從橡膠樹葉片中分離篩選拮抗細(xì)菌的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種從橡膠樹葉片中分離篩選拮抗細(xì)菌的方法，該方法采用常規(guī)的采樣分離方法從病葉上分離到細(xì)菌，通過將細(xì)菌與供試菌橡膠樹炭疽菌RC178進(jìn)行對峙培養(yǎng)，獲得一株對橡膠樹炭疽病病原菌RC178有明顯抑制作用的拮抗細(xì)菌。所分離的拮抗細(xì)菌常用作生防菌，有望制成微生物制劑，為橡膠樹炭疽病生物防治提供基礎(chǔ)準(zhǔn)備。
【專利說明】從橡膠樹葉片中分離篩選拮抗細(xì)菌的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物防治細(xì)菌領(lǐng)域，具體來說，涉及一種從橡膠樹葉片中分離篩選拮抗細(xì)菌的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]橡膠樹炭疽病是橡膠樹生產(chǎn)中嚴(yán)重影響膠乳產(chǎn)量和品質(zhì)的重要病害，病原菌為膠抱炭疽菌(C.gloeospor1ides Penz.)和尖抱炭疽菌(C.acutatum Simmons)，膠抱炭疽菌較尖孢炭疽菌更為常見，尖孢炭疽病為我國橡膠樹新發(fā)生病害。橡膠樹炭疽病為害導(dǎo)致葉片組織壞死或大量脫落，嚴(yán)重時(shí)造成大量落葉和嫩梢回枯，樹體衰弱，縮短割膠期限，推遲開割時(shí)間，使橡膠總產(chǎn)量顯著下降。
[0003]目前，國內(nèi)外對橡膠炭疽病開展了一系列研宄，主要集中在病害流行及藥劑篩選方面。崔昌華等(2006)采用菌落生長速率法在室內(nèi)進(jìn)行橡膠樹炭疽病菌對三唑酮、丙環(huán)唑、百菌清、代森鋅、多菌靈5種藥劑的敏感性測定。蔡志英等(2008)采用生長速率法室內(nèi)測定了云南省橡膠炭疽病菌膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌對咪鮮胺、多菌靈、甲基托布津、溴菌腈、百菌清和代森錳鋅的敏感性。鄭肖蘭(2008)采用菌落生長速率法測定了 18種橡膠炭疽病菌菌株對保治達(dá)等4種常用真菌性藥劑的敏感性。王蘭英等(2010)研宄報(bào)道了 8種殺菌劑對橡膠炭疽菌孢子萌發(fā)的抑制活性。然而，生產(chǎn)上對于橡膠炭疽病的防治仍以化學(xué)殺菌劑為主，而化學(xué)農(nóng)藥造成的病菌抗藥性、毒性和環(huán)境污染問題日益突出，已經(jīng)成為制約農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要障礙。因此，亟待需要尋找一種具有環(huán)境兼容性好、無毒無害的生防微生物，作為化學(xué)農(nóng)藥的理想替代品。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種從橡膠樹葉片中分離篩選拮抗細(xì)菌的方法，包括以下步驟:
(1)采集橡膠感病葉片；
(2)用升汞浸泡葉片，然后用無菌水沖洗；
(3)將葉片放在PDA培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)48h后將長出的菌體轉(zhuǎn)接至相同的培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)48h后純化；同時(shí)，將純化后所得的細(xì)菌采用梯度稀釋涂布LB平板培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)48h后挑取單菌落接至相應(yīng)培養(yǎng)基斜面上；
(4)將單菌落28°C震蕩培養(yǎng)約12小時(shí)，吸取少量置于LB固體培養(yǎng)基上，涂抹均勻，28°C培養(yǎng)；然后通過無限稀釋法處理獲得單一菌株；
(5)從菌株中篩選出細(xì)菌，轉(zhuǎn)接到LB平板，用涂布平板法得到單菌落；對獲得的單菌株與供試菌橡膠樹炭疽菌RC178進(jìn)行對峙培養(yǎng)；
(6)通過觀察有無抑菌圈，挑選出現(xiàn)抑菌圈的拮抗細(xì)菌。
[0005]在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，步驟(I)為:采集不同來源的橡膠感病葉片，清水沖洗；并且剪取大小為5X 5mm的小葉片備用。
[0006]在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，步驟(2)為:將剪取的小葉片用升汞浸泡30秒，然后用無菌水沖洗3次，晾干。
[0007]在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，步驟(3)為:用滅過菌的鑷子將剪取的小葉片貼放到PDA固體培養(yǎng)基上，每皿均勻擺放4塊，再將培養(yǎng)皿用保鮮膜密封。倒置放入恒溫培養(yǎng)箱中，28°C培養(yǎng)。每隔12h進(jìn)行觀察48h后將長出的菌體轉(zhuǎn)接至相同的培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)48h后進(jìn)行純化；同時(shí)，將純化后所得的細(xì)菌采用梯度稀釋涂布LB平板培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)48h后挑取單菌落接至相應(yīng)培養(yǎng)基斜面上。
[0008]在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，步驟(4)為:將放置于8?10°C培養(yǎng)箱中的斜面試管取出。在無菌操作臺(tái)中，將液體LB培養(yǎng)基分裝到錐形瓶中，然后用接種針挑去少量的細(xì)菌于錐形瓶中，封口。放置于28°C搖床上震蕩培養(yǎng)約12小時(shí)，取出。然后再通過無限稀釋法處理獲得單一菌株。
[0009]在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，PDA培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯200g/L、葡萄糖或蔗糖1g/L、瓊脂 18g/Lo
[0010]在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，LB培養(yǎng)基配方為:胰蛋白胨10g/L、酵母浸出粉5g/L、NaCl 10g/L，pH = 7 ;在上述配方中加入瓊脂形成LB固體培養(yǎng)基。
[0011]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的分離篩選方法具有以下有益效果:
(1)本發(fā)明方法很容易得到新的拮抗細(xì)菌菌株，該菌株對橡膠樹炭疽菌RC178具有十分明顯的拮抗作用；它常用作生防菌，有望制成微生物制劑，為橡膠樹炭疽病生物防治提供基礎(chǔ)準(zhǔn)備。
(2)使用本發(fā)明方法得到的拮抗細(xì)菌菌株可以大幅度的減少化學(xué)農(nóng)藥對環(huán)境帶來的污染，同時(shí)，可以達(dá)到控制病害發(fā)生的目的。
附圖簡介
[0012]圖1顯示了拮抗細(xì)菌與RC178對峙圖。
[0013]圖2顯示了拮抗細(xì)菌的菌落形態(tài)和孢子形態(tài)。

【具體實(shí)施方式】
[0014]以下作為實(shí)施例對本發(fā)明的方法進(jìn)一步說明，將有助于對本發(fā)明的進(jìn)一步的理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不受這些實(shí)施例的限定，其保護(hù)范圍由權(quán)利要求書來決定。
[0015]實(shí)施例1
[0016]從橡膠樹葉片中分離篩選拮抗細(xì)菌的方法具體包含下列步驟:
I采樣采集不同地區(qū)橡膠感病葉片，將采集好的葉片放入塑料袋中并記錄。
2材料表面消毒與拮抗細(xì)菌分離
2.1清水沖洗與剪取病葉用清水洗去葉片上的灰塵砂礫，晾干。用剪刀在病健交界處剪取大小為5X 5mm的小葉片備用；
2.2樣品消毒將剪取的小病葉放入燒杯，用升汞浸泡30秒，在浸泡的過程中應(yīng)注意不斷輕輕攪動(dòng)小病葉，然后用無菌水沖洗三次，晾干，備用；
2.3細(xì)菌分離培養(yǎng)用滅過菌的鑷子將剪取的小葉片貼放到PDA固體培養(yǎng)基上，每皿均勻擺放4塊，再將培養(yǎng)皿用保鮮膜密封。倒置放入恒溫培養(yǎng)箱中，28°C培養(yǎng)。每隔12h進(jìn)行觀察48h后將長出的菌體轉(zhuǎn)接至相同的培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)48h后進(jìn)行純化；同時(shí)，將純化后所得的細(xì)菌采用梯度稀釋涂布LB平板培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)48h后挑取單菌落接至相應(yīng)培養(yǎng)基斜面上；
3拮抗細(xì)菌的篩選
3.1細(xì)菌的純化將放置于8?10°C培養(yǎng)箱中的斜面試管取出，在無菌操作臺(tái)中，將液體LB培養(yǎng)基分裝到錐形瓶中，然后用接種針挑去少量的細(xì)菌于錐形瓶中，封口。放置于28°C搖床上震蕩培養(yǎng)約12小時(shí)，取出。然后用移液器吸取200uL于LB固體培養(yǎng)基上，涂抹棒涂抹均勻，于28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)。然后再通過無限稀釋法處理獲得單一菌株；
3.2對峙培養(yǎng)篩選拮抗細(xì)菌菌株從病葉分離的各菌株中篩選出細(xì)菌，轉(zhuǎn)接到LB平板，然后用涂布平板法得到單菌落29株。供試菌株RC178用無菌打孔器打取直徑為6_的菌餅，置于直徑為90mm的平板中間，圍繞RC178十字交叉的4個(gè)角落分別接種經(jīng)過初篩的29株菌株，每個(gè)菌株3個(gè)重復(fù)，用保鮮膜封上培養(yǎng)皿以防污染。另外，采用點(diǎn)線處理法和其他對峙形式，進(jìn)行對峙培養(yǎng)。以只接病原菌，不接分離菌株為對照。于28°C培養(yǎng)4?7d，觀察所分離的細(xì)菌菌株對供試菌株RC178的抑菌作用；
4形態(tài)學(xué)特征將待鑒定措抗細(xì)菌接種于LB平板上，37°C培養(yǎng)48h，觀察菌落形態(tài)并記錄結(jié)果。從圖1中可以看出，拮抗細(xì)菌與炭疽菌RC178用各種對峙方式培養(yǎng)都會(huì)出現(xiàn)明顯的抑菌圈，該抑菌圈在接拮抗菌后2d即出現(xiàn)，且該處病原菌停止生長，連續(xù)觀察10d，抑菌圈保持不變，抑菌率均可達(dá)到65.8%。
挑取LB平板上37°C培養(yǎng)48h的待鑒定拮抗菌進(jìn)行革蘭氏染色，1000倍光鏡顯微觀察其菌體和芽孢形態(tài)，并記錄觀察結(jié)果；拮抗菌在顯微鏡觀察下呈深紫色，為革蘭氏陽性菌。在1000倍光鏡下細(xì)菌的芽孢呈短棒狀，如圖2右所示。拮抗細(xì)菌的菌株在LB平板上為扁平狀，呈淡黃色不透明，近圓形、表面有皺起、邊緣不整齊，呈波浪狀和裂片狀[12]，如圖2左所示。
OTNA擴(kuò)增和16S rDNA基因擴(kuò)增及序列分析利用純化后提取菌株基因組DNA為模板，采用細(xì)菌通用引物PCR擴(kuò)增其16S rDNA片段。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行I %的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將PCR產(chǎn)物利用DNA回收試劑盒回收，純化。然后經(jīng)上海英駿生物技術(shù)有限公司廣州分公司測序；
PCR 所用引物為 UPl: 5 ' -TACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATA-3 ' ；UP2:5' -AGTAAGGAGGTGATCCAACCGCA-3,。
PCR 反應(yīng)體系:菌液 lyL;dNTP 2.0 μ L ；UP11.0yL ；UP21.0yL ；10XPCRBuffer2.5 μ L ；Taq DNA 聚合酶 0.2 μ L ;超純水補(bǔ)足至 25 μ L。
PCR 反應(yīng)條件:94°C 5min ；94°C 30Sec、52°C 30Sec、72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C lOmin，4°C保存。
PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化后測序。
[0017]根據(jù)菌株形態(tài)及培養(yǎng)特征和16SrRNA基因分析將其鑒定為枯草芽孢桿菌(B.subtilis)ο
[0018]而枯草芽孢桿菌作為多種病原菌的拮抗菌，是一類重要的生防真菌。利用生防菌制備微生物制劑來防治病害可以大幅度的減少化學(xué)農(nóng)藥對環(huán)境帶來的污染，同時(shí)，可以達(dá)到控制病害發(fā)生的目的。橡膠樹炭疽病的防治也向著生物防治的方向發(fā)展。分離出拮抗菌是制備微生物制劑的前提，為更好的開展橡膠樹炭疽病的生物防治做出了準(zhǔn)備。
【權(quán)利要求】
1.一種從橡膠樹葉片中分離篩選拮抗細(xì)菌的方法，包括以下步驟: (1)采集橡膠感病葉片； (2)用升汞浸泡葉片，然后用無菌水沖洗； (3)將葉片放在PDA培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)48h后將長出的菌體轉(zhuǎn)接至相同的培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)48h后純化；同時(shí)，將純化后所得的細(xì)菌采用梯度稀釋涂布LB培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)48h后挑取單菌落接至相應(yīng)培養(yǎng)基斜面上； (4)將單菌落28°C震蕩培養(yǎng)約12小時(shí)，吸取少量置于LB固體培養(yǎng)基上，涂抹均勻，28°C培養(yǎng)；然后通過無限稀釋法處理獲得單一菌株； (5)從菌株中篩選出細(xì)菌，轉(zhuǎn)接到LB平板，用涂布平板法得到單菌落；對獲得的單菌株與供試菌橡膠樹炭疽菌RC178進(jìn)行對峙培養(yǎng)； (6)通過觀察有無抑菌圈，挑選出現(xiàn)抑菌圈的拮抗細(xì)菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述PDA培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯200g/L、葡萄糖或鹿糖10g/L、瓊脂18g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述LB培養(yǎng)基配方為:胰蛋白胨10g/L、酵母浸出粉5g/L、NaCl 10g/L，pH = 7 ;在上述配方中加入瓊脂形成LB固體培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述步驟⑷的震蕩培養(yǎng)為:將放置于8?10°C培養(yǎng)箱中的斜面試管取出，在無菌操作臺(tái)中，將液體LB培養(yǎng)基分裝到錐形瓶中，然后用接種針挑去少量的細(xì)菌于錐形瓶中，封口 ；放置于28°C搖床上震蕩培養(yǎng)約12小時(shí)，取出。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其中所述步驟(5)的對峙培養(yǎng)為:用涂布平板法得到單菌落，供試菌株RC178用無菌打孔器打取直徑為6_的菌餅，置于直徑為90_的平板中間，在圍繞RC178十字交叉的4個(gè)角落分別接種經(jīng)過初篩的多個(gè)菌株，每個(gè)菌株3個(gè)重復(fù)，用保鮮膜封上培養(yǎng)皿以防污染；采用點(diǎn)線處理法和其他對峙形式，進(jìn)行對峙培養(yǎng)；以只接病原菌，不接分離菌株為對照。
【文檔編號(hào)】C12R1/125GK104480190SQ201410756455
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月10日
【發(fā)明者】鄭肖蘭, 梁艷瓊, 胡加誼, 吳偉懷, 習(xí)金根, 鄭金龍, 賀春萍, 易克賢 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所