一種口蹄疫病毒2c3abc重組蛋白及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)及其制備方法和應(yīng)用，特別涉及一種口蹄疫病毒2C3ABC 重組蛋白及其制備方法和應(yīng)用，屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 口蹄疫（Foot-and-mouthdisease，F(xiàn)MD)是偶蹄類動(dòng)物高度傳染且嚴(yán)重影響全球 經(jīng)濟(jì)、貿(mào)易的疾病，其病原為口蹄疫病毒（Foot-and-mouthdiseasevirus，F(xiàn)MDV)，屬于小 核糖核酸病毒科的口蹄疫病毒屬，目前發(fā)現(xiàn)已經(jīng)有7個(gè)血清型0、A、C、AsiaI、SAT1、SAT2、 SAT3。在亞洲、非洲、南美洲都有流行，包括中國(guó)、東南亞、中國(guó)臺(tái)灣等地。中國(guó)大陸在過去 的50年，主要流行0、AsiaI、A型口蹄疫。
[0003] FMDV為單鏈線狀RNA，大約有8500個(gè)核苷酸組成?；蚪M由5'端非編碼區(qū) (Untranslationregion，UTR)、開放閱讀框（Openreadingfragment，0RF)和 3'-UTR及 Poly(A)組成。ORF由L基因、Pl結(jié)構(gòu)蛋白基因、P2和P3非結(jié)構(gòu)蛋白基因以及起始密碼子 和終止密碼子組成，長(zhǎng)約6. 5kb，共同編碼一多聚蛋白。多聚蛋白經(jīng)3次裂解后，形成3~ 4種病毒結(jié)構(gòu)蛋白（VP0或VP4、VP2、VP3、VP1)，8種非結(jié)構(gòu)蛋白（L、2A、2B、2C、3A、3B、3C和 3D) 〇
[0004] 除發(fā)達(dá)國(guó)家外，在FMD流行的大多數(shù)發(fā)展中國(guó)家和地區(qū)需要進(jìn)行疫苗的接種來控 制該病的流行。因此區(qū)分FMD自然感染和免疫動(dòng)物是FMD預(yù)防的一項(xiàng)重要內(nèi)容。目前FMD弱毒疫苗已經(jīng)停止使用，而滅活疫苗的生產(chǎn)工藝都將非結(jié)構(gòu)蛋白除去。動(dòng)物接種滅活疫苗 后主要產(chǎn)生FMDV結(jié)構(gòu)蛋白抗體，很少產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)蛋白抗體；而自然感染動(dòng)物即產(chǎn)生結(jié)構(gòu)蛋 白抗體，也產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)蛋白抗體。所以，F(xiàn)MD非結(jié)構(gòu)蛋白作為抗原檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)NSP抗體，是 一種很好的區(qū)分自然感染動(dòng)物和疫苗免疫動(dòng)物生物診斷方法。在病毒復(fù)制、表達(dá)，急性或感 染口蹄疫病毒的動(dòng)物體內(nèi)有非結(jié)構(gòu)蛋白（NSP)抗體存在。高度純化的滅活口蹄疫疫苗除去 了細(xì)胞蛋白和病毒非結(jié)構(gòu)蛋白，免疫后產(chǎn)生結(jié)構(gòu)蛋白抗體。在FMDV感染動(dòng)物中存在口蹄疫 非結(jié)構(gòu)蛋白抗體，各血清型病毒有共同非結(jié)構(gòu)蛋白，高度保守，動(dòng)物口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3AB 或3ABC或2C、3C等NSP抗體是口蹄疫病毒感染動(dòng)物的標(biāo)志。因此檢測(cè)抗口蹄疫病毒非結(jié) 構(gòu)蛋白抗體可區(qū)別動(dòng)物免疫和感染。在近幾年，用血清學(xué)方法檢測(cè)口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白 抗體評(píng)估動(dòng)物中口蹄疫的病毒流行，包括膠體珠血凝法、酶聯(lián)免疫吸附轉(zhuǎn)移斑點(diǎn)法、多重發(fā) 光法，這些方法需要在實(shí)驗(yàn)室用不同的儀器和設(shè)備，限制了這些方法在田間的使用，延長(zhǎng)了 口蹄疫防控應(yīng)對(duì)和診斷的時(shí)間。目前，口蹄疫結(jié)構(gòu)蛋白3ABC和2C3AB為診斷抗原，研制了 多種血清學(xué)診斷試劑，用于活的家畜以及產(chǎn)品貿(mào)易管理，以及口蹄疫疾病檢測(cè)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 口蹄疫在亞洲、非洲、南美洲一些國(guó)家流行，經(jīng)常在暴露于FMDV的動(dòng)物中流行， 控制和根除口蹄疫需要可區(qū)分免疫動(dòng)物和感染動(dòng)物，口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗原是可靠 的診斷標(biāo)志抗原，但3ABC基因在昆蟲等真核細(xì)胞表達(dá)往往產(chǎn)生截?cái)嗟?ABC多肽，如3AB、 3C、3A。針對(duì)以上問題，本發(fā)明采用全長(zhǎng)完整的不被酶解的突變2C3ABC多肽為抗原，突變 2C3ABC多肽，克隆到質(zhì)粒PBV220,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a、實(shí)現(xiàn)高水平大量表達(dá)。mu2C3ABC以 包涵體形式表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，經(jīng)分離、變性、復(fù)性、CM陽離子交換層析、DEAE陰離子交換層 析、S-300分子篩層析純化。以此高度純化完整全長(zhǎng)、分子量為72kDa多肽為抗原，檢測(cè)口 蹄疫病毒試驗(yàn)性感染豬和自然沒有感染豬的靈敏度分別為98. 4%和100%，檢測(cè)自然沒有 感染豬、疫苗免疫豬的特異性分別為100%和98%。和商用試劑盒Ceditest和UBI比較， 有高度一致性，K= 0. 823 (p〈0. 05)，可用于區(qū)別感染動(dòng)物和免疫動(dòng)物。
[0006] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：
[0007] -種突變的口蹄疫病毒2C3ABC重組蛋白，其特征在于，在原始口蹄疫病毒3C蛋白 酶基因的基礎(chǔ)上進(jìn)行了以下位點(diǎn)的突變：Cysl42 -Ser，Cysl63 -Gly。
[0008] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的口蹄疫病毒的血清型為國(guó)內(nèi)流行的0型。
[0009] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的口蹄疫病毒3C蛋白酶基因來源于豬、牛、羊以及駱駝 的口蹄疫病毒。
[0010] 進(jìn)一步的，本發(fā)明提供了所述的突變的口蹄疫病毒2C3ABC重組蛋白的制備方法， 其特征在于，包括以下步驟：
[0011] (1)合成口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2C3ABC基因，基因合成后，插入到PGEM-T克隆質(zhì) 粒；
[0012] (2)以口蹄疫病毒全長(zhǎng)2C3ABC蛋白基因?yàn)槟０?，采用PCR方法進(jìn)行口蹄疫病毒3C 蛋白酶基因Cysl42 -Ser，Cysl63 -Gly的突變，突變后產(chǎn)物連接到pGEM-Teasy克隆質(zhì) 粒上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選陽性克隆，酶切和測(cè)序正確后，再將突變后產(chǎn)物克隆到 表達(dá)載體PBV220,克隆產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選陽性克隆，酶切和測(cè)序正確后，獲得重組質(zhì) 粒PBV220-mu2C3ABC;
[0013] (3)將含有重組質(zhì)粒PBV220-mu2C3ABC的大腸桿菌接種到含氨芐青霉素的LB培養(yǎng) 液中，以225rpm轉(zhuǎn)速30°C培養(yǎng)10小時(shí)，然后按照體積比1:100轉(zhuǎn)接到含氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)液中，225rpm轉(zhuǎn)速30°C培養(yǎng)10小時(shí)，即為發(fā)酵種子液，將發(fā)酵種子液體積比1:100~ 1:1000轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)4小時(shí)后，升溫到42°C誘導(dǎo)培養(yǎng)4~5小時(shí)，獲得大 腸桿菌培養(yǎng)液；
[0014] (4)重組蛋白2C3ABC提取和純化
[0015] a重組蛋白2C3ABC提取
[0016] 將步驟（3)得到的大腸桿菌培養(yǎng)液離心收集細(xì)胞，收集到的細(xì)胞加入裂解液重 懸，用超聲儀在冰浴中破碎細(xì)胞壁，超聲破碎后在4°C以10,OOOg離心20分鐘分離上清和沉 淀，沉淀用變性溶解緩沖液重懸，離心取上清，上清液進(jìn)行透析，透析平衡后用含0. 5%二巰 基乙醇的復(fù)性液稀釋，獲得重組蛋白2C3ABC的粗制溶液；
[0017] 其中，所述的裂解液含有 50mMTris,IOOmMNaCl, 0? 1 %TritonX以及 0? 2mM EDTA，pH7.2 ;
[0018] 所述的變性溶解緩沖液含有50mMNaH2PO4, 300mMNaCl以及8M尿素，pH8. 0 ;
[0019] 所述的復(fù)性液含有 50mMNaH2POjPIOOmMNaCl,pH7. 2 ;
[0020] b重組蛋白2C3ABC純化
[0021]將重組蛋白2C3ABC的粗制溶液依次經(jīng)CM-S印haroseFF陽離子交換層析、 DEAE-SepharoseFF陰離子交換層析和Sephcryl-400HR分子篩復(fù)性純化，洗脫收集蛋白峰， 洗脫液用PBS緩沖液透析，透析液用截留值30kDa的濾器濃縮備用，測(cè)定重組蛋白2C3ABC 的分子量、純度、含量和活性。
[0022] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟（1)所述的合成口蹄疫病毒全長(zhǎng)2C3ABC蛋白基因的引 物為SEQIDNO:1和SEQIDNO:4所示；步驟⑵所述的PCR方法中的引物為SEQIDNO: I-SEQIDNO:6 所示。
[0023] 2C3ABC在細(xì)胞或動(dòng)物體內(nèi)自行裂解為2C、3A、3B、3C(pro)，在大腸桿菌中表達(dá)自 然的2C3ABC或多為包涵體，且蛋白多肽被截短。本發(fā)明對(duì)自然的2C3ABC基因142和163 半胱氨酸殘基定點(diǎn)突變?yōu)樯彼岷透拾彼?，阻止了蛋白酶活性克服了?xì)胞內(nèi)酶解2C3ABC， mu2C3ABC與試驗(yàn)性感染FMDV豬血清反應(yīng)強(qiáng)烈，與疫苗免疫豬血清的反應(yīng)微弱。表明本發(fā)明 克服了 3C(pro)的蛋白酶活性獲得完整的mu2C3ABC蛋白。
[0024] 更進(jìn)一步的，本發(fā)明提供了所述的突變的口蹄疫病毒2C3ABC重組蛋白在制備抗 口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2C3ABC抗體中的應(yīng)用。以及
[0025] 所述的突變的口蹄疫病毒2C3ABC重組蛋白在制備檢測(cè)口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白 2C3ABC抗體試劑中的應(yīng)用。
[0026] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，采用層析條檢測(cè)動(dòng)物血清中口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2C3ABC 抗體。
[0027] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，采用便攜式掃描儀對(duì)層析條的顏色密度進(jìn)行分析，進(jìn)而得到 動(dòng)物血清中口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2C3ABC抗體的濃度。
[0028] 本發(fā)明公開的層析條能在豬感染早期檢測(cè)到豬感染口蹄疫病毒，在豬感染口蹄疫 病毒8天就能測(cè)出3ABC抗體，在豬感染后10-34天測(cè)定90%豬為陽性，靈敏度與商用試劑 盒Ceditest和UBI的相當(dāng)，但優(yōu)于CHEKIT試劑盒，豬感染0天、2天血清用層析條檢測(cè)陽性， 中和試驗(yàn)和ELISA法檢測(cè)確證為假陽性。本發(fā)明的免疫層析條檢測(cè)FMDV感染豬的靈敏性為 96. 8%，檢測(cè)未感染豬的特異性為100%，對(duì)疫苗免疫豬的檢測(cè)特異性為98. 8%。對(duì)6個(gè)豬 水泡炎病毒血清樣品檢測(cè)陰性，更加顯示了層析條的檢測(cè)特異性，和商用試劑盒Ceditest 和UBI性能相當(dāng)。
[0029] 層析條可立時(shí)檢測(cè)、既能定性又能定量，在1小時(shí)內(nèi)獲得動(dòng)物待檢血清的檢測(cè)結(jié) 果，適合實(shí)驗(yàn)室和田間大量樣本的篩選、處理、快速檢測(cè)，適合養(yǎng)殖場(chǎng)和農(nóng)場(chǎng)使用，可縮短檢 測(cè)和應(yīng)對(duì)爆發(fā)流行的時(shí)間，