穩(wěn)定的fmdv衣殼的制作方法
【專利說明】穩(wěn)定的FMDV衣殼
[0001] 本發(fā)明涉及獸醫(yī)學和病毒學的領域。具體而言，本發(fā)明涉及口蹄疫病毒（FMDV) VP2蛋白突變體，包含F(xiàn)MDV VP2蛋白突變體的FMDV衣殼，分離的核酸分子，宿主細胞，活重 組載體微生物，和針對FMD的疫苗。此外，本發(fā)明涉及用于這些實施方案和使用這些實施方 案的幾種方法。
[0002] 口蹄疫（FMD)是影響偶蹄類哺乳動物；偶蹄目的一種急性、全身性和高度感染性 的疾病。許多野生生物物種下一步，主要相關(guān)目標是家畜諸如牛、水牛、豬、綿羊和山羊。典 型癥狀是舌和蹄上的水皰；因此得到該疾病的名稱。這不僅引起許多不適和繼發(fā)性感染，而 且引起發(fā)燒和偶爾死亡率。此外，該疾病引起顯著的經(jīng)濟損失，因為受影響的動物將停止移 動和進食。FMD是一種應申報的疾病，許多國家將拒絕進口來自FMD陽性地區(qū)的動物；這由 出口認證的國際系統(tǒng)執(zhí)行（Paton 等人· 2009，Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci.，vol. 364，ρ· 2657)。
[0003] FMD由口蹄疫病毒（FMDV)引起，所述口蹄疫病毒（FMDV)是小核糖核酸病毒科的病 毒，并且是口瘡病毒屬的類型種。病毒粒子包含約8 kb的單鏈正鏈RNA基因組，其包含于 無包膜衣殼中。衣殼的直徑為約30 nm，且具有二十面體對稱。衣殼由四種結(jié)構(gòu)病毒蛋白 (VP1、VP2、VP3和VP4)中每一種的60個拷貝的高度規(guī)則排列組成。這些組織于含有VPl-4中每一個的具有5S的沉降系數(shù)的原聚體亞單位中；這些原聚體中的五個形成12S的五 聚體，且完整的衣殼由12個五聚體組成。這可以是約70S的非感染性空衣殼，或具有病毒 RNA內(nèi)容物的約146S的病毒粒子衣殼，其可以是感染性的（Fry等人，2005，Curr. Top. Microbiol. I mm. , vol. 288, p. 71) 〇
[0004] 作為二十面體結(jié)構(gòu)，F(xiàn)MDV衣殼具有三個天然類型的對稱軸：5重軸（5-fold axis)，其中原聚體滿足組裝成五聚體；以及兩個軸，其中五聚體亞單位滿足：對稱性的2重 軸，其中相鄰VP2-VP2蛋白相互作用，和3重軸，其中VP2-VP3蛋白相互作用；參見圖1。
[0005] 在天然復制中，F(xiàn)MDV病毒蛋白被表達為命名為Pl的長多蛋白前體，其包含 VP4-2-3-1。這也是為什么FMDV VP有時通過它們在Pl上的順序來命名的原因，由此：VP1 是1D，VP2是1B，VP3是IC且VP4被命名為1A。Pl的翻譯后切割成較小部分通過非結(jié)構(gòu) FMDV 編碼的蛋白 2 A-C 和 3 A-D 進行。（Chapter: Picornaviridae, : Fields Virology, 第4版，Lippincott Williams & Wilkins, ISBN-10: 0781718325)。
[0006] 為了減少FMD的發(fā)病率或嚴重度以及FMDV的傳播，典型措施是接種、選擇性剔除 (selective culling)和運動限制。然而，一些國家允許只在爆發(fā)條件下接種，因為出口認 證系統(tǒng)通過動物是否是FMDV血清學陽性來淘汰（condemn)動物。因此正在研究允許區(qū)分 接種和野生型感染的標記疫苗。
[0007] 傳統(tǒng)的FMD疫苗是滅活的完整病毒制備物的佐劑化乳劑，其誘導保護水平的病毒 中和抗體。然而，因為FMDV顆粒的高感染性，病毒的操作和此類疫苗的產(chǎn)生需要在高水平 生物安全條件下進行，且需要有效的質(zhì)量控制，特別是對病毒滅活。
[0008] FMDV是高度可變的病原體，且目前具有七種主要的血清型：0、A、C、SAT (南非地 區(qū)）-l、SAT-2和SAT-3和Asia 1。在這些血清型內(nèi)，存在許多抗原性變體、亞型和準種。提 供信息的是 Carrillo 等人（2005，J. of Gen. Virol·, vol. 79，ρ· 6487)，其已經(jīng)比對 了來自所有血清型的超過100種FMDV分離株的翻譯的基因組序列。
[0009] 因為主要血清型之間存在較少交叉保護，通常FMD疫苗包含F(xiàn)MD疫苗需要針對其 保護的每種血清型的單獨組分，通常作為組合疫苗。
[0010] 關(guān)于流行性，血清型A和0幾乎全世界存在，而血清型C從2004年以來沒有任何 爆發(fā)。三種SAT血清型在非洲和中東的幾個區(qū)域中發(fā)生，且血清型Asia 1在亞洲和中東發(fā) 生。
[0011] 七種血清型在生物物理特性（主要是它們的穩(wěn)定性）方面也不同。這作為FMDV 是相關(guān)的，除了具有高度感染性，也是相當不穩(wěn)定的，且容易被熱、酸度、剪切等滅活。盡管 如此，所有FMD疫苗需要在嚴格冷鏈物流下運送和儲存。這在FMD流行的世界的（亞）熱 帶和發(fā)展中地區(qū)中是特殊障礙。在這方面，血清型A和Asia 1的病毒粒子比其他血清型的 病毒粒子相對更穩(wěn)定，且具有6個月或更長的更可行的儲存期。然而，血清型0疫苗具有非 常有限的生物半衰期，通常只有幾個月。甚至更差的是三種SAT血清型的狀況，顯著低穩(wěn)定 性僅得到針對其具有低保護能力的疫苗，甚至當施用多次時。
[0012] 因此，持續(xù)需要開發(fā)和改進安全、穩(wěn)定和有效的FMD疫苗。
[0013] 通過重組DNA表達技術(shù)制備的FMD疫苗也已經(jīng)研究了許多年。例如，通過在各種 系統(tǒng)中表達FMDV亞單位或表位，諸如無細胞表達，或在原核或真核細胞（包括植物細胞） 中的基于細胞的表達。
[0014] 另一種選擇是使用空FMDV衣殼；這些比完整病毒更安全生產(chǎn)，并且被認為是有效 的免疫原（Rweyemamu,等人，1979，Arch. Virol., vol. 59，p. 69)。此類空衣殼可以在 以下中有效地產(chǎn)生：重組表達系統(tǒng)，諸如基于大腸桿菌（Lewis等人，1991，J. of Virol., vol. 65，ρ· 6572; Lee 等人，2009，J. Biomed. Sci.，vol. 16，ρ· 69)或病毒表達 系統(tǒng)，例如，使用重組牛痘病毒（Abrams等人，1995，J. of Gen. Virol., vol. 76，ρ. 3089);重組桿狀病毒，使用昆蟲細胞（Cao等人，2009，Vet. Microbiol·，vol. 137，ρ· I; Charleston等人，TO 2011/048353; Subramanian等人，2012，Antivir. Res·, vol. 96，p. 288)，或桑蠶（Li 等人，2012，PLoS One. 2012; 7(8): e43849);或活重組載體， 諸如重組腺病毒（Lu 等人，2008，vaccine, vol. 26，Suppl. 6，p. G48) 〇
[0015] 不幸地，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)空衣殼甚至比病毒粒子衣殼更加不穩(wěn)定；顯然，病毒RNA基因組 本身為FMDV衣殼結(jié)構(gòu)提供了一些穩(wěn)定作用。
[0016] 幾個組已經(jīng)研究了 FMDV衣殼的穩(wěn)定性特征，所述FMDV衣殼在高于生理溫度和低 于生理pH迅速解離成五聚體。對于疫苗使用，這是不利的，因為12S五聚體比完整衣殼的免 疫原性小得多。參見：Doel 等人（1981，Arch, of Virol·, vol. 70，ρ. 21)，和 Hegde 等 人（2009，： Editorial, Vaccine, vol. 27，ρ· 2199)。Twomey等人（1995，Virology, vol. 206，ρ. 69)研究了 FMDV A血清型的天然變體，其不那么酸敏感，這是由于VP2蛋白 的位置131和133的氨基酸取代導致的。
[0017] 為了改善FMDV衣殼的熱和/或酸穩(wěn)定性，幾個組已經(jīng)將突變引入一種或多種病毒 結(jié)構(gòu)蛋白，然后使用此類VP突變體以產(chǎn)生FMDV病毒粒子衣殼，且測試這些的生物物理特 性；這是所謂的衣殼工程改造。
[0018] 通常，成功不同；在一定程度上，酸敏感性可以通過對VP3的位置140 - 145中 的組氨酸殘基突變來降低：Martin-Acebes 等人，（2011，J. of Virol., vol. 85，p. 2733)，Liu 等人（CN 101270155)和 Ellard 等人（1999，J. of Gen. Virol·，vol. 80， ρ· 1911)。Martin-Acebes等人（同上）取代：VPl N17D (意指：VP1中的位置17的天冬 酰胺被天冬氨酸取代）。
[0019] 以類似的方式，F(xiàn)MDV衣殼熱穩(wěn)定性可以通過突變VP2和VP3蛋白的許多區(qū)域中的 氨基酸而得到一定改善：Mateo 等人（2008，J. of Virol.，vol. 82，P. 12232)，King等 人（W0 2002/000251)和 Fowler 等人（W0 2011/032348)。對于綜述：]\&^611(2011，？『〇七· Eng·，Des. &Sel·，vol. 24，p. MhMateo 等人（同上）應用取代 VP2A65H，和組合 的取代：VP3 D69E / VP2 T188A。Fowler 等人（同上）在 VP2 中取代：L78S、E79A、K80R、 T88A、E131K 或 A193S ;且在 VP3 中取代：H85P 或 E196A。
[0020] King等人（同上）的方法與本工作的不同之處在于，他們試圖通過引入除了非共 價鍵以外的共價鍵穩(wěn)定FMDV衣殼。通過用VP2氨基酸取代為半胱氨酸，他們在對稱的2重 軸處的兩個相鄰VP2蛋白之間引入非天然二硫鍵。但是，該方法只適用于穩(wěn)定空衣殼，而不 能用于穩(wěn)定病毒粒子衣殼。這是因為，在該方法中，所得衣殼是永久固定的，且病毒粒子衣 殼在感染宿主細胞之后不再可以脫衣殼。
[0021] King等人（同上）取代的氨基酸位于VP2蛋白的位置93(其作為其序列標識符編 號38的氨基酸編號179描述于WO 2002/000251)。該氨基酸位置在VP2蛋白的區(qū)域中，在 其天然結(jié)構(gòu)中，所述區(qū)域折疊成α螺旋：VP2蛋白a A螺旋，覆蓋（對于0血清型）VP2氨基 酸 88-98 (參見：Acharya 等人，1989，Nature, vol. 337，P. 709)。還關(guān)于另一種小核 糖核酸病毒人腸道病毒的脫包衣機制研究該區(qū)域（Wang等人，2012，Nature Str. & Mol. Biol., vol. 19，p. 424)，然而，該機制不同于FMDV的機制。Wang等人沒有進行或暗示該區(qū) 域中的任何突變。
[0022] 盡管現(xiàn)有技術(shù)中進行了所有努力，但當前沒有普遍適用且免疫有效的基于工程改 造的FMDV衣殼的FMD疫苗可用。
[0023] 本發(fā)明的一個目的是提供替代的FMD疫苗，其適用于所有FMDV血清型，且可以基 于FMDV空衣殼，或FMDV病毒粒子衣殼。一個進一步目的是提供改進的FMD疫苗。
[0024] 當本發(fā)明人嘗試應用King等人（同上）描述的技術(shù)時，他們失望地無法應用該方 法以生成除了 A型以外的血清型的空FMDV衣殼。例如，在來自血清型0的FMDV的VP2蛋 白的αΑ螺旋中的位置93或該螺旋中的其他位置進行半胱氨酸取代。嘗試產(chǎn)生空衣殼，然 而，完全沒有形成衣殼，或衣殼將嚴重聚集，使它們無法用于疫苗目的。
[0025] 令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，通過提供在VP2蛋白的a A螺旋的區(qū)域中包含特定氨基酸取代 的FMDV VP2蛋白突變體，而不需要引入共價鍵，可以滿足該目的，且因此可以克服現(xiàn)有技術(shù) 的缺點。
[0026] 此類FMDV VP2蛋白突變體現(xiàn)在可以引入FMDV衣殼，其然后獲得顯著改善的生物 物理穩(wěn)定性。所得穩(wěn)定的FMDV衣殼現(xiàn)在可以用于產(chǎn)生基于病毒粒子衣殼或空衣殼的有利 FMD疫苗。
[0027] 盡管不知道確切的作用機制，且不限于任何理論或模型，本發(fā)明人推測，該區(qū)域中 的此類取代的有利效果是，這為FMDV衣殼提供了分子水平的疏水和/或靜電穩(wěn)定作用。據(jù) 推測，這通過增強FMDV衣殼的2重對稱軸的區(qū)域中兩個相鄰VP2蛋白之間的分子間相互作 用而發(fā)生。這增強相鄰五聚體之間的相互作用，這導致FMDV衣殼作為整體的顯著改進的穩(wěn) 定性。
[0028] FMDV衣殼的改進的穩(wěn)定性導致相比于具有未修飾的親本VP2蛋白的FMDV衣殼的 許多優(yōu)點：可以產(chǎn)生更高量的含有VP2蛋白突變體的衣殼，它們可以在對冷鏈物流具有較 低嚴格要求的情況下運輸，且它們提供改善的免疫應答。
[0029] 這都是意料之外的，因為先前沒有描述VP2蛋白的該特定區(qū)域的非共價鍵突變， 或者可以預期其導致對FMDV衣殼穩(wěn)定性和由此產(chǎn)生的FMD疫苗的此類顯著改善。
[0030] 因此，在一個方面，本發(fā)明涉及口蹄疫病毒（FMDV) VP2蛋白突變體，其特征在于 VP2蛋白突變體包含位于VP2蛋白的a A螺旋中的至少一個氨基酸取代為選自Q、N、V、I、 L、M、F、Y、W和H的氨基酸。
[0031] 本發(fā)明的" 口蹄疫病毒"是具有分類種FMDV的成員的表征特征的病毒。這還包括 以任何方式由其細分，例如為亞種、準種、毒株、分離株、基因型、血清型、血清變體、變體或 亞型等的FMDV。對于技術(shù)人員顯而易見的是，盡管微生物目前可以命名為FMDV，這是當新 見解導致重新分類為新的或不同的分類組時可以進行改變的分類學分類。然而，由于這不 改變涉及的微生物或其表征特征，只有其名稱或分類，此類重新分類的生物體被認為仍在 本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0032] 本發(fā)明的"VP2蛋白"是指FMDV的病毒蛋白編號2,這被稱為FMDV衣殼的結(jié)構(gòu)蛋 白。其具有約218個氨基酸，約24 kDa的分子量。如技術(shù)人員容易理解，F(xiàn)MDV固有的變異 性意味著，VP2蛋白的大小和氨基酸序列的變化將天然存在。來自大量FMDV分離株的VP2 蛋白的氨基酸序列可公開得自序列數(shù)據(jù)庫諸如GenBank ?或Swiss Prot ?。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明的VP2蛋白突變體可以是生物或合成來源的，并且可以通過分離、純 化、組裝等獲得。優(yōu)選地，VP2蛋白突變體通過使用重組表達技術(shù)，通過表達編碼VP2蛋白 突變體的核苷酸序列而獲得。
[0034] 用于本發(fā)明的VP2蛋白可以獲得自FMDV，例如通過從FMDV獲得編碼VP2蛋白的核 酸，或其核苷酸序列。此類FMDV進而可以獲得（具有適當?shù)纳锇踩胧┳愿鞣N來源， 例如，作為原始野外分離株，或保藏機構(gòu)，諸如ATCC或CNCM，或各個實驗室和（參考）機構(gòu)， 諸如 Pirbright Institute (Pirbright, Woking, UK)，這是FAO和 WHO 口蹄疫世界參考實 驗室（FMD WRL)。
[0035] 用于本發(fā)明的FMDV是4、0、(：、341'-1、341'-2、341'-3或六81&1血清型中的一種或多 種FMDV ;優(yōu)選地，用于本發(fā)明的FMDV是在特定時間在野外循環(huán)的一種或多種FMDV。
[0036] 更優(yōu)選的是來自0、SAT-l、SAT-2或SAT-3血清型的一種或多種FMDV，因為這些血 清型缺乏穩(wěn)定性的問題在野外具有最大影響。
[0037] 或者，優(yōu)選的FMDV是WRL FMD推薦為高優(yōu)先疫苗候選的那些；例如，在其最近報 道中，這些是：〇 Manisa、0 PanAsia_2、0 BFS、0 Campos、A 24 Cruzeiro、Asia I Shamir、 A Iran_05、A 22 Iraq、SAT_2 Saudi Arabia 和 SAT-2 Eritrea，或任何這些的等效物（WRL FMD季度報道，2012年10月-12月）。
[0038] 本發(fā)明的"突變體"是從自然界或從實驗室先前未眾所周知或可用的實體。根據(jù)本 發(fā)明的FMDV VP2蛋白突變體因此不同于本發(fā)明之前的現(xiàn)有技術(shù)中描述的VP2蛋白。具體 而言，迄今已知的FMDV VP2蛋白氨基酸序列沒有資格作為根據(jù)本發(fā)明的VP2蛋白突變體。 盡管如此，根據(jù)本發(fā)明的VP2蛋白突變體可以獲得自自然界，但優(yōu)選為人造的。
[0039] 因此，在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的FMDV VP2蛋白突變體包含位于VP2蛋白 的a A螺旋中的至少一個氨基酸取代為選自Q、N、V、I、L、M、F、Y、W和H的氨基酸，條件是 所述取代不會導致具有現(xiàn)有技術(shù)中已知的氨基酸序列的VP2蛋白。
[0040] 因此，在一個進一步實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的FMDV VP2蛋白突變體包含位于 VP2蛋白的αΑ螺旋中的至少一個氨基酸取代為選自^￥、1上、1、？、￥、1和!1的氨基酸， 條件是所述取代不會導致具有以下氨基酸序列中的一種或多種（或所有）的VP2蛋白： 一血清型0的FMDV中的90V (例如，如毒株OlBFS和/或01Μ_87中），和/或（and/ or not)血清型C中的90V(例如，CS8cl)，和/或血清型Asia 1中的90V(例如，ASIA1_ Bar2003)，和/或血清型A中的90V (例如，A22_Iraq_95)，和/或血清型SAT-I中的901 (例 如，SATl_bot)，和/或血清型SAT-2中的901 (例如，SAT2_ZM7_83)，和/或血清型SAT-3 中的 901 (例如，SAT3_KNP10_90)。 -91Y〇 一血清型A的FMDV中的93Η (例如，如毒株A22_Iraq_95中），和/或血清型SAT-I中 的 93Q (例如，SATl_bot)。 一血清型0的FMDV中的94L (例如，如毒株OlBFS和/或01M_87中），和/或血清型 C中的94L(例如，CS8cl)，和/或血清型Asia 1中的94L (例如，ASIAl_Bar2003)，和/ 或血清型A中的94L (例如，A22_Iraq_95)，和/或血清型SAT-I中的94L (例如，SAT1_ bot)，和/或血清型SAT-2中的94L (例如