＝10)，以后連續(xù)注射28天。
參考文獻(xiàn)Enhancement of collagen-induced arthritis inmice genetically deficient in extracellular superoxidedismutase.
Ross AD，Banda NK，Muggli M，Arend WP.Arthritis Rheum.2004Nov；50(11)3702-11.
〔結(jié)果〕結(jié)果如圖65所示。即使在半乳凝素-9突變體的i.v.注入也可看到發(fā)癥被抑制。
3.佐劑性關(guān)節(jié)炎(AIA)模型半乳凝素-9突變體(i.v.注射)〔方法〕丁酸分枝桿菌(Mycobacterium butyricum，Difco，Detroit，MI，USA)由其供貨商購入。為了給予動(dòng)物，在全部實(shí)驗(yàn)中作為載體(vehicle，V)使用PBS(-)，將化合物懸浮于該溶液后給予動(dòng)物。雌性Lewis大鼠(5周齡)由SLC(靜岡，日本)購入，象實(shí)施例19那樣飼育。為了研究半乳凝素9突變體的作用效果，在佐劑注射前后0至22日，按照30-300μg/只(in PBS)向大鼠靜脈內(nèi)(i.v.)注射半乳凝素9突變體(略記為h-G9NC(null)、「gal-9」)。作為陽性對照按照3mg/kg、7mg/kg注射地賽米松(Dex.)。
〔佐劑性關(guān)節(jié)炎〕測定雌性Lewis大鼠(5周齡)的體重，在尾部做標(biāo)記，分為由9只動(dòng)物組成的組。在佐劑注射前(day 0)、記錄體重和兩個(gè)后足的足跖的容積。然后向各個(gè)大鼠的右后足注射佐劑。將沒有注射佐劑的組作為正常對照組(normal age-matched controls(sham))。分別在佐劑注射后的不同日期記錄將大鼠殺死前各組大鼠的體重和足的容積。
〔足的容積〕使用水銀置換型呼吸功能解析裝置(mercury displacementplethysmography；Muromachi，Tokyo，Japan)測定足的容積。將足的容積的變化以day 0與各個(gè)日期之間的差異進(jìn)行計(jì)算。
〔臨床上評(píng)價(jià)〕對于前肢或后肢的、1.指節(jié)骨關(guān)節(jié)和指、2.甲部或掌、3.踝骨關(guān)節(jié)或腕部象以下那樣分為0～3等級(jí)評(píng)價(jià)各足關(guān)節(jié)炎的程度0，既沒有紅斑，也沒有腫脹；1，輕度的紅斑或腫脹；2，踝骨關(guān)節(jié)或腕部的中程度的紅斑或腫脹；3，重度的紅斑或腫脹。
在不同的大鼠組中進(jìn)行了病狀打分。取等級(jí)化的足跖關(guān)節(jié)炎的分?jǐn)?shù)的和，獲得各大鼠每日的關(guān)節(jié)炎分?jǐn)?shù)的總分。
〔佐劑的程序〕將丁酸分枝桿菌(Mycobacterium butyricum)于乳缽中研碎，制備佐劑，與混合混合，做成最終濃度10mg/ml。使用27-號(hào)的0.5-英才針將0.2ml佐劑注射到大鼠右后足的足底。
統(tǒng)計(jì)上的解析象實(shí)施例28那樣進(jìn)行。即沒有特別指出時(shí)，數(shù)據(jù)用平均值(mean)±SEM表示。數(shù)據(jù)組的統(tǒng)計(jì)上的差異使用one-way ANOVA或two-way ANOVA進(jìn)行解析。而組之間的差異使用市售的統(tǒng)計(jì)軟件(GraphPad Software，Inc.，San Diego，USA)通過Dunnett′sMultiple Comparison Test或Bonferroni Post-Test進(jìn)一步評(píng)價(jià)。P值＜0.05被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義。
〔結(jié)果〕結(jié)果如圖66(半乳凝素9突變體，Gal-9)和圖67(吲哚美辛，Indo)所示。佐劑性關(guān)節(jié)炎主要是由自然免疫和T細(xì)胞參與的獲得免疫引起的炎癥。半乳凝素-9突變體雖然可抑制任一種炎癥，但主要是強(qiáng)烈抑制由獲得免疫引起的炎癥。另外體重的增減在吲哚美辛給予組和半乳凝素-9突變體給予組都表現(xiàn)出同樣的傾向。
實(shí)施例32〔大鼠CIA(膠原致敏)模型半乳凝素-9突變體(i.v.注入)〕〔方法〕將牛II型膠原(膠原技術(shù)研修會(huì))溶解于不完全佐劑(IFADifco)，制作乳劑，向大鼠(DA/Slc 11周齡日本SLC公司)的背部皮膚內(nèi)按照每次500μL進(jìn)行皮內(nèi)注射(膠原50μg/500μL/mouse)，進(jìn)行一次致敏。1周后將同膠原乳劑液(膠原50μg/500μL/mouse)注入動(dòng)物的尾根部，進(jìn)行二次致敏。每周3次對四肢進(jìn)行劃痕。加強(qiáng)后立刻向靜脈內(nèi)注入半乳凝素-9突變體(null human galectin-9＝h-G9NC(null)；3，10，30μg/1mL/mouse)、陰性對照物質(zhì)PBS(1mL/mouse)，陽性對照物質(zhì)脫氫可的松(3mg/10mL/kgSIGMA)經(jīng)口給予，每日1次、進(jìn)行到38天之前的第32天。
在膠原一次致敏日(0日)、一次致敏后7，15，18，22，26，30，35和39日測定左右后肢的足容積，按照下式算出浮腫率(％)。
浮腫率(swelling)(％)＝[致敏后的足跖體積(mL)-致敏前的足跖體積(mL)]/[致敏前的足跖體積(mL)]×100統(tǒng)計(jì)學(xué)上的處理如下進(jìn)行。左右后肢的加算作為個(gè)體值、用浮腫率(％)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。在PBS組和脫氫可的松組之間通過F檢定檢定等分散性，對于等分散的情況進(jìn)行Student的t檢定，對不等分散的場合進(jìn)行Aspin-Wech的t檢定。然后在PBS組和半乳凝素9突變體組之間通過Bartlet檢定檢定等分散性，對于等分散性的場合進(jìn)行參數(shù)的Dunnett’s test，對于不等分散性的場合進(jìn)行非參數(shù)的Dunnett’s test。無論那一種場合有意水準(zhǔn)將5％以下(p＜0.05)作為有意義，分成5％以下和1％以下(p＜0.01)表示。得到的結(jié)果如圖68和表3所示。表3中各個(gè)值用平均值(mean)±SEM表示。##來自對照的有意義差異(15，18，22DayStudent的t檢定、*p＜0.05，**p＜0.01來自對照的有意義差異(18，22Day參數(shù)的Dunnett，s test；15Day非參數(shù)的Dunnett，s test)。確認(rèn)半乳凝素9突變體抑制發(fā)癥。
表3

本半乳凝素9突變體(穩(wěn)定化半乳凝素9、例如、h-G9NC(null)等)由于表現(xiàn)出如下那樣的生物活性，所以可表現(xiàn)出預(yù)期的抗腫瘤效果腫瘤細(xì)胞的凝集······在許多腫瘤細(xì)胞中的凝集效果粘附抑制·········對細(xì)胞外基質(zhì)的粘附抑制效果凋亡、細(xì)胞損傷··在很多腫瘤細(xì)胞中的凋亡誘導(dǎo)樹狀細(xì)胞(DC)的活化···DC分化誘導(dǎo)NK、NKT活化····動(dòng)員促進(jìn)疼痛的抑制········抑制由辣椒辣素引起的疼痛本發(fā)明者等研究組研究了半乳凝素9在乳癌組織中的表達(dá)，通過半乳凝素9陽性例確認(rèn)遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移頻率低。而且現(xiàn)在正在進(jìn)行轉(zhuǎn)移予知診斷試劑盒的開發(fā)(Clin Cancer Res，2005 in press，Galectin-9 asa prognostic factor with anti-metastatic potential in breastcancer)。另外確認(rèn)半乳凝素9基因?qū)肴巳榘┘?xì)胞株在體內(nèi)表現(xiàn)出高的凝集性，在裸鼠體內(nèi)也確認(rèn)表現(xiàn)出同樣的凝集性。另外對包括血球系惡性腫瘤在內(nèi)的很多細(xì)胞系的細(xì)胞損傷活性都被確認(rèn)，確認(rèn)其中很多活性是由于凋亡的誘導(dǎo)導(dǎo)致的(Int J Cancer.2002 20；99(6)809-816，Possible role of galectin-9 in cell aggregation anda poptosis of human melanoma cell lines and its clinicalsignificance；J immunol.2003 1；170(7d)3631-3636，Galectin-9induces apoptosis through the carcium-calpain-caspase-1pathway)。另外，在給予半乳凝素9的局部，NK/NKT細(xì)胞、Mφ系細(xì)胞等的動(dòng)員被證實(shí)，表明細(xì)胞性癌免疫機(jī)構(gòu)誘導(dǎo)的可能性。
由以上結(jié)果可以預(yù)期穩(wěn)定化半乳凝素9(本發(fā)明的半乳凝素9突變體、例如、h-G9NC(null)等)具有通過對白血病等血球系惡性腫瘤、術(shù)后的釋放癌細(xì)胞的殺細(xì)胞效果、阻礙癌細(xì)胞的凝集·癌細(xì)胞的血管壁粘附和向其它組織的浸潤，抑制轉(zhuǎn)移、抑制癌性腹膜炎發(fā)癥的效果、以及通過效應(yīng)細(xì)胞向腫瘤周邊部位的動(dòng)員引起腫瘤免疫活性的亢進(jìn)等效果、以及成為預(yù)期作用效果更理想，副作用更少的新的抗癌物質(zhì)。
現(xiàn)在開發(fā)中的生物制劑(單克隆抗體等)以免疫細(xì)胞表面分子、細(xì)胞內(nèi)功能分子或炎癥性細(xì)胞因子作為靶。即是具有抑制效果，做成藥理作用的藥劑。另外本穩(wěn)定化半乳凝素9分子制劑是通過誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞或活化T細(xì)胞的凋亡和抑制骨破壞的作用，預(yù)期生物體本來具有的免疫調(diào)節(jié)作用、抗炎癥作用和骨·軟骨組織也可再生的與抗細(xì)胞因子療法等完全不同的新想法的開發(fā)研究。疼痛是關(guān)節(jié)風(fēng)濕病的主要所見，在上述實(shí)施例中使用的辣椒辣素是激發(fā)神經(jīng)性炎癥的炎癥性疼痛的重要的介體，穩(wěn)定化半乳凝素9抑制由于辣椒辣素涂布引起的耳殼腫脹。即預(yù)期可作為副作用少的新的全身性自身免疫疾患的治療藥。本穩(wěn)定化半乳凝素9可成為由于新的作用機(jī)制引起副作用少的抗風(fēng)濕病劑。本穩(wěn)定化半乳凝素9具有抑制炎癥和關(guān)節(jié)組織的修復(fù)、抑制疼痛的臨床效果上的特征，預(yù)期(1)活化T細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)，(2)滑膜細(xì)胞的凋亡、(3)花生四烯酸級(jí)聯(lián)，(4)骨破壞抑制等機(jī)理有望作為風(fēng)濕病治療藥。實(shí)際上關(guān)節(jié)炎(CIA、抗體混合物)模型的抑制發(fā)癥已被確認(rèn)。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性半乳凝素9突變體比野生型的半乳凝素對酶有抗性，所以在有效利用半乳凝素9表現(xiàn)出的多方面作用·功能中有重要作用。野生型半乳凝素9雖然通過對腫瘤細(xì)胞的直接作用(誘導(dǎo)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞間粘附與凋亡的活性)和借助于免疫系的作用，表現(xiàn)出具有抑制癌的轉(zhuǎn)移和誘導(dǎo)萎縮，但半乳凝素9突變體是表現(xiàn)出同樣活性的更有好的活性物質(zhì)，例如預(yù)期可作為抗腫瘤藥等。野生型半乳凝素9由于對非活化淋巴細(xì)胞沒有作用，而誘導(dǎo)活化T細(xì)胞、特別是誘導(dǎo)成為過剩免疫反應(yīng)原因的CD4陽性T細(xì)胞凋亡，本半乳凝素9突變體是表現(xiàn)出同樣活性的更有好的活性物質(zhì)、例如預(yù)期可作為抗炎癥藥、抗變態(tài)性藥、骨質(zhì)疏松藥。由于已闡明野生型半乳凝素9對與風(fēng)濕病中關(guān)節(jié)的變形等有關(guān)的滑膜細(xì)胞具有強(qiáng)力凋亡誘導(dǎo)能力，所以本半乳凝素9突變體預(yù)期可作為表現(xiàn)出同樣活性的更有好的活性物質(zhì)。因此可以在針對癌治療藥和難治的自身免疫疾患(包括風(fēng)濕病)、變態(tài)性疾患、炎癥疾患、與骨代謝有關(guān)的疾患的治療藥的開發(fā)、半乳凝素9的功能闡明和研究開發(fā)中利用。
本發(fā)明除了上述說明以及實(shí)施例特別敘述的以外，顯然能夠?qū)嵭小ｈb于上述的示范，本發(fā)明的多種改變以及變形都是可能的，因此這些也都是本件附加的權(quán)利要求范圍的范圍內(nèi)的內(nèi)容。
<序列表free text>
SEQ ID NO1，人工序列的描述半乳凝素9突變體的多聚核苷酸，G9NC(null)SEQ ID NO2，人工序列的描述半乳凝素9突變體的氨基酸SEQ ID NO5，半乳凝素9的M型同工型SEQ ID NO10，人工序列的描述用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO11，人工序列的描述用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO12，人工序列的描述用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO13，人工序列的描述用作PCR引物的寡核苷酸序列表<110>株式會(huì)社嘉爾藥物<120>新的半乳凝素9突變體蛋白質(zhì)及其用途<130>GL 05PCT<150>JP 2004-94401<151>2004-03-29<150>JP 2004-287005<151>2004-09-30<150>JP 2005-43156<151>2005-02-18<160>13<170>Patentln version 3.1<210>1<211>891<212>DNA<213>人工序列<220>
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gtc aat ggg acc gtt ctc agc tcc agt gga acc agg ttt gct gtg aac 144Val Asn Gly Thr Val Leu Ser Ser Ser Gly Thr Arg Phe Ala Val Asn35 40 45ttt cag act ggc ttc agt gga aat gac att gcc ttc cac ttc aac cct 192Phe Gln Thr Gly Phe Ser Gly Asn Asp Ile Ala Phe His Phe Asn Pro50 55 60cgg ttt gaa gat gga ggg tac gtg gtg tgc aac acg agg cag aac gga 240Arg Phe Glu Asp Gly Gly Tyr Val Val Cys Asn Thr Arg Gln Asn Gly65 70 75 80agc tgg ggg ccc gag gag agg aag aca cac atg cct ttc cag aag ggg 288Ser Trp Gly Pro Glu Glu Arg Lys Thr His Met Pro Phe Gln Lys Gly85 90 95atg ccc ttt gac ctc tgc ttc ctg gtg cag agc tca gat ttc aag gtg 336Met Pro Phe Asp Leu Cys Phe Leu Val Gln Ser Ser Asp Phe Lys Val100 105 110atg gtg aac ggg atc ctc ttc gtg cag tac ttc cac cgc gtg ccc ttc 384Met Val Asn Gly Ile Leu Phe Val Gln Tyr Phe His Arg Val Pro Phe115 120 125cac cgt gtg gac acc atc tcc gtc aat ggc tct gtg cag ctg tcc tac 432His Arg Val Asp Thr Ile Ser Val Asn Gly Ser Val Gln Leu Ser Tyr130 135 140atc agc ttc cag cat atg act ccc gcc atc cca cct atg atg tac ccc 480Ile Ser Phe Gln His Met Thr Pro Ala Ile Pro Pro Met Met Tyr Pro145 150 155 160cac ccc gcc tat ccg atg cct ttc atc acc acc att ctg gga ggg ctg 528His Pro Ala Tyr Pro Met Pro Phe Ile Thr Thr Ilc Leu Gly Gly Leu165 170 175tac cca tcc aag tcc atc ctc ctg tca ggc act gtc ctg ccc agt gct 576Tyr Pro Ser Lys Ser Ile Leu Leu Ser Gly Thr Val Leu Pro Ser Ala180 185 190cag agg ttc cac atc aac ctg tgc tct ggg aac cac atc gcc ttc cac 624Gln Arg Phe His Ile Asn Leu Cys Ser Gly Asn His Ile Ala Phe His195 200 205
ctg aac ccc cgt ttt gat gag aat gct gtg gtc cgc aac acc cag atc 672Leu Asn Pro Arg Phe Asp Glu Asn Ala Val Val Arg Asn Thr Gln Ile210 215 220gac aac tcc tgg ggg tct gag gag cga agt ctg ccc cga aaa atg ccc 720Asp Asn Ser Trp Gly Ser Glu Glu Arg Ser Leu Pro Arg Lys Met Pro225 230 235 240ttc gtc cgt ggc cag agc ttc tca gtg tgg atc ttg tgt gaa gct cac 768Phe Val Arg Gly Gln Ser Phe Ser Val Trp Ile Leu Cys Glu Ala His245 250 255tgc ctc aag gtg gcc gtg gat ggt cag cac ctg ttt gaa tac tac cat 816Cys Leu Lys Val Ala Val Asp Gly Gln His Leu Phe Glu Tyr Tyr His260 265 270cgc ctg agg aac ctg ccc acc atc aac aga ctg gaa gtg ggg ggc gac 864Arg Leu Arg Asn Leu Pro Thr Ile Asn Arg Leu Glu Val Gly Gly Asp275 280 285atc cag ctg acc cat gtg cag aca tag 891Ile Gln Len Thr His Val Gln Thr290 295<210>2<211>296<212>PRT<213>人工序列<220<223>半乳凝素9突變體的氨基酸<400>2Met Ala Phe Ser Gly Ser Gln Ala Pro Tyr Leu Ser Pro Ala Val Pro1 5 10 15Phe Ser Gly Thr Ile Gly Gly Gly Leu Gln Asp Gly Leu Gln Ile Thr20 25 30Val Asn Gly Thr Val Leu Ser Ser Ser Gly Thr Arg Phe Ala Val Asn
35 40 45Phe Gln Thr Gly Phe Ser Gly Asn Asp Ile Ala Phe His Phe Asn Pro50 55 60Arg Phe Glu Asp Gly Gly Tyr Val Val Cys Asn Thr Arg Gln Asn Gly65 70 75 80Ser Trp Gly Pro Glu Glu Arg Lys Thr His Met Pro Phe Gln Lys Gly85 90 95Met Pro Phe Asp Leu Cys Phe Leu Val Gln Ser Ser Asp Phe Lys Val100 105 110Met Val Asn Gly Ile Leu Phe Val Gln Tyr Phe His Arg Val Pro Phe115 120 125His Arg Val Asp Thr Ile Ser Val Asn Gly Ser Val Gln Leu Ser Tyr130 135 140Ile Ser Phe Gln His Met Thr Pro Ala Ile Pro Pro Met Met Tyr Pro145 150 155 160His Pro Ala Tyr Pro Met Pro Phe Ile Thr Thr Ile Leu Gly Gly Leu165 170 175Tyr Pro Ser Lys Ser Ile Leu Leu Ser Gly Thr Val Leu Pro Ser Ala180 185 190Gln Arg Phe His Ile Asn Leu Cys Ser Gly Asn His Ile Ala Phe His195 200 205Leu Asn Pro Arg Phe Asp Glu Asn Ala Val Val Arg Asn Thr Gln Ile
2l0 215 220Asp Asn Ser Trp Gly Ser Glu Glu Arg Ser Leu Pro Arg Lys Met Pro225 230 235 240Phe Val Arg Gly Gln Ser Phe Ser Val Trp Ile Leu Cys Glu Ala His245 250 255Cys Leu Lys Val Ala Val Asp Gly Gln His Leu Phe Glu Tyr Tyr His260 265 270Arg Leu Arg Asn Leu Pro Thr Ile Asn Arg Leu Glu Val Gly Gly Asp275 280 285Ile Gln Leu Thr His Val Gln Thr290 295<210>3<211>148<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>3Met Ala Phe Ser Gly Ser Gln Ala Pro Tyr Leu Ser Pro Ala Val Pro1 5 10 15Phe Ser Gly Thr Ile Gln Gly Gly Leu Gln Asp Gly Leu Gln Ile Thr20 25 30Val Asn Gly Thr Val Leu Ser Ser Ser Gly Thr Arg Phe Ala Val Asn35 40 45Phe Gln Thr Gly Phe Ser Gly Asn Asp Ile Ala Phe His Phe Asn Pro50 55 60
Arg Phe Glu Asp Gly Gly Tyr Val Val Cys Asn Thr Arg Gln Asn Gly65 70 75 80Ser Trp Gly Pro Glu Glu Arg Lys Thr His Met Pro Phe Gln Lys Gly85 90 95Met Pro Phe Asp Leu Cys Phe Leu Val Gln Ser Ser Asp Phe Lys Val100 105 110Met Val Asn Gly Ile Leu Phe Val Gln Tyr Phe His Arg Val Pro Phe115 120 125His Arg Val Asp Thr Ile Ser Val Asn Gly Ser Val Gln Leu Ser Tyr130 135 140Ile Ser Phe Gln145<210>4<211>146<212>PRT<213>智人<400>4Thr Pro Ala Ile Pro Pro Met Met Tyr Pro His Pro Ala Tyr Pro Met1 5 10 15Pro Phe Ile Thr Thr Ile Leu Gly Gly Leu Tyr Pro Ser Lys Ser Ile20 25 30Leu Leu Ser Gly Thr Val Leu Pro Ser Ala Gln Arg Phe His Ile Asn35 40 45
Leu Cys Ser Gly Asn His Ile Ala Phe His Leu Asn Pra Arg Phe Asp50 55 60Glu Asn Ala Val Val Arg Asn Thr Gln Ile Asp Asn Ser Trp Gly Ser65 70 75 80Glu Glu Arg Ser Leu Pro Arg Lys Met Pro Phe Val Arg Gly Gln Ser85 90 95Phe Ser Val Trp Ile Leu Cys Glu Ala His Cys Leu Lys Val Ala Val100 105 110Asp Gly Gln His Leu Phe Glu Tyr Tyr His Arg Leu Arg Asn Leu Pro115 120 125Thr Ile Asn Arg Leu Glu Val Gly Gly Asp Ile Gln Leu Thr His Val130 135 140Gln Thr145<210>5<211>972<212>DNA<213>智人<220>
<221>CDS<222>(1)..(972)<223>半乳凝素9的M型同工型(galectin-9 medium isoform)<400>5atg gcc ttc agc ggt tcc cag gct ccc tac ctg agt cca gct gtc ccc 48Met Ala Phe Ser Gly Ser Gln Ala Pro Tyr Leu Ser Pro Ala Val Pro1 5 10 15
ttt tct ggg act att caa gga ggt ctc cag gac gga ctt cag atc act 96Phe Ser Gly Thr Ile Gln Gly Gly Leu Gln Asp Gly Leu Gln Ile Thr20 25 30gtc aat ggg acc gtt ctc agc tcc agt gga acc agg ttt gct gtg aac 144Val Asn Gly Thr Val Leu Ser Ser Ser Gly Thr Arg Phe Ala Val Asn35 40 45ttt cag act ggc ttc agt gga aat gac att gcc ttc cac ttc aac cct 192Phe Gln Thr Gly Phe Ser Gly Asn Asp Ile Ala Phe His Phe Asn Pro50 55 60cgg ttt gaa gat gga ggg tac gtg gtg tgc aac acg agg cag aac gga 240Arg Phe Glu Asp Gly Gly Tyr Val Val Cys Asn Thr Arg Gln Asn Gly65 70 75 80agc tgg ggg ccc gag gag agg aag aca cac atg cct ttc cag aag ggg 288Ser Trp Gly Pro Glu Glu Arg Lys Thr His Met Pro Phe Gln Lys Gly85 90 95atg ccc ttt gac ctc tgc ttc ctg gtg cag agc tca gat ttc aag gtg 336Met Pro Phe Asp Leu Cys Phe Leu Val Gln Ser Ser Asp Phe Lys Val100 105 110atg gtg aac ggg atc ctc ttc gtg cag tac ttc cac cgc gtg ccc ttc 384Met Val Asn Gly Ile Leu Phe Val Gln Tyr Phe His Arg Val Pro Phe115 120 125cac cgt gtg gac acc atc tcc gtc aat ggc tct gtg cag ctg tcc tac 432His Arg Val Asp Thr Ile Ser Val Asn Gly Ser Val Gln Leu Ser Tyr130 135 140atc agc ttc cag cct ccc ggc gtg tgg cct gcc aac ccg gct ccc att 480Ile Ser Phe Gln Pro Pro Gly Val Trp Pro Ala Asn Pro Ala Pro Ile145 150 155 160acc cag aca gtc atc cac aca gtg cag agc gcc cct gga cag atg ttc 528Thr Gln Thr Val Ile His Thr Val Gln Ser Ala Pro Gly Gln Met Phe165 170 175tct act ccc gcc atc cca cct atg atg tac ccc cac ccc gcc tat ccg 576Ser Thr Pro Ala Ile Pro Pro Met Met Tyr Pro His Pro Ala Tyr Pro180 185 190
atg cct ttc atc acc acc att ctg gga ggg ctg tac cca tcc aag tcc 624Met Pro Phe Ile Thr Thr Ile Leu Gly Gly Leu Tyr Pro Ser Lys Ser195 200 205atc ctc ctg tca ggc act gtc ctg ccc agt gct cag agg ttc cac atc 672Ile Leu Leu Ser Gly Thr Val Leu Pro Ser Ala Gln Arg Phe His Ile210 215 220aac ctg tgc tct ggg aac cac atc gcc ttc cac ctg aac ccc cgt ttt 720Asn Leu Cys Ser Gly Asn His Ile Ala Phe His Leu Asn Pro Arg Phe225 230 235 240gat gag aat gct gtg gtc cgc aac acc cag atc gac aac tcc tgg ggg 768Asp Glu Asn Ala Val Val Arg Asn Thr Gln Ile Asp Asn Ser Trp Gly245 250 255tct gag gag cga agt ctg ccc cga aaa atg ccc ttc gtc cgt ggc cag 816Ser Glu Glu Arg Ser Leu Pro Arg Lys Met Pro Phe Val Arg Gly Gln260 265 270agc ttc tca gtg tgg atc ttg tgt gaa gct cac tgc ctc aag gtg gcc 864Ser Phe Ser Val Trp Ile Leu Cys Glu Ala His Cys Leu Lys Val Ala275 280 285gtg gat ggt cag cac ctg ttt gaa tac tac cat cgc ctg agg aac ctg 912Val Asp Gly Gln His Leu Phe Glu Tyr Tyr His Arg Leu Arg Asn Leu290 295 300ccc acc atc aac aga ctg gaa gtg ggg ggc gac atc cag ctg acc cat 960Pro Thr Ile Asn Arg Leu Glu Val Gly Gly Asp Ile Gln Leu Thr His305 310 315 320gtg cag aca tag 972Val Gln Thr<210>6<211>323<212>PRT<213>智人<400>6
Met Ala Phe Ser Gly Ser Gln Ala Pro Tyr Leu Ser Pro Ala Val Pro1 5 10 15Phe Ser Gly Thr Ile Gln Gly Gly Leu Gln Asp Gly Leu Gln Ile Thr20 25 30Val Asn Gly Thr Val Leu Ser Ser Ser Gly Thr Arg Phe Ala Val Asn35 40 45Phe Gln Thr Gly Phe Ser Gly Asn Asp Ile Ala Phe His Phe Asn Pro50 55 60Arg Phe Glu Asp Gly Gly Tyr Val Val Cys Asn Thr Arg Gln Asn Gly65 70 75 80Ser Trp Gly Pro Glu Glu Arg Lys Thr His Met Pro Phe Gln Lys Gly85 90 95Met Pro Phe Asp Leu Cys Phe Leu Val Gln Ser Ser Asp Phe Lys Val100 105 110Met Val Asn Gly Ile Leu Phe Val Gln Tyr Phe His Arg Val Pro Phe115 120 125His Arg Val Asp Thr Ile Ser Val Asn Gly Ser Val Gln Leu Ser Tyr130 135 140Ile Ser Phe Gln Pro Pro Gly Val Trp Pro Ala Asn Pro Ala Pro Ile145 150 155 160Thr Gln Thr Val Ile His Thr Val Gln Ser Ala Pro Gly Gln Met Phe165 170 175
Ser Thr Pro Ala Ile Pro Pro Met Met Tyr Pro His Pro Ala Tyr Pro180 185 190Met Pro Phe Ile Thr Thr Ile Leu Gly Gly Leu Tyr Pro Ser Lys Ser195 200 205Ile Leu Leu Ser Gly Thr Val Leu Pro Ser Ala Gln Arg Phe His Ile210 215 220Asn Leu Cys Ser Gly Asn His Ile Ala Phe His Leu Asn Pro Arg Phe225 230 235 240Asp Glu Asn Ala Val Val Arg Asn Thr Gln Ile Asp Asn Ser Trp Gly245 250 255Ser Glu Glu Arg Ser Leu Pro Arg Lys Met Pro Phe Val Arg Gly Gln260 265 270Ser Phe Ser Val Trp Ile Leu Cys Glu Ala His Cys Leu Lys Val Ala275 280 285Val Asp Gly Gln His Leu Phe Glu Tyr Tyr His Arg Leu Arg Asn Leu290 295 300Pro Thr Ile Asn Arg Leu Glu Val Gly Gly Asp Ile Gln Leu Thr His305 310 315 320Val Gln Thr<210>7<211>61<212>PRT
<213>智人<400>7Asn Pro Arg Thr Val Pro Val Gln Pro Ala Phe Ser Thr Val Pro Phe1 5 10 15Ser Gln Pro Val Cys Pho Pro Pro Arg Pro Arg Gly Arg Arg Gln Lys20 25 30Pro Pro Gly Val Trp Pro Ala Asn Pro Ala Pro Ile Thr Gln Thr Val35 40 45Ile His Thr Val Gln Ser Ala Pro Gly Gln Met Phe Ser50 55 60<210>8<211>29<212>PRT<213>智人<400>8Pro Pro Gly Val Trp Pro Ala Asn Pro Ala Pro Ile Thr Gln Thr Val1 5 10 15Ile His Thr Val Gln Ser Ala Pro Gly Gln Met Phe Ser20 25<210>9<211>17<212>PRT<213>智人<400>9Thr Gln Thr Val Ile His Thr Val Gln Ser Ala Pro Gly Gln Met Phe1 5 10 15
Ser<210>10<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用作PCR引物的寡核苷酸<400>10cgtcctcaata tggccttcag cggttcccag 30<210>11<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用作PCR引物的寡核苷酸<400>11cgaccgcata tgctggaagc tgatgtagga cag 33<210>12<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用作PCR引物的寡核苷酸<400>12cgtcctcata tgactcccgc catcccacct atg 33<210>13<211>33
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用作PCR引物的寡核苷酸<400>13cgaccgggat ccctatgtct gcacatgggt cag 3權(quán)利要求
1.蛋白質(zhì)或其鹽，其特征是半乳凝素9或基本上具有與半乳凝素9同等活性的蛋白質(zhì)的連接肽或其附近區(qū)域被改變。
2.權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)或其鹽，其特征是改變由在半乳凝素9或基本上具有與半乳凝素9同等活性的蛋白質(zhì)的連接肽或其附近區(qū)域的氨基酸序列中缺失、取代或添加的1個(gè)或1個(gè)以上的氨基酸的氨基酸序列形成，與半乳凝素9比較，至少對于連接肽的分解敏感性被改變。
3.權(quán)利要求1或2所述的蛋白質(zhì)或其鹽，其特征是基本上具有與半乳凝素9同等活性的蛋白質(zhì)與半乳凝素9的氨基酸序列至少具有70％以上同源性。
4.權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)或其鹽，其特征是(1)和(2)借助于(3)連接，其中(1)為具有半乳凝素9的N末端側(cè)的糖鏈識(shí)別區(qū)域(NCRD)或與該區(qū)域具有基本上同等活性的多肽；(2)為具有半乳凝素9的C末端側(cè)的糖鏈識(shí)別區(qū)域(CCRD)或基本上與該區(qū)域具有同等活性的多肽；(3)為在半乳凝素9的連接肽的氨基酸序列中缺失、取代或添加的1個(gè)或1個(gè)以上的氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的改變連接肽。
5.權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)或其鹽，其特征是(1)和(2)借助于(3)連接，其中(1)為具有序列3所示的氨基酸序列的多肽或基本上與它具有同等活性、且具有與序列3所示的氨基酸序列至少70％以上同源性的氨基酸序列的多肽，或具有在序列3所示的氨基酸序列中至少缺失、取代或添加1～8個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列的多肽；(2)為具有序列4所示的氨基酸序列的多肽或基本上與它具有同等活性、且具有與序列4所示的氨基酸序列至少70％以上同源性的氨基酸序列的多肽，或具有在序列3所示的氨基酸序列中至少缺失、取代或添加1～21個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列的多肽；(3)為在序列7～9中任一個(gè)序列表示的氨基酸序列中缺失(不過，序列7中的1～32以及1～44的缺失、和序列8中1～12的缺失除外)、取代或添加1個(gè)或1個(gè)以上的氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的改變連接肽。
6.一種核酸，其特征是具有編碼權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)的堿基序列。
7.權(quán)利要求6所述的核酸，其特征是聚核苷酸。
8.權(quán)利要求6或7所述的核酸，其特征是DNA或RNA。
9.一種重組載體，其特征是含有權(quán)利要求6～8任一項(xiàng)所述的核酸。
10.權(quán)利要求9所述的重組載體，其特征是除了含有權(quán)利要求6～8任一項(xiàng)所述的核酸外，還含有編碼標(biāo)記蛋白質(zhì)和/或肽的堿基序列。
11.一種轉(zhuǎn)化體，其特征是含有權(quán)利要求6～8任一項(xiàng)所述的核酸或權(quán)利要求9或10所述的重組載體。
12.權(quán)利要求11所述的轉(zhuǎn)化體，其特征是轉(zhuǎn)化體宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
13.一種藥物，其特征是作為有效成分含有從權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)、權(quán)利要求6～8中任一項(xiàng)所述的核酸、權(quán)利要求9或10所述的重組載體和權(quán)利要求11或12所述的轉(zhuǎn)化體中選擇的成分。
14.權(quán)利要求13所述的藥物，其特征是免疫調(diào)節(jié)劑。
15.權(quán)利要求13所述的藥物，其特征是抗腫瘤藥。
16.權(quán)利要求15所述的藥物，其特征是抗來自于包含腦腫瘤(多形形惡性膠質(zhì)瘤等)、脊髓腫瘤、上顎洞癌、胰液腺癌、齒肉癌、舌癌、口唇癌、上咽癌、中咽癌、下咽癌、喉頭癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、肺癌、胸膜腫瘤、癌性腹膜炎、癌性胸膜炎、食道癌、胃癌、大腸癌、膽管癌、膽囊癌、胰臟癌、肝癌、腎臟癌、膀胱癌、前列腺癌、陰莖癌、精巢腫瘤、腎上腺癌、子宮頸癌、子宮體癌、陰道癌、外陰癌、卵巢癌、纖毛上皮瘤、惡性骨腫瘤、軟部肉瘤、乳癌、皮膚癌、惡性黑色素瘤、基底細(xì)胞瘤、白血病、伴隨骨髓化性的骨髓纖維癥、惡性淋巴瘤、惡性淋巴肉芽腫病、漿細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等癌和肉瘤的腫瘤的抗腫瘤藥。
17.權(quán)利要求13所述的藥物，其特征是該藥物是針對下面疾患或疾病、或病的癥狀的藥物(A)炎癥性疾患，來自于在各臟器中發(fā)生的各種急性和慢性炎癥、變態(tài)性和自身免疫性炎癥、感染癥等中的疾??；(B)急性和慢性疾患，來自于包括支氣管炎、支氣管肺炎、間質(zhì)性肺炎、肺炎、細(xì)支氣管炎、急性縱隔炎的肺的疾患、包括心外膜炎、心內(nèi)膜炎、心肌炎、口內(nèi)炎、口角炎、扁桃炎、咽炎、喉頭炎、食道炎、腹膜炎、急性胃炎、慢性胃炎、急性腸炎、蟲垂炎、缺血性大腸炎、藥物性大腸炎、直腸炎在內(nèi)的肺以外的其它臟器的疾患、包括A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、重癥肝炎、急性和慢性肝炎以及肝硬變、膽囊炎、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、急性和慢性腎炎、膜性腎炎、絲球體腎炎、IgA腎癥、各種膀胱炎、腦髓炎、乳腺炎、皮炎、表層角膜炎、干性角結(jié)膜炎、中耳炎和鼻炎、副鼻腔炎和鼻茸、牙肉炎、牙周炎、牙周圍炎在內(nèi)的炎癥等疾??；(C)來自于神經(jīng)性炎癥(例如、神經(jīng)性胃炎、神經(jīng)性膀胱炎等)、癌或伴隨炎癥疼痛的疾病；(D)變態(tài)性炎癥疾患，全身性過敏性、支氣管哮喘、過敏性肺炎、花粉癥、變態(tài)性鼻炎、變態(tài)性結(jié)膜炎、免疫復(fù)合體引起的變態(tài)性疾患、血管神經(jīng)性浮腫等在內(nèi)的疾??；(E)自身免疫性的炎癥(自身免疫疾患)，來自于全身性(慢性關(guān)節(jié)風(fēng)濕病、全身性紅斑狼瘡、結(jié)節(jié)性多發(fā)性動(dòng)脈炎、強(qiáng)皮癥、多發(fā)性肌炎·皮膚肌炎、肖格倫綜合征、貝切特病等)、神經(jīng)系(多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力癥、HAM(HTLV-1脊髓癥)、肌萎縮性側(cè)索硬化癥等)、內(nèi)分泌性(巴澤多病、橋本病、1型糖尿病等)、血液(特發(fā)性血小板減少性紫斑病、自身免疫性溶血性貧血、再生不良性貧血等)、呼吸器(結(jié)節(jié)病、肺纖維癥等)、消化管(潰瘍性大腸炎、克羅恩病等)、肝臟(自身免疫性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變、原發(fā)性硬化性膽管炎、自身免疫性膽管炎等)、腎·尿路系(抗嗜中性白細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)抗體相關(guān)腎炎、血管炎、肺腎綜合征(Goodpasture)、抗絲球體基底膜抗體病等)等疾病；(F)感染癥，由于病原體傷害生物體的細(xì)胞·組織·臟器產(chǎn)生的疾患、或起因于給人帶來感染癥的病原體的疾患，病原體來自于1)細(xì)菌(包括螺旋體、衣原體、立克次體)、2)病毒、3)真菌、4)植物(藻類)、5)原蟲、6)寄生蟲(吸蟲、條蟲、線蟲)、7)節(jié)足動(dòng)物，包括細(xì)菌性感染癥(霍亂、瘟疫、大腸桿菌感染癥等)、螺旋體感染癥(鉤端螺旋體病等)、衣原體感染癥(鸚鵡病等)、立克次體感染癥(斑疹傷寒、破傷風(fēng)等)、病毒性感染癥(帶狀皰疹、病毒性出血熱、狂犬病等)、真菌癥(念珠菌病、隱球菌病、曲霉菌病等)、原蟲性疾患(阿米巴性痢疾、瘧疾、弓形體病等)、寄生蟲(吸蟲癥、線蟲癥等)、此外還包括支原體感染癥(支原體肺炎等)、分支桿菌感染癥(結(jié)核、非定型抗酸菌癥等)疾?。?G)皮膚科領(lǐng)域的疾患，i)皮膚感染癥、包括變態(tài)性炎癥和自身免疫性炎癥等在內(nèi)的皮炎癥，干癬、水皰癥、膿皰癥、角化、角化異常癥等具有特有炎癥的皮膚疾患、ii)來自于由于美容皮膚科相關(guān)的損傷或老化，與a)黑色素代謝調(diào)節(jié)(美白)、b)毛發(fā)成長(生發(fā))的調(diào)節(jié)、c)膠原產(chǎn)生調(diào)節(jié)有關(guān)的皮膚科領(lǐng)域的疾患(包括老化)；(H)生活習(xí)慣病，來自于包括高脂血癥、動(dòng)脈硬化癥、高血壓、糖尿病等在內(nèi)的疾??；(I)有關(guān)正常細(xì)菌叢的維持的異常；(J)來自于包括淀粉樣變性、阿爾茨海默病、骨質(zhì)疏松癥、骨折等在內(nèi)的疾??；(K)腦、神經(jīng)領(lǐng)域中的炎癥反應(yīng)，例如伴隨著腦梗塞、心肌梗塞等缺血性病變的進(jìn)展出現(xiàn)的炎癥、綜合失調(diào)癥；(L)痛風(fēng)；(M)骨質(zhì)疏松癥；或(N)間質(zhì)性肺炎。
18.分析或檢查試劑，特征是作為有效成分含有選自于權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)、權(quán)利要求6～8中任一項(xiàng)所述的核酸、權(quán)利要求9或10所述的重組載體以及權(quán)利要求11或12所述的轉(zhuǎn)化體的成分。
全文摘要
以大腸桿菌作為宿主生產(chǎn)的重組體半乳凝素9表明通過對腫瘤細(xì)胞的直接作用(誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞間粘附與凋亡的活性)和借助于免疫系的作用，具有抑制癌的轉(zhuǎn)移和誘導(dǎo)萎縮，而且對非活化淋巴細(xì)胞沒有作用，誘導(dǎo)活化T細(xì)胞、特別是成為過剩免疫反應(yīng)原因的CD4陽性T細(xì)胞的凋亡，以及對與風(fēng)濕病中關(guān)節(jié)的變形等有關(guān)的滑膜細(xì)胞具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)凋亡能力，重組體半乳凝素9由于連接兩個(gè)CRD的連接區(qū)對蛋白水解酶的敏感性提高，所以非常容易被酶消化，喪失上述活性，為了進(jìn)一步研究需要更穩(wěn)定型的分子。通過改變連接半乳凝素9的兩個(gè)CRD的連接區(qū)，可得到避免對上述活性造成惡影響，而且穩(wěn)定性提高的改變分子。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1957082SQ20058001044
公開日2007年5月2日 申請日期2005年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月29日
發(fā)明者西望, 平島光臣, 山內(nèi)清明, 伊藤愛子 申請人:株式會(huì)社嘉爾藥物