專利名稱：將預(yù)定改變引入有核細(xì)胞基因組的靶序列中的方法
本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?4194935.4，申請(qǐng)日為1994年12月9日，發(fā)明名稱為“用于真核細(xì)胞中定點(diǎn)突變的化合物”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
本申請(qǐng)是于1993年12月9日遞交的第08/164303號(hào)專利申請(qǐng)的后續(xù)申請(qǐng)，后者全文引入本文以供參考。
1．發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及分子遺傳學(xué)領(lǐng)域。具體地說(shuō)它涉及向活的、培養(yǎng)的真核細(xì)胞中引入特定基因改變的核酸化合物及其應(yīng)用。更具體地說(shuō)，它主要涉及基本上沃森-克里克規(guī)則配對(duì)的雙鏈核酸，其中雙鏈中的一條鏈的部分包含含2′-O或2′-OMe核糖的核苷酸，剩余部分包含脫氧核糖核苷酸。
2．發(fā)明背景2.1．嵌合和/或雜種雙鏈核酸本發(fā)明領(lǐng)域涉及核酸。核酸是雜聚物，即不同亞單位的聚合物，亞單位是通過(guò)定向的磷酸二酯鍵或其衍生物連接形成聚合物。雙鏈核酸是這樣的核酸，按照尿嘧啶或胸腺嘧啶與腺嘌呤對(duì)應(yīng)和胞嘧啶與鳥嘌呤對(duì)應(yīng)的原則，雙鏈中第一鏈的每一堿基對(duì)應(yīng)于第二鏈的堿基。據(jù)說(shuō)擁有這種對(duì)應(yīng)性的逆平行雙鏈?zhǔn)俏稚?克里克規(guī)則配對(duì)的。雙鏈核酸可有兩種主要類型核糖核酸和脫氧核糖核酸。每種核糖核苷酸都有相應(yīng)的脫氧核糖核苷酸，例如，腺嘌呤和脫氧腺嘌呤，胞嘧啶和脫氧胞嘧啶，鳥嘌呤和脫氧鳥嘌呤，尿嘧啶和胸腺嘧啶。如本領(lǐng)域中所用的那樣，在同一鏈中存在核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸的核酸被稱為混合或嵌合(下文稱“嵌合”)核酸。其中脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸相互對(duì)應(yīng)的雙鏈核酸被稱為雜種雙鏈(hybrid-duplex)。當(dāng)兩條鏈形成少于其全部堿基的雙鏈核酸區(qū)時(shí)，所形成的分子被稱為異形雙鏈(heteroduplex)。
更經(jīng)常地，雙鏈核酸的兩條鏈?zhǔn)欠枪矁r(jià)鍵合的，而僅通過(guò)沃森-克里克規(guī)則配對(duì)相連。然而，雙鏈的兩條鏈可通過(guò)寡核苷酸連接形成單一聚合物(single polymer)。連接寡核苷酸不是沃森-克里克規(guī)則配對(duì)的。其中第一鏈和第二鏈?zhǔn)菃我痪酆衔锏牟糠值漠愋坞p鏈被稱為“發(fā)夾雙鏈”或“柱和環(huán)”結(jié)構(gòu)。本文采用前一種名稱。
本文所用嵌合現(xiàn)象是核酸聚合物的一種特性，而雜種現(xiàn)象則是雙鏈的一種特性。例如，mRNA及其模板形成雜種雙鏈，但二者都是非嵌合的，然而例如嵌合的八核苷酸5′d(TTTT)-r(CCCC)3′和5′r(GGGG)-d(AAAA)3′相互形成沃森-克里克規(guī)則雙鏈，但生成的雙鏈?zhǔn)欠请s種雙鏈。下文稱非雜種雙鏈的雙鏈核酸為“同質(zhì)雙鏈”(homo-duplex)。除非另外特別說(shuō)明，同質(zhì)雙鏈僅指包含脫氧核苷酸的雙鏈。最后，值得注意的是本領(lǐng)域中稱沃森-克里克規(guī)則雙鏈的形成為“雜交(hybridigation)”，即使其形成的是非雜種雙鏈核酸。
對(duì)X射線衍射和二維NMR分析嵌合和/或雜種核酸結(jié)構(gòu)的研究感興趣的人們已合成了用于此研究的嵌合核酸和雜種雙鏈核酸。參見，例如Salazar,M。等，1994,J.Mol.Biol.241:440-55和Egli,M.等，1993,Biochemistry 32:3221-37(r3d7.d10形式的雙鏈的嵌合雜種雙鏈)；Ban,C.等，1994,J.Mol.Biol.236:275-85(d5r1d4形式的自身互補(bǔ)嵌合雜種雙鏈)；Chou,S.H.,1991,Biochemistry 30:5248-57(d4r4d4形式的自身互補(bǔ)和非自身互補(bǔ)的嵌合雜種雙鏈)。這些雙鏈核酸的互補(bǔ)鏈彼此是非共價(jià)鍵合的；它們僅通過(guò)沃森-克里克規(guī)則配對(duì)相連。
合成了嵌合核酸的第二組科學(xué)家感興趣于核糖酶(ribozyme)的研究和用途，核糖酶即自身切開或切開其它RNA的RNA分子。Perreault,J.P.等，1990,Nature 344:565；Taylor,N.R.等，1992,Neucleic Acids Research20:4559-65；Shimaya,T.,1993,Nrucleic Acids Research 21:2605。這些研究發(fā)現(xiàn)嵌合核糖酶具有活性，并且對(duì)核酸酶的消化比RNA核糖酶具有更強(qiáng)的耐受性。嵌合核糖酶是自身互補(bǔ)的，即沃森-克里克規(guī)則配對(duì)鏈?zhǔn)枪矁r(jià)連接的。在嵌合核糖酶的研究期間合成的化合物不同于上面提到的雜種雙鏈分子，它們被合成用于結(jié)構(gòu)的研究，因?yàn)槠渲械那逗虾颂敲覆话ǚ€(wěn)定的雜種雙鏈。因而，具有DNA結(jié)合臂的嵌合核糖酶與其底物結(jié)合，并形成雜種雙鏈。Yang,G.H.等，1990,Biochemistry 29:11156-60。還參見Sawata,S.等，1993,Neucleic Acids Research 21:5656-60；Hendry,P等，1992,Neucleic Acids Research 20:5737-41；Shimayama,T.,1993,Neucleic Acids Research 21:2605。核糖酶催化RNA底物的切開，雜種雙鏈因此溶解。
2.2．真核細(xì)胞中定點(diǎn)遺傳改變分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員知道不僅經(jīng)常需要向靶真核細(xì)胞中引入新的多核酸序列，即新的基因，而且也需要對(duì)靶細(xì)胞中確定的預(yù)先存在的基因加以改變。靶細(xì)胞可在培養(yǎng)物中使用或者使用它建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
已經(jīng)建立了許多向培養(yǎng)的真核細(xì)胞中引入DNA的技術(shù)。這些技術(shù)包括磷酸鈣沉淀法，DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的胞吞作用，電穿孔，脂質(zhì)體介導(dǎo)的融合，使用復(fù)制缺損病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。然而，這些技術(shù)雖然十分普遍地用于向真核細(xì)胞中引入功能性基因，但它們不能輕而易舉地完成對(duì)特定存在基因的改變(突變)。引入之后，外源性DNA通過(guò)異常重組在細(xì)胞基因組中隨機(jī)位點(diǎn)上分離，而不是通過(guò)同源重組在特定位點(diǎn)上分離。
迄今為止，還沒有一種令人普遍滿意的向高級(jí)真核細(xì)胞，即哺乳動(dòng)物或鳥類細(xì)胞中引入定點(diǎn)或特異位點(diǎn)的遺傳改變(誘變)的方案。雖然在真核細(xì)胞中通過(guò)引入極長(zhǎng)(＞1kb)的核酸可獲得同源重組，但這些技術(shù)需要應(yīng)用復(fù)雜的篩選技術(shù)，因?yàn)樵诟呒?jí)真核細(xì)胞中異常重組率大大超過(guò)了同源重組率。Thomas,K.R.&Smithies,M.R.,1987,Cell 52:503。還參見Valancius,V.&Smithies,O.,1991,Mol.Cell.Biol.11:4389(比較真核細(xì)胞中線性化和超螺旋質(zhì)粒的同源重組)。
一種完成優(yōu)勢(shì)定點(diǎn)誘變的方法是向細(xì)胞中直接引入單鏈寡脫氧核苷酸。這一技術(shù)被成功地用于酵母中，同源重組在啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中的活性顯著高于真核細(xì)胞。Moreschell,R.P.等，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.85:524-28；Yamamoto,T.等，1992,Yeast 8:935-48并且，至今也沒有用單鏈寡核苷酸成功地轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物或鳥類細(xì)胞的報(bào)道。研究表明改變的嘌呤和嘧啶堿基區(qū)，即〔d(TG)30·d(AC)30〕顯示顯示了令人喜悅的重組率，由此可推知哺乳動(dòng)物中靶DNA結(jié)構(gòu)和同源重組率之間的關(guān)系。對(duì)培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的非復(fù)制質(zhì)粒的研究證實(shí)了這些效果。Wahls,W.P.等，1990,Mol.Cell.Biol.10:785-93。這些實(shí)驗(yàn)沒有進(jìn)而表明外源性核酸和細(xì)胞基因組之間的重組。
曾嘗試使用RecA，一種促進(jìn)細(xì)菌(大腸桿菌)中同源重組的蛋白質(zhì)來(lái)促進(jìn)真核細(xì)胞中的同源重組。但是，這些嘗試顯然未獲得成功。例如，W.Bertling的美國(guó)專利4950599公開了在真核細(xì)胞中使用RecA導(dǎo)致極低的定向位點(diǎn)突變率，并且同源重組率也未增高。D.Zarling和E.Sane的專利申請(qǐng)WO93/22443及D.C.Gruenert和Z.Kunzelmann的申請(qǐng)94/04032都旨在校正培養(yǎng)的涉及囊纖維變性的細(xì)胞系中的基因缺損。這些出版物公開了證實(shí)原理的原始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)而非涉及操作方法實(shí)施例的數(shù)據(jù)。為將多核苷酸/RecA復(fù)合物引入到核中，Zarling和Gruenert使用膜是通透性的細(xì)胞，盡管這類細(xì)胞不能進(jìn)一步生長(zhǎng)。另外，即使這些出版物宣稱在完整細(xì)胞中發(fā)生了RecA促進(jìn)同源重組，它們也未給出對(duì)其頻率的定量評(píng)價(jià)。因此，還沒有證據(jù)可令人信服地表明在任何活的真核細(xì)胞中，使用原核RecA導(dǎo)致的同源重組率明顯高于自發(fā)性同源重組率。
3．發(fā)明概述本發(fā)明涉及單一共價(jià)連接的雙鏈寡核苷酸，它與所研究的基因同源，且具有脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。為了產(chǎn)生遺傳改變，在同源區(qū)內(nèi)，有一對(duì)或多對(duì)非對(duì)應(yīng)(下文稱“異源”或“突變基因”)堿基對(duì)。通常，細(xì)胞原有的同源重組過(guò)程導(dǎo)致突變基因核苷酸插入靶基因組位置?？墒褂帽景l(fā)明的雙鏈寡核苷酸(下文稱“嵌合載體”)向基因中引入異源堿基對(duì)，特定地改變所研究的基因。異源堿基對(duì)可能是不同于所研究的基因的堿基對(duì)，或者可能是所研究基因中存在的堿基對(duì)之外那些堿基對(duì)(插入)，或者異源堿基對(duì)還可能是不存在于所研究基因中的堿基對(duì)(缺失)。本發(fā)明部分地是基于下述發(fā)現(xiàn)，即載體中包含雜種雙鏈核酸的約15-50個(gè)堿基對(duì)區(qū)大大提高所研究基因的改變率。當(dāng)異源堿基對(duì)區(qū)是1-50個(gè)堿基對(duì)時(shí)，異源堿基對(duì)可以同質(zhì)或雜種雙鏈存在于本發(fā)明的載體中。當(dāng)異源堿基對(duì)長(zhǎng)度大于50個(gè)堿基對(duì)時(shí)，它優(yōu)選以同質(zhì)雙鏈存在。
可采用任何已知的向真核細(xì)胞中引入核酸的方法向靶細(xì)胞中引入載體。雖然就理論而言沒有限定，但據(jù)信嵌合載體是通過(guò)靶細(xì)胞的重組/修復(fù)機(jī)制來(lái)參與的，并且經(jīng)基因轉(zhuǎn)化或同源重組指導(dǎo)靶基因改變。
4．附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1顯示圖表表示的兩種嵌合載體。特定標(biāo)記如下1，第一鏈；2，第二鏈；3，異源區(qū)；4，同質(zhì)區(qū)；5，連接物；6，連接位點(diǎn)。
圖1的符號(hào)圖解
雜種雙鏈(四聚物)
同質(zhì)雙鏈(四聚物)
未配對(duì)的圖1A是R-D-R形式的連接的嵌合載體。
圖1B是R-D-R形式的具有單一3′和5′末端的發(fā)夾式嵌合載體。
5．發(fā)明詳述5.1．本發(fā)明嵌合載體的描述本發(fā)明包括含有含脫氧核糖和核糖的堿基雙鏈核酸。因此它們包括DNA和RNA區(qū)，故而被稱為“嵌合載體”。嵌合載體的核糖核苷酸的2′-O可以是甲基化的。任何磷酸二酯都可被硫代磷酸二酯或甲基磷酸二酯替代。
本發(fā)明的嵌合載體是單一核酸聚合物。因此本發(fā)明的嵌合載體須至少包括1個(gè)堿基至更通常的3或4個(gè)堿基，這些堿基不是沃森-克里克規(guī)則配對(duì)的。這些未配對(duì)堿基區(qū)連接兩條沃森-克里克規(guī)則配對(duì)的堿基鏈。與其它合成的具有未配對(duì)核苷酸的嵌合核苷酸相反嵌合載體沒有酶活性，即它們不催化化學(xué)反應(yīng)或者在沒有生物能源，如ATP存在下它們自身進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)。
優(yōu)選實(shí)施方案中的連接區(qū)堿基是脫氧核糖核苷酸?？蓸?gòu)建具有兩個(gè)連接區(qū)的嵌合載體，以使聚合物的3′和5′末端與相鄰的互補(bǔ)鏈核苷酸呈沃森-克里克規(guī)則配對(duì)。它們易于連接使嵌合載體形成單一連續(xù)環(huán)狀核酸聚合物。
基本上，嵌合載體的所有其余堿基都是沃森-克里克規(guī)則配對(duì)的。本文所描述的堿基是沃森-克里克規(guī)則配對(duì)的或它們形成雙鏈核酸應(yīng)被理解為在適當(dāng)?shù)臏囟群望}的條件下，它們可形成堿基對(duì)或雙鏈核酸。應(yīng)該知道在某些少鹽和/或升高的溫度條件下，沃森-克里克規(guī)則堿基對(duì)會(huì)失去熱力學(xué)穩(wěn)定性而使得雙鏈核酸熔解掉或變性。還應(yīng)知道一或兩對(duì)堿基對(duì)失配并不影響本發(fā)明的可操作性。
本發(fā)明的嵌合載體旨在將改變(突變)特定地引入靶基因。通過(guò)選擇具有與靶位點(diǎn)序列相同(同源)序列的嵌合載體部分(下文稱之為同源區(qū))確定遺傳改變位點(diǎn)。嵌合載體序列和靶基因之間的不同區(qū)被稱為異源區(qū)。應(yīng)注意到嵌合載體與靶基因雖是異源的，但在該載體區(qū)中并不是異形雙鏈。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，每個(gè)嵌合載體有兩個(gè)同源區(qū)，它們位于插入的異源區(qū)側(cè)翼，所有這三個(gè)區(qū)都以單一連續(xù)雙鏈核酸形式存在。再有，依據(jù)本發(fā)明，每個(gè)同源區(qū)包括雜種雙鏈核酸部分。每個(gè)雜種雙鏈至少是4對(duì)堿基對(duì)，優(yōu)選為8對(duì)堿基對(duì)，更優(yōu)選為約20-30對(duì)堿基對(duì)。嵌合載體的作用并不受到雜種雙鏈區(qū)內(nèi)同質(zhì)雙鏈的二核苷酸堿基對(duì)的影響，置入嵌合載體使3′和5′末端彼此連接。兩個(gè)同源區(qū)的長(zhǎng)度至少為20對(duì)堿基對(duì)，優(yōu)選在40-60對(duì)堿基對(duì)之間。
依據(jù)本發(fā)明，可將同質(zhì)雙鏈核酸區(qū)排列在載體的雜種雙鏈/同源區(qū)之間。被插入的同質(zhì)雙鏈區(qū)可包括異源區(qū)。當(dāng)異源區(qū)少于約50對(duì)堿基對(duì)，優(yōu)選地少于約20對(duì)堿基對(duì)時(shí)，可存在或不存在被插入的同質(zhì)雙鏈區(qū)。當(dāng)異源區(qū)超過(guò)約20對(duì)堿基對(duì)時(shí)，包含異源區(qū)的被插入同質(zhì)雙鏈?zhǔn)莾?yōu)選的。
5.2．本發(fā)明的嵌合載體的構(gòu)建可使用任意方法合成本發(fā)明的嵌合載體。使用經(jīng)改進(jìn)的用于DNA固相合成的技術(shù)可最簡(jiǎn)便地合成嵌合載體。參見Caruthers,M.H.,1985,Science 230:281-85；Itakura,K.等，1984,Ann.Rev.Biochem.53:523-56?？珊铣蒖NA和嵌合核酸的改進(jìn)方法公開于Scaringe,S.A.等，1990,NucleicAcids Research 18:5433-41；Usman,N.等，1992,Nucleic Acids Research20:6695-99；和Swiderski,P.M.等，1994,Anal.Biochem.216:83-88，上述文獻(xiàn)均全文引入本文以供參考。有關(guān)嵌合核酸合成的新近進(jìn)展綜述于Usman,N.&Cedergren,R.,1992,Trends Bioch.Sci.17:334-9。
插入兩個(gè)雜種雙鏈區(qū)之間的包含同質(zhì)雙鏈區(qū)的嵌合載體可使用半合成技術(shù)來(lái)建立。構(gòu)建兩種合成的具發(fā)夾構(gòu)象的嵌合多聚核酸。使用與兩種不同限制酶的消化產(chǎn)物的重疊部分互補(bǔ)的重疊交叉末端，構(gòu)建兩種嵌合核酸的游離3′和5′末端。得到與限制酶消化末端互補(bǔ)的同質(zhì)雙鏈區(qū)?？刹捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)來(lái)完成限制酶位點(diǎn)與克隆DNA片段末端的加成，所述技術(shù)例如，但不限于使用伸展引物的PCR擴(kuò)增和包含限制位點(diǎn)的連接體的平整末端連接?？墒褂贸Ｒ?guī)的酶促技術(shù)連接兩種嵌合核苷酸和同質(zhì)雙鏈區(qū)。通過(guò)在Tris Borate EDTA緩沖液中的6％聚丙烯酰胺電泳從不完全反應(yīng)的底物中分離兩個(gè)末端連接的嵌合寡核苷酸。該線性加帽的分子是壓縮的并且在這一條件下的電泳更緩慢。
僅含有天然產(chǎn)生的核苷酸的嵌合載體也可用于本發(fā)明。據(jù)發(fā)現(xiàn)包含約20個(gè)核糖核苷酸的雜種雙鏈區(qū)的嵌合載體在體外是RNAse H抗性的?？赏ㄟ^(guò)用2′-O甲基化核糖核苷酸替代核糖核苷酸獲得對(duì)酶促降解的抗性。另外或者可選擇性地，核酸的磷酸二酯鍵可被硫代磷酸二酯鍵替代。Shimayama,T.等，1993,Nucleic Acids Research 21:2605.也可以使用含阿拉伯糖的核苷酸。本文所用術(shù)語(yǔ)核酸意指包括帶有這些修飾的核酸。
5.3．本發(fā)明的嵌合載體的應(yīng)用本發(fā)明的嵌合載體可用于靶細(xì)胞基因組的特定位置上的突變。采用其核酸序列定義靶位的特定位置，下文中稱此核酸序列為靶序。依據(jù)本發(fā)明構(gòu)建嵌合載體，其中除存在某些雜種雙鏈區(qū)外，同源區(qū)與靶序列一致。異源區(qū)編碼被引入的變化。變化可是序列的一個(gè)或多個(gè)堿基變化或者是一個(gè)或多個(gè)堿基的加成。當(dāng)靶序列的變化是少于約20個(gè)堿基的加成時(shí)，可采用一或二個(gè)雜種雙鏈區(qū)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。當(dāng)靶序列的變化是多于約50個(gè)堿基的加成時(shí)，則優(yōu)選采用被包括在同質(zhì)雙鏈區(qū)內(nèi)的異源區(qū)。
本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)要求向靶細(xì)胞核中引入嵌合載體。任何導(dǎo)致這種引入的方法均可使用。這類方法包括電穿孔法，DEAE葡聚糖法，磷酸鈣沉淀法，脂質(zhì)體介導(dǎo)的融合法(LIPOFECTIN)和直接注射法。電穿孔法是特別適合的。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中嵌合載體用于建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。按照文獻(xiàn)描述方法，采用直接注射法向卵細(xì)胞的原核中引入嵌合載體，所述文獻(xiàn)是Brinster R.L.等，1989,PROC.NATL.ACAD.SCI.86:7087；還有T.E.Wagner和P.C.Hoppe的美國(guó)專利4,873,191，二者都全文引入本文以供參考。另外，可向胚胎干細(xì)胞中引入嵌合載體，可用正常胚泡細(xì)胞聚集胚胎干細(xì)胞從而產(chǎn)生嵌合動(dòng)物，以嵌合動(dòng)物的后代可重新獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，該方法參見Capccchi,M.R.,1989,Science 244:1288，該文獻(xiàn)全文引入本文以供參考。
采用電穿孔法，每10,000個(gè)被處理細(xì)胞就有一個(gè)細(xì)胞在靶序列上發(fā)生特異性突變(下文稱“轉(zhuǎn)化”)。因此，本發(fā)明的實(shí)踐包括從大量未突變細(xì)胞中選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法的使用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)增多。這些增多的優(yōu)點(diǎn)的非限制性實(shí)例包括抗藥性，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)的改變和利用代謝物能力的改變。在另一個(gè)實(shí)施例中，選擇方法是負(fù)選擇法，使用該方法在所選擇條件下使得被轉(zhuǎn)化細(xì)胞不能生長(zhǎng)，并且通過(guò)使其暴露在選擇性破壞增殖細(xì)胞的條件下而除去未被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
另外，被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可具有改變的細(xì)胞表面抗原表型，它可通過(guò)免疫熒光進(jìn)行檢測(cè)，采用熒光激活細(xì)胞分離器進(jìn)行選擇。
當(dāng)向細(xì)胞中引入嵌合載體的方法是直接注射法時(shí)，例如當(dāng)采用原核注射法建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，每10,000個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率可高于1個(gè)細(xì)胞。因此，大大降低了選擇的需要。
采用電穿孔法轉(zhuǎn)化的嵌合載體的典型用量是每百萬(wàn)個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞在10-1000ng之間。
6．實(shí)施例6.1．實(shí)施例1對(duì)黑粉菌屬真菌的體內(nèi)活性野生型黑粉菌具有功能性的尿嘧啶(ura)-3基因，其產(chǎn)物是尿嘧啶生物合成途徑中的一部分。當(dāng)野生型黑粉菌生長(zhǎng)于5′-fluororotic acid(5FOA)培養(yǎng)基中時(shí)，細(xì)胞由于該酸加入到上述途徑中而死亡。假如尿嘧啶-3發(fā)生突變，則不會(huì)產(chǎn)生尿嘧啶-3 mRNA，細(xì)胞就得以在5FOA培養(yǎng)基中存活。
內(nèi)源性尿嘧啶-3基因序列是本領(lǐng)域中已知的。在一組實(shí)驗(yàn)中，該序列的堿基358由腺嘌呤變?yōu)樾叵汆奏?，這一突變導(dǎo)致功能障礙蛋白的產(chǎn)生。
嵌合載體的合成如下堿基358突變的載體(358 RNA載體)5′TGCCGATCGGCAACTTTTGUUGCCGAUCGGCAAATTT3′(SEQ ID:1)該358載體采用發(fā)夾構(gòu)象。劃線堿基表示核糖核酸殘基。黑體字母表示突變基因(異型區(qū))。斜體“T”表示未配對(duì)堿基。
建立具有相同序列但不包含核糖核酸的載體作為對(duì)照。在該載體中胸腺嘧啶被尿嘧啶替代。
對(duì)照載體在堿基358進(jìn)行突變(DNA 358載體)5′TGCCGATCGGCAACTTTTGTTGCCGATCGGCAAATTT 3′(SEQ ID:2)也采用發(fā)夾構(gòu)象。再者，黑體殘基是突變基因。
進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，按照本領(lǐng)域所熟知的方法，將U.maydis細(xì)胞制成回收率為50ul轉(zhuǎn)化緩沖液中106個(gè)細(xì)胞的原生質(zhì)體，并使用不同量的嵌合載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染或者將同源(僅DNA)載體與原生質(zhì)體在37℃混合。然后，將細(xì)胞鋪于所選擇的培養(yǎng)基上，計(jì)數(shù)存活菌落(轉(zhuǎn)化細(xì)胞)的數(shù)目。結(jié)果以下面的表格形式表示<
>這些數(shù)據(jù)表明使用RNA 358載體的細(xì)胞轉(zhuǎn)染與使用相應(yīng)DNA載體的轉(zhuǎn)染相比，極大地提高了細(xì)胞的存活率。
6.2．實(shí)施例2:NIH 3T3細(xì)胞的轉(zhuǎn)化NIH 3T3細(xì)胞是具有良性(可控制的)生長(zhǎng)特性的人細(xì)胞。惡性(無(wú)控制的)生長(zhǎng)特性是由致癌基因H→ras中的單位點(diǎn)突變給予的，所謂突變是由Thr替代Gly12。這樣，G→T12導(dǎo)致生長(zhǎng)特性的易于選擇的變化。Taparowsky,E.等，1982,Nature 300:762；Sukumar S.等，1983,Nature306:658。
建立下述序列以指導(dǎo)發(fā)生G→T12突變的嵌合載體5′-CACACCGACGGCGCCCACCACTTTGTGGTGGGCGCCGTCGGTGTGGGTTTGCC-3′(SEQ ID:3)該序列以常規(guī)單字母代碼表示，其它特點(diǎn)是未劃線的表示RNA，未配對(duì)堿基是斜體，突變體堿基是黑體。需要注意的是，環(huán)化之后通過(guò)兩個(gè)三胸腺嘧啶序列將嵌合載體分為兩條基本上互補(bǔ)的鏈，并且所有含核糖的核苷酸僅存在于兩條鏈中的一條。
使用2′-OMe核糖堿基合成兩種形式的嵌合載體，它們分別具有一個(gè)(“R”)和兩個(gè)(“R-D-R”)的翼側(cè)有四個(gè)脫氧核糖殘基的雜種雙鏈區(qū)。R-D-R形式如上SEQ ID:3所示，R形式除堿基6-9是脫氧核苷酸外是相同的。值得注意的是，5′和3′末端是脫氧核苷酸。采用如在重組DNA中常用的相同DNA連接酶法，在合成之后環(huán)化嵌合載體。連接之后，通過(guò)兩次重復(fù)的制備性D600凝膠(AT Biochem,Malvern,PA)電泳從底物中分離環(huán)化嵌合載體。
對(duì)照載體是1)沒有雜種雙鏈的相同序列(“同質(zhì)雙鏈”所示數(shù)據(jù))；2)具有5′-GCCCACACCGACGGCGCCACCAC-3′(SEQ ID 4)序列的未配對(duì)DNA(“sDNA”所示數(shù)據(jù))；3)沒有異源區(qū)的嵌合載體，因而是沒有突變基因的核苷酸(未顯示數(shù)據(jù))。
采用電穿孔法通過(guò)轉(zhuǎn)化NIH 3T3細(xì)胞(1×106個(gè)細(xì)胞)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。電穿孔法之后，將細(xì)胞以4×103個(gè)接種密度鋪于培養(yǎng)基中并使其生長(zhǎng)14天。用結(jié)晶紫染色灶形成細(xì)胞使轉(zhuǎn)化細(xì)胞可見。使用編碼T12形式的H ras的質(zhì)粒pT24作為陽(yáng)性對(duì)照。該對(duì)照用于測(cè)定轉(zhuǎn)染的NIH 3T3細(xì)胞中的異常重組水平。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，下表表示其概括性結(jié)果。除下面所示結(jié)果外，使用沒有突變基因密碼子的嵌合載體的對(duì)照實(shí)驗(yàn)未顯示出NIH 3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)化灶。
這些結(jié)果表明嵌合載體通過(guò)同源重組引入特定突變以轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞。該實(shí)驗(yàn)中的轉(zhuǎn)化率大大高于通過(guò)異常重組的轉(zhuǎn)化率，這是由使用包含完全突變的H-ras基因的pT24陽(yáng)性對(duì)照載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染觀察到的。因此，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中使用嵌合載體的同源重組率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于異常重組率。
序列表(1)普通信息(ⅰ)申請(qǐng)者Kmiec,Eric(ⅱ)發(fā)明題目用于真核細(xì)胞中定點(diǎn)突變的化合物和方法(ⅲ)序列數(shù)4(ⅳ)通訊地址(A)收信人Pennie &amp; Edmonds(B)街道1155 Avenue ofthe Americas(C)城市New York(D)國(guó)家NY(F)郵政編碼10036-2731(ⅴ)可讀計(jì)算機(jī)源(A)媒介類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0,Version#1.25(ⅵ)當(dāng)前申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S(B)遞交日(C)分類(ⅷ)律師/代理人信息(A)姓名Friebel,Thomas E.
(B)注冊(cè)號(hào)29,258(C)文獻(xiàn)/摘要號(hào)7991-009(ⅸ)通訊信息(A)電話(212)790-9090(B)傳真(212)869-8864/009
(2)第一序列(SEQ ID:1)信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度37對(duì)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈合方式自身互補(bǔ)(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA/RNA(ⅸ)特點(diǎn)(A)名稱/檢索表-(B)位點(diǎn)19..32(D)其它信息/標(biāo)記=a/注=“RNA”(ⅹⅰ)序列描述第一序列描述TGCCGATCGG CAACTTTTGU UGCCGAUCGG CAAATTT37(2)第二序列(SEQ ID:2)信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度37對(duì)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈合方式自身互補(bǔ)(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述第三序列描述TGCCGATCGG CAACTTTTGT TGCCGATCGG CAAATTT37(2)第三序列(SEQ ID:3)信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度53對(duì)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈合方式自身互補(bǔ)(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA/RNA(ⅸ)特點(diǎn)
(A)名稱/檢索表-(B)位點(diǎn)2..5(D)其它信息/標(biāo)記=b/注=“RNA”(ⅸ)特點(diǎn)(A)名稱/檢索表(B)位點(diǎn)10..21(D)其它信息/標(biāo)記=d/注=“RNA”(ⅸ)特點(diǎn)(A)名稱/檢索表(B)位點(diǎn)51..52(D)其它信息/標(biāo)記=f/注=“RNA”(ⅹⅰ)序列描述第三序列描述CACACCGACG GCGCCCACCA CTTTGTGGTG GGCGCCGTCG GTGTGGGTTT GCC53(2)第四序列(SEQ ID:4)信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度23對(duì)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈合方式自身互補(bǔ)(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述第四序列描述GCCCCACCG ACGGCGCCAC CAC2權(quán)利要求
1．一種將預(yù)定改變引入有核細(xì)胞基因組的靶序列中的方法，它包括下述步驟a．提供一種嵌合載體，它具有兩個(gè)靶序列同源區(qū)，和一個(gè)排列在兩個(gè)同源區(qū)之間的編碼這種改變的異源區(qū)；b．使嵌合載體保持在細(xì)胞核中，以使嵌合載體與靶序列發(fā)生遺傳學(xué)重組。
2．權(quán)利要求1的方法，其中核是卵的原核并且采用直接注射法引入改變。
3．權(quán)利要求1的方法，其中核是胚胎干細(xì)胞核并且采用直接注射法引入改變。
4．一種獲得改變特征的細(xì)胞群的方法，它包括下述步驟a．提供一種嵌合載體，它具有兩個(gè)靶序列同源區(qū)，和一個(gè)排列在兩個(gè)同源區(qū)之間的編碼這種改變的異源區(qū)；b．使嵌合載體保持在細(xì)胞核中，由此嵌合載體與靶序列發(fā)生重組，細(xì)胞被轉(zhuǎn)化；及c．選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
5．權(quán)利要求4的方法，其中細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
6．權(quán)利要求4的方法，其中細(xì)胞是酵母菌或真菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及多核苷酸,它的第一鏈含有核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸兩種,而第二鏈僅含有脫氧核糖核苷酸;其中鏈?zhǔn)俏稚死锟艘?guī)則配對(duì)的并且通過(guò)寡核苷酸連接,如此該多核苷酸至多具有一個(gè)單一3′末端和一個(gè)單一5′末端?？蓪⑦@些末端連接,這樣多核苷酸就成為一個(gè)單一連續(xù)環(huán)狀聚合物(single continuous circular polymer)。該多核苷酸可用于向靶基因中引入特定改變。
文檔編號(hào)C07H21/04GK1215755SQ9811878
公開日1999年5月5日 申請(qǐng)日期1998年8月22日 優(yōu)先權(quán)日1993年12月9日
發(fā)明者E·B·克米克 申請(qǐng)人:托馬斯杰弗遜大學(xué)