一種跨膜蛋白3包裝的外泌體在制備抗登革病毒感染藥物中的應用
【專利說明】一種跨膜蛋白3包裝的外泌體在制備抗登革病毒感染藥物 中的應用
[0001]
技術領域
[0002] 本發(fā)明涉及蛋白質工程技術領域，更具體地，涉及一種跨膜蛋白3包裝的外泌體 在制備抗登革病毒感染藥物中的應用。
【背景技術】
[0003] 外泌體（exosome)又稱胞外體，是由細胞內的多泡體（multivesicularbody, MVB) 與細胞膜融合后，釋放到細胞外基質中的一種膜性囊泡（vesicles)。exosome這個術語最 初由Johnstone等報道提出并命名，他們在研宄網(wǎng)織紅細胞向成熟紅細胞轉變過程中，從 體外培養(yǎng)羊網(wǎng)織紅細胞的上清液中，分離純化了這種小囊泡狀物質，它可以帶走成熟紅細 胞不需要的質膜蛋白，如轉鐵蛋白受體和乙酰膽堿脂酶等。外泌體起源于細胞內吞過程中 的內體（endosome)，內體的外膜向其腔內出芽，形成一個膜包裹的結構，其基部逐漸與內涵 體的膜分離，脫落后就形成了內體內的小囊泡（40?100 nm大小)，同時可有多個小囊泡形 成，而含有多個小囊泡的內體又稱為多泡體（500 nm大小)。多泡體的代謝途徑一般有兩種： 一是與質膜融合，將其中的小囊泡以胞吐的方式排到細胞外環(huán)境，即成為外泌體：另一種是 在胞內與溶酶體（lysosome)融合，導致其內容物的降解。隨后研宄報道外泌體又從其他類 型細胞的培養(yǎng)基與體液中被分離出來。
[0004] 外泌體參與機體的多種功能，包括參與清除細胞冗余成分、介導細胞粘附及信號 傳遞、抗原提呈、細胞間傳遞遺傳物質；另外，外泌體具有促病毒感染與抑制病毒感染雙重 功能：1.外泌體傳遞病毒顆粒一一介導病毒的感染；2.外泌體傳遞病毒結構或非結構蛋 白--參與病毒逃避機體免疫監(jiān)視；3.外泌體傳遞宿主細胞抗病毒蛋白--參與宿主天然 抗病毒免疫調節(jié)。
[0005] 既然外泌體能夠包裝各種蛋白，那么在病毒感染時，如果宿主細胞將干擾素誘導 的抗病毒蛋白包裝成外泌體形式，進行抗病毒蛋白的細胞間傳遞，直接使宿主形成更強的 抗病毒免疫狀態(tài)，這將提出宿主天然免疫調節(jié)新型模式。Khatua等科學家研宄發(fā)現(xiàn)包裝了 AP0BEC3G蛋白的外泌體可直接傳遞到宿主細胞而具極強的抗HIV-I病毒感染的功效。作為 一種機體天然抗病毒因子，AP0BEC3G是一種胞嘧啶脫氨基酶家族成員，近年來因其獨特的 抗病毒作用機制受到了廣泛的關注。HIV-I在宿主細胞復制過程中，AP0BEC3G可以大量包 裝進入新生成的病毒顆粒內部，誘導病毒負鏈cDNA胞嘧啶（cytimidine，C)脫氨基突變?yōu)?尿嘧啶（uracil，U)，導致病毒基因組高度突變而喪失活性。但是，HIV編碼的Vif蛋白能拮 抗AP0BEC3G的脫氨基酶作用，二者形成動態(tài)平衡，所以HIV最終還是能夠逃脫AP0BEC3G的 抗病毒作用。而AP0BEC3G外泌體不但直接參與了宿主抵抗HIV入侵的防御機制，而且可以 避免HIV的Vif蛋白的拮抗作用，具體分子機制未明。外泌體傳遞宿主細胞抗病毒蛋白，為 新型抗病毒藥物的開發(fā)和機體天然免疫機制的研宄開拓了新的方向，可對未來的病毒性病 原體所致的疾病的防治提供新的線索與思路。本研宄通過探索包裝抗病毒蛋白的外泌體， 是否可以直接代替干擾素的抗病毒作用，如此可拓展人體天然抗病毒蛋白的臨床應用。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明人通過研宄發(fā)現(xiàn)，跨膜蛋白3作為外泌體的新型生物活性形式，外泌體傳 遞宿主細胞抗病毒蛋白，打破了現(xiàn)有技術中采用干擾素誘導產(chǎn)生抗病毒蛋白的思路，為新 型抗病毒藥物的開發(fā)和機體天然免疫機制的研宄開拓了新的方向。
[0007] 本發(fā)明的目的通過以下技術方案實現(xiàn)： 本發(fā)明提供了一種IFITM3(跨膜蛋白3)包裝的外泌體在制備抗登革病毒感染藥物中 的應用，所述外泌體的制備方法為收集高表達IFITM3的人臍靜脈內皮細胞培養(yǎng)基上清，將 上清采用蔗糖密度梯度超速離心法即得所述外泌體。
[0008] 優(yōu)選地，所述高表達IFITM3重組質粒的制備方法為： SI:根據(jù)IFITM3的基因序列，設計正向引物，如SEQ ID NO :1所示，設計反向引物，如 SEQ ID NO : 2 所示； S2:根據(jù)PCR擴增產(chǎn)物，反應條件如下：94 °C預變性5 min;94 °C變性30 s，55 °C 30 s，72 °C 60 s，30個循環(huán)；72 °C延伸7 min，然后將所有擴增產(chǎn)物用I. 5 %瓊脂糖凝膠電泳 并切膠回收純化； S3:利用QIAprep spin miniprep kit抽提質粒，將pMSCV質粒DNA與IFITM3基因片段 PCR產(chǎn)物進行雙酶切反應和連接，測序比對后，利用氯化銫梯度離心法提取pMSCV- IFITM3 重組質粒DNA。
[0009] 優(yōu)選地，所述IFITM3包裝的外泌體的產(chǎn)量鑒定方法為采用IFITM3包裝的外泌體 處理HeLa受體細胞后，檢測HeLa細胞中IFITM3的蛋白水平。
[0010] 優(yōu)選地，所述IFITM3包裝的外泌體的活性鑒定方法為應用real time RT-PCR檢 測細胞內感染的登革病毒RNA和培養(yǎng)基上清中病毒RNA。
[0011] 本研宄首先證明了登革病毒感染可誘發(fā)宿主細胞內高表達IFITM，繼而分別通過 逆轉錄病毒表達質粒和磷酸鈣轉染技術構建IFITM外源性穩(wěn)定及瞬時高表達體系，應用 western blotting技術、流式細胞術來證明IFITM3蛋白的抗登革病毒感染的活性。同時， 還將應用RNA干擾技術沉默IFITM表達，以明確其是否能增強登革病毒感染，用以探討宿主 細胞的內源性IFITM蛋白是否具有抗登革病毒感染能力。另一方面，本實驗利用逆轉錄病 毒系統(tǒng)構建穩(wěn)定高表達IFITM3蛋白的293T細胞系，并且利用超速分級離心技術成功獲得 了 293T-IFITM3細胞系上清中的外泌體，應用透射電鏡技術、質譜技術等方法證明上清中 的IFITM蛋白是外泌體形式，應real time RT-PCR技術證明IFITM3蛋白的外泌體形式的 高效抗登革病毒活性。由此提出了以IFITM3包裝的新型內源性外泌體應用于抗登革病毒 治療的新策略。
[0012] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果： 本發(fā)明所提供的外泌體可以傳遞宿主細胞抗病毒蛋白，從而為新型抗病毒藥物的開發(fā) 和機體天然免疫機制的研宄開拓了新的方向，可對未來的病毒性病原體所致的疾病的防治 提供新的線索與思路。同時，抗病毒蛋白外泌體是否可以代替干擾素直接應用于抗病毒藥 物研發(fā)，這將開拓人源性抗病毒蛋白在抗病毒防治的臨床應用新領域。
【附圖說明】
[0013] 圖1是一系列易感細胞感染登革病毒后E蛋白的表達情況以及感染后IFITM3蛋 白的表達變化情況的電泳圖； 圖2是穩(wěn)定高表達外源性IFITM1，2, 3的U937-IFITM1，2, 3細胞的建立并經(jīng)電泳證實 的結果圖； 圖3是流式細胞儀檢測外源性穩(wěn)定高表達IFITM1、IFITM2、IFITM3蛋白對U937細胞的 抗登革病毒感染作用的結果圖； 圖4是IFITM內源性高表達的HUVEC的培養(yǎng)基上清中存在IFITM3蛋白的電泳鑒定圖； 圖5是所述外泌體的透射電子電鏡觀察鑒定結果圖； 圖6是所述外泌體中存在IFITM3蛋白的電泳結果圖； 圖7是所述外泌體中存在IFITM3蛋白質譜技術鑒定結果圖； 圖8是所述IFITM3外泌體處理HeLa細胞內的IFITM3蛋白變化電泳結果圖； 圖9是所述IFITM3外泌體處理后HeLa細胞內的IFITM3蛋白變化的時間-效應電泳 結果圖； 圖10是Real time RT-PCR方法檢測細胞內感染的DENV RNA結果圖； 圖11是Real time RT-PCR方法檢測培養(yǎng)基上清中的DENV RNA結果圖。
【具體實施方式】
[0014] 下面結合一些【具體實施方式】對本發(fā)明做進一步解釋和說明。具體實施例為進一步 詳細說明本發(fā)明，非限定本發(fā)明的保護范圍。
[0015] 實施例1 :pMSCV-IFITM重組質粒的構建、鑒定及提取 從 GenBank 數(shù)據(jù)庫下載 IFITMl、IFITM2、IFITM3 基因序列，利用 Primer Premier 5. 0 軟件自行設計一對引物擴增全長IFITM1/2/3基因，引物由上海英俊生物公司合成，引物系 列如下：正向引物序列如下：GGAAGATCTGCCATGAATCACACTGTCCAAACCTTC ;反向引物序列如 下：CCGGAATTCCTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTATCCATAGGCCTGGAAGATCAG 〇
[0016] 利用Trizol法提取細胞總RNA后，以核酸蛋白定量儀分別測定RNA濃度，根據(jù)所 測得的濃度，將全部RNA用無 RNA酶的水稀釋成終濃度為1 μ g/μ 1。我們利用提取到的細 胞RNA得到IFITM1/2/3基因的cDNA產(chǎn)物，再根據(jù)PCR擴增產(chǎn)物，反應條件如下：94 °C預變 性 5 min;94 °C變性 30 s，55 °C 30 s，72 °C 60 s，30 個循環(huán)；72 °C延伸 7 min。將所有 擴增產(chǎn)物用I. 5 %瓊脂糖凝膠(含終濃度為0. 5 μ g/ml的EB)電泳并切膠回收純化。
[0017] 利用 QIAprep spin miniprep kit 抽提質粒，將 pMSCV 質粒 DNA 與 IFITM1/2/3 基 因片段PCR產(chǎn)物進行雙酶切反應和連接，在200 μ I DH5a感受態(tài)細菌中加入10 μ 1連接 產(chǎn)物中，37 °C培養(yǎng)箱中，倒置平板培養(yǎng)12?16 h至長出菌落。最后挑取單菌落接種于3 ml含氨芐青霉素（50 μ g/ml)的LB培養(yǎng)液中，37 °C 300 rpm搖菌過夜。