用于檢測(cè)2型糖尿病視網(wǎng)膜病變的miR-3197分子標(biāo)記物及其擴(kuò)增引物和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種miRNA分子標(biāo)記物，尤其是涉及一種用于檢測(cè)2型糖尿病視網(wǎng)膜病 變的miR-3197分子標(biāo)記物及其擴(kuò)增引物和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 2型糖尿病(Type 2 diabetes mellituS，T2DM)又名非胰島素依賴性糖尿病，是糖 尿病最主要的類型，約占90%(23499527)。是一組以慢性高血糖為特征的多因素代謝異常綜 合征，它是全球性主要致死、致殘及耗費(fèi)巨大的疾病之一。糖尿病性視網(wǎng)膜病變(Diabetic retinopathy, DR)作為糖尿病最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，已成為糖尿病患者致盲的首位 原因，目前全球DR患者約9300萬(wàn)（22301125)。我國(guó)糖尿病患者9240萬(wàn)，居全球第一 位，其中DR患病率為37%(20335585)。且隨著糖尿病發(fā)病率的增加和人均壽命的延長(zhǎng)， DR的患病率正不斷增加，提示未來(lái)DR將是視力喪失和視功能損害的主要原因。糖尿病視網(wǎng) 膜病變?cè)\斷的金標(biāo)準(zhǔn)是眼底熒光血管造影，但其是侵入性檢測(cè)，具有創(chuàng)傷性，并且價(jià)格昂 貴，費(fèi)時(shí)。因此，尋找一些生物標(biāo)記物預(yù)測(cè)或警示DR的發(fā)生，對(duì)降低其致盲率有著重要的意 義。
[0003] 目前，已有研究表明循環(huán)miRNAs是一類具有潛在臨床診斷價(jià)值的新型生物標(biāo)志 物。但目前，國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有公開任何關(guān)于利用miRNA分子作為檢測(cè)2型糖尿病視網(wǎng)膜病變預(yù) 測(cè)或診斷的分子標(biāo)記物來(lái)檢測(cè)2型糖尿病視網(wǎng)膜病變的相關(guān)研究報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種用于檢測(cè)2型糖尿病視網(wǎng)膜病變的miR-3197 分子標(biāo)記物及其擴(kuò)增引物和應(yīng)用 ，其中循環(huán) miR-3197 表達(dá)水平與 2 型糖尿病性視網(wǎng)膜 病變患病率呈正相關(guān)，檢測(cè)效率高，針對(duì)性強(qiáng)。
[0005] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為:一種用于檢測(cè)2型糖尿病視網(wǎng)膜 病變的miR-3197分子標(biāo)記物，所述的miRNA分子標(biāo)記物為miR-3197分子標(biāo)志物，分子標(biāo)記物 miR-3197基因片段的核苷酸序列為5'GGAGGCGCAGGCUCGGAAAGGCG-3'。
[0006] 上述miR-3197分子標(biāo)志物的正向擴(kuò)增引物的核苷酸序列為5'-GGA GGC GCA GGC TCG GAA -3'，其反向擴(kuò)增引物為通用引物。
[0007] -種用于檢測(cè)2型糖尿病視網(wǎng)膜病變的試劑盒，該試劑盒包括擴(kuò)增上述miR-3197 基因片段的正向擴(kuò)增引物:5'-GGA GGC GCA GGC TCG GAA -3'以及cel-miR-39內(nèi)參基因的 正向擴(kuò)增引物的核苷酸序列為:5 ' -CGTGAGTCGATCCATATTGTA-3 '。
[0008] -種利用上述miR-3197分子標(biāo)記物檢測(cè)2型糖尿病視網(wǎng)膜病變的檢測(cè)方法，步驟 如下： a、 總RNA的提??； b、 采用miScript? II RT Kit試劑盒對(duì)miRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄； c、 PCR擴(kuò)增:利用7500real_time PCR system儀器進(jìn)行，加入cel-miR-39作為內(nèi)參基 因，25ul擴(kuò)增體系：12 · 5ulSYBR Green混合液，2 · 5ul通用引物，2 · 5ul特異性引物，2ulcDNA 溶液和5.5ul無(wú) RNA酶水;擴(kuò)增反應(yīng)條件:初始激活在95°C，15分鐘；94 °C 15 s，55 °C 30 s，70 °C 30 s，共40次循環(huán);反應(yīng)完成后進(jìn)行熔解曲線分析;其中引物溶液包括擴(kuò)增miR-3197基因片段的正向擴(kuò)增引物:5'-GGA GGC GCA GGC TCG GAA -3'以及cel-miR-39內(nèi)參基 因的正向擴(kuò)增引物，其核苷酸序列為:5 ' -CGTGAGTCGATCCATATTGTA-3 '，反向引物為通用引 物;各引物濃度均為l〇pmol/ul; d、 鑒定:擴(kuò)增完成后，利用方法分析基因表達(dá)量，若miR-3197基因片段高水平表 達(dá)，且表達(dá)倍數(shù)高于1.7則認(rèn)為處于糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)病早期。
[0009] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明首次公開了用于檢測(cè)2型糖尿病視網(wǎng) 膜病變的miR-3197分子標(biāo)記物及其擴(kuò)增引物和應(yīng)用，其中分子標(biāo)記物為miR-3197分子標(biāo)志 物、內(nèi)參基因?yàn)閏el-miR-39以及擴(kuò)増miR-3197、cel-miR-39的正向引物;檢測(cè)方法為總RNA 的提取、cDNA合成、PCR擴(kuò)增和鑒定，鑒定快速、簡(jiǎn)便、特異和有效。循環(huán)miR-3197表達(dá)水平增 加會(huì)導(dǎo)致糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生，與糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)病率呈正相關(guān)。該標(biāo)記物的發(fā)掘 和應(yīng)用可以方便快捷地在分子水平上實(shí)現(xiàn)對(duì)2型糖尿病視網(wǎng)膜病變的檢測(cè)，檢測(cè)效率高，針 對(duì)性強(qiáng)，同時(shí)，以循環(huán)miR-3197表達(dá)水平為靶點(diǎn)的藥物有望成為2型糖尿病視網(wǎng)膜病變輔助 診斷、檢測(cè)和篩選的一種新手段。
【附圖說(shuō)明】
[0010] 圖1為循環(huán)miR-3197在DR與T2DM的表達(dá)水平差異性圖； 圖2是PCR擴(kuò)增獲得的miR-3197基因片段的R0C曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0011] 以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。 具體實(shí)施例
[0012] 1、研究對(duì)象的收集 本研究所有樣本都是在單位醫(yī)學(xué)研究倫理道德委員會(huì)批準(zhǔn)和患者知情同意情況下收 集，其中健康組血清樣本144例、糖尿病前期組血清樣本70例、T2DM血清樣本117例及DR血清 樣本75例。收集要求:①診斷均經(jīng)眼底熒光血管造影檢查證實(shí)，DR經(jīng)證實(shí)有微血管瘤，出血， 硬性滲出，棉絮狀軟性滲出等癥狀;健康組、糖尿病前期組、T2DM組經(jīng)證實(shí)雙眼散瞳檢查眼 底正常。均排除①急、慢性感染性疾病;②嚴(yán)重心、腦、肝功能損害及影響糖代謝的其它內(nèi)分 泌疾病;③單眼或雙眼屈光介質(zhì)明顯渾濁，影響眼底觀察者。
[0013] 2、運(yùn)用基因芯片在5例糖尿病前期、5例健康人、5例T2DM及5例DR(根據(jù)年齡、性別、 BMI及病史(>10年)嚴(yán)格配對(duì))血清樣本中篩選出有差異明顯、可能與DR發(fā)展密切相關(guān)的循 環(huán)miRNAs〇
[0014] 根據(jù)芯片檢測(cè)技術(shù)，結(jié)果顯示循環(huán)111丨1?-3197、111丨1?-2116-5?、111丨1?-3939及111丨1?-1910-3p在DR與T2DM組中表達(dá)差異顯著。各分子標(biāo)記物基因片段的核苷酸序列如下：分子標(biāo)記物 miR-3197的核苷酸序列為5 ' -GGAGGCGCAGGCUCGGAAAGGCG-3 ' ； miR-2116-5P的核苷酸序列為:5 ' -GGUUCUUAGCAUAGGAG⑶CU-3 ' ； miR-3939的核苷酸序列為：5 ' -UACGCGCAGACCACAGGAUGUC-3 ' ； miR-1910-3p的核苷酸序列為:5 ' -GAGGCAGAAGCAGGAUGACA-3 ' ； 3、通過(guò)根據(jù)年齡、性別、BMI及病史（>10年）進(jìn)行匹配，最后配對(duì)出45例DR血清和45例 T2DM血清樣本，并進(jìn)一步擴(kuò)大樣本驗(yàn)證。
[0015] 4、應(yīng)用miRNeasy Serum/Plasma Kit(Qiagen)試劑盒提取樣本的血清miRNA，再通 過(guò)分光光度測(cè)定儀檢測(cè)所得miRNA的濃度，以供循環(huán)miR-3197、miR-2116-5P、miR-3939及 miR-1910-3p熒光定量PCR檢測(cè)。
[0016] 5、RT_PCR 檢測(cè)