專利名稱：包含潛伏感染階段期間所表達的抗原的結(jié)核疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了饑餓誘導(dǎo)的抗原，或者基于饑餓期間誘導(dǎo)的得自結(jié)核分枝桿菌的多肽的免疫原性多肽的新的融合多肽，一種或多種本發(fā)明的融合多肽或者饑餓誘導(dǎo)的抗原用于制備用來給予人/動物的免疫原性組合物、疫苗或者藥物組合物的用途，以及這樣的免疫原性組合物、疫苗或者藥物組合物。
背景技術(shù)：
由結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis)所引起的人肺結(jié)核是一個嚴重的全球性健康問題，根據(jù)WHO的數(shù)據(jù)，其造成每年約3百萬人死亡。在二十世紀60年代和70年代期間，全世界新的肺結(jié)核(TB)發(fā)生病例已經(jīng)下降，但在近年中，部分由于AIDS的來臨和結(jié)核分枝桿菌的耐多元藥物(multidrug)菌株的出現(xiàn),這種趨勢已經(jīng)發(fā)生明顯的改變。目前唯一可供用于臨床使用的疫苗是BCG(卡介苗)，該疫苗的效力仍然有些爭議。BCG通常在TB動物模型中誘導(dǎo)高水平的獲得抗性，并在人群中給予抗傳播類型結(jié)核如腦脊膜炎(meningitis)和粟粒性結(jié)核保護。當給予低齡孩子BCG時,它在幾年之內(nèi)能起到抗結(jié)核的保護作用，但之后效力發(fā)生變化。比較不同的對照實驗(controlled trial),揭示BCG在成人中的保護效力在無效至80%保護的效力范圍內(nèi)顯著地變化。這使得開發(fā)新的和改良的抗結(jié)核分枝桿菌的疫苗成為非常迫切的事情，其已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織(WHO)給予非常高的優(yōu)先權(quán)。已經(jīng)有了很多對保護性分枝桿菌物質(zhì)進行闡述的嘗試，不同的研究者已經(jīng)報導(dǎo)了在試驗性接種疫苗后獲得提高的抗性。結(jié)核分枝桿菌具有并分泌一些潛在的適合用于產(chǎn)生新的結(jié)核分枝桿菌疫苗的蛋白質(zhì)。對候選分子的搜索主要集中在從區(qū)分的細菌(dividingbacteria)中釋放出來的蛋白質(zhì)。盡管大量這種蛋白質(zhì)已經(jīng)被表征，但其中只有少數(shù)在動物模型中被證實作為亞單元疫苗誘導(dǎo)保護性的免疫應(yīng)答，其中最顯著的是ESAT-6和Ag85B(Brandt等，2000 )。然而，還沒有獲得具有BCG潛力或加強BCG預(yù)防接種人中的能力的特定長期保護性免疫應(yīng)答的示例(demonstration)。充其量使用BCG的BCG加強沒有效果[Colditz，1994]。盡管與單獨使用BCG相比沒有什么顯著的改善，但在近交小鼠品系中用Ag85a進行BCG加強免疫后還是會引起一定的保護作用(Brooks等IAI2001 ;W00204018)。由于BCG需要區(qū)分和分泌蛋白質(zhì)以誘導(dǎo)保護性的免疫應(yīng)答，故強化免疫效果的缺乏主要是由于環(huán)境分枝桿菌的敏感性或來自初次BCG接種的剩余免疫應(yīng)答。兩者均引起抗BCG的急性免疫應(yīng)答和由此對生長的快速抑制，以及對BCG的清除。結(jié)核分枝桿菌傳染的過程主要經(jīng)歷三個時期。在急性期，細菌在器官中增殖，直到免疫應(yīng)答增強。特定敏化的CD4T淋巴細胞介導(dǎo)傳染的調(diào)節(jié)，最重要的介導(dǎo)分子似乎是Y干擾素(IFN-γ)。細菌負荷(bacterial load)開始減少，在細菌負荷穩(wěn)定維持在低水平時形成潛伏期。在這個時期，結(jié)核分枝桿菌由活躍的増殖趨于休眠，基本上轉(zhuǎn)變?yōu)榉菑?fù)制狀態(tài)并維持在肉芽腫內(nèi)。在某些情況下，傳染趨于再活化時期，休眠的細菌重新開始復(fù)制。已經(jīng)掲示出結(jié)核分枝桿菌從初次傳染到潛伏期的轉(zhuǎn)變伴隨著基因表達的變化(Honer zuBentrup, 2001 )0在免疫應(yīng)答的抗原-特異性方面也有可能發(fā)生變化，因為從活躍的復(fù)制到休眠的轉(zhuǎn)變期間，細菌調(diào)節(jié)著基因表達。控制潛伏性感染免疫應(yīng)答的所有特性和引起再活化的因素基本上是未知的。然而，有一些證據(jù)證明與主導(dǎo)細胞(dominant cell)類型中的轉(zhuǎn)變有夫。雖然CD4T細胞對急性期的感染控制是必要的和足夠的，但研究掲示CD8T細胞反應(yīng)在潛伏期更為重要。1998年，Cole等公開了結(jié)核分枝桿菌的完整基因組序列，并預(yù)測其中存在大約4000個開放閱讀框，披露了核苷酸序列和推定的蛋白序列(Cole等，1998)。然而重要地是，這個序列信息不能用于預(yù)測該DNA是否在體內(nèi)被翻譯和表達成蛋白。眾所周知，結(jié)核分枝桿菌的ー些基因在模擬潛伏期的條件下是正調(diào)節(jié)的。然而，這些是潛伏性感染期間總的基因表達的有限子集。另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會容易地理解，ー種基因的表達還不足以使其成為ー種好的候選疫苗。確定ー種蛋白在結(jié)核分枝桿菌潛伏感染期間是否被免疫系統(tǒng)識別的唯一方法是制備出這種給定的蛋白，并按照這里描述的適當試驗對該蛋白進行測試。ー些蛋白質(zhì)特別重要并有潛力成為晚期抗原(潛伏感染期間識別的抗原)，這 是由于在感染后，它們大部分表達了相對較長的時間，而此時免疫系統(tǒng)已經(jīng)發(fā)動了最初的適應(yīng)性防御，并且環(huán)境也變得對分枝桿菌更加敵對。模擬低氧壓カ的體外缺氧的培養(yǎng)條件此前已顯露與這方面相關(guān)，現(xiàn)在已經(jīng)被用于分析基因表達方面的變化。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在這些條件下可以誘導(dǎo)或者顯著地正調(diào)節(jié)ー些抗原，例如16kDa抗原α -晶體蛋白(a -crystalin)(Sherman，2001 )、Rv2660c 和 Rv2659c (Betts, 2002)(我們自己的申請)。另ー個有可能特別感興趣的環(huán)境刺激是饑餓，其設(shè)計反映出營養(yǎng)物被局限于肉芽腫內(nèi)(潛伏感染的位點)以及在饑餓下基因表達產(chǎn)物被正調(diào)節(jié)，因此有可能成為特別感興趣的感染潛伏期中的抗原靶。在超過20000種已知在初次感染期表達并作為疫苗被測試的抗原中，少于半打的抗原表現(xiàn)出明顯的潛力。迄今為止僅有ー種抗原已經(jīng)被證實具有作為治療性疫苗的所有潛質(zhì)(Lowrie，1999)。然而這個疫苗僅在作為DNA疫苗施用時起作用并被證明是有爭議的，因為有其它組聲稱使用該方案接種誘導(dǎo)了非特異性的保護甚至使疾病惡化(Turner，2000)。相反，如在提供的實施例中所顯示的，使用最佳識別的接種疫苗技術(shù)，本發(fā)明描述的融合多肽可以被摻入疫苗。進ー步地，由于TB疫苗不引起殺菌免疫性而是控制感染在亞臨床(subclinical)水平(從而導(dǎo)致隨后的潛伏感染的確立)，故本發(fā)明描述了將具有預(yù)防和治療活性的成分聯(lián)合的多期(multiphase)疫苗。常規(guī)的預(yù)防接種后,初次免疫應(yīng)答的逃逸(evasion)和潛伏性疾病的隨后發(fā)展或許至少部分地是由于侵襲細菌的抗原輪廓(antigenic profile)的改變。因此，用與潛伏TB相關(guān)的抗原進行接種，應(yīng)該能預(yù)防或者減少潛伏感染的形成，并因此將混合了細菌在第一對數(shù)生長期和潛伏發(fā)病期間所表達的抗原的疫苗，用作預(yù)防性疫苗時，能改善長期的免疫性。由于這種多期疫苗顯然也可以作為有效的治療疫苗，因此可以解決將要接受未來TB疫苗的第三世界的大部分人可能已經(jīng)被潛伏地感染的問題。發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于預(yù)防或/和治療由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(complex)(結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌等)的物種所引起的感染的免疫原性組合物、疫苗或者藥物組合物(包括加強接種疫苗和多期疫苗)，該免疫原性組合物、疫苗或者藥物組合物含有饑餓誘導(dǎo)的抗原或包含一種或多種饑餓誘導(dǎo)的結(jié)核分枝桿菌抗原的融合多肽，其中融合多肽的単元是結(jié)核分枝桿菌抗原。本發(fā)明還涉及像這樣的融合多肽和編碼該融合多肽的核酸序列。更進一歩地，本發(fā)明涉及通過合成或重組制備的短重疊(多個)肽或者長重疊(多個)肽或者不重疊的(多個)肽的用途。更進一歩地，本發(fā)明涉及饑餓誘導(dǎo)的抗原或者本發(fā)明的融合多肽序列或者核酸序列用于制備所述免疫原性組合物、疫苗或者藥物組合物的用途，以及由該方法制備的疫苗或者藥物組合物。進ー步地，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明饑餓誘導(dǎo)的抗原或融合多肽序列或核酸序列的疫苗用于制備所述免疫原性組合物、疫苗或者藥物組合物的用途，所述疫苗同時與BCG給予，也可以與BCG混合或者在不同的位置或以不同的途徑單獨給藥。更進一歩地，本發(fā)明涉及包含饑餓誘導(dǎo)的抗原或者融合多肽序列或者核酸序列的疫苗作為BCG加強劑的用途。進ー步地，通過包含天然感染期間早期和晩期均表達的抗原，疫苗將引起兩步的免疫應(yīng)答以使得免疫系統(tǒng)抵御病原體，無論該病原體帶有包括潛伏期間的某時間點上的何種最有效表位。發(fā)明細述 本發(fā)明公開了包含饑餓誘導(dǎo)的抗原或者含有一種或多種饑餓誘導(dǎo)的抗原的融合多肽的免疫原性組合物、疫苗或者藥物組合物。這些饑餓誘導(dǎo)(在饑餓期間超過6. 5倍正調(diào)節(jié)或者與饑餓誘導(dǎo)的基因遺傳性相連)抗原的氨基酸和核酸序列如以下所示出現(xiàn)在序列表中
權(quán)利要求
1.一種免疫原性組合物、疫苗或者藥物組合物，其包含多肽RV1284或含有與RV1284至少80%序列同一性的免疫原性多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的免疫原性組合物、疫苗或者藥物組合物，用于預(yù)防疾病用途、治療用途、多期疫苗，或者用于加強在先卡介苗接種的免疫性。
3.根據(jù)權(quán)利要求廣2中任一項所述的免疫原性組合物、疫苗或者藥物組合物，其是皮內(nèi)給藥、經(jīng)皮給藥、皮下給藥、肌內(nèi)給藥或粘膜給藥。
4.根據(jù)權(quán)利要求f3中任一項所述的免疫原性組合物、疫苗或者藥物組合物在制備用于預(yù)防疾病用途、治療用途、或者前述兩者、多期疫苗的藥物、或者用于加強在先卡介苗接種的免疫性的藥物中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求f3中任一項所述的免疫原性組合物、疫苗或者藥物組合物在制備用于治療由毒性分枝桿菌引起的活躍性結(jié)核病或者潛伏性結(jié)核病的藥物中的應(yīng)用，或者在制備用于加強在先卡介苗接種的免疫性的藥物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求廣3中任一項所述的免疫原性組合物、疫苗或者藥物組合物在制備用于預(yù)防毒性分枝桿菌的感染的藥物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的應(yīng)用，其中，所述分枝桿菌選自結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌或潰瘍分枝桿菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求f3中任一項所述的免疫原性組合物、疫苗或者藥物組合物在制備用于抗分枝桿菌的預(yù)防接種、加強接種、多期接種或者治療性接種的組合物中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中，所述分枝桿菌選自結(jié)核分枝桿菌、非洲分枝桿菌、牛分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌或潰瘍分枝桿菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含潛伏感染階段期間所表達的抗原的結(jié)核疫苗，具體涉及一種免疫原性組合物、疫苗或者藥物組合物，其包含多肽Rv1284或含有與Rv1284至少80%序列同一性的免疫原性多肽。
文檔編號A61K39/04GK102836425SQ201210332759
公開日2012年12月26日 申請日期2006年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月23日
發(fā)明者克勞斯·奧高, 卡里納·溫斯波-倫德貝里, 彼得·安德森 申請人:國家血清研究中心