專利名稱：聚乙二醇化的t1249多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及聚乙二醇化的T1249多肽化合物，還涉及使用和制備此類化合物的方法，例如在藥物組合物中使用和制備此類化合物的方法，并且還涉及進(jìn)行治療的治療性方法。
一些病毒，尤其是HIV，必須經(jīng)過一個稱為融合的復(fù)雜過程以進(jìn)入宿主細(xì)胞和繁殖。在融合過程中，病毒的外膜與宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜融合。在HIV的情況下，HIV病毒的外膜與繁殖期間的CD4+T細(xì)胞的細(xì)胞膜融合。
T1249是一類新的抑制病毒/細(xì)胞膜融合的抗病毒劑中的一員。在為HIV的情況下，其提供兩方面有益的作用阻斷HIV的繁殖并且不會發(fā)生由此引起的CD4+T細(xì)胞死亡。
在目前的HIV臨床治療手段中，對新近批準(zhǔn)的抗HIV藥物產(chǎn)生病毒抗性是一個突出問題。隨著時間的推移，開始聯(lián)合使用新近批準(zhǔn)的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療的許多患者都會對這些藥物中的一種或更多種產(chǎn)生抗性。但是，研究表明，T1249不受對任一目前批準(zhǔn)的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒類藥物所產(chǎn)生的抗性的影響。(所述數(shù)據(jù)在2001年6月4-8日于亞利桑那州斯科茨代爾舉行的第5屆國際藥物抗性和治療策略的會議上給出)。
臨床試驗(yàn)中對T1249劑量范圍的分析表明之前沒有經(jīng)歷抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療，其中包括對所有批準(zhǔn)的HIV藥物類型的突變而言，T1249的日劑量是唯一與經(jīng)歷治療患者中病毒載量降低相關(guān)的變量。其他實(shí)驗(yàn)表明T1249的體外活性不受對逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑及蛋白酶抑制劑抗性相關(guān)突變的影響。
象許多多肽治療劑一樣，T1249通常經(jīng)注射施用。目前的治療方案通常涉及一天多于一次的注射。
所以，提供具有較高性能和藥物動力學(xué)特性的T1249多肽及藥物組合物是有利的。能提供較低T1249治療劑量、較少施用頻率和/或具有作用持續(xù)時間延長的T1249是尤其有利的。
以下更詳細(xì)地描述了本發(fā)明的這些和其他目的。
本發(fā)明提供了下式的化合物 其中R1為封端基團(tuán)，m為1-17，n為10-1,000，p從1-3，且NHT1249為通過其末端α-氨基共價連接的T1249多肽。
在本發(fā)明化合物的一個實(shí)施方案中，R1為甲氧基，m為1，n為100-750，p為3。
還提供了藥物組合物，其包含與可藥用賦形劑混合的式(I)化合物，其中R1、m、n、p和NHT1249如上所述。
在本發(fā)明藥物組合物的一個實(shí)施方案中，R1為甲氧基，m為1，n為100-750，且p為3。
本發(fā)明還提供了抑制HIV感染的方法，包括施用包含與可藥用賦形劑混合的式(I)化合物的藥物組合物，其中R1、m、n、p和NHT1249如上所述。如果本發(fā)明涉及“包含一種化合物的抑制HIV感染的方法”是指“使用化合物來制備抑制HIV的藥物”。
抑制HIV感染方法的一個實(shí)施方案中，R1為甲氧基，m為1，n為100-750，p為3。
還提供了產(chǎn)生聚乙二醇化T1249多肽的方法，其包括使T1249多肽與下式的聚乙二醇醛反應(yīng)
其中R1、m、n、n和p如上所述，以產(chǎn)生公式(I)的化合物，其中聚乙二醇醛分子與T1249多肽的N末端氨基連接。如果本發(fā)明提到“制備…方法”是指“制備…過程”。


圖1顯示了PEG修飾的和未修飾的T1249多肽經(jīng)酶促消化的比較。也顯示了用內(nèi)切蛋白酶Lys-C的消化和隨后用反相HPLC的分離。
圖2顯示了收集的HPLC PEG-34級分(圖1)的基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時間(MALDI TOF)質(zhì)譜。光譜通過使用反-3-吲哚丙烯酸作為基質(zhì)的線性方式獲得。
圖3顯示了收集的HPLC PEG-34級分(圖1)的N-端(Edman)測序。
圖4顯示了一次皮下劑量施用之后大鼠中mPEG20k-CMAB-T1249的濃度-時間分布圖。
圖5顯示了一次皮下劑量施用之后大鼠中T1249的濃度-時間分布圖。
圖6顯示了T1249和mPEG20k-CMAB-T1249施藥對SCID小鼠中HIV-1病毒載量的影響。
如上所提到的，T1249是“融合抑制劑”多肽。T1249由39個氨基酸組成。T1249的多肽序列是WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF[SEQ.ID.NO1]N-末端(或氨基端)的氨基酸是色氨酸(W)。C-末端(或羧基端)的氨基酸是苯丙氨酸(F)。
如美國專利號6,348,568表1中(Seq.ID No.1071)所述(在此全部引用作為參考)T1249多肽序列可在其氨基端和羧基端之一端或兩端封閉/衍生。如美國專利號6,348,568中所述，色氨酸氨基端可由?；忾]/衍生，苯丙氨酸羧基端可由氨基封閉/衍生(后者造成-COOH到-CONH2的變換)。
正如在此使用的，“T1249”應(yīng)理解是指[SEQ.ID.NO1]，其任選地在苯丙氨酸C末端用氨基封閉。也就是說，當(dāng)談及“T1249”時，苯丙氨酸C末端或者是-COOH或者是-CONH2。
本發(fā)明提供了下式的聚乙二醇化T1249化合物 其中R1為封端基團(tuán)，m為1-17，n為10-1,000，p為1-3，且NHT1249是通過其末端α-氨基共價連接的T1249多肽。
正如在此使用的，R1“封端基團(tuán)”可以是任一適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)基團(tuán)，根據(jù)優(yōu)選，其通常與其他化學(xué)成分反應(yīng)或不反應(yīng)。在上面的化合物中，聚乙二醇與T1249的α-氨基共價連接。選擇R1封端基團(tuán)是為了允許或阻止雙官能性，例如，與第二目的化學(xué)成分的共價連接。
在封端基團(tuán)通常不與其他化學(xué)成分反應(yīng)的情況下，R1具有相當(dāng)?shù)亩栊裕虼瞬粫c另一化學(xué)成分共價連接。通常適當(dāng)?shù)姆欠磻?yīng)性R1封端基團(tuán)包括氫、羥基、低級烷基、低級烷氧基、低級環(huán)烷基、低級鏈烯基、低級環(huán)鏈烯基、芳基和雜芳基。
正如在此使用的，術(shù)語“低級烷基”的意思是直鏈或支鏈烷基，其包含1-7個碳原子，優(yōu)選的是1-4個，例如，甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己基、正庚基等等?！暗图壨榛比芜x地用一個或多個這樣的基團(tuán)取代，所述基團(tuán)獨(dú)立地選自鹵素、低級烷基、低級烷氧基、低級環(huán)烷基、低級鏈烯基、低級環(huán)鏈烯基、芳基和雜芳基。
術(shù)語“低級烷氧基”是指如以前定義的通過氧原子連接的低級烷基，低級烷氧基的例子有甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基等等。“低級烷氧基”任選地用一個或多個這樣的基團(tuán)取代，所述基團(tuán)獨(dú)立地選自鹵素、低級烷基、低級烷氧基、低級環(huán)烷基、低級鏈烯基、低級環(huán)鏈烯基、芳基和雜芳基。
術(shù)語“低級環(huán)烷基”是指含有3-7個優(yōu)選4-6個碳原子的環(huán)烷基，即環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基或環(huán)庚基?！暗图壄h(huán)烷基”任選地用一個或多個這樣的基團(tuán)取代，所述基團(tuán)獨(dú)立地選自鹵素、低級烷基、低級烷氧基、低級環(huán)烷基、低級鏈烯基、低級環(huán)鏈烯基、芳基和雜芳基。
正如在此使用的，術(shù)語“低級鏈烯基”是指含有2-7個優(yōu)選2-5個碳原子的直鏈或支鏈烯基，例如乙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基等等?！暗图夋溝┗比芜x地用一個或多個這樣的基團(tuán)取代，所述基團(tuán)獨(dú)立地選自鹵素、低級烷基、低級烷氧基、低級環(huán)烷基、低級鏈烯基、低級環(huán)鏈烯基、芳基和雜芳基。
術(shù)語“低級環(huán)鏈烯基”是指是含有4-7個碳原子的環(huán)鏈烯基，例如環(huán)丁烯基、環(huán)戊烯基、環(huán)己烯基等等?！暗图壄h(huán)鏈烯基”任選地用一個或多個這樣的基團(tuán)取代，所述基團(tuán)獨(dú)立地選自從鹵素、低級烷基、低級烷氧基、低級環(huán)烷基、低級鏈烯基、低級鏈烯基、芳基和雜芳基。
術(shù)語“芳基”是指這樣的苯基或萘基，其未發(fā)生取代或任選地由鹵素、低級烷基、低級烷氧基、三氟甲基、羥基、羧酸、羧酸酯、硝基、氨基或苯基單取代或多取代，特別是由鹵素、低級烷基、低級烷氧基、三氟甲基、羥基、硝基、氨基和苯基單取代或多取代。
術(shù)語“雜芳基”是指含有選自N、S和O的一個或多個雜原子的5或6元雜芳基，其還可能是苯并的和/或以如前所述“芳基”同樣的方式發(fā)生取代。
通常優(yōu)選的非反應(yīng)性R1封端基團(tuán)包括甲氧基、羥基或芐氧基。特別優(yōu)選的R1封端基團(tuán)是甲氧基。當(dāng)R1為甲氧基時，聚乙二醇化的多肽化合物有時在此指“mPEG”化合物，其中m代表甲氧基。
如果R1封端基團(tuán)通常與其他化學(xué)成分反應(yīng)，那么R1就是能與一些官能團(tuán)反應(yīng)的官能團(tuán)，如肽和/或蛋白質(zhì)中的胺和/或巰基。在這種情況下，R1可為易于與其他分子上的親電或親核基團(tuán)反應(yīng)的官能團(tuán)，與那些需要強(qiáng)催化劑或苛刻的反應(yīng)條件才能反應(yīng)的基團(tuán)形成對比。如果R1是相對活躍的，聚乙二醇醛可以與另一化學(xué)成分共價連接。
通常適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)性R1封端基團(tuán)的例子包括鹵素、環(huán)氧化物、馬來酰亞胺、二硫化鄰吡啶(orthopyridyl disulfide)、甲苯磺酸酯、異氰酸酯、水合肼、氰尿酰鹵化物、N-琥珀酰亞胺基氧基、硫代-N-琥珀酰亞胺基氧基、1-苯并三唑基氧基、1-咪唑基氧基、對硝基苯基氧基和 術(shù)語鹵素是指氟、氯、溴或碘。通常優(yōu)選的反應(yīng)性R1封端基團(tuán)是 當(dāng)此R1封端基團(tuán)存在時，應(yīng)當(dāng)理解為在本發(fā)明的化合物中，式中第一個m、n和/或p可以與第二個m、n和/或p相同或不同。然而優(yōu)選的是兩個m具有相同的數(shù)值，兩個n具有相同的數(shù)值，兩個p具有相同的數(shù)值。
在本發(fā)明中，m為1-17。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，m為1-14。更優(yōu)選的，m為1-7。甚至更優(yōu)選的m為1-4。最優(yōu)選的m為1。
在本發(fā)明中，n為10-1,000。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中n為20-1,000。優(yōu)選的n為50-1,000，甚至更優(yōu)選的n為75-1,000，最優(yōu)選的n為100-750。
在本發(fā)明中p為1-3。優(yōu)選的p為3。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，p為3，R1為甲氧基，m為1，n為100-750；或者p為2，R1為甲氧基，m為1，n為100-750；或者p為1，R1為甲氧基，m為1，n為100-750。
本發(fā)明提供了式(I)的實(shí)施方案，其中R1為甲氧基，m為1，n為100-750，p為3，NHT1249為通過其末端α-氨基共價連接的T1249多肽。
如上所提到的，本發(fā)明聚乙二醇化的T1249多肽化合物共價連接T1249的α-氨基基團(tuán)到具特定結(jié)構(gòu)的聚乙二醇衍生物上。這些聚乙二醇化的化合物可以以任何需要的方式生產(chǎn)，但通常通過使T1249與單獨(dú)制備的聚乙二醇衍生物反應(yīng)來制備。例如，T1249多肽可通過封閉所有賴氨酸殘基和使封閉的T1249與聚乙二醇衍生物反應(yīng)來聚乙二醇化。然后對T1249封閉的賴氨酸殘基去封閉，得到末端聚乙二醇化的T1249。
T1249多肽可以以任何合適的方式制備。例如，此化合物可以這樣合成使用常規(guī)的Merrifield固相合成技術(shù)，其涉及利用Boc-氨基酸的固相方法(Chem.Soc.，85，2149，1963)通過手工和自動化步驟合成，還有使用Fmoc-氨基酸的固相方法(Sheppard，R.C.等，J.Chem.Soc.Chem.Comm.，165-166頁(1985))，用從Advanced Chemtech.，Louisville，Ky.購買的200型Advanced Chemtech，用從Millipore，Bedford Mass購買的Millipore 9050+或其他有用的儀器合成。
T1249可以通過將編碼本發(fā)明化合物的cDNA導(dǎo)入有功能的病毒或環(huán)狀質(zhì)粒DNA載體來產(chǎn)生。載體或質(zhì)?？梢杂脕磙D(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化所選擇的微生物。轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的微生物在有益于表達(dá)載體所帶DNA條件下培養(yǎng)，然后就能從生長培養(yǎng)基中分離需要的多肽(例如，見美國專利號5,955,422，在此全部引用作為參考)。
T1249也可以通過標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)，使用本領(lǐng)域中眾所周知的技術(shù)來制備。例如Sambrook等描述的方法，Molecular CloningA laboratoryManual，第二版，(Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)或者Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley和Sons，New York(1995)，它們在此引用作為參考。
產(chǎn)生T1249的特定方法于在此引用的美國專利號6,258,7872和美國專利號6,348,568中闡述，其均在此引用作為參考。
T1249在解離和去保護(hù)之后，可以通過任何適當(dāng)?shù)氖侄渭兓?。例如，離子交換、凝膠過濾層析和/或反相柱/HPLC系統(tǒng)可以用來從其片段中純化全長T1249。在最初制備的T1249前體帶有與N-端相連的封閉或保護(hù)基團(tuán)(如?；?和/或與C-端相連的封閉或保護(hù)基團(tuán)(如氨基)的情況下，能用已知的技術(shù)去掉一個或兩個這些基團(tuán)。
T1249的氨基酸序列可以用標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸分析法和手動和自動化的Edman降解法來確認(rèn)和鑒別確定每一個氨基酸。也可以用HPLC分析法和質(zhì)譜法來確證T1249的產(chǎn)生。
能與T1249 反應(yīng)的聚乙二醇醛化合物也可以以任何需要的方式生產(chǎn)。然而優(yōu)選的是聚乙二醇可以根據(jù)2002年7月24日申請的美國專利申請順序號60/398,196中描述的方法生產(chǎn)，標(biāo)題為“聚乙二醇醛”，在此全部引用作為參考。
通常，下式的聚乙二醇醛用于聚乙二醇化T1249 其中R1、m、n和p如上所述，用于聚乙二醇化T1249的聚乙二醇醛可以通過任何合適的手段制備。一個優(yōu)選的聚乙二醇醛如下所述得到制備mPEG10k-丁醛反應(yīng)方案
不同大小的聚乙二醇醛(例如n值不同)可以按照以上的反應(yīng)圖解來制備。
本發(fā)明聚乙二醇化的T1249化合物可以通過任何適當(dāng)?shù)氖侄沃苽?。本發(fā)明還提供了使T1249多肽聚乙二醇化的方法，其包括使T1249多肽NHT1249與下式的聚乙二醇醛反應(yīng) 其中R1、m、n、p如上所述，以產(chǎn)生下式的化合物R1-(CH2CH2O)n-CH2CH2-O-(CH2)m-CO-NH-(CH2)p-CH2-NHT1249(I)其中聚乙二醇醛分子與T1249多肽的N-端氨基連接。
聚乙二醇化的T1249通過加入摩爾比從1∶1到1∶100的T1249和聚乙二醇試劑來制備。如上所討論的，T1249具有游離α-氨基(去掉所有酰基)以及游離羧基或氨基保護(hù)的羧基。反應(yīng)混合物在5.5-7.4pH值范圍的硼酸鹽或磷酸鹽緩沖液中于室溫或4℃放置約0.5到24小時。聚乙二醇試劑與肽/蛋白質(zhì)的摩爾比在1∶1到100∶1之間。肽/蛋白質(zhì)的濃度為1-10毫克/毫升。緩沖液的濃度通常為10-500mM。
聚乙二醇化的T1249通過取出聚乙二醇化的T1249反應(yīng)混合物，然后用平衡緩沖液(20mM Tris，pH值7.5)稀釋來純化。將得到的混合物過Q-瓊脂糖柱。得到的混合物加入QA柱之后，用平衡緩沖液洗；75M NaCl洗脫；200mMNaCl洗脫；1M NaCl洗脫；用1M HOAC+1M NaCl和0.5NaOH再生。
通過使用反相HPLC，可能容易地從混合物的其他副產(chǎn)物中分離和離析N-端單聚乙二醇化的產(chǎn)物。例如，在聚乙二醇化的T1249的色譜層析中，會有多個峰形成，每一峰具有不同的存留時間。第一個峰可能代表未反應(yīng)的多肽，在10.7分鐘時出現(xiàn)，第二個峰可能代表單聚乙二醇化的多肽，在17.6分鐘時出現(xiàn)，然后是雙聚乙二醇化的多肽，在19分鐘時出現(xiàn)。每一份收集的產(chǎn)物通過基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時間(MALDI TOF)質(zhì)譜來驗(yàn)證。
在本發(fā)明聚乙二醇化的T1249多肽的優(yōu)選實(shí)施方案中，p為3，R1為甲基，m為1，n為100-750；或者p為2，R1為甲氧基，m為1，n為100-750；或者p為1，R1為甲氧基，m為1，n為100-750。
本發(fā)明還提供了下式的聚乙二醇化的T1249多肽CH3-C-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-NHT1249(III)其中n為10-1,000，NHT1249為通過末端α-氨基基團(tuán)共價連接的T1249多肽。在一個實(shí)施方案中n大約為225，例如227。在另一個實(shí)施方案中，n大約為450。
這種聚乙二醇化的T1249多肽可以用任何需要的方式生產(chǎn)，優(yōu)選的是用實(shí)施例7所述方法生產(chǎn)。
本發(fā)明的藥物組合物包含與可藥用賦形劑混合的式(I)的化合物，其中R1、m、n、p和NHT1249如上所述。
包含聚乙二醇化T1249多肽或其鹽的本發(fā)明藥物組合物可以任何需要的方式產(chǎn)生，例如，通過常規(guī)的混合、包封、溶解、?；?、乳化、包埋或者冷凍干燥方法。這些藥物制劑可以與治療用惰性的、無機(jī)或有機(jī)的賦形劑和載體制劑。適于注射的賦形劑包括水、醇類、多羥基化合物、甘油、植物油、磷脂和表面活性劑。
藥物制劑也可包含防腐劑、促溶劑、穩(wěn)定劑、著濕劑、乳化劑、甜味劑、著色劑、調(diào)味劑、用以改變滲透壓的鹽類、緩沖劑、包衣劑或者抗氧化劑。它們還可包含其他治療上有用的物質(zhì)，包括額外的活性成分。
適宜注射施用的制劑(包括腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)注射或連續(xù)輸注)可以方便地以單位劑量形式提供并可以通過常規(guī)的藥物學(xué)技術(shù)制備。此類技術(shù)包括建立聚乙二醇化的T1249多肽和藥物載體或賦形劑聯(lián)系的步驟。一般來說，制劑通過全面而密切地建立聚乙二醇化的T1249多肽和液體載體的聯(lián)系來制備。適宜的注射施用的制劑包括含水溶和非含水無菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑，和使制劑與目的接受者的血液等滲的溶質(zhì)；可能含有懸浮劑和增稠劑的含水和非含水無菌懸浮液。制劑可以以單位劑量或多劑量容器形式提供，例如，密封安瓿和小瓶，制劑可以在冷干(冷凍干燥)的條件下儲存，只需在使用前立即加入無菌液體載體例如注射用水。
優(yōu)選的單位劑量制劑是那些包含如上所述施用成分的每日劑量，每日亞劑量，每周劑量，每周亞劑量或者其施用成分的適當(dāng)級分。
聚乙二醇化的T1249多肽優(yōu)選地是單位劑量形式。正如在此使用的，“單位劑量形式”意思是適于一次劑量的聚乙二醇化的T1249多肽的量為預(yù)先稱量和/或預(yù)先包裝形式。這允許施方便地制備用于施用地聚乙二醇化的T1249多肽，甚至允許患者的自我施用。劑量單位的數(shù)量顯然取決于待遞送的聚乙二醇化T1249多肽的量和用藥頻率。
聚乙二醇化T1249多肽也可以按單位劑量的量以冷凍干燥粉末形式提供，其適于在施用之前與可藥用賦形劑重建。
本發(fā)明的特定藥物組合物包含與可藥用賦形劑混合的式(I)的化合物，其中R1為甲氧基，m為1，n為100-750，p為3。
本發(fā)明的另一種藥物組合物是包含與可藥用賦形劑混合的式(III)的化合物的藥物組合物，其中n為10-1,000，且NHT1249是通過末端α-氨基共價連接的T1249多肽。在一個實(shí)施方案中n約為225，例如227。在另一個實(shí)施方案中n大約為450。
本發(fā)明還提供了抑制HIV感染的方法，其包括給患者施用包含與可藥用賦形劑混合的式(I)化合物的藥物組合物，其中R1、m、n、p和NHT1249如上所述。
聚乙二醇化T1249多肽一般以(非聚乙二醇化)T1249多肽當(dāng)前施用方式施用。然而可作一些改進(jìn)以利用聚乙二醇化T1249多肽提高的藥物動力學(xué)特性。
在本發(fā)明抑制HIV的方法中，藥物組合物可以以任何適當(dāng)?shù)姆绞胶屯緩绞┯?。在?yōu)選的方法中，聚乙二醇化的T1249多肽以可注射的溶液或懸浮液形式施用。優(yōu)選地，可注射的溶液或懸浮液通過皮下注射或靜脈內(nèi)注射施用。
在另一種優(yōu)選的方法中，聚乙二醇化的T1249多肽通過透皮遞送設(shè)備例如透皮貼片施用。
在本發(fā)明抑制HIV的方法中，藥物組合物可以以任何適當(dāng)?shù)膭┝亢头桨甘┯?。本發(fā)明的藥物組合物可以以任何需要的形式，通過任何需要的途徑施用。然而本發(fā)明的聚乙二醇化T1249多肽一般腸胃外施用，例如，以注射液的形式施用。
治療有效量的確定屬于本領(lǐng)域的技術(shù)范疇，并且根據(jù)本發(fā)明的聚乙二醇化T1249多肽的治療有效量或劑量可根據(jù)每一特別情況下個別需要改變和調(diào)整。一般而言，在給體重大約70Kg的成人注射施用的情況下，每天大約50毫克到大約300毫克的劑量應(yīng)該是合適的，優(yōu)選的是大約50毫克到大約200毫克，但在說明時上限可能過量。此劑量可以作為一次劑量、分開的劑量或連續(xù)的輸注施用。
藥用組合物可以以任何便利的劑量方案施用。藥用組合物優(yōu)選地每天一次，每天兩次，隔天一次，每周一次或每周兩次施用。藥物組合物更優(yōu)選地每周一次施用。
藥物組合物優(yōu)選地每周一次以約300毫克到約1,500毫克的劑量施用。藥物組合物更優(yōu)選地每周一次以約400毫克到約1,000毫克的劑量施用。藥物組合物甚至更優(yōu)選地每周一次以約100毫克到約200毫克的劑量施用。
本發(fā)明還提供抑制HIV感染的方法，其包括施用包含與可藥用賦形劑混合的式(I)化合物的藥物組合物，其中R1為甲氧基，m為1，n為100-750，p為3。
在本發(fā)明范疇之內(nèi)還預(yù)期了抑制HIV感染的方法，其包括施用包含與可藥用賦形劑混合的式(III)化合物的藥物組合物，其中n為10-1,000，NHT1249為通過末端α-氨基共價連接的T1249多肽。在一個實(shí)施方案中n大約為225，例如227。在另一個實(shí)施方案中，n大約為450。
提供以下實(shí)施例是為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明的化合物、組合物和方法。這些實(shí)施例子只作為例證，并非意在以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1
PEG10K-丁醛的制備240毫升甲苯中的分子量為10,000的mPEG(30.0克，3毫摩爾)通過回流2小時共沸干燥，然后除去120毫升甲苯。得到的溶液冷卻到室溫，然后向PEG溶液中加入叔丁醇鉀(0.68克，6毫摩爾)在20毫升無水叔丁醇和20毫升甲苯中的溶液。得到的混合物于氬環(huán)境下在室溫攪拌兩小時。反應(yīng)中通過注射器加入溴乙酸叔丁基酯(1.00毫升，6.75毫摩爾)然后反應(yīng)于氬環(huán)境下在室溫攪拌過夜。然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮反應(yīng)溶液。加入二乙醚沉淀殘留物。沉淀下來的mPEG10k叔丁基羧甲基酯產(chǎn)物過濾分離和真空干燥。產(chǎn)量28克。NMR(d6-DMSO)1.40ppm(t，9H，-CH3)；3.21ppm(s，-OCH3)；3.50ppm(s，-O-CH2CH2-O-)；3.96ppm(s，2H，-O-CH2-COO-)。
然后將mPEG10k叔丁基羧甲基酯(26.5克)溶于350毫升1N氫氧化鈉中，然后此溶液室溫攪拌過夜。加入6N鹽酸調(diào)節(jié)混合物的pH值到2.5，然后用二氯甲烷提取混合物。有機(jī)層用硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，然后沉淀到二乙醚中。通過過濾和真空干燥收集m-PEG10k-羧甲基酸產(chǎn)物。產(chǎn)量24克。NMR(d6-DMSO)3.21ppm(s，-OCH3)；3.5ppm(s，-O-CH2CH2-O-)；3.99ppm(s，2H，-O-CH2-COOH)。
然后將m-PEG10k-羧甲基酸(6克，0.6毫摩爾)溶于無水二氯甲烷(30毫升)中，然后加入4-氨基丁醛二乙基縮醛(140毫升，0.9毫摩爾)，1-羥基苯并三唑(80毫克，0.6毫摩爾)和二環(huán)己基碳二亞胺(160毫克，0.78毫摩爾)。在氬環(huán)境下室溫攪拌混合物過夜。過濾、濃縮反應(yīng)混合物，并用2-丙醇和二乙醚(1∶1)混合物沉淀。將mPEG10k-丁縮醛產(chǎn)物真空干燥過夜。產(chǎn)量5.4克。NMR(d6-DMSO)1.07-1.12ppm(t，6H，(-O-CH2-CH3)2)；1.46ppm(m，4H，-NHCH2CH2CH2-CH-)；3.08-3.11ppm(q，2H，-NHCH2CH2CH2-CH-)；3.21ppm(s，-OCH3)；3.5ppm(s，-O-CH2CH2-O-)；3.85ppm(s，2H，-O-CH2-CO-NH-)；4.44ppm(t，1H，-NHCH2CH2CH2-CH-)；7.67ppm(-NH-)。
然后將mPEG10k-丁縮醛(2克，0.2毫摩爾)溶于20毫升80％CF3COOH中，將溶液室溫攪拌過夜。加入1NNaOH溶液調(diào)整混合物的pH值到6.0，加入氯化鈉(10wt％)然后加入1NNaOH調(diào)整溶液的pH值到7.0。用二氯甲烷提取混合物。有機(jī)層用硫酸鈉干燥、過濾、濃縮并沉淀到二乙醚中。通過過濾和真空干燥收集mPEG10k-丁醛產(chǎn)物。產(chǎn)量1.7克。NMR(d6-DMSO)3.21ppm(s，-OCH3)；3.5ppm(s，-O-CH2CH2-O-)；3.85ppm(s，2H，-O-CH2-CO-NH-)；7.67ppm(-NH-)；9.66ppm(-CHO-)。
實(shí)施例2用PEG10k-丁醛聚乙二醇化T201.0毫升含20毫克T1249(純度93.7％)的緩沖液(50毫摩爾磷酸鉀，pH 6.5)中，按每一摩爾T1249使用5摩爾試劑的摩爾比加入PEG(10kDa)的丁醛(mPEG10k-CMAB)(見實(shí)施例1)。T1249多肽在α-氨基端去?；?，但在羧基端受-NH2保護(hù)。向反應(yīng)混合物中加入10％(V/V)0.5M氰基氫硼化鈉水溶液并在室溫下攪拌4小時。用離子交換層析(QA)從反應(yīng)混合物中純化聚乙二醇化的T1249。增加的鹽濃度即20mMTris(pH7.5)中65mM到1M NaCl的線性梯度用來分離聚乙二醇化的T1249和未受修飾的T1249。
實(shí)施例3mPEG20K-丁醛的制備800毫升甲苯中分子量20,000的mPEG(60.0克，3毫摩爾)通過回流2小時共沸干燥，然后除去200毫升甲苯。得到的溶液冷卻到室溫，然后向PEG溶液中加入叔丁醇鉀(0.68克，6毫摩爾)在20毫升無水叔丁醇和20毫升甲苯中的溶液。得到的混合物于氬環(huán)境下在室溫攪拌兩小時。反應(yīng)中通過注射器加入溴乙酸叔丁基酯(1.00毫升，6.75毫摩爾)然后反應(yīng)于氬環(huán)境下在室溫攪拌過夜。然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮反應(yīng)溶液。加入二乙醚沉淀殘留物。沉淀下來的mPEG10k叔丁基羧甲基酯產(chǎn)物過濾分離和真空干燥。產(chǎn)量56克。NMR(d6-DMSO)1.42ppm(t，9H，-CH3)；3.21ppm(s，-OCH3)；3.50ppm(s，-O-CH2CH2-O-)；3.98ppm(s，2H，-O-CH2-COO-).
然后將mPEG20k羧甲基叔丁酯(28克)溶于750毫升1N氫氧化鈉中，然后此溶液室溫攪拌過夜。加入6N鹽酸調(diào)整混合物的pH值到2.5，然后用二氯甲烷提取混合物。有機(jī)層用硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，然后沉淀到二乙醚中。通過過濾和真空干燥收集m-PEG20k-羧甲基酸產(chǎn)物。產(chǎn)量25克。NMR(d6-DMSO)3.21ppm(s，-OCH3)；3.5ppm(s，-O-CH2CH2-O-)；3.99ppm(s，2H，-O-CH2-COOH)。
然后將m-PEG20K-羧甲基酸(20克，1.0毫摩爾)溶于無水二氯甲烷(100毫升)中，然后加入4-氨基丁醛二乙基縮醛(0.77毫升，4毫摩爾)，1-羥基苯并三唑(270毫克，2.0毫摩爾)和二環(huán)己基碳二亞胺(620毫克，3.0毫摩爾)。在氬環(huán)境下室溫攪拌混合物過夜。過濾、濃縮反應(yīng)混合物，并用2-丙醇和二乙醚(1∶1)混合物沉淀。將mPEG20k-丁縮醛產(chǎn)物真空干燥過夜。產(chǎn)量18.6克。NMR(d6-DMSO)1.07-1.12ppm(t，6H，(-O-CH2-CH3)2)；1.46ppm(m，4H，-NHCH2CH2CH2-CH-)；3.08-3.11ppm(q，2H，-NHCH2CH2CH2-CH-)；3.21ppm(s，-OCH3)；3.5ppm(s，-O-CH2CH2-O-)；3.85ppm(s，2H，-O-CH2-CO-NH-)；4.44ppm(t，1H，-NHCH2CH2CH2-CH-)；7.67ppm(-NH-)。
然后將mPEG20k-丁縮醛(14.7克，0.73毫摩爾)溶于200毫升10％CF3COOH中，將溶液室溫攪拌過夜。加入1N NaOH溶液調(diào)整混合物的pH值到6.0，加入氯化鈉(10wt％)然后加入1N NaOH調(diào)整溶液的pH值到7.0。用二氯甲烷提取混合物。有機(jī)層用硫酸鈉干燥、過濾、濃縮并沉淀到二乙醚中。通過過濾和真空干燥收集mPEG20k-丁醛產(chǎn)物。產(chǎn)量13.1克。NMR(d6-DMSO)3.21ppm(s，-OCH3)；3.5ppm(s，-O-CH2CH2-O-)；3.85ppm(s，2H，-O-CH2-CO-NH-)；7.67ppm(-NH-)；9.66ppm(-CHO-)。
實(shí)施例4用PEG20k-丁醛聚乙二醇化T124920毫克T1249(純度93.7％)中，其溶解于0.4毫升50mM硼酸鹽pH9.5緩沖液中，加入根據(jù)實(shí)施例3制備的PEG(20kDa)的丁醛，然后按每摩爾T1249 10摩爾試劑的摩爾比用100mM pH6.5磷酸鉀稀釋10倍。T1249多肽在α-氨基端去?；隰然耸?NH2保護(hù)。向反應(yīng)混合物中加入0.4mL10％(V/V)0.5M氰基氫硼化鈉(NaBH3CN)水溶液并在室溫下攪拌4小時。用平衡緩沖液(20mM Tris，pH7.5)10倍稀釋反應(yīng)混合物并通過0.45um濾器過濾。用離子交換層析(Q-瓊脂糖凝膠)從反應(yīng)混合物中純化聚乙二醇化的T1249。增加的鹽濃度即平衡緩沖液中75mM、200mM到1MNaCl的線性梯度分別用來分離雙-聚乙二醇化的T1249、單-聚乙二醇化的T1249和未受修飾的T1249。以上的實(shí)驗(yàn)以開始用70毫克T1249，1∶10摩爾過量的PEG20k-丁醛重復(fù)，并如前所述純化?；旌蠌膬蓚€實(shí)驗(yàn)中收集的單-聚乙二醇化的T1249(200mM NaCl洗脫)，濃縮到大約2毫克/毫升并滲濾到儲存緩沖液(PBS緩沖液，pH7.3)中于-20℃保存直到進(jìn)一步使用。材料的等分試樣用作抗病毒活性分析。
實(shí)施例5帶有PEG20k-丁醛的％單-、％雙-、％三-聚乙二醇化的T1249多肽帶有PEG20k-丁醛的％單-、％雙-、％三-聚乙二醇化的T1249多肽通過一系列實(shí)驗(yàn)確定，其中T1249和聚乙二醇的摩爾比，反應(yīng)溶液的pH值和反應(yīng)時間如下表1、表2和表3中變化。這些實(shí)驗(yàn)的目的是為了優(yōu)化聚乙二醇化的參數(shù)。
例如，在表1中，向含5毫克T1249(純度93.7％)的50mM磷酸鉀pH6.5緩沖液中加入根據(jù)實(shí)施例3制備的PEG 20kDa(mPEG20k-CMAB)的丁醛。T1249多肽在α-氨基端去?；?，但在羧基端受-NH2保護(hù)。PEG試劑與T1249的摩爾比為1∶1，1∶2到1∶5。反應(yīng)混合物中加入10％(v/v)0.5M氰基氫硼化鈉水溶液。室溫下在2、4、6和24小時的預(yù)定時間間隔取出等分試樣。
表1pH6.5的磷酸鉀緩沖液
表2中，含5毫克T1249(純度93.7％)的50mM磷酸鉀pH6.0緩沖液中，按每摩爾T1249 10摩爾PEG試劑的摩爾比加入根據(jù)實(shí)施例3制備的PEG 20kDa(mPEG20k-CMAB)的丁醛。T1249多肽在α-氨基端去?；?，但在羧基端受-NH2保護(hù)。PEG試劑與T1249的摩爾比為1∶1，1∶2到1∶5。反應(yīng)混合物中加入10％(v/v)0.5M氰基氫硼化鈉水溶液。室溫下在2、4、6和24小時的預(yù)定時間間隔取出等分試樣。
表2pH6.0的磷酸鉀緩沖液
表3中，含5毫克T1249(純度93.7％)的50mM磷酸鉀pH5.5緩沖液中，按每摩爾T1249 10摩爾PEG試劑的摩爾比加入根據(jù)實(shí)施例3制備的PEG 20kDa(mPEG20k-CMAB)的丁醛。T1249多肽在α-氨基端去?；隰然耸?NH2保護(hù)。PEG試劑與T1249的摩爾比為1∶1，1∶2到1∶5。反應(yīng)混合物中加入10％(v/v)0.5M氰基氫硼化鈉水溶液。室溫下在2、4、6和24小時的預(yù)定時間間隔取出等分試樣。
表3pH5.5的磷酸鉀緩沖液
通過反相HPLC獲得每一反應(yīng)混合物的單-，雙-和三-聚乙二醇化的T1249和未反應(yīng)的游離T1249的百分比。以上表1、2和3中作為例子的數(shù)據(jù)描述了在T1249∶PEG摩爾比，pH值和反應(yīng)時間的多種條件下何時能得到單-聚乙二醇化的T1249的最佳數(shù)量。例如表1中61％的最佳單-聚乙二醇化在1∶5的T1249∶PEG摩爾比和6小時的時間點(diǎn)出現(xiàn)。例如表2中61％的最佳單-聚乙二醇化在1∶10的T1249∶PEG摩爾比和4小時的時間點(diǎn)出現(xiàn)。例如表3中60％的最佳單-聚乙二醇化在1∶10的T1249∶PEG摩爾比和6小時的時間點(diǎn)出現(xiàn)。
實(shí)施例6聚乙二醇化位點(diǎn)的確定進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)以評定聚乙二醇與T1249連接的位點(diǎn)。結(jié)果表明95％以上的修飾位于N-端色氨酸殘基。其他修飾位點(diǎn)較少出現(xiàn)(＜5％)，但它們精確的特征尚未清楚確定。
為確定聚乙二醇修飾位點(diǎn)，樣品用內(nèi)切蛋白酶Lys-C消化然后通過反相HPLC分離多肽。用納噴射ESI(電噴射離子化)質(zhì)譜、MALDI TOF(基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時間)質(zhì)譜和N-端(Edman)測序來進(jìn)一步分析單個的多肽峰。下面概述了這些過程。
根據(jù)實(shí)施例4制備的20k單-聚乙二醇化-丁醛-T1249(20kmPEG-CMAB-T1249)和T1249(游離α-氨基端；羧基端受-NH2保護(hù))樣品室溫下按10/1的樣品與酶的比例用蛋白內(nèi)切酶Lys-C蛋白水解消化2小時。加入終濃度2％(v/v)的乙酸終止反應(yīng)。
通過使用裝有Phenomenex Luna反相柱(C-18，3pt，150×200毫米)的HP1100 HPLC系統(tǒng)的反相HPLC來分離蛋白水解肽。溶劑系統(tǒng)由水、乙腈和三氟乙酸(0.05％)組成。梯度為50分鐘內(nèi)以0.2毫升/分鐘流速從5％到64％的有機(jī)溶劑。收集含肽的峰用于進(jìn)一步分析。
用Finnigan LCQ離子分離器上納噴射ESI質(zhì)譜分析所有收集的樣品。基于實(shí)驗(yàn)分子量確定單個的肽。含聚乙二醇肽的級分也用Bruker反射器上進(jìn)行MALDI TOF質(zhì)譜分析。所用的基質(zhì)為反式-3-吲哚乙酸或α-4-羥基肉桂酸。
含聚乙二醇的肽級分用Perkin Elmer(ABI)精密儀器進(jìn)行自動N-端(Edman)測序。
聚乙二醇化的T1249蛋白水解片段反相HPLC分析的結(jié)果在圖1中顯示。圖1顯示了從兩個樣品反相HPLC分析獲得的紫外追蹤。在T1249對照(圖1B中HT-20峰)中觀察到的N-端肽在聚乙二醇修飾的T1249中幾乎全部消失(圖1A)。取而代之出現(xiàn)一新峰(圖1A中PEG-34峰)。其含有聚乙二醇修飾的肽。
單個HPLC級分質(zhì)譜分析結(jié)果總結(jié)于表4中。所有非修飾肽實(shí)驗(yàn)分子量與經(jīng)計算的非修飾肽分子量一致。
表4從收集的HPLC級分獲得的分析結(jié)果(也見圖1)。
1也見于圖1；2計算的以Da為單位的準(zhǔn)確質(zhì)量；3測量的以Da為單位的準(zhǔn)確質(zhì)量，未修飾肽的納噴射ESI MS和聚乙二醇修飾肽的MALDI TOF MS；4自動Edman測序，n.A.＝未得到，x＝未確定；5基于分子量一致性和/或Edman測序。未修飾的T1249樣品的氨基酸序列為WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-NH2.
圖2A展示了從完整聚乙二醇修飾的T1249獲得的MALDI TOF質(zhì)譜結(jié)果。測量的分子量為26758 Da。注意存在一些未修飾的肽。其來源目前尚不了解，然而其可能潛在的由質(zhì)譜本身的測量所引起。圖2B顯示了從聚乙二醇-34(圖1)獲得的MALDI TOF質(zhì)譜結(jié)果。測量的分子量為23083Da。分子量和質(zhì)譜表象確定此HPLC級分聚乙二醇-34為含有聚乙二醇修飾的肽的級分。納噴射ESI質(zhì)譜表明此HPLC級分中存在聚乙二醇(數(shù)據(jù)未展示)。
圖3顯示了自動N-端測序(Edman)的結(jié)果。觀察到的主要序列為N-端內(nèi)Lys-C肽xQEWEQK。除了第一個氨基酸殘基，其他所有的氨基酸都能大量獲得。一般不能從第一個氨基酸位置上獲得色氨酸(圖3，循環(huán)3)。HPLC紫外追蹤，MALDI TOF質(zhì)譜和N-端測序結(jié)果都確定N-端色氨酸為主要的聚乙二醇修飾位點(diǎn)。
以上的結(jié)果與聚乙二醇醛和T1249 N-端色氨酸之間連接的存在一致。雖然不能完全排除直接與色氨酸側(cè)鏈的連接，N-端測序的結(jié)果似乎與N-端氨基酸存在“封閉”聚乙二醇成分相矛盾。
實(shí)施例7用mPEG10k-丙醛聚乙二醇化T1249使用具有如下結(jié)構(gòu)的PEG(10kDa)化丙醛CH3-O-(CH2-CH2-O)227-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CHO1.0毫升含20毫克T1249(純度93.7％)的緩沖液(50毫摩爾磷酸鉀，pH 6.5)中，按每一摩爾T1249使用5摩爾試劑的摩爾比加入200毫克mPEG10k-丙醛。T1249多肽在α-氨基端去?；隰然耸?NH2保護(hù)。
反應(yīng)混合物中加入10％(V/V)的0.5M氰基氫硼化鈉水溶液并在室溫下攪拌4小時。用離子交換層析(QA)從反應(yīng)混合物中純化聚乙二醇化的T1249。聚乙二醇化的T1249多肽結(jié)構(gòu)如下CH3-O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-NH-T1249(III)20mMTris(pH7.5)中65mM到1M不斷上升的NaCl線性濃度梯度用來分離聚乙二醇化的T1249和未受修飾的T1249。然后通過反相HPLC獲得單-聚乙二醇化的T1249和未反應(yīng)的游離T1249的百分比并確定為31.7％。
實(shí)施例8cMAGI/MAGI抗病毒分析這些分析使用指示細(xì)胞系MAGI(半乳糖苷酶指示劑的多核活化)或者CCR5-表達(dá)衍生細(xì)胞系cMAGI評價感染性病毒滴度的降低。MAGI細(xì)胞系通過用雙嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體引入CD4基因和HIV-1 LTR-控制的b-半乳糖苷酶報告基因，從親代HeLa細(xì)胞衍生而來(Kimpton J，EmermanM，J Virol 662232-9，1992)。cMAGI細(xì)胞系通過用雙嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PA317引入CCR5基因，從MAGI細(xì)胞系衍生而來(Chackerian B，LongEM，Luciw PA，Overbaugh J，J Virol 713932-9，1997)。cMAGI細(xì)胞支持原代NSI(R5)分離株和實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)株X4病毒的復(fù)制，而MAGI細(xì)胞只支持X4病毒的復(fù)制。兩個細(xì)胞系都借助HIV-1tat的能力反式激活受HIV-LTR控制的b-半乳糖苷酶報告基因的表達(dá)。b-半乳糖苷酶報告基因已被修飾以定位于細(xì)胞核，在感染的幾天之內(nèi)，可以強(qiáng)烈的細(xì)胞核著色形式用X-gal底物檢測到。這樣，如果著色前只有一個感染周期，著色細(xì)胞核的數(shù)量可以認(rèn)為等于攻擊接種中感染性病毒粒子的數(shù)量。
感染后24小時加入感染和細(xì)胞-細(xì)胞融合的抑制劑如T1249(Wild C，Greenwell T，Matthews T，AIDS Res Hum Retroviruses 91051-3，1993)，這樣是為了允許確定代表了一個感染周期。受感染的細(xì)胞使用CCD-成像儀計數(shù)，原代分離株和實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)的分離株都顯示病毒數(shù)量和通過成像儀觀察到的受感染細(xì)胞數(shù)量之間的有線性關(guān)系。在MAGI和cMAGI分析中，感染滴度降低50％(Vn/Vo＝0.5)有意義并且提供了評價抗病毒活性的主要截斷值。感染滴度降低90％(Vn/Vo)用作評價抗病毒活性的附加截斷值。
每一種檢測化合物的稀釋物一式兩份地通過對病毒接種物的抗性來檢測，在48孔微量滴定板上將病毒接種物調(diào)整為大約1500-2000個受感染細(xì)胞/孔。將檢測化合物加入cMAGI或MAGI細(xì)胞，然后加入病毒接種物，24小時后加入感染和細(xì)胞-細(xì)胞融合的抑制劑(Wild C，Greenwell T，Matthews T，AIDS Res Hum Retroviruses 91051-3，1993)以阻止第二輪感染和細(xì)胞間病毒擴(kuò)散。細(xì)胞再培養(yǎng)2天，固定，用X-半乳糖苷酶底物染色以檢測受感染細(xì)胞。每一個對照和檢測化合物稀釋物的受感染細(xì)胞的數(shù)量用CCD-成像儀確定。IC50定義為造成感染性病毒滴度降低50％的檢測化合物的稀釋物。IC90定義為造成感染性病毒滴度降低90％的稀釋物。
實(shí)施例9聚乙二醇化的T1249的IC50/IC90下面表5顯示了T1249和用mPEG20K-丁醛聚乙二醇化的T1249(實(shí)施例4，此后稱為“mPEG20k-CMAB-T1249”)的IC50和IC90結(jié)果。IC50和IC90結(jié)果根據(jù)實(shí)施例8確定。
表5.IC50和IC90結(jié)果
觀察到mPEG20k-CMAB-T1249的體外抗病毒活性與親代T1249分子相比有所降低(第一批中IC50，13.7倍，IC90，9倍)。然而這種體外活性的喪失并不預(yù)示如實(shí)施例12中所述的結(jié)果展示的體內(nèi)生物學(xué)活性(見圖6)。
實(shí)施例10用mPEG20k-丙醛聚乙二醇化的T1249的藥物動力學(xué)研究方案9只雄性Wistar大鼠(Charles River實(shí)驗(yàn)室，Wilmington，DE)(n＝3/時間點(diǎn))接受單次皮下劑量的mPEG20k-丙醛聚乙二醇化的T1249(實(shí)施例4)。
mPEG20k-CMAB-T1249懸浮于水中并用NaOH滴定到pH值6.8。然后將mPEG20k-CMAB-T1249懸浮物溶解于最小體積的碳酸鈉緩沖液中并用PBS緩沖液稀釋到pH值7.3-7.4。所使用的PEG-T1249的量足夠提供最終制劑中每毫升150毫克的mPEG20k-CMAB-T1249濃度。大鼠按8毫克活性成分/千克體重施用。
藥物施用之后，在每一個時間點(diǎn)從眶后竇收集約1mL血液。時間點(diǎn)為藥物施用之后的0.5、1、3、6、8、16、24、32、48、72和96小時。所有血液樣品室溫放置不超過30分鐘，低溫離心分離血清。
生物分析方法在反相HPLC C18柱上用含有0.05M醋酸銨和乙腈的線性梯度分離所有的血液樣品。280nm下監(jiān)測吸光度。使用摻有mPEG20k-CMAB-T1249的血清提取物作為校正標(biāo)準(zhǔn)的圖中(曲線下的面積v.[mPEG20k-CMAB-T1249])外推出濃度。
所報道的藥物動力學(xué)參數(shù)來源于通過商業(yè)動力學(xué)分析軟件包WinNonlin 3.3版(Pharsight Corporation，Mountain View，CA)使用非區(qū)室分析mPEG20k-CMAB-T1249、其代謝產(chǎn)物和二者組合的合并血清濃度分布圖。
結(jié)果圖4顯示了施用一次皮下劑量之后大鼠中mPEG20k-CMAB-T1249的濃度時間曲線。在0.5小時時間點(diǎn)未檢測到mPEG20k-CMAB-T1249或代謝產(chǎn)物水平，表明了從注射部位緩慢的吸收過程。對代謝產(chǎn)物來說，最初的可檢測濃度在服藥后6小時出現(xiàn)，這代表了緩慢的代謝產(chǎn)物形成過程。mPEG20k-CMAB-T1249和其代謝產(chǎn)物最低血清濃度分別在服藥后48小時和72小時檢測到。
下面表6報告了系統(tǒng)的Cl/F和Vd/F、AUC(0-48小時或0-72小時)、Cmax、Tmax和半衰期。
表6，大鼠中mPEG20k-CMAB-T1249的藥物動力學(xué)參數(shù)。
aAUC0-48小時bAUC0-72小時實(shí)施例11T1249的藥物動力學(xué)研究方案每一個治療組由每種性別9只的Sprague-Dawley大鼠組成(CharlesRiver實(shí)驗(yàn)室，Wilmington，DE)。組中每一個成員接受單次皮下或靜脈劑量的T1249(實(shí)施例9/表5引用的批號2)。大鼠按1.2或15毫克活性成分/每千克體重施用。
在12小時的時間內(nèi)，每個時間點(diǎn)從每組實(shí)驗(yàn)動物中每一性別三只大鼠收集血液樣品。時間點(diǎn)為施藥后的0.5、1、2、4、6、8、10和12小時。
生物分析方法血液樣品用T1249 PcAb ECLIA分析法分析。T1249 PcAb ECLIA是一種非競爭性的二位免疫測定方法，其使用兩種不同的對T1249特異的兔PcAb制劑。在這種分析法中，通過首先在也含有生物素-標(biāo)記的抗體(A制劑)和釕-標(biāo)記的抗體(B制劑)的試管中孵育被稀釋的檢測樣品進(jìn)行T1249測定。在下一步驟中，在試管中加入鏈親和素包被的磁珠以俘獲已形成的抗體-肽-抗體免疫復(fù)合體(夾心復(fù)合體)。將混合物泵入分析儀中的流式細(xì)胞儀，之后給與流式細(xì)胞儀相連的磁體施加電流。通過分析緩沖液中與檢測抗體相連的釕金屬離子和過量存在的三丙胺離子間的循環(huán)氧化-還原反應(yīng)產(chǎn)生的光。光能是測量的終點(diǎn)。含有適量T1249的樣品與含有少量和不含T1249的樣品相比呈現(xiàn)出更高的信號。
結(jié)果圖5顯示了施用單次皮下或靜脈內(nèi)劑量之后大鼠中T1249的濃度-時間分布圖。
下面表7報告了Tmax、半衰期、AUC(0-12小時或0-∞小時)和Cmax。
表7，大鼠中T1249的藥物動力學(xué)參數(shù)。
考慮到mPEG20k-CMAB-T1249(表6)的藥物動力學(xué)數(shù)據(jù)和T1249(表7)15毫克/千克的皮下劑量，表明了mPEG20k-CMAB-T1249的終末半衰期提高了4.5倍。較高的Tmax反應(yīng)了與T1249相比mPEG20k-CMAB-T1249的較低的清除率，雖然具有相似的Cmax。此外，一旦表7中的數(shù)據(jù)用劑量差異(如實(shí)施例10中15毫克/千克歸一化到8毫克/千克)歸一化，可觀察到mPEG20k-CMAB-T1249的AUC比T1249的提高5倍(T1249 57.1μghr/ml(歸一化的)對mPEG20k-CMAB-T1249 279μghr/ml)。
實(shí)施例12T1249和mPEG20k-CMAB-T1249對小鼠中HIV-1病毒載量的影響每治療組使用9只HuPBMC-SCID小鼠(除PEG對照組為6只小鼠外)。在第0天，每個治療組在HIV分離株感染之后接受午后治療。之后從第1天到第6天，每個治療組一天接受兩次治療(上午和午后)。第7天收集小鼠。服藥細(xì)節(jié)見表8。最后劑量施用之后的14小時收集血漿樣品用于T1249分析。
表8，服藥方案
通過實(shí)時定量PCR確定血漿中的HIV-1。收集血漿用于T1249化合物的定量。然后冷凍的血漿樣品進(jìn)行化合物分析。
圖6顯示了施用T1249和mPEG20k-CMAB-T1249對SCID小鼠中HIV-1病毒量的影響。
T1249和mPEG20k-CMAB-T1249在體內(nèi)具有相同的活性。結(jié)果表明在測定檢測化合物血漿濃度時沒有可辨認(rèn)的體內(nèi)病毒抑制活性差別。
以上結(jié)果表明了本發(fā)明有利的特性，mPEG20k-CMAB-T1249和T1249在等量血漿濃度下相同的體內(nèi)生物學(xué)活性(實(shí)施例12)，通過實(shí)施例10和11中的比較顯示mPEG20k-CMAB-T1249更好的藥物動力學(xué)特性。
本發(fā)明如此描述，顯然，其同樣可以以多種方式變化。并不認(rèn)為這樣的變化是偏離本發(fā)明的精神和范圍，并且所有此類修改意在包括在以下權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
序列表<110>弗·哈夫曼-拉羅切有限公司<120>聚乙二醇化的T1249多肽<130>21327US1<150>US 60/439,213<151>2003-01-10<150>US 60/398,190<151>2002-07-24<160>5<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>39<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽序列為合成來源的.
<220>
<221>MOD_RES<222>(39)..(39)<223>39位殘基任選地用氨基修飾<400>1Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln1 5 10 15Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asp Lys Trp20 25 30
Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe35<210>2<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽序列為合成來源的.
<400>2Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys1 5<210>3<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽序列為合成來源的.
<400>3Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys1 5 10<210>4<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽序列為合成來源的.
<400>4Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys
1 5<210>5<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽序列為合成來源的.
<220>
<221>MOD_RES<222>(8)..(8)<223>8位殘基用氨基修飾<400>5Trp Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe1 權(quán)利要求
1.式(I)的化合物 其中R1為封端基團(tuán)，m為1-17，n為10-1,000，p為1-3，且NHT1249為通過其末端α-氨基共價連接的T1249多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R1選自鹵素、環(huán)氧化物、馬來酰亞胺、二硫化鄰吡啶、甲苯磺酸酯、異氰酸酯、水合肼、氰尿酰鹵化物、N-琥珀酰亞胺基氧基、硫代-N-琥珀酰亞胺基氧基、1-苯并三唑基氧基、1-咪唑基氧基、對硝基苯基氧基和
3.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中p為3。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中p為3，R1為甲氧基，m為1，n為100-750。
5.下式的化合物CH3-O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-NHT1249(III)其中n為10-1,000，NHT1249為通過其末端α-氨基共價連接的T1249多肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的化合物，其中n約為450。
7.藥物組合物，其包含與可藥用賦形劑混合的下式化合物 其中R1為封端基團(tuán)，m為1到17，n為10-1,000，p為1-3，且NHT1249為通過其末端α-氨基共價連接的T1249多肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的藥物組合物，其中p為3，R1為甲氧基，m為1，n為100-750。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的藥物組合物，其為冷凍干燥粉末形式。
10.根據(jù)權(quán)利要求7的藥物組合物，其為注射用溶液或懸液形式。
11.包含與可藥用賦形劑混合的式I化合物的藥物組合物的用途，用于制備抑制HIV感染的藥物 其中R1為封端基團(tuán)，m為1到17，n為10-1,000，p為1-3，且NHT1249為通過其末端α-氨基共價連接的T1249多肽。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的用途，其中p為3，R1為甲氧基，m為1，n為100-750。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的用途，其中藥物組合物通過腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)注射或連續(xù)輸注。
14.根據(jù)權(quán)利要求11的用途，其中藥物組合物以每次約50毫克-約300毫克的量施用。
15.包含與可藥用賦形劑混合的式III化合物的藥物組合物的用途，用于制備抑制HIV感染的藥物CH3-O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-NHT1249(III)其中n為10-1,000，且NHT1249為通過其末端α-氨基共價連接的T1249多肽。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的用途，其中藥物組合物為每周以約300毫克-約1,500毫克的量單劑量施用。
全文摘要
提供了聚乙二醇化的T1249多肽化合物。還提供了包含聚乙二醇化的T1249多肽化合物的藥物組合物以及生產(chǎn)此類化合物及組合物的方法。還提供了包含與可藥用賦形劑混合的式(I)化合物的藥物組合物的用途，用于制備抑制HIV感染的藥物。
文檔編號C07K14/155GK1671735SQ03817679
公開日2005年9月21日 申請日期2003年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月24日
發(fā)明者P·S·拜隆, C-Y·王 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司