一種區(qū)分活動性結(jié)核和潛伏結(jié)核感染的檢測試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物治療領(lǐng)域，尤其涉及一種區(qū)分活動性結(jié)核和潛伏結(jié)核感染的檢測 試劑盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)核病仍然是威脅人類健康的主要傳染病之一，每年全世界依然有幾百萬的新發(fā) 結(jié)核病例。我國在結(jié)核病的預(yù)防和控制上投入了大量人力物力，盡管我國廣泛接種卡介苗 (BCG)，并依照WHO的標(biāo)準(zhǔn)來治療結(jié)核病患者，但每年死于結(jié)核的人數(shù)依然徘徊于主要傳染 病的前三位。特別是近年來，隨著耐藥結(jié)核以及耐多藥結(jié)核菌株的流行，以及結(jié)核與艾滋合 并感染的增多，使得結(jié)核問題變得更為復(fù)雜。持續(xù)升溫的結(jié)核問題使得發(fā)達(dá)國家也加強(qiáng)了 結(jié)核基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究方面的投入，包括臨床快速診斷，改良或研發(fā)新疫苗，研發(fā)新型抗 結(jié)核藥物，以及研究結(jié)核桿菌同宿主免疫系統(tǒng)之間的相互作用機(jī)制。
[0003] 結(jié)核感染機(jī)體后，免疫反應(yīng)中的調(diào)節(jié)子，比如細(xì)胞因子，細(xì)胞表面受體等等，一直 是研究的重點(diǎn)。關(guān)注這些免疫調(diào)節(jié)子，不僅可以了解結(jié)核感染的具體致病機(jī)制，更可以利用 相關(guān)因子作為診斷或治療的靶標(biāo)，來開發(fā)新型診斷技術(shù)或治療手段。比如IFN-γ主要由CD4 和CD8T細(xì)胞分泌，是指導(dǎo)TH1型細(xì)胞免疫的主要細(xì)胞因子。目前基于IFN-γ釋放試驗(yàn)診斷結(jié) 核感染的方法，就是利用血液中特異性T淋巴細(xì)胞來識別TB抗原，釋放IFN-γ的原理。在已 有研究中發(fā)現(xiàn)，潛伏結(jié)核感染者血里IFN- γ含量高于活動性結(jié)核病人，另外一些炎癥因子， 比如TNF-a，IL-6，IP-10和ΜΙΡ-1等等，也隨著ΤΒ發(fā)病呈現(xiàn)不同的表達(dá)譜。而另一些特征性因 子，比如細(xì)胞表面受體TLR2，TLR4等的表達(dá)也與結(jié)核發(fā)病相關(guān)。
[0004] 此外，結(jié)核病發(fā)生與否，主要受兩種因素的影響，一為感染菌量及結(jié)核桿菌毒力的 大小，另一為機(jī)體免疫抵抗力的高低。所以老年人與兒童等機(jī)體免疫抵抗力較低的人群較 容易發(fā)生結(jié)核病。這與活動性結(jié)核患者體內(nèi)調(diào)控系統(tǒng)可能存在著失調(diào)的情況有關(guān)，這其中 可能包含一類特殊的調(diào)節(jié)子，microRNA，在結(jié)核感染中表達(dá)情況與調(diào)節(jié)作用都并不清楚，尚 在研究中。
[0005] MicroRNA是一種內(nèi)源非編碼的小RNA，在生物體內(nèi)起著重要調(diào)控作用。它主要在轉(zhuǎn) 錄后水平通過降解mRNA或抑制翻譯的方式，抑制靶基因的表達(dá)。這種調(diào)控作用貫穿于細(xì)胞 生長，分化，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的各個(gè)環(huán)節(jié)。自microRNA被發(fā)現(xiàn)以來，研究日新月異，越來越多的研究 發(fā)現(xiàn)microRNA在人類各種疾病中都具有特征表達(dá)譜，對于發(fā)病或疾病的進(jìn)程具有預(yù)示作 用。
[0006] 現(xiàn)有技術(shù)中，已經(jīng)可以通過建立mi croRNA特征表達(dá)譜，來揭示mi croRNA與相關(guān)疾 病之間的聯(lián)系;更多的研究者希望能找到疾病特征的microRNA，用來為疾病診斷服務(wù);還有 研究者把特殊的microRNA作為治療的靶點(diǎn)，進(jìn)行藥物開發(fā)。
[0007] 現(xiàn)有的采用microRNA對疾病進(jìn)行診斷或治療的技術(shù)有：如由丹麥制藥公司 Santaris Pharma開發(fā)的LNA-antimiRTM-122已經(jīng)進(jìn)入了臨床試驗(yàn)，是世界上首個(gè)在人體中 試驗(yàn)的micro RNA藥物;又如Hoekstra等找到miR-135a在冠狀動脈疾病(CAD)患者中上調(diào)， 而miR-147卻在CAD患者中明顯下調(diào)表達(dá)。MiR-146a，miR-155，miR-132和miR-16被報(bào)道在風(fēng) 濕病人TOMC中呈不同程度的上調(diào)表達(dá)。Da i等發(fā)現(xiàn)有16個(gè)mi croRNA是在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患 者的PBMC中差異表達(dá)。Voellenkle等對缺血性慢性心衰患者（ICM)、非缺血性心肌擴(kuò)張型心 衰患者(NIDCM)以及對照組PBMC中microRNA表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)miR-107，miR-139和miR-142-5p在兩組患者中都是下調(diào)表達(dá)，而miR-142-3p和miR-29b僅在NIDCM患者中上調(diào)，同時(shí) miR-125b和miR-497僅在ICM患者中下調(diào)。
[0008] 近幾年，miRNA在結(jié)核感染中的研究已經(jīng)取得一定進(jìn)展。在沒有結(jié)核抗原誘導(dǎo)時(shí)， miRNA在結(jié)核患者PBMC中呈現(xiàn)差異表達(dá)譜，有研究對比結(jié)核患者和健康人兩組人群，發(fā)現(xiàn)在 活動性結(jié)核患者外周血單核細(xì)胞中有28個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，2個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)。由于 microRNA檢測技術(shù)復(fù)雜，不同的microRNA對疾病的表達(dá)差異較大，因此，亟待對與結(jié)核感染 相關(guān)的microRNA進(jìn)一步的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明旨在對與結(jié)核感染相關(guān)的microRNA進(jìn)一步的研究，并提供了一種區(qū)分活動 性結(jié)核和潛伏結(jié)核感染的檢測試劑盒及其應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明的第一方面提供了一種區(qū)分活動性結(jié)核和潛伏結(jié)核感染的檢測試劑盒，包 括序列為SEQ ID No.l、SEQ ID No.2、SEQ ID Νο·3、以及SEQ ID Νο·4的micro RNA特異性 擴(kuò)增引物。
[0011 ] 上述的四種特異性擴(kuò)增引物相對應(yīng)的microRNA為與結(jié)核感染有關(guān)的microRNA，分 別是 miR-107、miR-23c、miR-3926 和 miR-4423-3p。
[0012] 其中，miR-107 序列為agcagcauuguacagggcuauca ;miR_23c 序列 aucacauugccagugauuaccc ;miR_3926 序列為uggccaaaaagcaggcagaga;miR-4423_3p序列為 auaggcaccaaaaagcaacaa 〇
[0013] 優(yōu)選地，上述試劑盒還包括real-time PCR試劑、內(nèi)參引物、micro RNA反轉(zhuǎn)錄體系 和緩沖液。
[0014] 另一方面，本發(fā)明還提供上述試劑盒的使用方法，包括以下步驟：
[0015] 步驟一，從外周血中分離單個(gè)核細(xì)胞；
[0016] 步驟二，從步驟一所得單個(gè)核細(xì)胞中抽提總RNA;
[0017] 步驟三，使用polyA加尾的方法反轉(zhuǎn)錄cDNA
[0018] 步驟四，以U6作為參比基因，檢測miR-107、miR-23c、miR-3926或miR-4423-3p的相 對表達(dá)倍數(shù)；
[0019] 步驟五，根據(jù)步驟四所得的相對表達(dá)倍數(shù)進(jìn)行活動性結(jié)核和潛伏結(jié)核的判定。
[0020] 在本發(fā)明一個(gè)較為優(yōu)選的實(shí)施例中，所述的活動性結(jié)核病血液檢測試劑及其所包 含的PCR擴(kuò)增特異性引物還可包括序列SEQ ID No.5。序列SEQ ID No.5為本發(fā)明中所需使 用計(jì)算mi croRNA相對表達(dá)倍數(shù)的內(nèi)參基因 U6的PCR擴(kuò)增特異性引物。
[0021] 具體地：
[0022] 本發(fā)明所述SEQ ID No. 1(本發(fā)明下文也稱為"hsa-miR-107"）的序列為5'-agcagcattgtacagggctatca-3,；
[0023] 本發(fā)明所述的SEQ ID No.2(本發(fā)明下文也稱為"hsa-miR-23c"）的序列為5'- atcacattgccagtgattaccc-3,；
[0024] 本發(fā)明所述的SEQIDNo.3(本發(fā)明下文也稱為"hsa-miR-3926"）的序列為5'-tggccaaaaagcaggcagaga-3 ,；
[0025] 本發(fā)明所述的SEQIDNo.4(本發(fā)明下文也稱為"hsa-miR-4423-3p"）的序列為5'-ataggcaccaaaaagcaacaa-3 ,；
[0026] 本發(fā)明所述的SEQIDNo.5(本發(fā)明下文也稱為"U6-part"）的序列為5'-ctcgcttcggcagcacatatac_3 ,〇
[0027] 進(jìn)一步地，檢測miR-107時(shí)，具體判定方法為：
[0028] miR-107的相對表達(dá)倍數(shù)小于等于0.4478時(shí)，判斷為非活動性結(jié)核；大于0.4478 時(shí)，判斷為活動性結(jié)核。
[0029]進(jìn)一步地，檢測miR-23c時(shí)，具體判定方法為：
[0030] miR-23c的相對表達(dá)倍數(shù)小于等于0.804時(shí)，判斷為非活動性結(jié)核;大于0.804時(shí)， 判斷為活動性結(jié)核。
[0031 ] 進(jìn)一步地，檢測miR-3926時(shí)，具體判定方法為：
[0032] miR-3926的相對表達(dá)倍數(shù)小于等于0.6063時(shí)，判斷為非活動性結(jié)核；大于0.6063 時(shí)，判斷為活動性結(jié)核。
[0033] 進(jìn)一步地，檢測miR-4423-3p時(shí)，具體判定方法為：
[0034] miR-4423-3p的相對表達(dá)倍數(shù)小于等于0.5211時(shí)，判斷為非活動性結(jié)核；大于 0.5211時(shí)，判斷為活動性結(jié)核。
[0035]本發(fā)明一種區(qū)分活動性結(jié)核和潛伏結(jié)核感染的檢測試劑盒及其應(yīng)用具有以下的 優(yōu)選或有益效果：
[0036]本發(fā)明可用于T-SP0T.TB陽性受試者中活動性結(jié)核病血液的檢測，為活動性結(jié)核 病的快速診斷提供新的技術(shù)基礎(chǔ);本發(fā)明操作快速、合理可行，可以提高活動性結(jié)核病的診 斷效率。
【附圖說明】
[0037] 圖1A為用熒光定量PCR的方法檢測在活動性結(jié)核患者、結(jié)核潛伏感染者血液中 miR-107相對值散點(diǎn)圖；
[0038] 圖1B為用熒光定量PCR的方法檢測在活動性結(jié)核患者、結(jié)核潛伏感染者血液中 miR-23c相對值散點(diǎn)圖；
[0039] 圖1C為用熒光定量PCR的方法檢測在活動性結(jié)核患者、結(jié)核潛伏感染者血液中 miR-3926相對值散點(diǎn)圖；
[0040] 圖1D為用熒光定量PCR的方法檢測在活動性結(jié)核患者、結(jié)核潛伏感染者血液中 miR-4423-3p相對值散點(diǎn)圖；
[0041 ] 圖2A為miR-107的決策樹圖；
[0042] 圖2B為miR-23c的決策樹圖；
[0043] 圖2C為miR-3926的決策樹圖；
[0044] 圖2D為miR-4423-3p的決策樹圖。
[0045] 說明：
[0046] LTB為結(jié)核潛伏感染者，ATB或TB為活動性結(jié)核患者。 具體實(shí)施例
[0047] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的區(qū)分活動性結(jié)核和潛伏結(jié)核感染的檢測試劑盒 及其應(yīng)用做進(jìn)一步說明，但不作為本發(fā)明的限定。
[0048] 本實(shí)施例中所述的 microRNA 包括 miR-107、miR-23c、miR-3926 以及 miR-4423-3p。
[0049] 所述的 miR-107 的序列為 agcagcauuguacagggcuauca;
[0050] 所述的 miR_23c 的序列 aucacauugccagugauuaccc;
[0051 ]所述的 miR-3926 的序列為 uggccaaaaagcaggcagaga;
[0052] 所述的 miR-4423_3p 的序列為 auaggcaccaaaaagcaacaa。
[0053] 本實(shí)施例中還包含U6snRNA參比基因表達(dá)的檢測，所述的U6snRNA用于計(jì)算特異性 microRNA的相對表達(dá)變化倍數(shù)。
[0054]本實(shí)施例中的microRNA來源于人體細(xì)胞，其抽提方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的 RNA分離及提取方法。
[0055] 本實(shí)施例中采用的microRNA相對表達(dá)倍數(shù)的檢測方法，具體包括以下步驟：
[0056] 步驟1，從外周血中分離單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cell， PBMC)：
[0057] 采集受試者樣本，包括活動性結(jié)核患者和結(jié)核潛伏感染者血液樣本：
[0058] 其中所述患者診斷為活動性肺結(jié)核的依據(jù)為:患者有痰涂片陽性結(jié)果或痰培養(yǎng)陽