一種rna及其用途、包含該rna的組合物、重組表達(dá)載體和宿主細(xì)胞的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種RNA及其用途、包含該RNA的組合物、重 組表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤是威脅人類健康的頭號殺手之一，并且目前并沒有十分有效的手段來治療腫 瘤。傳統(tǒng)的治療方法，如化療、放療、手術(shù)和靶向藥物，盡管最初能成功控制住腫瘤，但往 往又會反過來誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生一系列其他的行為，進(jìn)而最終導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)、擴(kuò)散和轉(zhuǎn) 移?；蛑委熡捎谄溽槍π詮?、靶向性好、有效和基本無毒副作用等優(yōu)點，這些年正在越來 越受到人們的青睞和關(guān)注。TRAIL(tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand)屬于腫瘤壞死因子（TNF)家族成員，因其可以選擇性地殺死腫瘤細(xì)胞，但對絕大多 數(shù)正常組織沒有毒性而成為癌癥基因治療的研究熱點之一。研究表明靜脈多次注射重組可 溶性TRAIL可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤的生長和形成，延長實驗動物的生存時間的同 時卻不引起可監(jiān)測到的毒性發(fā)生。盡管它可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，但不同的腫瘤細(xì)胞 對TRAIL的敏感性不同，因此增強抗性細(xì)胞對TRAIL的敏感性具有良好的臨床應(yīng)用前景。
[0003] 目前研究表明，TRAIL抗性的機制在不同細(xì)胞中是不同的，有諸如假受體占位、細(xì) 胞內(nèi)部抗凋亡分子的高表達(dá)等假說，但是有些假說驗證困難，且目前并沒有十分有效的方 法來改善TRAIL抗性問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明提供一種RNA及其用途、包含該RNA的組合物、重組表達(dá)載體和 宿主細(xì)胞。該RNA能有效抑制miR-222的表達(dá)水平，增強TRAIL對A549的殺傷活性。本發(fā) 明提供的重組病毒是有生物學(xué)活性的，有希望成為腫瘤基因治療的候選病毒。
[0005] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0006] 本發(fā)明提供了一種RNA，其特征在于，其具有：
[0007] ( I )、如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列；或
[0008] ( II )、如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列的互補序列；或
[0009] (III)、與（I )或（II )的核苷酸序列編碼相同蛋白質(zhì)，但因遺傳密碼的簡并性 而與（I )或（II )的核苷酸序列不同的序列；或
[0010] (IV)、與（I )或（II )或（III)所述序列至少有70%同源性的序列。
[0011] 本發(fā)明還提供了所述RNA用于抑制Hsa-miR-222的用途。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種組合物，包括TRAIL95 281和所述的RNA。
[0013] 本發(fā)明還提供了所述組合物的制備方法：
[0014] 步驟1 :將編碼TRAIL95 281與所述的RNA的核苷酸序列連接到載體中，構(gòu)建表達(dá)載 體；
[0015] 步驟2:將所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，表達(dá)，收集表達(dá)產(chǎn)物，即得。
[0016] 本發(fā)明還提供了一種重組表達(dá)載體，包括：
[0017] (1)編碼trail95281的核苷酸序列；和/或
[0018] (2)編碼本發(fā)明所述RNA的核苷酸序列。
[0019] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述重組表達(dá)載體的構(gòu)建方法，將編碼 TRAIL 95 281與所述RNA的核苷酸序列連接到載體中，構(gòu)建表達(dá)載體。
[0020] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述重組表達(dá)載體的構(gòu)建方法中的載體為質(zhì)粒 或病毒。
[0021] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述重組表達(dá)載體的構(gòu)建方法中病毒為腺相關(guān) 病毒。
[0022] 本發(fā)明還提供了一種宿主細(xì)胞，包括所述的重組表達(dá)載體。
[0023]所述重組表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)為 pAM-CAG-pL-INS-TRAIL95 2S1-polyA-U6-miR-222-TuD -WPRE-BGH polyA 的 AAV 重組表達(dá)載體，簡稱 AAV-TRAIL-miR-222-TuD。
[0024]所述重組表達(dá)載體包括：pAM(the abbreviation of the plasmid of anti-ampcilin construction)、 ITR(adeno_associated virus 2 inverted terminal repeat sequence)、CAG(cytomegalovirus immediated-early enhancer/chicken 0 -actin hybrid)n INS(human Insulin)secretion signal peptide、pL (poly-linker)、 TRAIL95 2S1 (編碼 TRAIL 第 95 至 281 位氨基酸）、polyA(多聚腺苷酸）、U6、miR-222-TuD、 WPRE(Woodchuck Heptitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element)、BGH(Bos taurus growth hormone)、polyA (多聚腺苷酉愛）和 ITR(adeno_associated virus 2 inverted terminal repeat sequence)〇
[0025]其中，ITR sequence (Patent TO0220748)的序列如 SEQ ID No. 5 所示；CAG sequence 的序列如 SEQ ID No. 6 所不；INS secretion signal peptide sequence (Genbank accession no. NM 000207)的序列如 SEQ ID No.7 所不；WPRE sepuence(Genbank accession no. J04f514)的序列如 SEQ ID No. 8 所不；BGH(Bos taurus growth hormone) pA sequence 的序列如 SEQ ID No.9 所不；TRAIL95 281 amino acid sequence (Patent ZL03138357. 2)的序列如 SEQ ID No. 10 所示。
[0026] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述宿主細(xì)胞為細(xì)胞株，所述細(xì)胞株選自HeLa 細(xì)胞、A549 細(xì)胞、Bel-7402 細(xì)胞、CNE-2Z 細(xì)胞、EC109 細(xì)胞、MGC-803 細(xì)胞、SW1990 細(xì)胞、 DU145細(xì)胞、U251細(xì)胞、A875細(xì)胞、HCT116細(xì)胞、MCF7細(xì)胞或SK-0V-3細(xì)胞。
[0027] 本發(fā)明還提供了所述組合物、所述重組表達(dá)載體、所述宿主細(xì)胞在制備治療腫瘤 的藥物中的應(yīng)用。
[0028] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述腫瘤為原發(fā)性、繼發(fā)性或轉(zhuǎn)移性的腫瘤。
[0029] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述腫瘤包括肺癌、肝癌、鼻咽癌、食管癌、結(jié)直 腸癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、乳腺癌、宮頸癌或卵巢癌。
[0030] 本發(fā)明的實驗證明，在HeLa細(xì)胞、A549細(xì)胞、Bel-7402細(xì)胞、CNE-2Z細(xì)胞、EC109 細(xì)胞、MGC-803 細(xì)胞、SW1990 細(xì)胞、DU145 細(xì)胞、U251 細(xì)胞、A875 細(xì)胞、HCT116 細(xì)胞、MCF7 細(xì)胞、SK-0V-3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了 Has-miR-222的mimics以后能增強細(xì)胞對TRAIL的抗性，而 轉(zhuǎn)染了 Has-miR-222的inhibitor以后能增強細(xì)胞對TRAIL的敏感性（圖1)。人工設(shè)計 的miR-222特異性抑制劑TuD (圖2A)，并在原有pAM/CAG-TRAIL載體基礎(chǔ)上加入polyA以 終止II類啟動子CAG，然后插入一個新的III類啟動子U6來表達(dá)miR-222-TuD (圖2B)。 將構(gòu)建好的共表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到293T細(xì)胞中驗證各個抑制劑對miR-222的靶向抑制作用， miR-222-TuD能有效抑制miR-222的表達(dá)水平（圖2C)。將各個共表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Hela中，用 Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒流式檢測細(xì)胞凋亡，可以看到，miR-222-TuD 能增強TRAIL對Hela的殺傷活性（圖2D)。
[0031] 采用輔助病毒缺陷包裝系統(tǒng)進(jìn)行該重組共表達(dá)載體的包裝，病毒用碘克沙醇 密度梯度超速離心純化，超濾濃縮，Real-time PCR確定其最終滴度。同樣方法制備 和包裝編碼綠色熒光蛋白（EGFP)的AAV重組病毒（AAV-EGFP)作為陰性對照，只編碼 TRAIL蛋白的AAV-TRAIL作為陽性對照。將AAV-EGFP病毒侵染293細(xì)胞和A549細(xì)胞 72h后，觀察細(xì)胞的熒光表達(dá)情況，可以看到細(xì)胞被成功侵染并表達(dá)了綠色熒光蛋白（圖 3A)。將 AAV-EGFP、AAV-TRAIL、AAV-TRAIL+miR-222-TuD 分別侵染 293 細(xì)胞，檢測到在被 AAV-TRAIL和AAV-TRAIL+miR-222-TuD侵染后，TRAIL的表達(dá)水平明顯升高（圖3B)，而被 AAV-TRAIL+miR-222-TuD侵染后，miR-222的表達(dá)被明顯抑制（圖3C)。在A549裸鼠體內(nèi) 移植瘤實驗中，經(jīng)AAV-TRAIL治療后，腫瘤生長受到抑制，但在AAV-TRAIL+miR-222-TuD聯(lián) 合治療組可以看到更明顯的生長抑制（圖4)，并且miR-222-TuD是通過靶向抑制miR-222 間接促進(jìn)其靶基因PTEN來發(fā)揮作用（圖5)，表明得到的重組病毒是有生物學(xué)活性的，有希 望成為腫瘤基因治療的候選病毒。
【附圖說明】
[0032] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0033] 圖 1 示 miR-222 對 TRAIL 抗性的影響；轉(zhuǎn)染了 miR-222 的 mimics 和 inhibitors 以后，再用TRAIL蛋白刺激人宮頸癌細(xì)胞Hela、人肺腺癌細(xì)胞A549、人肝癌細(xì)胞Bel-7402、 人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z、人食管癌細(xì)胞EC109、人胃癌細(xì)胞MGC-803、人胰腺癌細(xì)胞SW1990、人 前列腺癌細(xì)胞DU145、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251、人黑色素瘤細(xì)胞A875、人乳腺癌細(xì)胞MCF7、 人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116、人卵巢癌細(xì)胞SK-0V-3對細(xì)胞的殺傷作用；
[0034] 圖2示pAM/CAG-TRAIL-U6-miR-222-TuD共表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及功能驗證，其中圖 2(A) :miR-222-TuD 的序列設(shè)計；圖 2(B) :pAM/CAG-TRAIL-polyA-U6-miR-222-TuD 共表達(dá) 載體的表達(dá)結(jié)構(gòu)；圖2(C):共表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后對miR-222表達(dá)水平的影響；圖