一種跨膜受體的單克隆抗體的篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種跨膜受體的單克隆抗體的篩選方法，通過包被不表達(dá)跨膜受體的細(xì)胞膜以及表達(dá)或高表達(dá)跨膜受體的細(xì)胞膜，成對、平行地進(jìn)行差異化ELISA檢測，可以大規(guī)模篩選針對跨膜受體的單克隆抗體。本發(fā)明類似于常規(guī)的ELISA，可以高通量、快速、便捷地篩選針對完整跨膜受體的單克隆抗體，具有非常高的檢測靈敏度；篩選出來的候選抗體經(jīng)過FACS驗(yàn)證確認(rèn)。
【專利說明】一種跨膜受體的單克隆抗體的篩選方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種單克隆抗體的篩選方法，特別涉及一種跨膜受體的單克隆抗體的篩選方法。

【背景技術(shù)】
[0002]G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)、酪氨酸激酶受體(RTK)以及離子通道(1n channel)是細(xì)胞膜上非常重要的跨膜受體，它們將激素、神經(jīng)遞質(zhì)、肽類等信號分子轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，通過跨膜受體傳遞并放大信號。目前80%臨床使用藥物的靶點(diǎn)都集中在跨膜受體上，它們通過與跨膜受體結(jié)合而起作用，有的藥物激活跨膜受體，有的藥物抑制跨膜受體活性，從而影響下游信號的傳導(dǎo)，進(jìn)而改變細(xì)胞內(nèi)生理生化反應(yīng)。以跨膜受體為靶點(diǎn)的抗體藥物，由于治療性抗體具有非常好的靶標(biāo)選擇性和代謝穩(wěn)定性，是很重要的一類藥物，并日益受到制藥界的青睞。
[0003]目前，以可溶性蛋白為抗原制備、篩選單克隆抗體相對容易，而制備針對跨膜受體蛋白的單克隆抗體就會非常困難。一方面是因?yàn)橹苽浼兓目扇苄钥缒な荏w蛋白，需要去垢劑維持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，但通常在純化后都會變性，失去特定構(gòu)象，這樣限制了利用純化的跨膜受體作為抗原來篩選特異性結(jié)合的抗體；另一種策略是基于跨膜受體拓?fù)鋵W(xué)和結(jié)構(gòu)預(yù)測，合成跨膜受體中親水區(qū)的多肽或串聯(lián)多肽，并以此作為抗原來篩選抗體，其缺點(diǎn)在于會大量遺漏識別結(jié)構(gòu)性表位的抗體，甚至是篩選出的抗體不識別具有天然構(gòu)象的跨膜受體。還有一種辦法是表達(dá)跨膜受體的N’端胞外區(qū)，并以此作為抗原來篩選針對跨膜受體的抗體，這種篩選方法也很有限，比如對于某些GPCR來說，它們的N’端胞外區(qū)很短，而且具有調(diào)控作用的功能性抗體多數(shù)是結(jié)合在跨膜受體的Loop區(qū)。
[0004]以完整跨膜受體蛋白為抗原篩選特異性結(jié)合抗體的篩選方法也非常有限，通常有流式細(xì)胞術(shù)(FACS)、全細(xì)胞ELISA (酶聯(lián)免疫吸附劑測定)以及熒光微體積檢測技術(shù)(Fluorescent microvolume assay technology, FMAT)。其中流式細(xì)胞術(shù)很難做到高通量篩選，不容易做到超過1000個以上雜交瘤細(xì)胞上清的檢測；全細(xì)胞ELISA需要將細(xì)胞固定在96孔板中，因?yàn)橛袃?nèi)源性的過氧化物酶活性，通常使得檢測背景很高，更麻煩的是整個過程需要經(jīng)過很多次的洗滌，細(xì)胞很容易脫落，這樣篩選的重復(fù)性很差；FMAT采用熒光標(biāo)記的二抗作為檢測手段，信號放大遠(yuǎn)不及化學(xué)發(fā)光，那么檢測靈敏度很有限。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種簡便、快速、高通量且篩選成本較低的跨膜受體的單克隆抗體的篩選方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足。
[0006]本發(fā)明以內(nèi)皮素受體ETaR的抗體的篩選為例，介紹這種快速簡便的跨膜受體抗體的篩選方法。受體內(nèi)皮素受體ETaR屬于七次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)。內(nèi)皮素受體ETaR是好的藥物靶點(diǎn)，它的抗體可用于治療肺動脈高壓或其診斷。
[0007]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是: 一種跨膜受體的單克隆抗體的篩選方法，所述方法包括如下步驟:
(1)免疫原穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建
將帶有hETaR基因的載體轉(zhuǎn)染于二氫葉酸還原酶缺陷型中國倉鼠卵巢細(xì)胞，在甲氨蝶呤梯度濃度培養(yǎng)下加壓篩選，然后用FACS檢測，獲得高表達(dá)hETaR的穩(wěn)定細(xì)胞株；
(2)抗體的制備
用步驟(I)得到的高表達(dá)hETaR的穩(wěn)定細(xì)胞株作為hETaR免疫原免疫小鼠后，用FACS方法檢測血清效價直至適合抗體滴度(樣品的FACS峰值與陰性對照比較，右移I個log單位以上)時，殺死小鼠，獲取小鼠脾臟細(xì)胞，然后與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合得到雜交瘤細(xì)胞；
(3)細(xì)胞膜的制備
用PBS緩沖液洗滌步驟(I)得到的高表達(dá)hETaR的穩(wěn)定細(xì)胞株，離心棄上清液后，沉淀先用緩沖液A重懸，反復(fù)吹吸重懸液50-100次后，補(bǔ)加緩沖液A，離心，沉淀用緩沖液A洗滌后，離心，沉淀用緩沖液B重懸，最后用蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行膜總蛋白定量，分裝，得表達(dá)hETaR的細(xì)胞膜；
用PBS緩沖液洗滌二氫葉酸還原酶缺陷型中國倉鼠卵巢細(xì)胞，離心棄上清液后，沉淀先用緩沖液A重懸，反復(fù)吹吸重懸液50-100次后，補(bǔ)加緩沖液A，離心，沉淀用緩沖液A洗滌后，離心，沉淀用緩沖液B重懸，最后用蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行膜總蛋白定量，分裝，得不表達(dá)hETaR的細(xì)胞膜；
(4)基于細(xì)胞膜的ELISA篩選
通過包被不表達(dá)hETaR的細(xì)胞膜作為對照，與包被表達(dá)hETaR的細(xì)胞膜成對、平行檢測步驟(2)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)后的上清液，進(jìn)行差異化ELISA檢測，從而大規(guī)模篩選出針對hETaR這一跨膜受體的單克隆抗體。
[0008]作為優(yōu)選，步驟(I)中甲氨蝶呤梯度濃度范圍為150ηΜ_10μΜ濃度。
[0009]作為優(yōu)選，緩沖液A的配比為:10 mM HEPES，I mM MgCl2, pH 7.4,0.1 mM苯甲基磺酰氟，2x羅氏蛋白酶抑制劑。
[0010]作為優(yōu)選，緩沖液B的配比為:10 mM HEPES，I mM MgCl2, pH 7.4，Ix羅氏蛋白酶抑制劑。
[0011]作為優(yōu)選，步驟(4)具體步驟為:用PBS緩沖液將表達(dá)hETaR的細(xì)胞膜、不表達(dá)hETaR的細(xì)胞膜稀釋后，分別進(jìn)行ELISA篩選:以1-1OOyg /孔的量包被ELISA板，4°C過夜，吸去ELISA板孔中液體，然后用PBST洗滌，加入酪蛋白溶液封閉，加入作為第一抗體的步驟(2)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)后的上清液孵育后，洗滌，加入第二抗體GxM-HRP-Fc孵育后，洗滌，加入TMB顯色底物反應(yīng)，最后用硫酸終止，用酶標(biāo)儀檢測對比后，從而大規(guī)模篩選出針對hETaR這一跨膜受體的單克隆抗體。
[0012]本發(fā)明主要內(nèi)容為:a用高表達(dá)跨膜受體抗原的穩(wěn)定細(xì)胞株，制備表達(dá)有跨膜受體抗原的細(xì)胞膜；b建立基于細(xì)胞膜的ELISA篩選方法；c篩選出的抗體得到流式細(xì)胞術(shù)的驗(yàn)證。
[0013]本發(fā)明的關(guān)鍵特征是:采用低滲溶液(緩沖液A、緩沖液B)裂解高表達(dá)有完整跨膜受體的細(xì)胞，高速離心洗滌后獲取細(xì)胞膜，也即是微小細(xì)胞囊泡。完整跨膜受體鑲嵌在低滲獲取的微小細(xì)胞囊泡上，仍然可以保持天然的構(gòu)象以及正確的朝向。然后利用細(xì)胞膜上帶有大量的負(fù)電荷，包被96孔板，之后的封閉、一抗二抗孵育、洗滌、顯色和終止，建立了基于細(xì)胞膜的ELISA篩選。
[0014]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明提供了一種針對跨膜受體的單克隆抗體的篩選技術(shù)，類似于常規(guī)的ELISA，可以高通量、快速、便捷地篩選針對完整跨膜受體的單克隆抗體，具有非常高的檢測靈敏度；篩選出來的候選抗體經(jīng)過FACS驗(yàn)證確認(rèn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1是本發(fā)明的基于細(xì)胞膜的ELISA篩選雜交瘤細(xì)胞上清。每一個雜交瘤細(xì)胞上清分別用包被有CHO-DHFR-hETaR細(xì)胞膜和對照的CHO-DHFR細(xì)胞膜進(jìn)行平行篩選，標(biāo)記粗體下劃線和灰色背景表示針對hETaR特異性結(jié)合的抗體上清。
[0016]圖2:流式細(xì)胞術(shù)檢測幾個篩選出的單克隆抗體7B6，38G1和18E3與CHO-DHFR細(xì)胞(虛線)、CHO-DHFR-hETaR (實(shí)線)結(jié)合圖。灰色峰是CHO-DHFR細(xì)胞本身，灰色峰和虛線峰分別為陰性對照。
[0017]圖3:通過與全細(xì)胞ELISA方法(表2)對比，用篩選出的單克隆抗體(7B6，38G1，54C11，54C12和80H4)驗(yàn)證細(xì)胞膜ELISA方法(表I)。

【具體實(shí)施方式】
[0018]下面通過具體實(shí)施例，并結(jié)合附圖，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。
[0019]本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。
實(shí)施例
[0020]1、免疫用抗原細(xì)胞穩(wěn)定株的構(gòu)建
接種CH0-DHFR_ (二氫葉酸還原酶缺陷型中國倉鼠卵巢細(xì)胞，市售)至6孔板中，24h后用帶有hETaR基因的載體(市售)轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染前更換培養(yǎng)液，按照Invitrogen公司推薦Lipofectamine 2000的轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行轉(zhuǎn)染。48小時后，再換為含有濃度為150nM的MTX(甲氨蝶呤，市售)的完全培養(yǎng)基，每隔3天換液，待兩周左右，出現(xiàn)穩(wěn)定生長的克隆，逐漸提高M(jìn)TX的濃度進(jìn)行加壓篩選，優(yōu)選的MTX使用濃度范圍為150ηΜ-10 μ Μ。構(gòu)建的穩(wěn)定細(xì)胞株分別進(jìn)行FACS檢測，10 μ M MTX篩選后的CHO-DHFR-hETaR細(xì)胞膜上hETaR有大量表達(dá)，經(jīng)過克隆篩選獲得高表達(dá)hETaR的穩(wěn)定細(xì)胞株。
[0021]2、抗體的制備
將在弗氏佐劑(市售)中乳化的hETaR免疫原(高表達(dá)hETaR的穩(wěn)定細(xì)胞株)以1-1OOyg的劑量皮下注射BALB/c小鼠(6_8周齡)。2周后，使用不完全弗氏佐劑乳化的hETaR免疫原，加強(qiáng)免疫小鼠，此后每周加強(qiáng)一次。通過眼球放血或剪尾的方式采血，進(jìn)行FACS檢測血清效價。直至適合抗體滴度時(樣品的FACS峰值與陰性對照比較，右移I個log單位以上)，殺死小鼠，獲取脾臟細(xì)胞，和小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0 (市售)進(jìn)行融合。將所得的雜交瘤細(xì)胞在96孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，并進(jìn)行HAT (次黃嘌呤、氨甲喋呤和胸苷)篩選，以除去非融合的細(xì)胞。7-10天后收取培養(yǎng)板中的雜交瘤細(xì)胞的上清液進(jìn)行ELISA檢測。
[0022]3、細(xì)胞膜的制備
ImM EDTA消化貼壁細(xì)胞，離心收集細(xì)胞后計(jì)數(shù)，_80°C冷凍保存，或者直接用于細(xì)胞膜抗原的制備。用4°C預(yù)冷PBS Ix洗滌細(xì)胞(高表達(dá)hETaR的穩(wěn)定細(xì)胞株)，2000rpm離心5分鐘后，完全移去上清。先用1ml緩沖液A (10 mM HEPES，I mM MgCl2,pH 7.4,0.1 mM苯甲基磺酰氟，2x羅氏蛋白酶抑制劑(Roche PI cocktail,市售))重懸,用4#針頭反復(fù)吹吸細(xì)胞液50-100次后，補(bǔ)加20ml緩沖液A。lOOOOrpm，4°C離心60分鐘。沉淀用緩沖液A洗滌一次，離心后去除上清，沉淀用5-10ml緩沖液B (10 mM HEPES, I mM MgCl2, pH 7.4，Ix羅氏蛋白酶抑制劑(Roche PI cocktail,市售))重懸。最后用蛋白濃度測定試劑盒(Pierce BCA Protein Assay Kit,市售)進(jìn)行膜總蛋白定量,分裝,得表達(dá)hETaR的細(xì)胞膜(CHO-DHFR-hETaR 細(xì)胞膜)，_20°C保存。
[0023]不表達(dá)hETaR的細(xì)胞膜(CH0-DHFR細(xì)胞膜)來源為二氫葉酸還原酶缺陷型中國倉鼠卵巢細(xì)胞，制備方法同上。
[0024]4、基于細(xì)胞膜的ELISA篩選
用PBS將CHO-DHFR-ETaR或CH0-DHFR細(xì)胞膜稀釋成10 μ g/ml,以100 μ I/孔包被于高親和力的96孔板中，4°C過夜。第二天吸去孔中液體，用0.05% PBST洗滌3次。200μ1/孔加入1%酪蛋白的PBST溶液作為封閉液，置于37°C封閉2小時。經(jīng)過酪蛋白封閉后，力口入步驟(2)雜交瘤細(xì)胞的上清液(一抗)4°C孵育90 min。多次洗滌后，每孔加入100 μ I稀釋的(1:5000 稀釋于 PBST 溶液)GxM-HRP-Fc (與 HRP (Horseradish Peroxidase，辣根過氧化物酶)偶聯(lián)的羊抗鼠的第二抗體，市售)二抗，37°C孵育0.5h。洗滌5次后，每孔加Λ 100 μ I TMB (3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺，市售)顯色底物，371:反應(yīng)151^11，等體積的2皿H2SO4終止，讀取0D450值，如圖1。
[0025]在篩選實(shí)驗(yàn)中，陽性對照為免疫小鼠的血清；陰性對照為細(xì)胞培養(yǎng)基上清。選取分泌抗hETaR抗體的雜交瘤株，進(jìn)行克隆化以獲得能穩(wěn)定分泌針對hETaR的細(xì)胞株。再選取雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體上清進(jìn)行FACS驗(yàn)證。
[0026]5、陽性雜交瘤細(xì)胞上清流式分析鑒定(FACS)
用含1mM EDTA的PBS收集15個感興趣的細(xì)胞，分別加入1.5ml EP管，離心后棄上清，陰性對照樣本用流式上樣緩沖液(PBS，2% FBS)重懸。陽性處理組細(xì)胞每管加適量抗體上清，室溫孵育；離心，棄上清，用流式上樣緩沖液洗一次，再離心，重懸，加入1:100稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠熒光二抗(BD，200 μ I/孔，市售)，室溫避光孵育30 min ;離心，棄上清，再用流式上樣緩沖液洗一次，離心，最后用流式上樣緩沖液重懸，上機(jī)檢測。雜交瘤細(xì)胞上清和表達(dá)有hETaR的CHO-DHFR細(xì)胞有特異性結(jié)合，灰色峰和虛線峰分別為陰性對照，雜交瘤細(xì)胞上清對應(yīng)的實(shí)線峰有明顯右移(圖2)。
[0027]6、細(xì)胞膜的ELISA篩選與全細(xì)胞的ELISA篩選的對比實(shí)驗(yàn)
用DMEM將CHO-DHFR-hETaR或CHO-DHFR細(xì)胞稀釋成15細(xì)胞/ml，以20000細(xì)胞/孔包(到第二天大約是40000細(xì)胞/孔包)被于96孔板中，37°C，5% CO2過夜。第二天吸去孔中液體，用0.05% PBST洗滌3次。200μ1/孔加入1%酪蛋白封閉液，置于37°C封閉2小時。經(jīng)過酪蛋白封閉后，加入雜交瘤細(xì)胞上清4°C孵育90 min。多次洗滌后，每孔加入100 μ I稀釋的GxM-HRP-Fc 二抗，37°C孵育0.5h。洗滌5次后，每孔加入100 μ I TMB顯色底物，37°C反應(yīng)15min，等體積的2M H2SO4終止，讀取0D450值，陽性對照為免疫小鼠的血清；陰性對照為細(xì)胞培養(yǎng)基上清。同時，相應(yīng)的基于細(xì)胞膜的ELISA篩選法與其對照如圖3。
[0028]同現(xiàn)有的全細(xì)胞ELISA篩選方法比較:本發(fā)明基于細(xì)胞膜的ELISA抗體篩選方法更便捷，消除了細(xì)胞的無菌操作；此方法更準(zhǔn)確，可以消除因洗板而細(xì)胞脫落引起的篩選誤差。因此，我們這里描述了一個新的并優(yōu)于先前全細(xì)胞ELISA的抗體篩選方法。
[0029]以上所述的實(shí)施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出權(quán)利要求所記載的技術(shù)方案的前提下還有其它的變體及改型。
【權(quán)利要求】
1.一種跨膜受體的單克隆抗體的篩選方法，其特征在于:所述方法包括如下步驟: (1)免疫原穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建 將帶有hETaR基因的載體轉(zhuǎn)染于二氫葉酸還原酶缺陷型中國倉鼠卵巢細(xì)胞，在甲氨蝶呤梯度濃度培養(yǎng)下加壓篩選，然后用FACS檢測，獲得高表達(dá)hETaR的穩(wěn)定細(xì)胞株； (2)抗體的制備 用步驟(I)得到的高表達(dá)hETaR的穩(wěn)定細(xì)胞株作為hETaR免疫原免疫小鼠后，用FACS方法檢測血清效價直至適合抗體滴度時，殺死小鼠，獲取小鼠脾臟細(xì)胞，然后與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合得到雜交瘤細(xì)胞； (3)細(xì)胞膜的制備 用PBS緩沖液洗滌步驟(I)得到的高表達(dá)hETaR的穩(wěn)定細(xì)胞株，離心棄上清液后，沉淀先用緩沖液A重懸，反復(fù)吹吸重懸液50-100次后，補(bǔ)加緩沖液A，離心，沉淀用緩沖液A洗滌后，離心，沉淀用緩沖液B重懸，最后用蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行膜總蛋白定量，分裝，得表達(dá)hETaR的細(xì)胞膜； 用PBS緩沖液洗滌二氫葉酸還原酶缺陷型中國倉鼠卵巢細(xì)胞，離心棄上清液后，沉淀先用緩沖液A重懸，反復(fù)吹吸重懸液50-100次后，補(bǔ)加緩沖液A，離心，沉淀用緩沖液A洗滌后，離心，沉淀用緩沖液B重懸，最后用蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行膜總蛋白定量，分裝，得不表達(dá)hETaR的細(xì)胞膜； (4)基于細(xì)胞膜的ELISA篩選 通過包被不表達(dá)hETaR的細(xì)胞膜作為對照，與包被表達(dá)hETaR的細(xì)胞膜成對、平行檢測步驟(2)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)后的上清液，進(jìn)行差異化ELISA檢測，從而大規(guī)模篩選出針對hETaR這一跨膜受體的單克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于:步驟(I)中甲氨蝶呤梯度濃度范圍為150ηΜ-10μΜ 濃度。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于:緩沖液A的配比為:10mM HEPES，ImM MgCl2, pH 7.4,0.1 mM苯甲基磺酰氟，2x羅氏蛋白酶抑制劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于:緩沖液B的配比為:10mM HEPES，ImM MgCl2, pH 7.4，Ix羅氏蛋白酶抑制劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的篩選方法，其特征在于:步驟(4)具體步驟為:用PBS緩沖液將表達(dá)hETaR的細(xì)胞膜、不表達(dá)hETaR的細(xì)胞膜稀釋后，分別進(jìn)行ELISA篩選:以1-1OOyg /孔的量包被ELISA板，4°C過夜，吸去ELISA板孔中液體，然后用PBST洗滌，加入酪蛋白溶液封閉，加入作為第一抗體的步驟(2 )雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)后的上清液孵育后，洗滌，加入第二抗體GxM-HRP-Fc孵育后，洗滌，加入TMB顯色底物反應(yīng)，最后用硫酸終止，用酶標(biāo)儀檢測對比后，從而大規(guī)模篩選出針對hETaR這一跨膜受體的單克隆抗體。
【文檔編號】C07K16/28GK104513313SQ201310445524
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年9月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月27日
【發(fā)明者】張 成, 汪笑峰, 蓋順, 景書謙 申請人:杭州鴻運(yùn)華寧生物醫(yī)藥工程有限公司